JP2001165894A - 縫い込み型インターカレータ、核酸断片の検出方法、及び核酸断片の検出キット - Google Patents

縫い込み型インターカレータ、核酸断片の検出方法、及び核酸断片の検出キット

Info

Publication number
JP2001165894A
JP2001165894A JP34928599A JP34928599A JP2001165894A JP 2001165894 A JP2001165894 A JP 2001165894A JP 34928599 A JP34928599 A JP 34928599A JP 34928599 A JP34928599 A JP 34928599A JP 2001165894 A JP2001165894 A JP 2001165894A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleic acid
acid fragment
group
intercalator
analysis element
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP34928599A
Other languages
English (en)
Inventor
Yoshihiko Makino
快彦 牧野
Kazunobu Takahashi
和信 高橋
Makoto Takagi
誠 高木
Shigeori Takenaka
繁織 竹中
Kenichi Yamashita
健一 山下
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Holdings Corp
Original Assignee
Fuji Photo Film Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuji Photo Film Co Ltd filed Critical Fuji Photo Film Co Ltd
Priority to JP34928599A priority Critical patent/JP2001165894A/ja
Publication of JP2001165894A publication Critical patent/JP2001165894A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 完全な相補性を有する二本鎖核酸断片等の電
気化学的な検出において、特に有効に用いることが可能
な新規な電気化学活性縫い込み型インターカレータ、核
酸断片の検出方法及び核酸断片の検出キットを提供する
こと。 【解決手段】 下記一般式で表される縫い込み型インタ
ーカレータ。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、基板上に固定され
た核酸断片と相補性を有する核酸断片の電気化学的な検
出に利用するのに特に有効な電気化学活性な縫い込み型
インターカレータに関する。
【０００２】
【従来の技術】生物学や医学分野での遺伝子発現のモニ
タリング、核酸の塩基配列の決定、遺伝子変異解析、遺
伝子多型解析等においては、特定の配列を有する核酸を
検出する方法として、サザンハイブリダイゼーション法
に代表されるハイブリダイゼーション法が用いられてい
る。サザンハイブリダイゼーション法を含めた従来法
は、何れも標識としてＲＩを用いる。サザンハイブリダ
イゼーション法では、ＲＩの代わりに蛍光を用いる手法
も知られており、同様に蛍光を標識手段として用いるＤ
ＮＡチップ（ＤＮＡアレイ）技術も既に実用化されてい
る。標識手段として蛍光を用いる方法は、蛍光の内部消
光のために、一定以上の蛍光物質を標識として導入する
ことは困難であるという欠点を有するものの、アトモル
のレベルの解析が可能な点で非常に有効な方法である。
【０００３】一方、特開平９−２８８０８０号公報に
は、標識手段として導電性物質を使用する方法が開示さ
れている。この方法では、電極に、フェロセンカルボン
酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで標識された
ＤＮＡ断片、あるいは標識されていないＤＮＡ断片を電
極に固定し、ここに、酸化還元活性を有する下記式で表
される縫い込み型インターカレータ、および試料ＤＮＡ
断片を接触させると、形成されるハイブリッドＤＮＡに
インターカレータが特異的に挿入するため、電位の印加
によりフェロセン分子間に流れる電流量を測定すること
ができる。
【０００４】
【化２】
【０００５】上記記載の縫い込み型インターカレータ
は、ナフタレンジイミド構造をコアとし、その両側に直
鎖状のリンカー部分を有し、そして、リンカー部分の端
部には酸化還元活性を持つフェロセン分子を有する。Ｄ
ＮＡ断片に相補性を有する試料ＤＮＡ断片の検出では、
ハイブリッドＤＮＡに挿入されている縫い込み型インタ
ーカレータに電位を印加して得られる電流量は、ＤＮＡ
断片、試料ＤＮＡ断片、測定緩衝液の塩濃度等の条件に
よって異なると考えられるが、約４５０乃至約６２０ｍ
Ｖの範囲にある電位を印加した場合にピーク値を示すた
め、通常、そのピーク電流値を与える電位を印加するこ
とによって行われる。一方、縫い込み型インターカレー
タについては、リンカー部分の構造を変化させることに
よって、主にフェロセン分子の酸化還元電位を変化させ
ることができると考えられている。そこで、リンカー部
分の構造を変えた、上記記載の化合物と異なる新規な縫
い込み型インターカレータを設計・製造することは、試
料ＤＮＡ断片の検出において非常に重要である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、完全な相補
性を有する二本鎖核酸断片、部分的に相補性を有する二
本鎖核酸断片等の電気化学的な手法による検出におい
て、特に有効に用いることが可能な新規な電気化学活性
縫い込み型インターカレータ、核酸断片の検出方法、お
よび核酸断片の検出キットを提供することを、その課題
とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、下記一般式：
【０００８】
【化３】
【０００９】［式中、ＲおよびＲ1は、互いに独立に、
水素原子、そして、置換基を有していてもよい炭素原子
数が１乃至３のアルキル基、炭素原子数が２乃至４のア
シル基、炭素原子数が６乃至２０のアリール基および炭
素原子数が１乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が
７乃至２３のアラルキル基からなる群より選ばれる原子
もしくは基を表し；ＹおよびＹ1は、互いに独立に、−
ＮＨ−ＣＯ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−を表し；Ｅおよび
Ｅ1は、互いに独立に、置換基を有していてもよい一つ
の結合手を有するフェロセンを表し；ＸおよびＺは、互
いに独立に、水素原子、ハロゲン原子、あるいは炭素原
子数が１乃至６のアルキル基を表し；そして、ｍ、ｎ、
ｋおよびｐは、各々、１乃至６の整数を表す；但し、ｍ
とｎとの和、およびｋとｐとの和は、各々、４乃至８で
ある］で表される縫い込み型インターカレータにある。
【００１０】本発明の縫い込み型インターカレータの好
ましい態様は以下の通りである。 （イ）ＲとＲ1、ＹとＹ1、およびＥとＥ1とが、それぞ
れ互いに、同一の基を表し、そして、ｍとｋ、およびｎ
とｐとが、それぞれ互いに、同一の数である。 （ロ）Ｒが、メチル基であり、そして、Ｙが−ＮＨ−Ｃ
Ｏ−基である。 （ハ）ｍおよびｎが、共に３である。
【００１１】本発明は、また、基板表面に区画された一
つまたは複数の領域のそれぞれに核酸断片が一端で固定
されてなる電気化学分析素子に、核酸断片を溶解もしく
は分散してなる水性液を本発明の縫い込み型インターカ
レータの存在下に接触させることにより、該水性液中
の、該分析素子に固定されている核酸断片と相補性を有
する核酸断片を結合させると共に、該縫い込み型インタ
ーカレータの存在下で、該分析素子に４００乃至６００
ｍＶの範囲の電位を印加し、該分析素子と該縫い込み型
インターカレータとの間を流れる電流量を測定すること
を特徴とする相補性を有する核酸断片の検出方法にもあ
る。
【００１２】本発明は、さらに、（１）基板表面に区画
された一つまたは複数の領域のそれぞれに核酸断片が一
端で固定されてなる電気化学分析素子に、核酸断片を溶
解あるいは分散してなる水性液を接触させ、本発明の縫
い込み型インターカレータの存在下にて、該分析素子に
４００乃至６００ｍＶの範囲の電位を印加することによ
り、該縫い込み型インターカレータと該分析素子との間
を流れる電流量を測定する工程；（２）該電気化学分析
素子に、電気化学分析素子に固定されている核酸断片と
相補性を有する核酸断片を溶解あるいは分散してなる水
性液を接触させ、（１）と同じ操作を行うことによって
電流量を測定する工程；そして、（３）上記の工程
（１）と工程（２）のそれぞれで測定された電流量を比
較することによって、工程（１）で用いた核酸断片が、
工程（２）で用いた相補性核酸断片と塩基配列に関して
部分的に同一性を有するものであるか否かを検出する方
法にもある。
【００１３】本発明の検出方法は、好ましくは、電気化
学分析素子に固定されている核酸断片として、その塩基
配列が既知のものを用いる、または水性液中の核酸断片
として、その塩基配列が既知のものを用いる。
【００１４】本発明は、さらにまた、基板表面に区画さ
れた一つまたは複数の領域のそれぞれに核酸断片が一端
で固定されてなる電気化学分析素子、および本発明の縫
い込み型インターカレータを組み合わせてなる核酸断片
の検出キットにもある。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明の新規な縫い込み型インタ
ーカレータを下記一般式（Ｉ）で示す。
【００１６】
【化４】（Ｉ）
【００１７】上記式中、Ｎ−置換−イミノ基は、縫い込
み型インターカレータに可溶性を付与する基であり、Ｒ
およびＲ1は、互いに独立に、水素原子、そして、置換
基を有していてもよい炭素原子数が１乃至３のアルキル
基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭素原子数が６
乃至２０のアリール基および炭素原子数が１乃至３のア
ルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキル
基からなる群より選ばれる原子もしくは基を表す。炭素
原子数が１乃至３のアルキル基としては、メチル基もし
くはエチル基であることが好ましく、メチル基であるこ
とが特に好ましい。炭素原子数が２乃至４のアシル基と
しては、アセチル基であることが好ましい。炭素原子数
が６乃至２０のアリール基としては、フェニル基もしく
はナフチル基であることが好ましく、フェニル基である
ことが特に好ましい。炭素原子数が１乃至３のアルキル
基を有する炭素原子数が７乃至２３のアラルキル基とし
ては、ベンジル基であることが好ましい。ＲおよびＲ1
は、同一の原子もしくは基であることが好ましく、メチ
ル基であることが特に好ましい。
【００１８】置換基としては、ヒドロキシル基、ハロゲ
ン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、カルボキシル基、炭素原
子数が１乃至６のアルキル基、炭素原子数が１乃至６の
アルキルアミノ基、炭素原子数が１乃至６のハロゲン化
アルキル基、炭素原子数が６乃至１２のアリール基、お
よび炭素原子数が１乃至６のアルコキシ基からなる群よ
り選ばれる原子もしくは基を挙げることができる。置換
基の数は、炭素原子数が１乃至６のアルキル基、炭素原
子数が１乃至６のアルキルアミノ基、炭素原子数が１乃
至６のハロゲン化アルキル基、あるいは炭素原子数が１
乃至６のアルコキシ基については、１乃至１２個である
ことが好ましく、１乃至３個であることさらに好まし
く、１個であることが特に好ましい。炭素原子数が６乃
至１２のアリール基については、その数は１乃至７個で
あることが好ましく、１乃至３個であることがさらに好
ましく、１個であることが特に好ましい。
【００１９】ＹおよびＹ1は、互いに独立に、−ＮＨ−
ＣＯ−基もしくは−ＣＯ−ＮＨ−基を表し、−ＮＨ−Ｃ
Ｏ−基であることが好ましい。これらの基のカルボニル
基もしくはイミノ基が、それぞれ、ＥおよびＥ1と結合
する。
【００２０】ＥおよびＥ1は、互いに独立に、一つの結
合手を有するフェロセンを表す。当該フェロセンは、置
換基を有していても有していなくてもよい。置換基を有
している場合には、同一であることが好ましい。以下
に、置換基を有するフェロセンの具体例を示す。置換基
の位置は、シクロペンタジエニル基の何れの位置であっ
てもよい。
【００２１】
【化５】
【００２２】ＸおよびＺは、互いに独立に、水素原子、
ハロゲン原子、あるいは炭素原子数１乃至６のアルキル
基を表すが、水素原子であることが好ましい。炭素原子
数１乃至６のアルキル基の好ましい例としては、前記記
載のＲ（もしくはＲ1）と同様である。
【００２３】ｍ、ｎ、ｋおよびｐは、縫い込み型インタ
ーカレータのリンカー部分の長さを決定するものであ
り、各々、１乃至６の整数を表す。但し、ｍとｎとの
和、およびｋとｐとの和は、各々、４乃至８である。ｍ
とｋ、およびｎとｐとは、それぞれ、同一の数であるこ
とが好ましく、ｍ、ｎ、ｋおよびｐは、何れも３である
ことが特に好ましい。
【００２４】本発明の縫い込み型インターカレータは、
例えば、下記一般式（ＩＩ）で表されるジアミンを原料
として公知の方法（特開平９−２８８０８０号公報）に
よって簡便に収率良く製造することができる。
【００２５】
【化６】（ＩＩ）
【００２６】上記式中、Ｒ2、ａおよびｂは、それぞ
れ、一般式（Ｉ）のＲ、ｍ、ｎと同義である。本発明の
縫い込み型インターカレータは、一般式（ＩＩ）で表さ
れる原料が安価で入手し易く、また、特開平９−２８８
０８０号公報に記載の方法で安価に製造することができ
るという利点を有する。また、一般式（ＩＩ）の化合物
を出発物質とする下記式で表される合成ルートによって
も安価に、かつ収率良く製造することができる。但し、
本発明の縫い込み型インターカレータの製造方法は、特
開平９−２８８０８０号公報に記載の方法および下記合
成ルートに限定されない。
【００２７】
【化７】
【００２８】上記合成ルートは、反応＜ａ＞、＜ｂ＞、
および＜ｃ＞からなる。上記合成ルートにおいて、Ｌ1
は、−（ＣＨ2）a−Ｎ（Ｒ2）−（ＣＨ2）b−に限定す
る。一般式（ＩＩ）の化合物を二種類以上使用し、ナフ
タレンジイミド構造（コア）に対して互いに異なるリン
カー部分を縮合させてもよいが、本合成ルートでは、代
表的な製造方法を示すこととし、一般式（ＩＩ）の化合
物を一種類に限定する。Ｑは、単結合に限定する。Ｅ、
ＸおよびＺは、一般式（Ｉ）で説明したそれぞれの記号
と同様である。
【００２９】以下、それぞれの反応について分説する。
【００３０】上記一般式（４）の化合物Ａ−ＮＨ−Ｌ1
−ＮＨ2は、上記一般式（５）で表される公知のジアミ
ンより、公知の方法（Green T.W.,Wuts.P.G.M,Protecti
ve Groups in Organic Synthesis(2nd Edition,Wiley,N
ew York,1991,315-345,349-358）に準じて製造すること
ができる。Ａは、炭素原子数が２乃至５のアシル基、炭
素原子数が２乃至５のアルコキシカルボニル基および置
換基を有していてもよいベンゾイル基もしくはベンジル
オキシカルボニル基からなる群より選ばれる基であるこ
とが好ましく、アセチル基、ｔ−ブチルカルボニル基
（ピバロイル基）、ｔ−ブトキシカルボニル基もしくは
置換基を有していてもよいベンジルオキシカルボニル基
であることが特に好ましい。ベンゾイル基もしくはベン
ジルオキシカルボニル基が有していてもよい置換基とし
ては、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭素原子数が１乃
至６のアルキル基、および炭素原子数が１乃至６のアル
コキシ基からなる群より選ばれる原子もしくは基を挙げ
ることができる。置換基の数は、１乃至５個であること
が好ましく、１個であることが特に好ましい。
【００３１】一般式（４）の保護アミンは、一般的に
は、ジアミン（５）に、Ａに対応する酸ハライド、もし
くはＡに対応する酸無水物を反応させることによって得
ることができる。Ａに対応する酸ハライド、もしくはＡ
に対応する酸無水物としては、ベンゾトリアゾール−１
−イル−オキシ（ＯＢｔ）基、スクシンイミジルオキシ
（ＯＳｕ）基、３−チアゾリジン−２−チオン基等を脱
離基として有する反応試薬であることが好ましい。この
ような試薬としては、３−ベンジルオキシカルボニル−
１，３−チアゾリジン−２−チオンを用いることが特に
好ましい。上記反応試薬に対して、ジアミン（５）を過
剰量加えることが好ましく、その割合は、３乃至１０倍
モルの範囲にあることが特に好ましい。
【００３２】反応は、塩基を用いて行ってもよい。有機
塩基としては、ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプ
ロピルエチルアミン等を挙げることができる。無機塩基
としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水
素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等を挙げ
ることができる。塩基の添加量の割合は、酸ハライド等
の反応試薬に対して、０．１倍乃至大過剰モルの範囲に
あることが好ましく、１乃至１０倍モルの範囲にあるこ
とが特に好ましい。
【００３３】反応は、下記の溶媒中にて実施することが
好ましいが、無溶媒で実施することもできる。溶媒とし
ては、原料もしくは生成物の全部あるいは一部を溶解す
ることができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であ
れば何れの溶媒であってもよい。具体的には、アルコー
ル類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロピル
アルコール、エチレングリコール等）、アミド類（例え
ば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ア
セトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等）、ニトリル類
（例えば、アセトニトリル、ｎ−ブチロニトリル）、エ
ーテル類（例えば、エチレングリコールモノメチルエー
テル、エチレングリコールモノエチルエーテル、テトラ
ヒドロフラン、ジオキサン等）、ジメチルスルホキシ
ド、スルホランおよび水を挙げることができる。これら
の溶媒を二種類以上混合して用いてもよい。反応は、冷
却下でも加熱下でも行うことができるが、その温度は、
−５０乃至１５０℃の範囲にあることが好ましく、−１
０乃至１００℃の範囲にあることがさらに好ましく、０
乃至５０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００３４】一般式（３）の化合物Ａ−ＮＨ−Ｌ1−Ｎ
ＨＣＯ−Ｑ−Ｅは、一般式（４）の保護アミンと、ＭＯ
2Ｃ−Ｑ−Ｅ、あるいはＭ1ＯＣ−Ｑ−Ｅとを縮合させる
ことによって製造することができる（反応＜ａ＞）。Ｍ
は、水素原子、アルカリ金属原子（ナトリウム、カリウ
ム等）、あるいは窒素原子に結合手を有するイミド基を
表す。窒素原子に結合手を有するイミド基としては、ス
クシンイミド基、フタルイミド基、グルタルイミド基等
を挙げることができる。Ｍ1は、活性基を表し、ハロゲ
ン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ等）、−ＳＯ2Ｃｌ基、あるい
は後述する縮合剤との反応中間体の該当する基であるこ
とが好ましい。
【００３５】反応＜ａ＞は、一般的には、アミノ基とカ
ルボン酸基との縮合反応である。縮合反応は、Larock
R.C.,Comprehensive Organic Transformations(VCH,New
York,1989,972-976)に記載されている方法により行う
ことができる。縮合反応は、縮合剤を用いて行うことが
好ましい。縮合剤としては、１，３−ジシクロヘキシル
カルボジイミド、１−エチル−３−（３’−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド等を用いることが好まし
い。反応は、溶媒の存在下で行うことが好ましい。溶媒
としては、原料もしくは生成物の全部あるいは一部を溶
解することができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒
であれば何れの溶媒であってもよい。具体的には、前述
の反応＜ａ＞で示した有機溶媒に加え、ハロゲン系溶媒
（ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエ
タン等）、およびエステル類（酢酸エステル等）を挙げ
ることができる。これらの有機溶媒を混合して用いても
よく、水、あるいは水とこれらの有機溶媒との混合溶媒
も好ましく用いることができる。この反応では、一般式
（４）の化合物に対して、例えば、一般式（６）のカル
ボン酸を過剰量加えることが好ましく、その割合は、１
乃至２倍モルの範囲にあることが好ましい。また、一般
式（４）の化合物に対しては、Ｍ1ＯＣ−Ｑ−Ｅの化合
物を、過剰量加えることが好ましく、その割合は、１乃
至３倍モルの範囲にあることが好ましい。
【００３６】縮合剤として、１，３−ジシクロヘキシル
カルボジイミド、１−エチル−３−（３’−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド等を用いる場合には、さ
らに、酸性の添加剤もしくは塩基性の添加剤を用いても
よい。酸性の添加剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド、Ｎ−ヒドキシベンゾトリアゾール、もしくは
３，４−ジヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベン
ゾトリアジンを用いることが好ましい。塩基性の添加剤
としては、第三アミン、例えば、トリエチルアミン、ピ
リジン、もしくは４−ジメチルアミノピリジンを用いる
ことが好ましい。添加剤の添加量は、縮合剤に対して、
０．１倍乃至大過剰モルの範囲にあることが好ましく、
１乃至３倍モルの範囲にあることが特に好ましい。反応
は、冷却下でも加熱下でも行うことができるが、その温
度は、−５０乃至１５０℃の範囲にあることが好まし
く、−１０乃至１００℃の範囲にあることがさらに好ま
しく、０乃至５０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００３７】反応＜ｂ＞は、アミノ基の脱保護反応であ
る。保護基Ａにより脱保護の条件を決定する。一般的に
は、Protective Groups in Organic Synthesisに記載さ
れている条件を用いることができる。その中でも、ヨー
ドトリメチルシランを用いる方法が特に好ましい。この
反応は、下記の溶媒中にて実施することが好ましいが、
無溶媒で実施することもできる。溶媒としては、原料も
しくは生成物の全部あるいは一部を溶解することがで
き、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であれば何れの
溶媒であってもよい。具体的には、ハロゲン系溶媒（例
えば、ジクロロメタン、ジクロロエタン等）、ニトリル
類（例えば、アセトニトリル、ｎ−ブチロニトリル
等）、エーテル類（テトラヒドロフラン、ジオキサン
等）、芳香族系溶媒（トルエン、ベンゼン等）、および
これらの混合溶媒を挙げることができる。この反応で
は、一般式（３）の化合物に対してヨードトリメチルシ
ランを過剰量加えることが好ましく、その割合は、１乃
至１０倍モルの範囲にあることが好ましい。反応は、冷
却下でも加熱下でも行うことができるが、その温度は、
−５０乃至１５０℃の範囲にあることが好ましく、−１
０乃至１００℃の範囲にあることがさらに好ましく、０
乃至５０℃の範囲にあることが特に好ましい。
【００３８】反応＜ｃ＞は、コア部分に相当するナフタ
レンジイミド構造（７）に、一般式（２）の化合物を側
鎖として脱水縮合させ、一般式（１）の化合物を得る反
応である。コア部分に相当するナフタレンジイミドの原
料としては、一般的に、１，４，５，８−ナフタレン四
カルボン酸二無水物を用いることが好ましい。反応は、
原料もしくは生成物の全部あるいは一部を溶解すること
ができ、かつ、反応に実質的に不活性の溶媒であること
を条件に、前述の反応＜ａ＞、＜ｂ＞および＜ｃ＞で示
した有機溶媒、あるいはこれらの混合溶媒を用いること
ができる。反応では、１，４，５，８−ナフタレン四カ
ルボン酸二無水物に対して、一般式（２）の化合物を２
当量以上加えることが好ましい。使用する溶媒によって
は、（２）の化合物の量は、２当量以下であってもよ
い。反応は、冷却下でも加熱下でも行うことが、０℃乃
至使用溶媒の沸点の温度範囲にて行うことが特に好まし
い。
【００３９】次に、本発明の縫い込み型インターカレー
タを用いて核酸断片を検出する方法について述べる。
【００４０】本発明の核酸断片の検出方法は、以下の工
程を含む。（１）電気化学分析素子に、核酸断片が溶解
もしくは分散してなる水性液を、前記記載の本発明の縫
い込み型インターカレータの存在下に接触させる工程で
ある。ここで、電気化学分析素子とは、導電性を付与さ
れた基板表面に区画された一つまたは複数の領域のそれ
ぞれに核酸断片が一端で固定されてなる分析素子をい
う。次に（２）該水性液中の、電気化学分析素子に固定
されている核酸断片と相補性を有する核酸断片を結合さ
せると共に、該縫い込み型インターカレータを挿入させ
る工程である。そして、（３）電気化学分析素子の導電
性部分、好ましくは電極に電位を印加し、分析素子の電
極と該縫い込み型インターカレータとの間を流れる電流
量を測定する工程である。
【００４１】基板表面上に区画された一つまたは複数の
領域とは、導電性を持たない基板上に配置された領域を
いう。領域が複数個である場合には、それらは互いに接
しないように、かつ規則的に配置されていることが好ま
しい。基板表面に区画された一つまたは複数の領域は、
核酸断片の固定および導電性の付与のため、その表面が
予め処理されている。金、炭素、グラシーカーボン等で
処理されていることが好ましく、金で蒸着処理されてい
ることが特に好ましい。基板表面上に区画された一つま
たは複数の領域には、金、炭素等で表面処理をする前
に、電荷を有する親水性の高分子物質等からなる層や架
橋剤からなる層を設けてもよい。このような層を設ける
ことによって表面処理後の領域の凹凸を軽減することが
できる。従って、基板表面に区画された、導電性を付与
された一つまたは複数の領域とは、表面処理がなされた
導電性を有する領域である。
【００４２】基板としては、電気絶縁性の疎水性担体、
あるいは電気絶縁性の低親水性の担体であることが好ま
しい。また、その表面が凹凸を有する平面性の低いもの
であっても好ましく用いることができる。基板の材質と
しては、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックスも
しくはニューセラミックス、ポリエチレンテレフタレー
ト、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネ
ート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポ
リマー、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラ
ミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不
織布、濾紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質
物質などを挙げることができる。多孔質物質の細孔の大
きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にあることが好まし
く、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが特に好まし
い。基板の材質は、上記記載の各種ポリマー、ガラスも
しくはシリコンであることが特に好ましい。これは、表
面処理の容易さや電気化学的方法による解析の容易さに
よるものである。基板の厚さは、特に限定されないが、
板状である場合には、１００乃至１００００μｍの範囲
にあることが好ましい。
【００４３】導電性を有する一つまたは複数の領域が備
えられた基板としては、文献（Sosnowski,R.G. et al.:
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,1119-1123(1997))に記載の
シリコンチップのような、基板表面に電極を一つまたは
複数配置したものも好ましく用いることができる。電極
としては、金属、合金、金属酸化物、半導体等を挙げる
ことができる。電極の他には、導線であってもよく、プ
リント配線基板のように、電極や導線が基板上の印刷さ
れてなるものであってもよい。
【００４４】核酸断片の固定方法としては、公知の方法
を用いることができる。基板表面に区画された一つまた
は複数の領域が金で蒸着処理されている場合には、核酸
断片の５’もしくは３’末端にメルカプト基を導入し、
金とイオウとの配位結合を介して、核酸断片を該領域に
固定する。核酸断片にメルカプト基を導入する方法は、
文献(M.Maeda et al.,Chem.Lett.,1805~1808(1994)およ
びB.A.Connolly,Nucleic Acids Res.,13,4484(1985))に
記載されている。基板表面に区画された一つまたは複数
の領域がグラシーカーボンで塗布処理されている場合に
は、そのグラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸
化することによって、該領域にカルボン酸基が導入され
るため、核酸断片は、アミド結合により該領域に固定さ
れる。実際の固定化方法については、文献(K.M.Millan
et al.,Analytical Chemistry,65,2317~2323(1993))に
詳細が記載されている。
【００４５】核酸断片は、ＤＮＡ断片およびＲＮＡ断片
の何れも用いることができる。本発明の検出方法では、
基板上の領域に固定される核酸断片が試料核酸断片であ
っても、電気化学分析素子に接触させることによってハ
イブリダイゼーションさせる核酸断片が試料核酸断片で
あってもよい。以下、基板上の領域に固定する核酸断片
をＤＮＡ断片、ハイブリダイゼーションに用いる核酸断
片を試料核酸断片と仮定する。
【００４６】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する。Ｐ
ＣＲ法によって増幅しないものも好ましく使用すること
ができる。また、遺伝子の変異や多型を調べるには、標
準となる既知の配列をもとにして、変異や多型に対応す
る種々のオリゴヌクレオチドを合成し、これを使用する
ことが好ましい。さらに、塩基配列分析の場合には、４
n（ｎは、塩基の長さ）種のオリゴヌクレオチドを合成
したものを使用することが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基
配列は、一般的な塩基配列決定法によって予めその配列
が決定されていることが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃
至５０量体であることが好ましく、１０乃至２５量体で
あることが特に好ましい。
【００４７】核酸断片の固定は、核酸断片が溶解あるい
は分散されてなる水性液を基板上の領域に点着して行う
ことが好ましい。点着後、所定の温度（好ましくは、室
温）でそのまま数時間放置すると核酸断片の一端が基板
上の領域に固定される。点着後、必要に応じてインキュ
ベーションを行ってもよい。点着の条件は、使用する基
板の種類、大きさ等によって異なる。点着は、マニュア
ル操作によっても行うことができるが、ＤＮＡチップ作
製装置に装備されたスポッター装置を用いて行うことも
好ましい。即ち、基板表面に区画された一つまたは複数
の領域に、スポッター装置を用いて核酸断片の水性液を
スポットすることも好ましい。
【００４８】上記の工程によって作製された電気化学分
析素子の寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡ電
気化学分析素子で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてな
るオリゴＤＮＡ電気化学分析素子ではさらに長期間であ
る。これらの電気化学分析素子は、遺伝子発現のモニタ
リング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等に利用
される。検出原理は、後述する、試料核酸断片とのハイ
ブリダーゼーションである。
【００４９】試料核酸断片としては、その配列や機能が
未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ断片試料を用
いることが好ましい。試料核酸断片は、遺伝子発現を調
べる目的では、真核生物の細胞や組織サンプルから単離
することが好ましい。試料がゲノムならば、赤血球を除
く任意の組織サンプルから単離することが好ましい。赤
血球を除く任意の組織は、抹消血液リンパ球、皮膚、毛
髪、精液等であることが好ましい。試料がｍＲＮＡなら
ば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプルから抽出するこ
とが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応によりｃＤＮＡ
とすることが好ましい。１回のハイブリダイゼーション
に必要なｍＲＮＡ量としては、測定条件によって異なる
が、数μｇ以下を用いることが好ましい。電気化学分析
素子上の核酸断片がオリゴＤＮＡである場合には、試料
核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。
【００５０】ハイブリダイゼーションは、試料核酸断片
が溶解あるいは分散してなる水性液を、電気化学分析素
子上に点着することによって実施することが好ましい。
ハイブリダイゼーションは、室温乃至７０℃の温度範囲
で、そして０．５乃至２０時間の範囲で実施することが
好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、蒸留水、緩
衝液、またはそれらと界面活性剤との混合溶液を用いて
洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去することが好
ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、
クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス
緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエ
ン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。
【００５１】ハイブリダイゼーションは、本発明の縫い
込み型インターカレータの存在下にて行うことが好まし
い。縫い込み型インターカレータは、一般的に、電気化
学分析素子上の核酸断片と試料核酸断片とで形成される
ハイブリッドＤＮＡ（電気化学分析素子上の核酸断片お
よびハイブリダイゼーションに供される核酸断片の種類
を問わず、形成される二本鎖核酸断片を「ハイブリッド
ＤＮＡ」とする。）に高い特異性で挿入されるため、電
位を印加することにより、電気化学分析素子とインター
カレータとの間を流れる電流量を測定することによっ
て、相補性を有する試料核酸断片を検出することができ
る。印加電位は、１００乃至７００ｍＶの範囲にあるこ
とが好ましく、４００乃至６００ｍＶの範囲にあること
が特に好ましい。
【００５２】本発明の縫い込み型インターカレータは、
部分相補性核酸断片を検出する方法にも使用することが
できる。部分相補性核酸断片とは、核酸断片Ａに対して
相補性を有する核酸断片をＢとしたときに、核酸断片Ｂ
と塩基配列が部分的に同一性（即ち、部分的に非同一
性）を示す核酸断片をいう。このような核酸断片として
は、核酸断片Ｂに関して塩基欠損、塩基挿入等の塩基配
列の変化を有する核酸断片を挙げることができる。部分
相補性核酸断片の検出方法は、特に遺伝子診断分野での
未知の異常遺伝子の探索・同定に重要な手法である。詳
細が特願平１１−１５９３３９号の明細書に記載されて
いる。
【００５３】本発明の縫い込み型インターカレータを用
いて、部分相補性核酸断片を検出する本発明の方法は、
以下の工程を含む。即ち、（１）電気化学分析素子に、
核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液を接触さ
せ、本発明の縫い込み型インターカレータの存在下に
て、該分析素子に電位を印加することにより、該インタ
ーカレータと該分析素子との間を流れる電流量を測定す
る工程；（２）電気化学分析素子に固定されている核酸
断片と相補性を有する核酸断片を用いて（１）の操作を
行うことによって電流量を測定する工程；そして、
（３）上記の工程（１）と工程（２）のそれぞれで測定
された電流を比較することによって、工程（１）で用い
た核酸断片が、工程（２）で用いた相補性核酸断片に関
して部分相補性核酸断片であることを検出する工程であ
る。
【００５４】上記方法で使用する核酸断片、電気化学分
析素子、印加する電位、および検出原理については、前
記記載の相補性を有する核酸断片の検出方法の記載と同
様である。本発明の検出方法では、電気化学分析素子上
に固定されている核酸断片が部分相補性核酸断片であっ
ても、水性液中に含まれる核酸断片が部分相補性核酸断
片であってもよい。工程（１）および工程（２）でそれ
ぞれ得られる電流値間には有効な差を生じるため、部分
相補性核酸断片とのハイブリッドＤＮＡ（ミスマッチ構
造のハイブリッドＤＮＡ）を容易に検出することがで
き、このことは、部分相補性核酸断片を容易に検出する
ことができることを示す。
【００５５】本発明の核酸断片の検出キットは、電気化
学分析素子、および本発明の縫い込み型インターカレー
タとを組み合わせてなる。本発明の検出キットは、遺伝
子分野の研究に携わる使用者によって特に有効に使用さ
れる。
【００５６】
【実施例】［製造例１］ Ｎ，Ｎ’−ビス（７−フェロセンカルボン酸アシド−４
−メチル−４−アザヘプチル）ナフタレンジイミドの製
造
【００５７】
【化８】
【００５８】（１）Ｎ−１−ベンジロキシカルボニル−
１，７−ジアミノ−４−メチル−４−アザヘプタンの製
造 ジ（３−アミノプロピル）−Ｎ−メチルアミン（７３．
０ｇ、５００ミリモル）をジクロロメタン（４００ｍ
Ｌ）に溶解し、ここに、３−ベンジロキシカルボニル−
１，３−チアゾリジン−２−チオン（Synthesis,1990,2
7）（１２．８ｇ、５０ミリモル）のジクロロメタン
（１００ｍＬ）溶液を滴下し、室温にて３時間攪拌し
た。次いで、生成した沈殿を濾別し、濾液に酢酸エチル
と水とを加えて、酢酸エチルで二度抽出した。酢酸エチ
ル層を水および飽和食塩水で洗浄後、１規定塩酸水溶液
で二度抽出し、得られた水層を酢酸エチルで洗浄した。
水層を冷却しながら、ここに、６規定水酸化ナトリウム
水溶液を加えて、ｐＨを９乃至１０に調整し、酢酸エチ
ルにて抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、
無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、溶媒を留去し、標題化
合物を黄色油状物として得た（９．４ｇ、収率６６
％）。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ； １．５８〜１．７２（４Ｈ，ｍ） ２．２０（３Ｈ，ｓ） ２．３５〜２．４５（４Ｈ，ｍ） ２．６４（２Ｈ，ｔ） ３．２３〜３．３２（２Ｈ，ｍ） ５．１５（２Ｈ，ｓ） ７．２２〜７．４５（５Ｈ，ｍ） ＭＳ：ＦＡＢ ２８０（Ｍ+＋１）（マトリックス：ｍ
−ニトロベンゼン）
【００５９】（２）Ｎ−１−ベンジロキシカルボニル−
１−アミノ−７−フェロセンカルボン酸アシド−４−メ
チル−４−アザヘプタンの製造 上記（１）で得られたＮ−１−ベンジロキシカルボニル
−１，７−ジアミノ−４−メチル−４−アザヘプタン
（３．０ｇ、１１ミリモル）をジクロロメタン（３０ｍ
Ｌ）に溶解し、ここに、フェロセンカルボン酸（２．５
ｇ、１１ミリモル）、ピリジン（２ｍＬ）およびエチル
Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸
塩（２．３ｇ、１２ミリモル）を加え、室温で３時間攪
拌した。反応溶液に、塩化アンモニウム水溶液を加え、
酢酸エチルで二度抽出し、酢酸エチル層を飽和食塩水で
洗浄後、溶媒を留去した。得られた褐色油状物をアルミ
ナカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホル
ム：メタノール＝２０：１）に付し、得られた結晶をヘ
キサン−酢酸エチルの混合溶媒で洗浄し、標題化合物を
オレンジ色の結晶として得た（３．３ｇ、収率６２
％）。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ； １．６２〜１．９０（４Ｈ，ｍ） ２．２７（３Ｈ，ｓ） ２．４０〜２．６２（４Ｈ，ｍ） ３．２５〜３．３９（２Ｈ，ｍ） ３．３９〜３．５８（２Ｈ，ｍ） ４．２２（５Ｈ，ｓ） ４．３１（２Ｈ，ｓ） ４．６９（２Ｈ，ｓ） ５．１４（２Ｈ，ｓ） ５．６０（１Ｈ，ｂｓ） ６．８２（１Ｈ，ｂｓ） ７．２７〜７．４８（５Ｈ，ｍ）
【００６０】（３）１−アミノ−７−フェロセンカルボ
ン酸アシド−４−メチル−４−アザヘプタンの製造 上記（２）で得られたＮ−１−ベンジロキシカルボニル
−１−アミノ−７−フェロセンカルボン酸アシド−４−
エチル−４−アザヘプタン（１．５ｇ、３．０ミリモ
ル）をアセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解し、室温で攪
拌しながら、ここに、ヨウ化トリメチルシラン（１．２
５ｍＬ、８．８ミリモル）を滴下した。５分後に、反応
溶液に１規定塩酸水溶液と酢酸エチルとを加え、１規定
塩酸水溶液にて三度抽出し、水層を酢酸エチルで洗浄し
た。氷冷した水層に、２規定水酸化カリウム水溶液を加
えてｐＨ１０とし、クロロホルムにて二度抽出した。有
機層を飽和食塩水にて洗浄後、溶媒を留去し、標題化合
物を褐色結晶として得た（１．０ｇ、収率９３％）。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ； １．５７〜１．８７（４Ｈ，ｍ） ２．３３（３Ｈ，ｓ） ２．４１〜２．６０（４Ｈ，ｍ） ２．８６（２Ｈ，ｔ） ３．４０〜３．５３（２Ｈ，ｍ） ４．２４（５Ｈ，ｓ） ４．３７（２Ｈ，ｓ） ４．７０（２Ｈ，ｓ）
【００６１】（４）Ｎ，Ｎ’−ビス（７−フェロセンカ
ルボン酸アシド−４−メチル−４−アザヘプチル）ナフ
タレンジイミドの製造 上記（３）で得られた１−アミノ−７−フェロセンカル
ボン酸アシド−４−メチル−４−アザヘプタン（０．９
ｇ、２．５ミリモル）をテトラヒドロフラン（５０ｍ
Ｌ）に溶解し、室温で攪拌しながら、ここに、１，４，
５，８−四カルボン酸ナフタレン二無水物（０．３ｇ、
１．１ミリモル）を加えて７時間環流した。反応溶液を
濾過した後、クロロホルムにて洗浄し、合わせた有機層
から溶媒を留去して得られた残渣をアルミナクロマトグ
ラフィー（溶出溶媒；クロロホルム：メタノール＝１
５：１）に付し、得られた結晶を酢酸エチルで洗浄し、
標題化合物を褐色結晶として得た（０．６６ｇ、収率６
２％）。1 Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ； １．７０〜１．８５（８Ｈ，ｍ） １．９３〜２．０９（４Ｈ，ｍ） ２．３５（６Ｈ，ｓ） ２．５１〜２．６６（８Ｈ，ｍ） ３．４５〜３．５６（４Ｈ，ｍ） ４．１９（１０Ｈ，ｓ） ４．３２（４Ｈ，ｓ） ４．７０（４Ｈ，ｓ） ７．１９（２Ｈ，ｂｓ） ８．７９（４Ｈ，ｓ） ＭＳ：ＦＡＢ ９４７（Ｍ＋Ｈ）（マトリックス：ｍ−
ニトロベンゼン）
【００６２】［実施例１］ （１）電気化学分析素子の作製 面積が２．２５ｍｍ2の金電極に、５’末端にメルカプ
トヘキシル基を有する１００ピコモル／１μＬのチミン
の２０量体（ｄＴ20）の水溶液（２μＬ）を滴下し、室
温で１時間放置して電気化学分析素子を作製した。尚、
ｄＴ20の調製、および固定化については、特開平９−２
８８０８０号公報に記載の方法に従って行った。 （２）試料ＤＮＡ断片の調製 試料ＤＮＡ断片として、アデニンの２０量体（ｄＡ20）
を上記公報に記載の方法に従って調製した。 （３）ハイブリッドＤＮＡの検出 上記（１）で作製した電気化学分析素子上に、上記
（２）で得たｄＡ20（７０ピコモル）を含む１０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）溶液の２μＬを滴下し、２５
℃で２０分インキュベートした。インキュベート後、分
析素子表面を０．１Ｍリン酸二水素ナトリウム−リン酸
水素二ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）にて洗浄し、未
反応のｄＡ20を除去した。次いで、製造例１で得られた
縫い込み型インターカレータ(I)（５０μＭ）を含む
０．１Ｍ塩化カリウム−０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．
６）の混合溶液中に、洗浄後の分析素子を浸積し、デフ
ァレンシャルパルスボルタンメトリー（ＤＰＶ）を、パ
ルス振幅５０ｍＶ、パルス幅５０ｍＳ、印加電圧１００
乃至７００ｍＶの範囲およびスキャン速度１００ｍＶ／
秒の条件にて測定した。応答電位４６０ｍＶにおける電
流量を求めた。また、試料ＤＮＡ断片ｄＡ20を滴下しな
い以外は上記と同様の操作を行って得られた電流量を基
本値とし、上記測定によって得られた電流量の基本値か
らの変化量（％）を求めたところ、３７％であった。
【００６３】［比較例１］縫い込み型インターカレータ
（II)として、下記式で表される化合物を用い、応答電
位４６０ｍＶにおける電流量を求める以外は実施例１と
同様にして、電流量の変化量を求めたところ、３８％で
あった。
【００６４】
【化９】
【００６５】実施例１および比較例１の結果より、４６
０ｍＶの電圧値において、縫い込み型インターカレータ
(I)を使用した場合には、従来の縫い込み型インターカ
レータ(II)と使用した場合とほぼ同程度の応答電流の変
化を示すことが分かる。
【００６６】［実施例２］ミスマッチ構造のハイブリッ
ドＤＮＡの検出 （１）電気化学分析素子の作製 ｄＴ19Ｇ1を用いる以外は、実施例１の（１）と同様に
して、電気化学分析素子を作製した。 （２）ミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡの検出 電気化学分析素子として、実施例１の（１）で作製した
電気化学分析素子、および上記（１）の分析素子をそれ
ぞれ用いる以外は実施例１と同様の操作を行って、印加
電圧４００乃至７００ｍＶの範囲でＤＰＶを測定し、４
６０ｍＶでの電流量の変化率を求めたところ、それぞ
れ、３７％、２２％であった。
【００６７】実施例２より、ｄＴ19Ｇ1を固定して作製
された電気化学分析素子に、試料ＤＮＡ断片ｄ20Ａを接
触させて得られるハイブリッドＤＮＡは、ミスマッチ構
造のハイブリッドＤＮＡであり、本発明の新規縫い込み
型インターカレータを用いて、フルマッチ構造のハイブ
リッドＤＮＡとミスマッチ構造のハイブリッドＤＮＡと
の応答電流の差を求めることができることが分かる。
【００６８】
【発明の効果】本発明の縫い込み型インターカレータ
は、そのリンカー部分に可溶性を付与するＮ−置換イミ
ノ基を含む新規な構造を有するインターカレータであっ
て、安価でかつ入手容易な原料より簡便に合成すること
ができるものである。また、本発明の縫い込み型インタ
ーカレータは、Ｎ−置換イミノ基が簡便に四級化できる
ため、核酸断片とのより強い相互作用を考慮し、インタ
ーカレータの構造の転換を図ることが可能である。核酸
断片の検出において、本発明のインターカレータは、従
来のインターカレータと同様に約４６０ｍＶの印加電位
にてピーク電流値を与えるため、従来のインターカレー
タに代わるものとして使用することができる。また、本
発明の検出キットは、本発明のインターカレータを含む
最初のキットであり、遺伝子分野等の研究で有効に使用
される。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ０７Ｄ 471/04 １１２Ｚ 33/58 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３５１ // Ｃ０７Ｄ 471/04 １１２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 竹中 繁織 福岡県古賀市舞の里４−23−21 (72)発明者 山下 健一 福岡県福岡市城南区堤団地17−104 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 BA13 BB60 DA12 DA13 FA34 FB02 FB05 FB07 GC20 4B024 AA11 AA20 CA01 CA04 CA09 CA11 CA12 HA12 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA01 FA15 4B063 QA01 QA08 QA12 QA13 QQ03 QQ07 QQ08 QQ42 QQ52 QQ53 QR32 QR41 QR56 QR84 QS25 QS34 QX04 4C065 AA07 AA19 BB09 CC01 DD02 EE02 HH09 JJ04 KK09 LL04 PP01

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記一般式： 【化１】 ［式中、ＲおよびＲ1は、互いに独立に、水素原子、そ
    して、置換基を有していてもよい炭素原子数が１乃至３
    のアルキル基、炭素原子数が２乃至４のアシル基、炭素
    原子数が６乃至２０のアリール基および炭素原子数が１
    乃至３のアルキル基を有する炭素原子数が７乃至２３の
    アラルキル基からなる群より選ばれる原子もしくは基を
    表し；ＹおよびＹ1は、互いに独立に、−ＮＨ−ＣＯ−
    もしくは−ＣＯ−ＮＨ−を表し；ＥおよびＥ1は、互い
    に独立に、置換基を有していてもよい一つの結合手を有
    するフェロセンを表し；ＸおよびＺは、互いに独立に、
    水素原子、ハロゲン原子、あるいは炭素原子数が１乃至
    ６のアルキル基を表し；そして、ｍ、ｎ、ｋおよびｐ
    は、各々、１乃至６の整数を表す；但し、ｍとｎとの
    和、およびｋとｐとの和は、各々、４乃至８である］で
    表される縫い込み型インターカレータ。
  2. 【請求項２】 ＲとＲ1、ＹとＹ1、およびＥとＥ1と
    が、それぞれ互いに同一の基を表し、そして、ｍとｋ、
    およびｎとｐとが、それぞれ互いに同一の数であること
    を特徴とする請求項１に記載の縫い込み型インターカレ
    ータ。
  3. 【請求項３】 Ｒが、メチル基であり、そして、Ｙが−
    ＮＨ−ＣＯ−基であることを特徴とする請求項２に記載
    の縫い込み型インターカレータ。
  4. 【請求項４】 ｍおよびｎが、共に３であることを特徴
    とする請求項１もしくは２に記載の縫い込み型インター
    カレータ。
  5. 【請求項５】 基板表面に区画された一つまたは複数の
    領域のそれぞれに核酸断片が一端で固定されてなる電気
    化学分析素子に、核酸断片を溶解もしくは分散してなる
    水性液を請求項１乃至４の内の何れかの項に記載の縫い
    込み型インターカレータの存在下に接触させることによ
    り、該水性液中の、該分析素子に固定されている核酸断
    片と相補性を有する核酸断片を結合させると共に、該縫
    い込み型インターカレータの存在下で、該分析素子に４
    ００乃至６００ｍＶの範囲の電位を印加し、該分析素子
    と該縫い込み型インターカレータとの間を流れる電流量
    を測定することを特徴とする相補性を有する核酸断片の
    検出方法。
  6. 【請求項６】 （１）基板表面に区画された一つまたは
    複数の領域のそれぞれに核酸断片が一端で固定されてな
    る電気化学分析素子に、核酸断片が溶解あるいは分散し
    てなる水性液を接触させ、請求項１乃至４の内の何れか
    の項に記載の縫い込み型インターカレータの存在下に
    て、該分析素子に４００乃至６００ｍＶの範囲の電位を
    印加することにより、該分析素子と該縫い込み型インタ
    ーカレータとの間を流れる電流量を測定する工程；
    （２）該電気化学分析素子に、電気化学分析素子に固定
    されている核酸断片と相補性を有する核酸断片が溶解あ
    るいは分散してなる水性液を接触させ、（１）の操作を
    行うことによって電流量を測定する工程；そして、
    （３）上記の工程（１）と工程（２）のそれぞれで測定
    された電流量を比較することによって、工程（１）で用
    いた核酸断片が、工程（２）で用いた相補性核酸断片と
    塩基配列に関して部分的に同一性を有するものであるか
    否かを検出する方法。
  7. 【請求項７】 電気化学分析素子に固定されている核酸
    断片として、その塩基配列が既知のものを用いることを
    特徴とする、または水性液中の核酸断片として、その塩
    基配列が既知のものを用いることを特徴とする請求項５
    もしくは６に記載の検出方法。
  8. 【請求項８】 基板表面に区画された一つまたは複数の
    領域のそれぞれに核酸断片が一端で固定されてなる電気
    化学分析素子、および請求項１乃至４の内の何れかの項
    に記載の縫い込み型インターカレータを組み合わせてな
    る核酸断片の検出キット。
JP34928599A 1999-12-08 1999-12-08 縫い込み型インターカレータ、核酸断片の検出方法、及び核酸断片の検出キット Withdrawn JP2001165894A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP34928599A JP2001165894A (ja) 1999-12-08 1999-12-08 縫い込み型インターカレータ、核酸断片の検出方法、及び核酸断片の検出キット

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP34928599A JP2001165894A (ja) 1999-12-08 1999-12-08 縫い込み型インターカレータ、核酸断片の検出方法、及び核酸断片の検出キット

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001165894A true JP2001165894A (ja) 2001-06-22

Family

ID=18402735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP34928599A Withdrawn JP2001165894A (ja) 1999-12-08 1999-12-08 縫い込み型インターカレータ、核酸断片の検出方法、及び核酸断片の検出キット

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2001165894A (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003035407A1 (fr) * 2001-10-22 2003-05-01 Mitsui Chemicals, Inc. Composes imide et support d'enregistrement optique fabrique a l'aide de ces composes
JP2004534959A (ja) * 2001-07-09 2004-11-18 サントル　ナショナル　ドゥ　ラ　ルシェルシュ　シアンティフィク 固形支持体の機能化方法、機能化された固形支持体、およびその使用
WO2005121159A1 (en) * 2004-06-10 2005-12-22 Agency For Science, Technology And Research Novel dna threading intercalators
JP2006510025A (ja) * 2002-12-11 2006-03-23 サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク プローブ分子と標的生体分子との間の少なくとも１つの特異的相互作用を電子的に検出する方法

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004534959A (ja) * 2001-07-09 2004-11-18 サントル　ナショナル　ドゥ　ラ　ルシェルシュ　シアンティフィク 固形支持体の機能化方法、機能化された固形支持体、およびその使用
WO2003035407A1 (fr) * 2001-10-22 2003-05-01 Mitsui Chemicals, Inc. Composes imide et support d'enregistrement optique fabrique a l'aide de ces composes
US7259260B2 (en) 2001-10-22 2007-08-21 Mitsui Chemicals, Inc. Imide compound and optical recording media made by using the same
EP1930339A3 (en) * 2001-10-22 2008-06-18 Mitsui Chemicals, Inc. Imide compound for high density optical data storage
US7405030B2 (en) 2001-10-22 2008-07-29 Mitsui Chemicals, Inc. Imide compound and optical recording media made by using the same
JP2006510025A (ja) * 2002-12-11 2006-03-23 サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィク プローブ分子と標的生体分子との間の少なくとも１つの特異的相互作用を電子的に検出する方法
WO2005121159A1 (en) * 2004-06-10 2005-12-22 Agency For Science, Technology And Research Novel dna threading intercalators
US7479557B2 (en) 2004-06-10 2009-01-20 Agency For Science, Technology +Research DNA threading intercalators
US7902362B2 (en) 2004-06-10 2011-03-08 Agency For Science, Technology & Research DNA threading intercalators

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2003077851A9 (en) Compounds and methods for analyzing the proteome
KR100499278B1 (ko) 로텍산 화합물이 공유결합된 고체 기판 및 이를 이용한바이오칩
EP1106619B1 (en) Threading intercalator having oxidation-reduction activity
JP2000125865A (ja) Ｄｎａセンサおよびｄｎａの検出方法
KR100786577B1 (ko) 신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 이의 제조방법, 및상기의 제조방법에 의해 제조된 자기조립단분자층, 상기자기조립 단분자층에 자발적인 올리고유전자의 비가역적인분자인식에 의한 올리고유전자 고정화 방법 및 이에 의해제조된 올리고유전자 칩
JP2001165894A (ja) 縫い込み型インターカレータ、核酸断片の検出方法、及び核酸断片の検出キット
US20060275756A1 (en) Displacement assay for detecting ligate-ligand association events
JP4309037B2 (ja) 酸化還元活性を有する縫い込み型インターカレータ
US7321831B2 (en) Nucleic acid fragment-fixed electrode and its use
JP4426700B2 (ja) Ｄｎａ分析素子あるいはｐｎａ分析素子を用いる相補性を有する試料核酸断片の高感度定量法
JP4267208B2 (ja) 蛍光インターカレータおよび相補性核酸断片の検出方法
JP4189929B2 (ja) ジップコード方式を用いたｐｎａチップ及びその製作方法
KR100381457B1 (ko) 이중가닥 디엔에이의 전기화학적 검출에 유용한인터칼레이터 화합물, 이의 제조 방법 및 이 방법에유용한 중간체
JP4011937B2 (ja) ミスマッチ検出分子
JP2002000299A (ja) 複数の電位を用いる遺伝子の発現解析
JP2001321198A (ja) 試料核酸断片の相補性の検定方法
JP4320104B2 (ja) 部分相補性核酸断片の検出方法
JP2007031389A (ja) ヌクレオチド誘導体及びその利用
JP4177006B2 (ja) グアニンバルジ修飾分子
JP2001013103A (ja) 走査型電気化学顕微鏡による試料核酸断片の検出方法および定量方法
WO2003052139A1 (en) Discrimination method of hybridization between probes and nucleotides in sample on the bio chip using enzyme reaction
KR100869916B1 (ko) 신규한 아미노캘릭스아렌 유도체, 이의 제조방법, 및상기의 제조방법에 의해 제조된 자기조립단분자층, 상기자기조립 단분자층에 자발적인 올리고유전자의 비가역적인분자인식에 의한 올리고유전자 고정화 방법 및 이에 의해제조된 올리고유전자 칩
JPWO2002053571A1 (ja) 新規なフェロセン化多環式炭化水素誘導体、並びに新規なフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体、その製造方法及び該誘導体からなるインターカレータ及び遺伝子の電気化学的検出方法
JP4219748B2 (ja) プローブの蛍光標識化方法
JP2004325074A (ja) ミスマッチ検出分子及びそれを用いたミスマッチの検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 20070306