JP3448287B2 - 高分子光酸発生剤を用いたペプチド核酸プローブの製造方法 - Google Patents

高分子光酸発生剤を用いたペプチド核酸プローブの製造方法

Info

Publication number
JP3448287B2
JP3448287B2 JP2001501650A JP2001501650A JP3448287B2 JP 3448287 B2 JP3448287 B2 JP 3448287B2 JP 2001501650 A JP2001501650 A JP 2001501650A JP 2001501650 A JP2001501650 A JP 2001501650A JP 3448287 B2 JP3448287 B2 JP 3448287B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
solid matrix
nucleic acid
peptide nucleic
solution
array
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2001501650A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2003501640A (ja
Inventor
キム，ミン−フワン
キム，ド−ユン
ムーン，ボン−セオク
パク，ジャエ−チャン
キム，ヨン−ヒー
セオ，セウン−ジュー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Samsung Electronics Co Ltd
Original Assignee
Samsung Electronics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Samsung Electronics Co Ltd filed Critical Samsung Electronics Co Ltd
Publication of JP2003501640A publication Critical patent/JP2003501640A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3448287B2 publication Critical patent/JP3448287B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C07K14/003—Peptide-nucleic acids (PNAs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00351—Means for dispensing and evacuation of reagents
    • B01J2219/00427—Means for dispensing and evacuation of reagents using masks
    • B01J2219/00432—Photolithographic masks
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B01J2219/00529—DNA chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/0059—Sequential processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00596—Solid-phase processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00608—DNA chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/0061—The surface being organic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00612—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports the surface being inorganic
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00617—Delimitation of the attachment areas by chemical means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00623—Immobilisation or binding
    • B01J2219/00626—Covalent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00632—Introduction of reactive groups to the surface
    • B01J2219/00637—Introduction of reactive groups to the surface by coating it with another layer
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00675—In-situ synthesis on the substrate
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00709—Type of synthesis
    • B01J2219/00711—Light-directed synthesis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00729—Peptide nucleic acids [PNA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/14—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B60/00—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries
    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 技術分野 本発明は、高分子光酸発生剤(polymeric photoacid gen
erator)を用いたペプチド核酸プローブの製造方法に関
し、より具体的には、高分子光酸発生剤を用いて固体マ
トリックス上に固定されたオリゴペプチド核酸プローブ
のアレイを製造する方法に関する。
【０００２】従来の技術 バイオチップは遺伝子分析、疾病診断、生物学的プロセ
ス及び環境のモニタリングに使用されるバイオセンサー
の一種であり、おおまかには、ヌクレオチド配列を同定
するDNAチップと、病原体、抗体、抗原または酵素など
のタンパク質を認識するプロテインチップに分けること
ができる。
【０００３】1953年にワトソン(Watson)とクリック(Cri
ck)によって同定されたDNAの構造は、分子生物学、生化
学などの生命科学分野に大きな影響を与えてきた。DNA
は、４つの異なる塩基であるアデニン(A)、シトシン
(C)、グアニン(G)またはチミン(T)、糖(デオキシリボー
ス)およびリン酸を有する生体高分子であり、非常に安
定な二重らせん構造を形成する。リン酸−糖は、骨格を
形成し、糖に結合した塩基は、相補的な塩基と対を作り
(例えば、AとTおよびGとT)、水素結合により安定化され
る。塩基間の特異的/相補的な水素結合は、アンチセン
ス薬剤などの医薬の開発および特に遺伝子疾患、癌およ
び心臓疾患のための遺伝子治療において非常に重要な役
割を果たす。
【０００４】最近、約10万個のヒト遺伝子を同定するた
めに多大な努力が払われるとともに、遺伝子疾患の診断
及び予防のために可能な限り迅速に莫大な量の遺伝子情
報を提供する方法についての要求が増加している。サン
ガー(Sanger)のDNA配列決定法はポリメラーゼ連鎖反応
(polymerase chain reaction, PCR)によって改善されて
いるにも関わらず、依然としてわずらわしく、時間を浪
費し、高い費用ならびに高度の熟練を必要とする。そこ
で、このような欠点を克服することができる新しい方法
が当業界で考案された。このような必要に応じて、最近
の数年間でDNAチップの制作と利用技術に関する大きい
進歩があった。
【０００５】一般的に、DNAチップとは、1平方インチ未
満の表面、例えばシリカ、表面誘導体化ガラス、ポリプ
ロピレン、または活性化ポリアクリルアミドなどに固定
された数百から数十万個の範囲の既知のオリゴヌクレオ
チドプローブの高密度マイクロアレイである。DNAチッ
プ上に標的DNA断片を置くと、標的DNA断片はその配列相
補性に従ってチップ上のプローブにハイブリダイズす
る。従って、光学的な方法または放射能化学的方法によ
り検出されるハイブリダイズしたDNAの存在または位置
によって、標的DNAの配列を分析することができる。DNA
チップを援用した方法を用いると、DNA分析システム
を、診断のために極微量のサンプルDNAを用いることが
でき、標的DNA中のいくつかの配列を同時に分析するこ
とができ、従って、遺伝子情報を、簡単に、費用効果的
に、および迅速に取得することができるように、小型化
することができる。
【０００６】オリゴヌクレオチドDNAチップを用いる配
列分析技術は、従来のサンガーの方法よりも迅速かつ容
易に標的遺伝子の配列決定を行うことができるので、画
期的な方法である。サンガーの方法では、蛍光標識また
は放射性同位体標識されたDNA断片をゲル電気泳動によ
り分離する必要があり、時間消費性および技術的困難性
の観点では満足のいくものではない。それに対して、オ
リゴヌクレオチドDNAチップを用いるハイブリダイゼー
ションによる配列決定(SBH)は、蛍光標識または放射性
同位体標識された標的遺伝子断片を、オリゴヌクレオチ
ドプローブを用いてDNAチップ上に配置し、次いで該チ
ップを溶媒で簡単に洗浄することによって、既知のオリ
ゴヌクレオチドプローブと相補的な遺伝子断片を水素結
合により結合させるという原理を利用するものである。
【０００７】有機溶媒に溶解しない固体マトリックス上
で化合物を反応させ、さらに該固体マトリックス上で有
機反応を行うというMerryfieldの合成法は、反応生成物
の精製において非常に簡便で効率的であるので、生物学
的に重要な酵素および遺伝子のオリゴヌクレオチドのオ
リゴペプチドを合成するのに効率的に用いられてきた
(参照：Fed. Proc.,24:412(1962))。このような方法と
コンビナトリアル・ケミストリーとを組合せた新規で効
率的な合成法が、触媒スクリーニングや薬剤の開発にも
効率的に用いられてきた。さらに、固体マトリックス上
の合成法と、半導体産業で用いられるフォトリソグラフ
ィとの組合せにより、オリゴヌクレオチドプローブのア
レイを調製するための種々の技術が開発され、遺伝子診
断に用いられてきた。この技術は、オリゴヌクレオチド
が化学的に結合する表面誘導体化ガラスの特定の領域の
選択的な活性化を含む。特定の標的領域を活性化するた
めには、所定のパターンにより作製されたフォトリソグ
ラフィックマスク(photolithographic mask)の透過性領
域に光線をあてる。各工程で、マスクのパターンおよび
核酸の組成を制御することにより、特定の核酸を所望の
位置に配置することができる。この技術は半導体装置に
使用される極微細加工技術であるので、爪ほどの大きさ
のチップ上に数百万個のプローブを固定させることがで
きる。
【０００８】例えば、Fordorらは、紫外線光に不安定な
保護基を有する核酸またはアミノ酸を固相表面上に結合
させ、フォトリソグラフィックマスクを用いて表面の選
択した領域を光に曝すことにより該保護基を除去した
後、光不安定保護基を有する核酸またはアミノ酸と反応
させて特定の位置の核酸またはアミノ酸を重合させると
いう新しい直接光分解技術合成方法を教示している（参
照：米国特許第5,445,934号）。この方法は特定位置に
特定の配列／長さを有するオリゴヌクレオチドプローブ
の選択的な合成を可能にするので、所定の位置で所望の
配列および長さを有する種々のオリゴヌクレオチドプロ
ーブの合成において有用である。また、この方法は半導
体装置に使用される極微細加工技術を用いるものである
ので、オリゴヌクレオチドプローブを高密度に製造する
のに非常に有用である。Fordorらはまた、サンガーの方
法より極めて容易で迅速なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いる配列決定法が高密度オリゴヌクレオチドプロー
ブの作製に有用であることを提示した。しかし、これに
は以下のような欠点があることを示している。すなわ
ち、光不安定保護基の除去は、光源の強さに比例するの
で、高密度チップの作製のための極微細加工において不
都合な役割を果たす。
【０００９】一方、半導体産業で微細パターンを形成す
るために使用されるフォトレジスト(以下、「PR」とい
う)を用いたリソグラフ加工は、DNAチップの密度を改善
するための必須の技術として注目を浴びてきた。半導体
チップのサイズまたは容量は、リソグラフ加工の空間的
な解像度によって左右されるので、リソグラフ加工が半
導体産業とマイクロエレクトロニックス産業において先
導的な役割を果たしてきた。リソグラフ加工は、露光領
域と非露光領域の間の溶解度の差を利用するものであ
る。露光領域の溶解度の減少をネカティブシステムと呼
び、溶解度の上昇をポジティブシステムと呼び、半導体
チップの製造には主にポジティブを使用する。このよう
なリソグラフ加工を利用すると、チップの制限された面
積上により多くのオリゴヌクレオチドプローブを配列さ
せることができる。
【００１０】現在まで、リソグラフ加工は、一般的なPR
システム(参照：米国特許第5,658,734号)及び光酸パタ
ーン配列システム(以下、「PPA」という、参照：米国特
許第5,843,655号)に適用されてきた。
【００１１】PRシステムを用いたリソグラフ加工(以
下、「PR加工」という)は、既に半導体産業のために開
発または商用化されている材料を使用することができる
という利点がある。このシステムによると、光照射によ
ってパターンを形成し、洗浄するとその表面上で標準的
な固相核酸合成反応が起こり、最終的にはヌクレオチド
が結合する。PRとしては、表面との接着力が優れている
ジアゾキノン/クレゾール-ノボラックが挙げられるが、
これは、アイ-ライン(i-line、365nm)で優れたパターン
特性を有することが示され、16メガDRAM加工に使用され
ている。しかし、このようなPRはアルカリ溶液(［OH-］
＞0.1M)の条件で現像をするが、この条件では塩基のア
ミノ基を保護するアミド結合の開裂を引き起こす。この
ような現像の問題を克服するために、PRの下の保護コー
ティングが提唱された(参照：J. Vac.Sci. Tech., B7
(6):1734, 1989)。
【００１２】PR加工は３つの主要な工程からなる。すな
わち、第１は主に、PRのコーティング、露光及び現像を
伴うPRのパターン形成であり、第２は酸性溶液による保
護基の除去および非露光領域の除去であり、および第３
は核酸の結合と後処理である。PRシステムを用いるリソ
グラフ加工は、高い解像度を得るには優れているが、前
記のような複雑な加工が主要な欠点であった。
【００１３】このような複雑な工程を単純化し、効率を
高めるために、当業界でPPAシステムが提唱された。PPA
システムは高分子マトリックスに光酸発生剤(以下、「P
AG」という）を混合して用いるので、露光された領域の
みで酸が生成し、熱処理の後に保護基の除去が起こる。
従って、PR加工において用いられる２つの別個の工程
を、１工程で行うことができる。しかし、このPPAシス
テムにもいくつかの問題点が報告されている。例えば、
PR加工では保護基を接触させ、除去するために大量の酸
溶液を用いるので、酸溶液の濃度または量によって影響
されないが、PPAシステムによって生成した酸は高分子
マトリックス上に残るので、酸の量を合わせるために
は、より多くのPAGを添加しなけらばならない。しか
し、一定濃度以上になるとPAGドメインが生じることに
なり光を散乱させて微細パターン形成を妨害する。換言
すれば、パターン形成の安定性と再現性のために用いら
れる過剰量のPAGにより加工の効率が低下する。さら
に、生成する酸は、熱によって高分子から保護基の表面
（実際には熱源から近い部分）に拡散しなければならな
いが、ガラス板をホットプレートに載せて加熱すると、
生成する酸は保護基から反対の方向に拡散し、従って効
率が低下する。さらに、カップリングをするための高分
子とPAGの混合フィルムは、アセトンまたはメチルエチ
ルケトンのような有機溶剤によって除去する必要があ
り、このような有機溶剤は費用が高い。
【００１４】一方、従来のDNAチップが直面している他
の問題点は、オリゴヌクレオチドプローブと標的遺伝子
および遺伝子中に存在する点突然変異とのハイブリダイ
ゼーションの過程における結合／解離の程度、速度の低
下である。例えば、Nielsenらは、負に荷電したオリゴ
ヌクレオチド間の反発力がオリゴヌクレオチドのハイブ
リダイゼーションの間のアニーリング強度ならびに速度
を低下させるという知見に基づいて、改変されたMarryf
ieldのペプチド合成法により合成することができるオリ
ゴヌクレオチドの代わりとなる中性に荷電したペプチド
核酸(以下、「PNA」という)を開発した。PNAはオリゴヌ
クレオチドとのハイブリダイゼーションの間の結合力お
よび速度を大幅に改善し、非相補的なオリゴヌクレオチ
ド間の結合の低下により認識され得る特定の遺伝子にお
ける単一の塩基変異の検出に実際に応用されている（参
照：Nature、8:53、1993）。このような長所により、現
在PNAを用いるアンチセンス治療剤について研究されて
いる。しかし、上述した長所にも関わらず、フォトリソ
グラフィックマスクによる高密度ペプチド核酸プローブ
合成にRNAを用いることについては報告されていない。
【００１５】従って、PRおよびPPAシステムを用いた従
来のDNAチップの製造において直面した問題を克服する
ような、固体マトリックス上で多様なヌクレオチド配列
を有するペプチド核酸及びオリゴヌクレオチドを合成す
るための代替的な方法の開発及び研究が絶えず求められ
てきた。
【００１６】発明の概要 本発明者らは、多様なヌクレオチド配列を有するペプチ
ド核酸プローブを製造するための効率的な方法を提供す
るために鋭意努力した結果、高分子光酸発生剤(以下、
「高分子PAG」という)を用いることによって、固体マト
リックス上に固定された、負に荷電したオリゴヌクレオ
チドに関連する問題を解消することができる一方、従来
の高分子にPAGを用いるPPA法の問題を克服するような、
ペプチド核酸のアレイを製造するための極めて効率的な
方法を開発した。
【００１７】本発明の主な目的は、高分子光酸発生剤を
用いて固体マトリックス上で多様なヌクレオチド配列を
有するペプチド核酸プローブのアレイを製造するための
方法を提供することである。
【００１８】本発明の他の目的は、高分子光酸発生剤を
用いて調製された多様なヌクレオチド配列を有するペプ
チド核酸プローブのアレイを提供することである。
【００１９】発明の説明 多様なヌクレオチド配列を有するペプチド核酸プローブ
は、アミノアルキルオキシシランのアルコール溶液で固
体マトリックスの表面を誘導体化し、固体マトリックス
に酸に不安定な保護基を有するリンカーを結合させ、該
固体マトリックスを高分子光酸発生剤(PAG)でコーティ
ングし、このようにコーティングされた該固体マトリッ
クスを露光して酸を発生させることによって酸に不安定
な保護基を除去し、該固体マトリックスをアルカリ性溶
液または有機溶媒で洗浄して残っている高分子光酸発生
剤を除去し、酸に不安定な保護基を有するモノマーペプ
チド核酸を該固体マトリックスに結合させ、上記の工程
を繰り返すことにより調製される。
【００２０】本発明で用いられる高分子PAGは、分子量
が500〜1,000,000である高分子であり、主鎖または側鎖
にスルホニウム塩を有し、側鎖に有機光酸発生基をも有
し、露光することにより、酸を生成する。
【００２１】本発明のペプチド核酸モノマーは、アデニ
ン、シトシン、グアニンまたはチミンなどの塩基がアミ
ド結合により連結されたN-(2-アミノエチル)グリシン主
鎖を有する。ペプチド核酸は、主鎖のアミノ基と他のペ
プチド核酸モノマーのカルボキシル基との間のアミド結
合により合成される。現在、酸に不安定なt-ブチルオキ
シカルボニル保護基またはアルカリに不安定なフルオロ
メチルオキシカルボニル保護基により保護されたペプチ
ド核酸モノマーが商業的に入手可能であるが、それらに
おいては、アデニン、シトシン、及びグアニンの環外ア
ミノ基は、酸に安定なジフェニルメチルオキシカルボニ
ル保護基またはベンジルオキシカルボニル保護基により
保護されている。本発明者らは、主鎖のアミノ基が酸に
不安定なt-ブチルオキシカルボニルにより保護されたモ
ノマーを用い、環外アミノ基が安定なp-メトキシベンゾ
イル基またはイソブタノイル基により保護された塩基を
合成した。
【００２２】ペプチド核酸合成法は、一般的には当業界
で公知のオリゴヌクレオチドの合成方法（参照：Acc. C
hem. Res., 24:278, 1991)と同様な様式で行うことがで
きる。Nielsonらは、固相を用いることによりオリゴペ
プチド核酸を合成した。第１に、固相支持体のアミノ基
を、主鎖のアミノ基が酸または塩基に不安定な官能基に
より保護された特定の塩基(A,C,GまたはT)のペプチド核
酸のカルボキシル基と反応させて、アミド結合の形態で
互いに連結する。次に、得られたものを、酸または塩基
で処理して、アミノ保護基を除去してアミノ基を露出さ
せ、続いて主鎖のアミノ基が酸または塩基に不安定な官
能基により保護された特定の塩基のペプチド核酸のカル
ボキシル基と反応させて、アミド結合の形態で互いに連
結させた後、前記工程を所望の塩基配列および塩基数の
オリゴペプチドを得るまで繰り返し、最後に強酸で処理
して化学反応により固相支持体から環外アミノ保護基を
遊離させる。この方法は、過剰なペプチド核酸(5当量)
の可能な限り完全な反応ならびに残ったモノマーおよび
反応物を濾過し、有機溶媒で洗浄することによる、有機
溶媒に耐性を有する固相支持体上のペプチド核酸の容易
な精製を確実にするという意味で望ましいものである。
固相合成法に基づいて、本発明者らは、多様なヌクレオ
チド配列を有するバイオチップを調製し、最終的には、
上記で説明した高分子PAG法を用いることにより、固体
マトリックス上に固定されたペプチド核酸プローブのア
レイを製造した。
【００２３】多様なヌクレオチド配列を有するペプチド
核酸プローブの製造方法において用いられる高分子PAG
およびペプチド核酸モノマーは、それぞれ製造例1およ
び2、ならびに製造例３によって製造されたものであ
る。
【００２４】製造例1：塩化物塩の形態の高分子PAG 0.026モルのアニソールジフェノールスルフィド塩を、2
6mlのN,N'-ジメチルアセトアミドに溶解させて、0.077
モルのトリエチルアミンを加えた後、0℃に冷却した。
0.026モルのセバコニルクロライドを26mlヘプタンに溶
解させたものに、前記溶液を加え、室温にて一晩反応さ
せた。上層のヘプタンを分離させて、混合物から穏やか
に除去した後、N,N'-ジメチルアセトアミド層を400mlの
ジエチルエテルに滴下して、沈澱物を得た。沈殿を濾過
して乾燥させることにより、塩化物塩形態の高分子PAG
を得た。得られた物質を20mlのメタノールに再溶解した
後、水中で再度沈殿させ、濾過および乾燥して表題の化
合物を得た。
【００２５】製造例2：塩の置換製造例2-1 ：高分子PAGのp−トルエンスルホン酸塩 製造例1で得られた塩化物塩の形態の高分子PAG 0.01モ
ルを、10mlのメタノールに溶解し、これにパラトルエン
サルホン酸のナトリウム塩0.03モルを添加した。3時間
インキュベートした後、7mlのメタノールを除去して該
溶液を濃縮し、水を添加して沈澱させた。沈殿物を濾過
して乾燥し、高分子PAGのp−トルエンスルホン酸塩を得
た。
【００２６】製造例2-2：高分子PAGのナフトールスルホ
ン酸塩 製造例1で得られた塩化物塩の形態の高分子PAG 0.01モ
ルを、10 mlのメタノールに溶解し、これに1-ナフトー
ル-5-スルホン酸のナトリウム塩0.03モルを添加した。3
時間インキュベートした後、7mlのメタノールを除去し
て該溶液を濃縮し、水を添加して沈澱させた。沈殿物を
濾過して乾燥し、高分子PAGの1-ナフトール-5-スルホン
酸塩を得た。
【００２７】製造例2-3：高分子PAGの9.10-ジメトキシ-
2-アントラセンスルホン酸塩 製造例1で得られた塩化物塩の形態の高分子PAG 0.01モ
ルを、10mlのメタノールに溶解し、これに9,10-ジメト
キシ-2-アントラセンスルホン酸塩0.012モルを添加し
た。3時間インキュベートした後、いくらかのメタノー
ルを除去して該溶液を濃縮し、水を添加して沈澱させ
た。沈殿物を濾過して乾燥し、高分子PAGの9,10-ジメト
キシ-2-アントラセンスルホン酸塩を得た。
【００２８】製造例3：ペプチド核酸モノマー製造例3-1 ：ペプチド核酸主鎖 107mL(1.60mol)のエチレンジアミンと60mLの1,4-ジオキ
サンとを、2Lの丸底フラスコ中で撹拌しながら混合し
た。その後、600mLのジ-t-ブチルカルボネート溶液(1,4
-ジオキサン中の43.65g(0.20mol))を加え、一晩中撹拌
しながらインキュベートした。次いで、溶媒を減圧下で
蒸発させ、残っている溶液に水1Lを加えた。水の添加に
より白色の沈殿が生成したが、このように生成された沈
殿物を濾過して除去し、ジクロロメタンで抽出した。こ
のように得られた有機層を合わせて硫酸マグネシウムで
乾燥し、減圧下で濃縮して、27.21g(1.36mol)のt-ブチ
ルN-(2-アミノエチル)グリシネート(白色の粉末)を得
た。t-ブチルN-(2-アミノエチル)グリシネート5.00g(0.
25mol)を、2L反応フラスコに入れて500mLのジクロロメ
タンに溶解した後、トリエチルアミン41.5mL(0.30mol)
を一度に加え、ベンジル-2-ブロモアセテート62.54g(0.
27mol)を滴加し、一晩中撹拌しながらインキュベートし
た。その後、この反応物をジクロロメタンで抽出して水
と食塩水(brine)で順に洗浄した。次に、得られた有機
層を硫酸マグネシウムで乾燥して減圧下で濃縮し、粗化
合物を得た。該粗化合物を、5%のメタノール/ジクロロ
メタンを移動相として用いてシリカゲルカラムクロマト
グラフィーを実施して分画し、白色の粉末のベンジルN-
[2-(t-ブトキシル)アミノエチル]グリシネート47.80g
(0.16mol)を得た。
【００２９】製造例3-2：アデニンモノマー アデニン27.03g(0.20mol)を、500mLのピリジンに溶解さ
せた後、34.12g(0.20mol)のp-アニソールクロライドを5
5分に渡ってゆっくり添加し、攪拌しながら100℃にて4
時間反応させた。その後、反応温度を室温に下げ、さら
に撹拌しながら一晩反応させ、ピリジンを減圧下で蒸留
して除去した。生成した粗化合物をイソプロパノールと
メタノール中でそれぞれ再結晶して、33.7g(0.13mol)の
白色粉末N6-(4-メトキシベンゾイル)アデニンを得た。3
3.66g(125mmol)のN6-(4-メトキシベンゾイル)アデニン
と400mLのDMFとを、1Lの反応フラスコに入れて60%NaH6.
0g(150mmol)を少しずつ加えた後、t-ブチルブロモアセ
テート22.15mL(150mmol)を1時間15分に渡って滴加し
て、一晩反応させた。この反応の溶媒であるDMFを減圧
下で除去し、水を加えると沈殿物が得られた。この沈殿
物を分離してメタノール中で再結晶して、白色固体とし
てN6-(4-メトキシベンゾイル)-9-(t-ブトキシカルボニ
ルメチル)アデニン33.46g(87.30mmol)を得た。33.46g(8
7.30mmol)のN6-(4-メトキシベンゾイル)-9-(t-ブトキシ
カルボニルメチル)アデニンと800mLのジクロロメタンを
2Lの反応フラスコに入れて、室温にて混合し、この反応
物に180mLのTFAを加えた。反応物を同じ温度で一晩撹拌
しながら混合した。ジクロロメタンとTFAを減圧下で除
去した後、得られた粗化合物を450mLの1N NaOHに溶解さ
せた。該溶液をジクロロメタンで洗浄し、6N HClで酸
性化して、白色固体としてN6-(4-メトキシベンゾイル)-
9-(カルボニルメチル)アデニン23.54g(71.9mmol)を得
た。N6-(4-メトキシベンゾイル)-9-(カルボニルメチル)
アデニン21.99g(67.20mmol)、ベンジルN-[2-(t-ブトキ
シル)アミノエチル]グリシネート20.72g(62.7mmol)およ
び200mLのジクロロメタンを、500mLの反応フラスコ中に
順番に加えた後、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エ
チルカルボジアミド14.17g(73.92mmol)を一度に加え
た。反応混合物を室温にて一晩撹拌しながらインキュベ
ートし、ジクロロメタンと水で抽出し、食塩水で洗浄し
た。有機層を硫酸マグネシウム乾燥させて、減圧下で濃
縮して粗化合物を得た後、フラッシュカラムクロマトグ
ラフィー(移動相：5%メタノール/ジクロロメタン)を通
して精製し、ベンジルN-[2-(t-ブトキシルカルボニル)
アミノエチル]-N-[(N6-(4-メトキシベンゾイル)-アデニ
ン-9-イル)アセチル]グリシネート28.24g(45.70mol)を
白色の粉末として得た。28.24g(45.70mol)の前記化合物
に400mLのメタノールを加えた後、撹拌しながら1.0gの
パラジウム-活性炭(Pd/C)を加えた。水素風船により作
られた水素環境下で、反応フラスコを3時間撹拌した。
触媒をセライトを通じて濾過により除去し、溶媒を減圧
下で蒸発させた。得られた物質を200mLの1N NaOHに溶解
し、ジクロロメタンで洗浄して6N HClで酸性化した
後、それぞれジクロロメタンとヘキサンで再結晶して、
表題の生成物として17.07g(32.40mmol)のN-[2-(t-ブト
キシカルボニル)アミノエチル]-N-[(N2-(4-メトキシベ
ンゾイル)-アデニン-9-イル)アセチル]グリシン(白色粉
末)を得た。
【００３０】製造例3-3：グアニンモノマー グアニン3.02g(20mmol)を60mLのジメチルホルムアミド
(DMF)に加えて、トリエチルアミン6.2mL(44mmol)とイソ
ブチリルクロライド4.6mL(44mmol)を加えて、反応を120
℃で一晩、一定に撹拌しながら行った。次いで、反応温
度を室温に下げてメタノール20mLの添加により反応を停
止させた後、反応溶液を減圧濃縮し、熱いイソプロパノ
ールを添加して沈殿させた。該沈殿物を濾過分離して、
1.84g(8.32mmol)のN2-(イソブタノイル)グアニン(白色
粉末)を得た。N2-(イソブタノイル)グアニン1.83g(8.27
mmol)を50mLのDMFに添加し、60% NaH 0.40g(10mmol)を
加えた。この懸濁液を1時間室温で撹拌してt-ブチルブ
ロモアセテート1.35mL(9.14mmol)を加えて同一温度でさ
らに2時間撹拌しながら混合した。この反応溶液をCO2 /
メタノールで処理して減圧濃縮させ、粗化合物を得た。
該粗化合物を酢酸エチルで抽出して収得した有機相の層
を減圧濃縮させて、白色粉末であるN2-(イソブタノイ
ル)-9-(t-ブトキシカルボニルメチル)グアニンとN2-(イ
ソブタノイル)-7-(t-ブトキシカルボニルメチル)グアニ
ンの混合物を収得した。前記収得した混合物に50mLのジ
クロロメタンを加えた後、撹拌しながら19mLのＴＦＡを
加えて、この最終反応混合物を二日間撹拌しながらイン
キュベートした。次いで、反応物を減圧濃縮させてN2-
(イソブタノイル)-9-(カルボキシメチル)グアニンとN2-
(イソブタノイル)-7-(カルボキシメチル)グアニンの混
合物を1.5g(5.64mmol)収得した。前記収得した混合物を
酢酸エチルで処理すると白色沈澱物が生成した。この生
成した沈殿物を濾過分離して減圧乾燥させて、0.72g(2.
57mmol)のN2-(イソブタノイル)-9-(カルボキシメチル)
グアニンを収得した。N2-(イソブタノイル)-9-(カルボ
キシメチル)グアニン690mg(2.47mmol)、ベンジルN-[2-
(t-ブトキシル)アミノエチル]グリシネート922mg(2.99m
mol)及びEDC 577mg(3.01mmol)を20mLのDMF中に溶解し
て、この反応混合物を室温で3時間一定に撹拌した。そ
の後、DMFを減圧蒸留で除去して、得られた化合物を酢
酸エチルで抽出して、収得した有機相の層を減圧濃縮さ
せた。この生成された粗化合物をジクロロメタン10mLに
溶解させた後、ヘキサンで再結晶させて白色沈殿物を収
得した。この収得した沈殿物を濾過分離してさらにフラ
ッシュカラムクロマトグラフィー(移動相：10%メタノー
ル/ジクロロメタン)で精製して、ベンジルN-[2-(t-ブト
キシルカルボニル)アミノエチル]-N-[(N2-(イソブタノ
イル)-グアニン-9-イル)アセチル]グリシネートを1.24g
(2.18mmol)収得した。この化合物1.22g(2.14mmol)に25m
Lのメタノールを加えて撹拌しながら0.25gの10% Pd/C
と混合した。反応フラスコを水素バルーンにより作り出
した水素環境下で、2時間45分間撹拌した後、セライト
を通じて濾過して触媒を除去し、濾液を減圧濃縮させ
た。この粗化合物を酢酸エチル中に溶解し、一晩中撹拌
して白色沈殿物を得た。この沈殿物を濾過分離し、乾燥
して0.92g(1.91mmol)のN-[2-(t-ブトキシルカルボニル)
アミノエチル]-N-[(N2-(イソブタノイル)-グアニン-9-
イル)アセチル]グリシンを白色粉末状で収得した。
【００３１】製造例3-4：シトシンモノマー シトシン22.02g(0.20mol)をピリジンに溶解させて、p-
アニソールクロライド37.53g(0.22mol)を45分に渡って
ゆっくりと滴加させた後、反応温度を120℃まで徐々に
上げて一晩中撹拌しながら同じ温度で反応させた。その
後、反応生成物を減圧濃縮すると粗化合物が生成され
た。粗生成物をメタノールに溶解させて加熱した後、冷
却して、沈殿物を得た。この沈殿物を濾過分離し乾燥し
て25.78g(0.11mol)のN4-(4-メトキシベンゾイル)シトシ
ンを収得した。このように収得したN4-(4-メトキシベン
ゾイル)シトシン25.75g(0.11mol)と500mLのDMFを1Lの反
応フラスコに入れて、60% NaH 5.04g(0.13mol)を滴加
した後、t-ブチルブロモアセテート18.61mL(0.13mol)を
滴加した。この反応混合物を室温で一晩撹拌した後、DM
Fを減圧下で除去した。このように生成された粗生成物
をメタノールで再結晶して、白色粉末である1-(t-ブト
キシカルボニルメチル)-N4-(4-メトキシベンゾイル)シ
トシンを22.52g(62.60mmol)収得した。22.52g(62.60mmo
l)の該化合物と600mLのジクロロメタンを2L反応フラス
コに入れて室温で混合した後、この反応物に130mLのTFA
を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。次い
で、ジクロロメタンとTFAを減圧下で除去して収得した
粗化合物を1N NaOH 450mLに溶解させて6N HClで酸性
化すると白色沈澱物が生成された。この沈殿物を濾過分
離して乾燥させて18.82g(62.10mmol)の1-(カルボキシル
メチル)-N4-(4-メトキシベンゾイル)シトシンを白色粉
末として収得した。この化合物18.82g(62.10mmol)をベ
ンジルN-[2-(t-ブトキシルカルボニル)アミノエチル]グ
リシネート12.05g(68.3mmol)と500mLの反応フラスコ中
で混合した後、120mLのDMFを加えて、EDC13.09g(68.30m
mol)を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌して、
DMF溶媒を減圧下で除去した。ここで生成された粗生成
物をジクロロメタンで抽出して減圧濃縮させた後、ジク
ロロメタンとヘキサンでそれぞれ再結晶して、白色沈殿
物であるベンジルN-[2-(t-ブトキシカルボニル)アミノ
エチル]-N-[(N4-(4-メトキシベンゾイル)-シトシン-1-
イル)アセチル]グリシネートを26.90g(45.30mmol)収得
した。26.90g(45.30mmol)のこの化合物を850mLのメタノ
ール中に溶解して撹拌させながら1.0gのPd/Cを加えた。
反応溶液を水素バルーンにより作り出された水素環境下
で4時間撹拌した。触媒をセライトを通じて濾過して除
去した後、濾液を減圧濃縮した。このように収得した物
質を1N NaOH 200mLに溶解させ、ジクロロメタンで洗
浄して6N HClで酸性化した後、ジクロロメタンとヘキ
サンでそれぞれ再結晶すると18.83g(37.40mmol)のN-[2-
(t-ブトキシカルボニル)アミノエチル]-N-[(N4-(4-メト
キシベンゾイル)-シトシン-1-イル)アセチル]グリシン
(白色粉末)を得た。
【００３２】製造例3-5：チミンモノマー チミン50.45g(0.40mol)と炭酸カリウム55.28g(0.40mol)
及びDMF1.20mLを2Lの丸底フラスコ中で混合した後、生
成された白色懸濁液にエチルブロモアセテート44.40mL
(0.40mol)を一度に加えて、室温で48時間撹拌した。次
いで、この懸濁液を濾過して溶解されない固体を除去
し、この濾液中のDMFを減圧下で除去した。反応温度を0
℃に下げて沈殿を形成させた後、400mLの水と11mLの6N-
HClと混合して30分間撹拌し濾過した。白色沈殿である1
-(エトキシカルボニルメチル)チミンを収得した。この
化合物を水400mL及び2N-NaOH 200mLと1Lの反応フラス
コ中で混合し、10分間加熱還流させた。このように加熱
還流する間白色懸濁液が透明な溶液に変わった時点で、
反応溶液を0℃に冷却し、6N-HCl 90mLを加えると白色
沈殿物が生成した。生成した沈殿物を濾過分離して水で
洗浄した後、真空オーブンで乾燥して白色粉末の1-(カ
ルボキシメチル)チミンを47.56g(0.26mol)得た。この化
合物10.94g(54.40mmol)とベンジルN-[2-(t-ブトキシカ
ルボニル)アミノエチル]グリシネート15.27g(49.50mmo
l)を250mLのDMF中に溶解させて、EDC 11.39g(59.40mmo
l)を滴加した後、室温で一晩中撹拌した。一晩撹拌させ
た反応溶液の溶媒であるDMFを減圧下で除去させた後、
残りの溶液に水500mLを加えてジクロロメタンで抽出し
た。収得した有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し減圧濃
縮させて粗化合物を得た。収得した粗化合物をフラッシ
ュカラムクロマトグラフィー(移動相：10%メタノール/
ジクロロメタン)で精製して、白色粉末であるベンジルN
-[2-(t-ブトキシカルボニル)アミノエチル]-N-((チミン
-1-イル)アセチル]グリシネート21.76g(45.90mmol)を得
た。この化合物21.76g(45.90mmol)を400mLのメタノール
に溶解させて10%Pd/C 5.0gと混合した。水素バルーン
により作り出された水素環境下でさらに4時間30分間撹
拌した。触媒をセライトを通して濾過して除去し、濾液
に1N NaOH 50mLと水100mLを加えた後、ジクロロメタ
ンで洗浄して6N-HClで酸性化した。このように収得した
混合物を酢酸エチルで抽出して収得した有機相を回収
し、硫酸マグネシウムで乾燥して減圧濃縮した後、さら
に真空オーブンで乾燥して白色粉末状あるN-[2-(t-ブト
キシカルボニル)アミノエチル]-N-((チミン-1-イル)ア
セチル]グリシン17.05g(43.60mmol)を収得した。
【００３３】以下、本発明の高分子光酸発生剤を用いて
多様なヌクレオチド配列を有するペプチド核酸のアレイ
の製造方法を詳細に説明する。
【００３４】第1工程：固体マトリックス上へのリンカ
ーの結合 アミノアルキルオキシシランのアルコール溶液で固体マ
トリックスの表面を誘導体化した後、固体マトリックス
上に、酸に不安定な保護基を有するリンカーを結合す
る。
【００３５】まず、固体マトリックス、例えば有機溶媒
に耐性を有する材料(例えば、シリコン、表面誘導体化
ガラス、ポリプロピレンまたは活性化アクリルアミドな
ど、好ましくは表面誘導体化ガラス)で作製されたプレ
ート、より好ましくは顕微鏡用ガラスプレートの表面上
にアミン基を固定させるために、0.05〜0.15%(v/v)、最
も好ましくは0.1%(v/v)のアミノアルキルオキシシラン
溶液、好ましくはアミノプロピルトリエトキシシランの
アルコール(最も好ましくは、エタノール)溶液に固体マ
トリックスを浸して室温で3〜7分間、最も好ましくは5
分間混合し、アルコール、最も好ましくはエタノールで
洗浄した後、真空オーブンで100〜140℃、より好ましく
は110〜130℃、最も好ましくは120℃で、10〜30分間、
好ましくは15〜25分間、最も好ましくは20分間乾燥す
る。次いで、アルゴンガス下で10〜14時間、最も好まし
くは12時間放置して、DMF中に浸し、ジクロロメタンで
充分洗浄する。
【００３６】次に、固体マトリックス上に固定されたア
ミン基に、酸に不安定な保護基を有するリンカーを結合
させるために、0.05〜0.5mM、より好ましくは0.2mMのジ
イソプロピルエチルアミンを含有する0.02〜0.2mM、最
も好ましくは0.1mMのアミノアルキルカルボン酸、最も
好ましくは6-N-t-ブトキシカルボニルアミノカプロン酸
が溶解されたN-メチルピロリドン(NMP)溶液を調製し、
0.05〜0.5mM、最も好ましくは0.12ｍM HATU(o-(7-アザ
ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3,-テトラメチルウ
ロニウムヘキサフルオロホスフェート)をNMPに溶解させ
た溶液を製造して、前記二つの溶液を混合して1〜5分、
最も好ましくは2分間活性化させた後、前記固体マトリ
ックスを浸して40〜90℃、最も好ましくは60℃で30分〜
4時間、好ましくは1〜3時間、最も好ましくは2時間撹拌
しながらインキュベートする。固体マトリックス上の未
反応のアミン基は前記固体マトリックスを1:2〜1:4(v/
v)、最も好ましくは1:3(v/v)の無水酢酸/ピリジン溶液
中で0.5〜2時間、最も好ましくは1時間撹拌しながらイ
ンキュベートすることによりアセチル基でキャッピング
する。
【００３７】第2工程：高分子PAGによるコーティング 前記固体マトリックスを高分子PAGを用いてコーティン
グする：リンカーまたは単量体が結合した固体マトリッ
クスに、有機溶媒、最も好ましくはNMP中の5〜50%(w/v)
の高分子PAGを用いて、1,000〜5,000rpm、最も好ましく
は3,000rpmでスピンコーティングする。
【００３８】第3工程：酸に不安定な保護基の除去 前記コーティングされた固体マトリックスを露光させて
酸を発生させることによって、酸に不安定な保護基を除
去する：コーティングされた固体マトリックスを50〜10
0℃で１分間、最も好ましくは80℃で30秒〜2分間ソフト
ベーキングし、短波長白色光でフォトマスクを用いて6
秒〜2分間、最も好ましくは1分間露光させた後、50〜10
0℃で3分間、最も好ましくは80℃で30秒〜5分間、再度
ベーキングして酸を発生させ、最終的に露光された位置
の保護基を選択的に除去する。
【００３９】第4工程：残りの高分子PAGの除去 前記固体マトリックスをアルカリ性溶液または有機溶媒
で洗浄し、残っている高分子PAGを除去する：第3工程の
完了後、残っている高分子PAGは希釈水酸化トリアルキ
ルアンモニウム、NaOH溶液、KOH溶液または有機溶剤で
洗浄して除去する。
【００４０】第5工程：ペプチド核酸モノマーとの反応 前記固体マトリックスへ酸に不安定な保護基を有するモ
ノマーペプチド核酸を結合させる：選択的に露出された
固体マトリックス上のアミン基を製造例3で収得された
ペプチド核酸モノマーと反応させる。ペプチド核酸モノ
マーが10〜20μM、最も好ましくは15μMで溶解されたNM
P溶液に、ジイソプロピルエチルアミンを、溶解した核
酸モノマーに対して1:1〜1:5(重量比)で添加して溶解さ
せた溶液と、溶解した核酸モノマーに対して1:1〜1:2
(重量比)でHATUを含有する別のNMP溶液を調製する。こ
の二つの溶液を混合して1〜5分間活性化させた後、固体
マトリックスと50〜100℃、最も好ましくは60℃で1〜3
時間、最も好ましくは2時間撹拌しながら反応させる。
この際、未反応のアミン基は1:2〜1:4(v/v)、最も好ま
しくは1:3(v/v)の無水酢酸/ピリジン溶液中で0.5〜2時
間、最も好ましくは1時間撹拌しながらインキュベート
することによりアセチル基でキャッピングする。
【００４１】次いで、最終的に前記第2工程〜第5工程を
繰り返して、固体マトリックス上に固定化されたペプチ
ド核酸プローブのアレイを製造する。
【００４２】固体マトリックス上の遊離反応基、すなわ
ちペプチド核酸のアミン基は、DMF中0.5〜2mM、最も好
ましくは1mMの蛍光イソチオシアネートと共に室温で30
分〜2時間、最も好ましくは1時間インキュベートするこ
とにより蛍光標識した後、DMFとエタノールを用いて順
に洗浄する。暗室に保管して、共焦点蛍光レーザーで撮
影する。
【００４３】高分子PAGを使用して多様なヌクレオチド
配列を有するペプチド核酸のアレイを製造する方法は、
従来技術に対して、以下に示す利点を有する： 第一に、本発明の工程は、従来のPPA工程が高分子マト
リックスと混合したモノマーPAGを使用するのに対し
て、高分子PAGを適当な溶剤に溶解させて直接スピンコ
ーティングを実施できるという点で望ましい； 第二に、PPA工程で発生した酸は、高分子マトリックス
とは別に作用して、脱保護のための酸の実際の量は少な
くなるが、本発明の高分子PAG工程ではPAG自体が脱保護
すべき基と接触していて、より多量の発生酸が脱保護反
応により関わる； 第三に、PAGが高分子主鎖に直接結合されていて、PAGが
工程中に発生する熱または化学物質に対して安定とな
り、コーティング中にドメインが形成されることなく最
小限の厚さの良質パターンを得ることができ、露光され
た光が底まで容易に到達し酸を発生させて、酸の拡散も
促進することができる； 第四に、パターン工程の後、高分子PAGをアルカリ性希
釈溶液を用いて洗浄することができるので経済的であ
る。
【００４４】以下、本発明を実施例によってさらに具体
的に説明する。これら実施例は専ら本発明を具体的に説
明するためのものであり、これら実施例により本発明の
技術的範囲を制限するものではない。
【００４５】実施例1：ペプチド核酸プローブの製造実施例1-1 ：ガラスプレート上へのリンカーの結合 顕微鏡用ガラスプレートをクレンジング溶液(95%エタノ
ール1L、水12mL、水酸化ナトリウム120g)に浸して、水
で数回洗浄した後、空気中で乾燥した。次いで、該ガラ
スプレートを95%エタノールで洗浄し、0.1%アミノプロ
ピルトリエトキシシランのエタノール溶液に浸し、室温
で5分間撹拌した後、再度95％エタノールを用いて3回洗
浄し、真空オーブンで120℃で20分間乾燥した。その
後、該ガラスプレートをアルゴンガス下で12時間放置し
て、DMF中に浸した後、ジクロロメタンで洗浄し、固体
マトリックスである顕微鏡用ガラスプレート上にアミン
基を固定させた。
【００４６】次に、0.1mMの6-N-t-ブトキシカルボニル
アミノカプロン酸および0.2mMのジイソプロピルエチル
アミンを含有する0.5mlのNMP溶液と、0.12mMのHATUを含
有するNMP溶液とを、2分間混合した。この溶液に前記固
体マトリックスを60℃で2時間撹拌しながら浸すことに
より、前記表面誘導体化されたガラスプレート上にリン
カーを結合させた。次いで、1:3(v/v)の無水酢酸/ピリ
ジン溶液中で1時間撹拌しながらインキュベートするこ
とによって、未反応のアミン基をアセチル基でキャッピ
ングした。
【００４７】実施例1-2：ペプチド核酸の結合 製造例2で収得した高分子PAGを最終濃度が30%(w/v)に達
するようにNMP中に溶解し、前記実施例1-1で調製された
酸に不安定な保護基を含有するリンカーが結合されたガ
ラスプレート上に3,000rpmでスピンコーティングした。
コーティングされたガラスプレートを80℃で1分間ソフ
トベーキングし、短波長白色光でフォトマスクを用いて
露光させ、再度80℃で3分間ベーキングし、そして酸を
発生させて露光された位置の保護基を選択的に除去し
た。
【００４８】次いで、除去された保護基とガラスプレー
ト上に残っている高分子PAGを、1%水酸化トリアルキル
アンモニウムで洗い流した。製造例3で調製したペプチ
ド核酸モノマー0.3gを含有するNMP溶液にジイソプロピ
ルエチルアミン0.3gを溶解させた溶液と、HATU0.4gを含
有する別のNMP溶液とを混合して2分間活性化させた。こ
の活性化溶液中に保護基が選択的に除去されたガラスプ
レートを2時間撹拌しながら浸して、ガラスプレート上
の脱保護化アミン基にペプチド核酸モノマーを結合させ
た。ガラスプレートを1:3(v/v)の無水酢酸/ピリジン溶
液中で1時間撹拌しながらインキュベートすることによ
り、未反応のアミン基をアセチル基でキャッピングし
た。
【００４９】次に、前記のように高分子PAGのコーティ
ング、フォトマスクを用いた露光、保護基の除去、アミ
ン基が保護されたペプチド核酸モノマーとの反応、なら
びにキャッピングの工程を繰り返して行い、ガラスプレ
ート上のペプチド核酸を所望の長さまで伸長させた。
【００５０】ガラスプレートの遊離反応基は、DMF中1mM
の蛍光イソチオシアネートと共に室温で1時間インキュ
ベートして蛍光標識し、DMF及びエタノールの順で洗浄
して、乾燥させて暗室に保管した。上記のガラスプレー
トを分光蛍光計分析し、10μ解像度で顕微鏡画像を得る
ことができる。
【００５１】以上で説明して立証したように、本発明は
DNAチップの製造に使用し得る固体マトリックス上に固
定化された多様なヌクレオチド配列を有するペプチド核
酸プローブのアレイを製造する方法を提供する。本発明
によると、従来のDNAチップの製造に使用されたPRシス
テムとPPAシステムの問題点を克服し、高分子光酸発生
剤を用いることによって、工程を単純化して効率を高め
ることができ、従来の負に荷電したオリゴヌクレオチド
プローブの有望な代替物として中性のペプチド核酸プロ
ーブを製造することができる。
【００５２】当業者であれば、本明細書で記載した本発
明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明に特
定の変化および変更を加えることができることを理解す
るだろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ムーン，ボン−セオク 大韓民国 305−390 テジョン，ユソン −グ，ジェオンミン−ドン，チョング− ナレ アパートメント 104−902 (72)発明者 パク，ジャエ−チャン 大韓民国 305−390 テジョン，ユソン −グ，ジェオンミン−ドン，セジョン アパートメント 103−802 (72)発明者 キム，ヨン−ヒー 大韓民国 305−390 テジョン，ユソン −グ，ジェオンミン−ドン，セジョン アパートメント 101−1307 (72)発明者 セオ，セウン−ジュー 大韓民国 305−390 テジョン，ユソン −グ，ジェオンミン−ドン，セジョン アパートメント 109−706 (56)参考文献 特開 平11−99000（ＪＰ，Ａ) 国際公開99／006591（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 C12M 1/00 C12M 1/34 C12N 15/09 G01N 37/00 102

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 高分子光酸発生剤を使用することにより
    固体マトリックス上に固定化されたペプチド核酸プロー
    ブのアレイの製造方法であって、以下の工程： (i)アミノアルキルオキシシランのアルコール溶液で固
    体マトリックスの表面を誘導体化し、固体マトリックス
    上に、酸に不安定な保護基を有するリンカーを結合させ
    る工程； (ii)前記固体マトリックスを高分子光酸発生剤(polymer
    ic photoacid generator；PAG)でコーティングする工
    程； (iii)前記コーティングされた固体マトリックスを露光
    させて酸を発生させることにより、酸に不安定な保護基
    を除去する工程； (iv)前記固体マトリックスをアルカリ性溶液または有機
    溶媒で洗浄することによって、残りの高分子光酸発生剤
    を除去する工程；および、 (v)前記固体マトリックスに、酸に不安定な保護基を有
    するモノマーペプチド核酸を結合させる工程、ならびに
    前記工程(ii)〜(v)を繰り返し行うこと、 を含む前記方法。
  2. 【請求項２】 前記固体マトリックスが有機溶媒に耐性
    のシリコン、表面誘導体化ガラス、ポリプロピレンまた
    は活性化アクリルアミドから作製されたプレートであ
    る、請求項１記載の固体マトリックス上に固定化された
    ペプチド核酸プローブのアレイの製造方法。
  3. 【請求項３】 前記固体マトリックスの表面が、0.05〜
    0.15%(v/v)のアミノアルキルオキシシランのアルコール
    溶液に浸し、室温で3〜7分間混合し、アルコールで洗浄
    して100〜140℃で10〜30分間乾燥させ、アルゴンガス下
    に10〜14時間放置し、そしてジメチルホルムアミド及び
    ジクロロメタンで洗浄して、固体マトリックスにアミン
    基を固定させることにより誘導体化される、請求項１記
    載の固体マトリックス上に固定化されたペプチド核酸プ
    ローブのアレイの製造方法。
  4. 【請求項４】 酸に不安定な保護基を有するリンカーが
    アミノアルキルカルボン酸である、請求項１記載の固体
    マトリックス上に固定化されたペプチド核酸プローブの
    アレイの製造方法。
  5. 【請求項５】 固体マトリックス上のアミン基へのリン
    カーの結合が、0.02〜0.2mMのアミノアルキルカルボン
    酸のNMP(N-メチルピロリドン)溶液および0.05〜0.5mMの
    ジイソプロピルエチルアミンと、0.05〜0.5mMのHATU(o-
    (7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3,-テトラ
    メチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)のNMP溶
    液とを混合し、1〜5分間活性化させ、前記固体マトリッ
    クスをこの活性化溶液中に浸して40〜90℃で30分〜4時
    間撹拌しながらインキュベートし、そしてそのようにイ
    ンキュベートした固体マトリックスを１：２〜１：４(v
    /v)の無水酢酸/ピリジン溶液中で0.5〜2時間撹拌しなが
    らインキュベートすることにより、マトリックス上の未
    反応アミン基をアセチル基でキャッピングする、ことに
    より実施される、請求項１記載の固体マトリックス上に
    固定化されたペプチド核酸プローブのアレイの製造方
    法。
  6. 【請求項６】 高分子光酸発生剤が分子量500〜1,000,0
    00を有する高分子であって、主鎖または側鎖にスルホニ
    ウム塩を有し、側鎖に有機光酸発生基を有することによ
    って、露光により酸を発生させる、請求項１記載の固体
    マトリックス上に固定化されたペプチド核酸プローブの
    アレイの製造方法。
  7. 【請求項７】 高分子PAGによる固体マトリックスのコ
    ーティングが、リンカー又はモノマーが結合した固体マ
    トリックスを、有機溶媒中5〜50％(w/v)の高分子PAGを
    用いて1,000〜5,000rpmの速度でスピンコーティングす
    ることにより実施される、請求項１記載の固体マトリッ
    クス上に固定化されたペプチド核酸プローブのアレイの
    製造方法。
  8. 【請求項８】 酸に不安定な保護基の除去が、コーティ
    ングされた固体マトリックスを50〜100℃で30秒〜2分間
    ソフトベーキングし、短波長白色光でフォトマスクを用
    いて30秒〜２分間露光させ、そして50〜100℃で30秒〜5
    分間再びベーキングして酸を発生させることによって実
    施される、請求項１記載の固体マトリックス上に固定化
    されたペプチド核酸プローブのアレイの製造方法。
  9. 【請求項９】 モノマーが、その主鎖に位置するアミン
    基がｔ-ブチルオキシカルボニル基で、塩基に位置する
    アミン基がp-メトキシベンゾイル基またはイソブタノイ
    ル基で保護されている化合物である、請求項１記載の固
    体マトリックス上に固定化されたペプチド核酸プローブ
    のアレイの製造方法。
  10. 【請求項１０】 工程(iv)のアルカリ性溶液が希釈水酸
    化トリアルキルアンモニウム、NaOH溶液またはKOH溶液
    である、請求項１記載の固体マトリックス上に固定化さ
    れたペプチド核酸プローブのアレイの製造方法。
  11. 【請求項１１】 工程(v)の酸に不安定な保護基を有す
    るペプチド核酸モノマーの、固体マトリックスへの結合
    が、ペプチド核酸モノマー10〜20μMを含有するNMP溶液
    と、核酸モノマーを基準にして、1:1〜1:5（重量比）の
    比で、ジイソプロピルエチルアミンおよび核酸モノマー
    を基準にして、1:1〜1:2（重量比）の比で、HATUを含有
    するNMP溶液を混合し、1〜5分間活性化させ、酸に不安
    定な保護基が除去された固体マトリックスを該活性化溶
    液中に浸し、50〜100℃で1〜3時間撹拌しながらインキ
    ュベートし、そして、そのようにインキュベートした固
    体マトリックスを1:2〜1:4(v/v)の無水酢酸/ピリジン溶
    液中で0.5〜2時間撹拌しながらインキュベートすること
    によりマトリックス上の未反応アミン基をアセチル基で
    キャッピングすることによって実施する、請求項１記載
    の固体マトリックス上に固定化されたペプチド核酸プロ
    ーブのアレイの製造方法。
JP2001501650A 1999-06-07 2000-06-07 高分子光酸発生剤を用いたペプチド核酸プローブの製造方法 Expired - Fee Related JP3448287B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1999/20899 1999-06-07
KR1019990020899A KR20010001577A (ko) 1999-06-07 1999-06-07 고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법
PCT/KR2000/000590 WO2000075372A1 (en) 1999-06-07 2000-06-07 A process for preparing peptide nucleic acid probe using polymeric photoacid generator

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2003501640A JP2003501640A (ja) 2003-01-14
JP3448287B2 true JP3448287B2 (ja) 2003-09-22

Family

ID=19590408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001501650A Expired - Fee Related JP3448287B2 (ja) 1999-06-07 2000-06-07 高分子光酸発生剤を用いたペプチド核酸プローブの製造方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US6359125B1 (ja)
EP (1) EP1105525B1 (ja)
JP (1) JP3448287B2 (ja)
KR (2) KR20010001577A (ja)
CN (1) CN1148456C (ja)
AT (1) ATE344332T1 (ja)
DE (1) DE60031635T2 (ja)
WO (1) WO2000075372A1 (ja)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6660479B2 (en) * 1999-06-07 2003-12-09 Samsung Electronics Co., Ltd. Process for preparing peptide nucleic acid probe using polymeric photoacid generator
US7560267B2 (en) * 2002-03-18 2009-07-14 City University Of Hong Kong Apparatus and methods for on-chip monitoring of cellular reactions
EP2112229A3 (en) 2002-11-25 2009-12-02 Sequenom, Inc. Methods for identifying risk of breast cancer and treatments thereof
US20040121339A1 (en) * 2002-12-19 2004-06-24 Jizhong Zhou Special film-coated substrate for bio-microarray fabrication and use thereof
JP2004337042A (ja) * 2003-05-14 2004-12-02 Canon Inc 核酸アレイ
JP4927319B2 (ja) * 2003-07-24 2012-05-09 韓国科学技術園 高密度カーボンナノチューブフィルムまたはパターンを用いたバイオチップの製造方法
KR100561842B1 (ko) * 2003-08-25 2006-03-16 삼성전자주식회사 단량체 광산발생제 조성물, 상기 조성물로 코팅된 기판,상기 단량체 광산발생제 조성물을 이용하여 기판상에서화합물을 합성하는 방법 및 상기 방법에 의하여 제조된마이크로어레이
CA2490675A1 (en) * 2003-12-22 2005-06-22 Affymetrix, Inc. Process for high-yield synthesis of standard length and long-mer nucleic acid arrays
US7638266B2 (en) * 2004-08-12 2009-12-29 International Business Machines Corporation Ultrathin polymeric photoacid generator layer and method of fabricating at least one of a device and a mask by using said layer
WO2007032236A1 (ja) * 2005-09-16 2007-03-22 Yamatake Corporation バイオチップ用基板、バイオチップ、バイオチップ用基板の製造方法、及びバイオチップの製造方法
US20070122842A1 (en) * 2005-11-30 2007-05-31 Rajasekaran John J Massively parallel synthesis of proteinaceous biomolecules
EP1979088A2 (en) 2005-12-29 2008-10-15 Affymetrix, Inc. Use of acid scavengers for the synthesis of standard length and long-mer nucleic acid arrays
US20070154946A1 (en) * 2005-12-29 2007-07-05 Rajasekaran John J Massively parallel synthesis of biopolymeric arrays
US20070224616A1 (en) * 2006-03-24 2007-09-27 Erdogan Gulari Method for forming molecular sequences on surfaces
KR100745990B1 (ko) 2006-07-17 2007-08-06 삼성전자주식회사 마이크로 어레이의 제조 방법
JP4850854B2 (ja) * 2007-03-22 2012-01-11 信越化学工業株式会社 マイクロアレイ作製用基板の製造方法
US8097422B2 (en) 2007-06-20 2012-01-17 Salk Institute For Biological Studies Kir channel modulators
KR100891098B1 (ko) * 2007-08-27 2009-03-31 삼성전자주식회사 바이오칩 및 그 제조 방법
EP3699291B1 (en) 2008-01-17 2024-08-07 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes and compositions
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
EP2391714B2 (en) 2009-01-30 2019-07-24 Whitehead Institute for Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
WO2010118243A2 (en) 2009-04-08 2010-10-14 Genentech, Inc. Use of il-27 antagonists to treat lupus
JP2010256034A (ja) * 2009-04-21 2010-11-11 Jsr Corp 樹脂組成物及びバイオチップの製造方法
JP2010256168A (ja) * 2009-04-24 2010-11-11 Jsr Corp バイオチップ製造用樹脂組成物及びバイオチップの製造方法
JP5597936B2 (ja) * 2009-05-13 2014-10-01 Ｊｓｒ株式会社 バイオチップ製造用樹脂組成物及びバイオチップの製造方法
JP5521389B2 (ja) * 2009-05-13 2014-06-11 Ｊｓｒ株式会社 バイオチップ製造用樹脂組成物及びバイオチップの製造方法
US20120190574A1 (en) 2009-06-19 2012-07-26 The Arizona Board of Regents, A body Corporate of the State of Arizona for and on behalf of Arizona Compound Arrays for Sample Profiling
JP2011013118A (ja) * 2009-07-02 2011-01-20 Jsr Corp 酸転写性樹脂組成物、バイオチップ及びバイオチップの製造方法
JP2011017798A (ja) * 2009-07-07 2011-01-27 Jsr Corp 酸転写性樹脂組成物、バイオチップの製造方法及びバイオチップ
WO2011087760A2 (en) 2009-12-22 2011-07-21 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
WO2011133931A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Genentech, Inc. Use of il-27 antagonists for treating inflammatory bowel disease
JP2012131718A (ja) 2010-12-20 2012-07-12 Samsung Electronics Co Ltd 化合物合成方法、マイクロアレイ、酸転写用組成物及びバイオチップ製造用組成物
WO2013131021A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Sequenom Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
AU2013266461A1 (en) 2012-05-21 2014-12-11 The Scripps Research Institute Ribosomal polynucleotides and related expression systems
AU2013290102B2 (en) 2012-07-13 2018-11-15 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US9588095B2 (en) 2012-07-24 2017-03-07 Massachusetts Institute Of Technology Reagents for oxidizer-based chemical detection
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
WO2014168711A1 (en) 2013-03-13 2014-10-16 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
US10816530B2 (en) 2013-07-23 2020-10-27 Massachusetts Institute Of Technology Substrate containing latent vaporization reagents
JP2016537965A (ja) 2013-10-11 2016-12-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｎｓｐ４阻害剤及び使用方法
WO2015138774A1 (en) 2014-03-13 2015-09-17 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2015154087A1 (en) 2014-04-04 2015-10-08 Massachusetts Institute Of Technology Reagents for enhanced detection of low volatility analytes
AU2016276981B2 (en) 2015-06-12 2022-10-06 Alector Llc Anti-CD33 antibodies and methods of use thereof
US11174313B2 (en) 2015-06-12 2021-11-16 Alector Llc Anti-CD33 antibodies and methods of use thereof
KR20180054639A (ko) 2015-08-28 2018-05-24 알렉터 엘엘씨 항-siglec-7 항체 및 이의 사용 방법
US10758886B2 (en) 2015-09-14 2020-09-01 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Conditioned surfaces for in situ molecular array synthesis
AU2016343987B2 (en) 2015-10-29 2023-11-23 Alector Llc Anti-Siglec-9 antibodies and methods of use thereof
US20190262794A1 (en) * 2015-12-28 2019-08-29 Vibrant Holdings, Llc Substrates, systems, and methods for nucleic acid array synthesis
EP3472181A4 (en) 2016-06-20 2020-05-13 Healthtell Inc. METHOD FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES
AU2017281039A1 (en) 2016-06-20 2019-01-24 Healthtell Inc. Methods for differential diagnosis of autoimmune diseases
US11371990B2 (en) 2016-11-11 2022-06-28 Cowper Sciences Inc. Methods for identifying candidate biomarkers
US11147249B2 (en) 2016-12-08 2021-10-19 Alector Llc Siglec transgenic mice and methods of use thereof
EP3625258A1 (en) 2017-05-16 2020-03-25 Alector LLC Anti-siglec-5 antibodies and methods of use thereof
US10538808B2 (en) 2017-05-26 2020-01-21 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
CN117700548A (zh) 2017-08-03 2024-03-15 艾利妥 抗cd33抗体及其使用方法
US12025615B2 (en) 2017-09-15 2024-07-02 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Methods of classifying response to immunotherapy for cancer
US11470827B2 (en) 2017-12-12 2022-10-18 Alector Llc Transgenic mice expressing human TREM proteins and methods of use thereof
JP7535495B2 (ja) 2018-07-27 2024-08-16 アレクトル エルエルシー 抗Ｓｉｇｌｅｃ－５抗体及びその使用方法
EP4038222A4 (en) 2019-10-02 2023-10-18 Arizona Board of Regents on behalf of Arizona State University METHODS AND COMPOSITIONS FOR IDENTIFYING NEOANTIGENS FOR USE IN THE TREATMENT AND PREVENTION OF CANCER
WO2021243271A2 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Front Range Biosciences, Inc. Methods and compositions for pathogen detection in plants
CA3188481A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Front Range Biosciences, Inc. Characterization of cannabis cultivars based on terpene synthase gene profiles

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5866304A (en) 1993-12-28 1999-02-02 Nec Corporation Photosensitive resin and method for patterning by use of the same
US5843655A (en) 1995-09-18 1998-12-01 Affymetrix, Inc. Methods for testing oligonucleotide arrays
US5658734A (en) * 1995-10-17 1997-08-19 International Business Machines Corporation Process for synthesizing chemical compounds
US6060242A (en) * 1997-02-27 2000-05-09 Lorne Park Research, Inc. PNA diagnostic methods
AU4218499A (en) * 1998-05-27 1999-12-13 Syntrix Biochip Light-mediated method and apparatus for the regional analysis of biologic material
JP2002531470A (ja) * 1998-12-01 2002-09-24 シントリクス バイオチップ， インコーポレイテッド 支持体表面上で化学反応のアレイを行うための方法および組成物

Also Published As

Publication number Publication date
US6359125B1 (en) 2002-03-19
CN1148456C (zh) 2004-05-05
KR20010053471A (ko) 2001-06-25
WO2000075372A1 (en) 2000-12-14
CN1313907A (zh) 2001-09-19
KR100429002B1 (ko) 2004-04-29
EP1105525A4 (en) 2003-07-30
EP1105525B1 (en) 2006-11-02
JP2003501640A (ja) 2003-01-14
KR20010001577A (ko) 2001-01-05
DE60031635D1 (de) 2006-12-14
DE60031635T2 (de) 2007-09-13
ATE344332T1 (de) 2006-11-15
EP1105525A1 (en) 2001-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3448287B2 (ja) 高分子光酸発生剤を用いたペプチド核酸プローブの製造方法
US6773888B2 (en) Photoactivatable silane compounds and methods for their synthesis and use
US6660479B2 (en) Process for preparing peptide nucleic acid probe using polymeric photoacid generator
US20070020676A1 (en) Method for manufacturing hydrogel biochip by using star-like polyethylene glycol derivative having epoxy group
US20230294064A1 (en) Substrates, systems, and methods for nucleic acid array synthesis
JP2003528301A (ja) マイクロアレイ応用のためのポリマー被膜表層
JP2001108683A (ja) Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法
JP2001128683A (ja) Ｄｎａ断片の固定方法、ｄｎａチップおよび核酸断片の検出方法
US20050101763A1 (en) Synthesis of photolabile 2-(2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl protected amino acids
JP3342695B2 (ja) 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具
JP3568197B2 (ja) 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具
KR100348868B1 (ko) 고분자 광산발생제를 이용한 고체기질 위에서의 염기함유 올리고머 합성방법
JP3975042B2 (ja) 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ
JP3857075B2 (ja) 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具
JP4054499B2 (ja) 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ
JP4184718B2 (ja) 反応性固相担体の製造方法
JP2004509323A (ja) 複製可能プローブアレー
JP2003530861A (ja) オリゴヌクレオチドを支持体に固定させる方法及びその方法によって製造されるオリゴヌクレオチドアレイ
JP2003194815A (ja) 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具
JP2001128697A (ja) Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片の固定方法および核酸断片の検出方法
JP2001178466A (ja) Ｄｎａ断片固定固相担体、ｄｎａ断片固定固相担体の製造方法および核酸断片試料の検出方法
JP2002365291A (ja) 反応性核酸断片及び相補性ｄｎａ断片検出用具の製造方法
JP2002365292A (ja) 反応性固相担体及びｄｎａ断片検出用具

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070704

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080704

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080704

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090704

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090704

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100704

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110704

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110704

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120704

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120704

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130704

Year of fee payment: 10

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees