KR20070047093A

KR20070047093A - 신규한 이민캘릭스아렌 유도체, 그의 제조방법, 그를이용하여 제조된 자기조립단분자층 및 그의 자기조립단분자층을 이용하는 단백질 단분자층 제조방법

Info

Publication number: KR20070047093A
Application number: KR1020050103857A
Authority: KR
Inventors: 김태선; 김정훈; 송금수
Original assignee: (주)바이오메트릭스 테크놀로지
Priority date: 2005-11-01
Filing date: 2005-11-01
Publication date: 2007-05-04
Also published as: KR100787471B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1, 2, 3 및 4 와 일치하는 화합물의 합성과, 이 화합물들을 이용하여 도 1 또는 2 와 같은 고체기질위 단분자층 제조, 및 도 3과 같은 단백질이 단백질 외부에 있는 암모늄기를 신규한 이민캘릭스아렌 유도체의 단분자층에 비가역적으로 인식되어 칩 기판에 고정화되어 모든 종류의 단백질 칩을 단백질의 변성없이 용액상에서 칩 기판으로 고정화시키는 단백질 칩 기판의 제조와, 이 기판에서의 단백질 고정화를 이용하여 제조되는 단백질 칩의 제조에 관한 것이다.

(식 중, R₁, R'₁, R₂, R'₂, R₃, R'₃, R₄, 및 R'₄ 는 서로 독립적으로 -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -OCH₃, -Cl, -C₆H₅ ,-OH, -OCH₂CH₃, -Br, -CF₃, -OCH₂C₆H₅, -OC₆H₅,

-OC₆H₄CH₃, -OC₆H₄C(CH₃)₃, -OC₆H₄CF₃, -OC₆H₄Cl, -OCOCH₃, -NHCOCH₃, -CONHCH₃, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH₃ 또는 -C₂H₅ 를 나타낸다.)

-OC₆H₄CH₃, -OC₆H₄C(CH₃)₃, -OC₆H₄CF₃, -OC₆H₄Cl, -OCOCH₃, -NHCOCH₃, -CONHCH₃, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH₃ 또는 -C₂H₅ 를 나타낸다. 또한, 상기 Y₁, Y₂, Y₃ 및 Y₄ 는 서로 독립적으로 -H, -(CH₂)_n-CH=O, -(CH₂)_n-SH, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-CH=O, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-SH, -(CH₂)_m-C₆H₄-(CH₂)c-Z, 및 -CO-(CH₂)_m-1-C₆H₄-(CH₂)_c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH₂, 그리고 -C₆H₄- 와 -C₆H₅ 는 페닐기로 정의됨)).

(식 중, R₁, R'₁, R₂, R'₂, R₃, R'₃, R₄, 및 R'₄ 는 서로 독립적으로 -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -OCH₃, -Cl, -C₆H₅ ,-OH, -OCH₂CH₃, -Br, -CF₃, -OCH₂C₆H₅, -OC₆H₅, -OC₆H₄CH₃, -OC₆H₄C(CH₃)₃, -OC₆H₄CF₃, -OC₆H₄Cl, -OCOCH₃, -NHCOCH₃, -CONHCH₃, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH₃ 또는 -C₂H₅ 를 나타낸다.)

(식 중, R₁, R'₁, R₂, R'₂, R₃, R'₃, R₄, 및 R'₄ 는 서로 독립적으로 -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -OCH₃, -Cl, -C₆H₅ ,-OH, -OCH₂CH₃, -Br, -CF₃, -OCH₂C₆H₅, -OC₆H₅, -OC₆H₄CH₃, -OC₆H₄C(CH₃)₃, -OC₆H₄CF₃, -OC₆H₄Cl, -OCOCH₃, -NHCOCH₃, -CONHCH₃, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH₃ 또는 -C₂H₅ 를 나타낸다. 또한, 상기 Y₁, Y₂, Y₃ 및 Y₄ 는 서로 독립적으로 -H, -(CH₂)_n-CH=O, -(CH₂)_n-SH, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-CH=O, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-SH, -(CH₂)_m-C₆H₄-(CH₂)c-Z, 및 -CO-(CH₂)_m-1-C₆H₄-(CH₂)_c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH₂, 그리고 -C₆H₄- 와 -C₆H₅ 는 페닐기로 정의됨)).

이민캘릭스아렌 유도체, 단백질 칩

Description

신규한 이민캘릭스아렌 유도체, 그의 제조방법, 그를 이용하여 제조된 자기조립단분자층 및 그의 자기조립 단분자층을 이용하는 단백질 단분자층 제조방법{NOVEL IMINECALIXARENE DERIVATES, METHOD FOR PREPARING THE SAME, SELF-ASSEMBLED MONOLAYER PREPARED BY USING THE SAME, AND METHOD FOR PREPARING PROTEIN MONOLAYER USING THE SELF-ASSEMBLED MONOLAYER}

도 1 은 논문(Langmuir,1996년 Vol 12, pp 5338-5342)에 발표된 방법에 따라 제조된 아민 슬라이드 글래스와 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체와의 화학결합에 의해 제조되는 이민캘릭스아렌 유도체 자기조립 단분자층의 모식도이다.

도 2 는 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체 중 화학식 2 와 화학식 4 의 유도체 중 티올기가 부착된 유도체가 금 기질 위에서 형성하는 자기조립 단분자층의 제조과정의 모식도이다.

도 3 은 본 발명에서 개발된 이민캘릭스아렌 유도체가 단분자층으로 덮여있는 금 혹은 유리슬라이드 등의 고체기질 표면에 단백질 용액을 도포하면 자발적인 분자인식으로 단백질이 기질의 표면에 고정화되어 고밀도로 빈자리 없이 단백질이 고정화되어 형성되는 단백질 단분자층, 즉 단백질 칩을 제조하는 신기술을 보여주는 모식도이다.

도 4 는 실시예 13 에 따라 항체 단백질 고정화시 Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺ 등 이온 종류와 이온농도에 따라 단백질의 고정화 속도가 영향을 받는다는 것을 보여주는 측정결과이며, NH₄ ⁺ 이온 100-400 mM 에서 최고밀도로 그리고 10 내지 30분 정도의 짧은 시간에 초고속으로 단백질이 고정화되어 단백질 칩을 제조할 수 있다는 신기술임을 보여주는 결과이다. 고정화된 단백질의 밀도는 형광부착된 항원과 결합시켜 확인하였으며, 도 5 에서 보이는 이론적 최고밀도의 형광감도와 동일하여 최고밀도로 단백질 고정화가 진행된다는 것을 보여주는 결과이다.

도 5 는 본 발명에서 자발적인 단백질 고정화를 수행한 결과인 도 4 에서 실시된 결과를 고정화된 단백질 이론적 최고밀도의 결과와 비교 분석하기 위하여 최고밀도의 단백질과 결합되는 양의 2배, 1배, 0.5배의 형광부착된 항원을 동일한 공간에 도포한 뒤 말려서 측정한 형광감도이다. 이 중 1 배인 경우의 형광감도가 도 4 에서 암모늄이온을 이용하여 30 분에 측정된 결과와 동일하여 초고속, 고밀도 단백질 고정화가 진행된 결과임을 확인해주는 실제실험 결과이다.

도 6 은 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체 자기조립단분자층에서 단백질 고정화가 단백질의 외부에 노출된 라이신 등의 말단기에 존재하는 아민, 즉 암모늄이온과 단백질의 N-말단, 즉 아민말단기 등에 부착된 암모늄이온이 비가역적으로 이온인식되어 궁극적으로 단백질을 고정화시킨다는 것을 보여주기 위해 아민작용기가 부착된 아민화합물과 단백질 간의 경쟁반응을 진행하여 아민화합물의 농도에 따라 단백질의 고정화가 방해받는다는 것을 보여주는 모식도이다.

도 7 은 실시예 15 에 따라 진행된 실험결과이며, 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체 자기조립단분자층에서 단백질 고정화시 알라닌, 페닐알라닌, 페네틸아민 등의 암모늄기가 부착된 화합물이 고정화되는 단백질과 이온인식을 경쟁적으로 수행하여 실제 단백질의 고정화 속도를 감소시킨다는 것을 보여주는 경쟁반응 결과이다.

도 8 은 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체가 네 개의 아민화합물(용액상에서 암모늄이온)을 인식하는 모식도이다. 둥근 구체형태로 암모늄 사이에 끼어있는 것은 음이온이다.

도 9 는 네 개의 암모늄 형태로된 아민 화합물이 이민캘릭스아렌 유도체에 실제로 용액상에서 인식된 것을 보여주는 NMR 결과이다. NMR 결과는 이민캘릭스아렌 유도체의 네 개의 이민 수소가 동일한 위치로 이동하는 것을 보여주고 있으며, 캘릭스아렌의 8 개의 수소도 1 ppm 정도 이동하는 것을 보여주고 있어서 이 암모늄 이온 인식이 가역적인 평형상태가 아니라 비가역적임을 보여주고 있다. 추가로 인식되는 속도는 벤젠고리가 달려있는 아민화합물이 없는 화합물에 비해 수십배나 빠르게 인식된다는 것을 보여주어서 도 7 의 경쟁반응 결과를 보조해 주는 결과이다.

도 10 은 본 발명에서 개발된 하나의 이민캘릭스아렌 유도체에 알릴아민의 분자인식을 측정한 NMR 결과이다. 알릴아민의 CH₂의 수소 8개가 0.8 ppm 이동한 것과 이중결합에 부착된 수소들이 4 개 정도의 비율이 이동하여 하나의 이민캘릭스아렌 내부에 네 개의 알릴아민이 비가역적으로 인식된다는 것을 증명하는 실시예 17의 실험 결과이다. 이민캘릭스아렌의 수소들은 도 9의 아민화합물이 인식되었을때와 비슷한 이동형태를 보여주어 동일한 형태의 암모늄 이온 인식이 진행되었다는 것을 보여준다.

본 발명은 신규한 테트라이민캘릭스아렌 유도체, 그의 제조방법, 그를 이용하여 제조된 자기조립단분자층, 그의 자기조립 단분자층에 이온인식을 이용하는 무변성 단백질 고정화 방법, 및 이를 이용하는 단백질 칩 제조기술에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 항원, 항체 등의 단백질 혹은 암모늄기를 가진 화합물 등이 분자인식에 의해 고체기질의 표면에 고정화가 가능한 테트라이민캘릭스아렌 유도체 화합물, 그의 제조방법, 이를 유리나 금 기질등의 고체기질에 단분자층으로 제조하는 기술, 및 그의 자기조립 단분자층을 이용한 단백질 단분자층, 즉 단백질 칩(protein chip)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

생명현상의 발생 및 분화는 단백질-단백질, 단백질-리간드(혹은 약물), 항원-항체, 효소-기질 등의 기능적인 상호작용에 의해서 조절되어진다. 따라서 특정 단백질이나 리간드와 특이적으로 상호 작용하는 생체분자의 기능이나 역할을 밝히는 연구는 생명과학, 보건 및 의료분야 등에서의 주된 과제가 되고 있다. 이 러한 다양한 단백질들을 하나의 고체기질 즉 칩 상에 고정화하고, 단백질-단백질 혹은 단백질-리간드 간의 상호작용을 측정하는데 다수의 단백질을 동일 칩 상에 고정화한 단백질 칩이 많이 연구되고 있다.　

특히, 효소, 항원, 항체 등을 고체기질에 고정화 하는 방법은 면역화학과 효소화학 등 생명과학이나 단백질을 이용하여 질병을 판단하는 진단키트 등의 다양한 단백질을 사용하는 분야에서 가장 기초적인 기반기술이 된다. 예를 들어 진단에서 많이 사용되고 있는 효소면역측정법(Enzyme-Linked Immunoassay, EIA)는 특정한 단백질 혹은 병원을 일으키는 특이 단백질을 분석하기 위하여 항체를 플라스틱으로 제조된 96-마이크로타이터 웰(96 microtiter well)의 바닥에 물리흡착 시키거나 혹은 항체 외부에 존재하는 다양한 작용기를 반응시켜 결합시키는 화학결합 방식에 의해 항체를 고정화 시켜 제품을 제조하고 여기에 혈청의 항원과 반응한 뒤 이차항체-효소 결합체를 이용하여 발색, 형광분석 등을 이용하여 항원의 농도를 측정하여 진단하는 방식으로 다양한 질병진단용 키트가 시중에서 판매되고 있다.　

이러한 물리흡착이나 화학결합 방식 외에도 스트렙토에버딘이라는 단백질을 바이오틴이 부착된 고체기질 상에 수소결합에 의해 고정화시킨 뒤 바이오틴이 부착된 항체 등의 단백질을 바이오틴-스트렙토에버딘 분자인식에 의해 단백질을 고정화 시키는 방식 등이 알려져 있다.

기존에 사용하던 물리흡착 방식이나 화학결합 방식 및 최근에 사용되기 시작한 바이오틴-스트렙토에버딘 분자인식을 이용한 방식 등의 단백질 고정화 기술에서 나타나고 있는 문제점은 다음과 같다.　

1. 고정화 밀도: 단백질 고정화 기술에서 가장 많은 연구가 진행된 분야이나 현재 고정화를 위해 사용되는 다양한 종류의 단백질들은 고정화시에 전체공간을 완전히 뒤덮는 단백질 단분자층 제조가 가능한 고체기질이 거의 발표되지 않고 있다. 표면의 고정화된 단백질의 밀도가 완전한 수준의 단분자층을 이루는 밀도 (항체인 경우 1.1-1.4 ug/cm²) 가 되지 않으면 여러 가지의 단백질이 고정화되어 있는 고체기질의 표면에 단백질로 덮이지 않은 노출된 고체기질의 표면에 정해진 항원이 항체에 고정화되지 않고 고체기질이 그대로 노출된 표면에 비특이적인 고정화가 진행되는 현상 및 고정화된 항체의 양이 작아서 결합된 항원의 양이 적게 나타나고 결과적으로 판독이 어려워지는 문제점과 판독 가능한 단백질의 농도가 기존기술과 차별화되지 않는 문제점들이 나타나고 있다.

2. 재현성 : 단백질 고정화 기술에서 제품화를 위한 가장 중요한 기술로 수종-수십종의 단백질을 고정화 했을 때 고정화된 단백질이 동일한 수준의 고정화 밀도와 활성을 나타내어야 정확한 진단결과를 획득할 수 있다. 하지만 현재 사용되고 있는 단백질 고정화 기술은　 고체기질상에서 화학결합이나 바이오틴-스트렙토에버딘 방식 혹은 폴리라이신 계열의 고분자를 이용하여 유리 슬라이드상에서 화학결합을 최대한 이룰 수 있는 고분자를 이용하는 방식 등이 사용되고 있는데 대부분이 단백질과 특정 작용기와의 반응이 필요하고 반응 후 고정화를 진행해야 하기 때문에 여러 번의 불완전한 반응을 진행하면 동일한 결과 즉 재현성을 나타내는데 많은 문제점을 가지고 있다.

3. 초고속 고정화 : 고정화시에 용액상에서 고체기질의 표면으로 고정화가 진행되는데 용액상에 단백질이 녹아 있는 경우 시간이 흐름에 따라 용액상에서 단백질의 활성이 점진적으로 감소하는 경향을 나타내고 있다. 하지만 고정화된 후에는 활성감소가 거의 없기 때문에 고정화시의 활성 감소를 최소화 하기 위하여 1시간 이내에 고정화를 완전하게 수행하는 초고속 고정화가 가능한 고체기질의 개발이 필요하나 아직까지 개발되지 못하고 있다.

4. 무변성 단백질 고정화 : 단백질 고정화 밀도 즉 고정화 되는 단백질의 개수가 일정한 수치내에서 동일하게 유지되는 재현성 확보와 동일한 단백질의 개수가 고정화 되었더라도 단백질의 활성이 일정오차 내에서 동일한 수준에서 고정화를 진행하려면 제어가 가능한 용액상에서 고정화가 진행되어야 하고 이를 위해서는 단백질의 활성에 문제를 일으킬 가능성이 있는 화학결합 단계가 불필요한 무변성 단백질이 용액상에서 직접 고정화 되는 기술의 개발이 필수적이다. 본 연구진에서 수년전에 발표한 크라운화합물을 이용한 기술 외에 아직 무변성 단백질 고정화 기술이 개발되지 못하고 있어서 작용기 부착이 없는 무변성 단백질 고정화 기술 및 이를 접목한 고체기질의 개발이 필요하다.　

본 발명의 목적은 전술한 기존의 다양한 단백질 고정화 방법에서 발생하는 고정화 밀도의 균일성 및 활성유지 문제, 느리게 고정화되는 단백질에 의한 고정화 단백질 활성의 불균일성 문제, 단백질의 활성을 나타내는 활성위치는 주로 수소결합에 의해 나타나는데 화학결합시 수소결합력 보다 강력한 고체기질과의 화학결합 력에 의해 활성이 감소되는 문제등을 해결하여 재현성 있는 바이오칩을 개발하는데 필수적인 이민캘릭스아렌 유도체 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

추가로, 본 발명의 목적은 상기화합물을 아민작용기가 부착된 유리기질(아민 슬라이드 글래스), 실리콘웨이퍼, 용융실리카(fused silica) 혹은 금 기질 등에 부착함으로서 모든 종류의 단백질이 아무런 가공과정 없이 용액상에서 30분 내지 1시간 정도의 짧은 시간내에 초고속으로 고체기질에 고정화되어 단백질 단분자층을 제조할 수 있는 이민캘릭스아렌 유도체의 단분자층을 제공하는 것이다.

추가로, 본 발명의 목적은 모든 종류의 단백질이 아무런 변성과정 없이 단백질이 빽빽하게 고밀도로 초고속으로 고정화되는 단백질 단분자층, 즉 단백질 칩 제조기술을 제공하는 것이다.

단백질이 아무런 가공과정 없이 30분 내지 1시간 이내에 초고속으로 고정화되는 자기조립단분자층 제조에 필수적인 신규한 이민캘릭스아렌 유도체는 하기 화학식 1, 2, 3, 4의 구조를 가지는 화합물이다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

상기 화학식 5의 물질은 캘릭스[4]아렌을 논문(Journal of Organic Chemistry, 1990년 Vol 55, pp 5639-5643, Journal of Organic Chemistry, 1979년 Vol 44, pp 1233-1238) 에 기재된 방법에 따라 테트라니트로캘릭스[4]아렌으로 변 환한 뒤 상기 논문에 기재된 방법에 따라 환원반응에 의해서 화학식 5의 물질 5,11,17,23-테트라아미노캘릭스[4]아렌 (테트라아미노캘릭스[4]아렌) 을 합성한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 실시예 2 에 따라 합성된 화학식 5의 물질을 출발물질로 하여 화학식 5의 아민 작용기를 적합한 방향족 알데히드(aromatic aldehyde) 와 반응시켜 화학식 1의 이민캘릭스아렌 유도체들을 합성한다.

본 발명의 화학식 2의 화합물은 화학식 1의 화합물과 반응하여 에테르, 에스테르등의 방법으로 결합하면서 말단에 알데히드, 티올, 카르복시산등의 작용기를 부착하는 화합물을 1번 화합물의 캘릭스아렌에 부착된 -OH, 즉 알코올 작용기와 반응시켜 각각의 알코올 작용기를 독립적으로 알킬기 말단에 알데히드 혹은 티올이 부착된 이민캘릭스아렌 유도체 화학식 2 의 화합물을 합성한다.

본 발명의 화학식 3 의 화합물은 실시예 6 에 따라 합성된 화학식 5 의 물질을 출발물질로 하여 화학식 5 의 아민 작용기를 적합한 방향족 알데히드(aromatic aldehyde) 와 반응시켜 화학식 3의 이민캘릭스아렌 유도체들을 합성한다.

본 발명의 화학식 4 의 화합물은 화학식 3 의 화합물과 반응하여 에테르, 에스테르등의 방법으로 결합하면서 말단에 알데히드, 티올, 카르복시산등의 작용기를 부착하는 화합물을 1번 화합물의 캘릭스아렌에 부착된 -OH, 즉 알코올 작용기와 반응시켜 각각의 알코올 작용기를 독립적으로 알킬기 말단에 알데히드 혹은 티올이 부착된 이민캘릭스아렌 유도체 화학식 2 의 화합물을 합성한다.

추가로, 본 발명은 상기 화학식 2 의 화합물을 금 기질 또는 아민 작용기가 부착된 유리 기질에 부착함으로써 모든 종류의 올리고유전자를 고밀도로 고정화된 올리고유전자 단분자층, 즉 올리고 유전자 칩 제조기술을 제공하는 것이다.

도 1 은 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체의 유리기질 위에서의 자기조립 단분자층 제조과정을 개략적으로 나타낸다.

아민 작용기가 부착된 유리기질에 이민캘릭스아렌 유도체의 자기조립단분자층을 제조하기 위한 구체적인 방법은 다음과 같다.　　

먼저 사용된 아민 작용기가 부착된 유리기질(유리 슬라이드 글래스)은 논문(Langmuir, 1997년 Vol 13, pp 4305-4308; Langmuir,1996년 Vol 12, pp 5338-5342)에 발표된 방법에 따라 실라놀(-Si-OH) 작용기가 표면에 풍부한 유리기질의 표면에 화학반응을 통하여 아민 말단기를 가진 유리기질(아민 슬라이드 글래스, 혹은 아민 칩)형태로 제조하였다. 이렇게 제조된 아민 작용기가 부착된 유리기질을 화학식 2 의 화합물을 0.1 내지 5 mM 농도로 녹인 클로로포름과 THF의 혼합용액(CHCl₃ : THF = 9 : 1)에 넣어둔다. 1 내지 5시간 뒤 클로로포름과 아세톤, 에탄올 순으로 세척한 뒤 건조시키면 도 1 과 같은 이민캘릭스아렌 자기조립단분자층이 완성된다. 단분자층의 생성은 표면반사 적외선 분광분석법을 이용하여 확인한다. 여기에 사용되는 유리기질은 일반적으로 시판되는 모든 종류의 슬라이드 글래스 혹은 유리이다. 단백질과 같은 생체물질은 대부분 PH 가 7 내지 8 사이의 완충용액에서 녹여서 제조하기 때문에 이러한 용도로 사용할 때에는 이민 결합된 형태로 곧바로 사용하여도 문제가 없다는 연구결과를 확인하였다.

도 2 는 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체의 금 기질 위에서의 자기조립 단 분자층이 제조되는 과정을 개략적으로 나타낸다. 금 기질에 이민캘릭스아렌 유도체의 자기조립단분자층을 제조하기 위한 구체적인 방법은 다음과 같다.

클로로포름 (CHCl₃) 등의 유기용매에 화학식 2 또는 4 의 화합물 중 티올 부착된 화합물을 0.1 내지 5 mM 농도로 녹인 용액을 제조한다. 금 기질을 상기 제조된 용액에 넣어 1 내지 5 시간 동안 담근 후 꺼내어 이를 클로로포름 및 아세톤 그리고 물로 각각 세척한 뒤 건조시키면 도 2 와 같은 이민 캘릭스아렌 유도체의 자기조립 단분자층이 완성된다. 여기에 사용되는 금 기질은 어떤 종류의 금 박막이라도 가능하나 일반적으로 유리, 용융 석영(fused silica), 실리콘 웨이퍼, 플라스틱 기질 등에 크롬(Cr)이나 티타늄(Ti)등을 2 내지 10 nm 로 진공증착 시킨 후 금을 50 내지 200 nm 두께로 진공증착시킨 기질이다. 이렇게 제조된 금 기질은 사용 직전에 피라니아 용액 (Piranha solution : conc.H₂SO₂ : 30% H₂O₂ =3:1)에 1분 정도 담근 뒤 정제수에서 씻은 뒤 질소를 불어주며 말려서 사용하는 것이 일반적이다. 단분자층의 생성은 표면반사 적외선 분광분석법을 이용하여 확인한다.

추가로, 본 발명은 이민캘릭스아렌 유도체의 네 개의 질소를 이용하여 단백질의 암모늄기 혹은 알기닌의 구아니딘기의 하나 혹은 그 이상을 이온/분자 인식하여 다중 이온/분자 인식에 의한 무변성 단백질 고정화 방법을 제공하는 것이다.

추가로, 본 발명의 고정화 방식은 단백질 고정화를 이용한 모든 종류의 진단용 바이오칩, 연구용 단백질 칩 등을 제조하는 모든 종류의 단백질 고정화를 이용한 제품의 제조에 기반이 되는 기술로서 현재까지는 세계적으로 비슷한 연구결과도 발표된 적이 없는 발명이다.

도 3 은 본 발명에서 개발된 이민캘릭스아렌 단분자층에 항체 단백질이 자발적인 이온/분자 인식에 의한 무변성 단백질로 고정화된 뒤 고정화된 항체 단백질의 밀도와 활성을 Cy-5 형광물질이 부착된 Cy-5 와 항원결합체(conjugate)를 이용하여 고정화된 항체에 항원을 항원-항체 반응을 통하여 결합시키는 모식도이다.

도 4 에서 보여지는 결과는 도 3의 모식도에서 보여지는 것과 같이 이민캘릭스아렌 단분자층에 C-반응성 단백질(C-reactive protein) (CRP)의 항원(Ag)과 항체(Ab)를 사용하여 진행한 실제 연구 결과이다. 이 결과는 본 발명에서 개발된 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층에 단백질의 고정화 속도 및 밀도 그리고 고정화된 단백질의 활성분석까지를 동시에 보여주는 결과이다. 단백질의 고정화는 Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺ 의 세가지 크기가 조금씩 차이가 나는 이온을 이용하여 동일한 농도의 항체 단백질 농도 [표면에 고정화될 이론적 밀도(1.4 ug/cm²)의 3배, 45 ug/mL 3 uL]를 사용하여 고정화를 진행하였다. 그리고 항체 단백질의 고정화 시간을 10분, 30분 및 1시간의 각각 다른 시간동안 항체 단백질을 고정화시킨다. 고정화된 항체 단백질을 고정화된 항체단백질과 결합하는데 충분한 양의 형광부착된 항원단백질과 항원-항체 반응하여 항체단백질에 형광부착된 항원단백질이 결합되게하여 항체의 활성과 동시에 고정화된 항체의 밀도분석까지를 수행하였다. 형광감도 분석은 스캐너(GSI lite, 미국)를 이용하여 결과를 확인한다. 분석된 결과에 따르면 Na⁺ 이 온을 이용한 경우와 K⁺ 이온을 이용한 경우 동일하게 100 mM 내지 800 mM 농도에서 항체 단백질의 고정화 시간이 10분, 30분 및 1시간으로 항체단백질의 고정화 시간이 길어질수록 점진적으로 형광감도가 증가하여 1 시간에서 최대치의 형광감도, 즉 최대치의 정도만에 형광감도가 백색(white)에 가깝게 나타나는 것을 확인할 수 있다. NH₄ ⁺이온을 이용한 경우에는 항체단백질 고정화가 10분이 진행된 수준에서도 최대치 형광의 90% 정도가 보여지며 30분 내지 1시간 동안의 고정화와 거의 동일한 수준의 고정화가 진행된 결과를 확인할 수 있다. 추가로 동일한 결과가 약 100 mM 이온농도에서 800 mM 이온농도에서 나타나고 있어서 다양한 이온농도 조건, 특히 암모늄(NH₄ ⁺)을 이용할 때 단백질의 고정화가 10 내지 30분 내에 초고속으로 진행된다는 것을 알 수 있다. 추가로 고정화에 사용한 항체 단백질은 아무런 변성없이 항체 단백질 그대로 사용한 결과이다. 이 결과는 도 5 의 이론적으로 항체단백질이 최대치로 고정화되는 양 (1.4 ug/cm²) 과 1:1로 결합하는 개수의 형광부착된 항원을 고체기질에 도포하여 말린뒤 측정한 이론적 최대치의 형광감도와 동일하게 나타났으므로 이론적 최대치의 항체 단백질이 10분 내지 30분 정도에 고정화가 완료되며 활성도 우수하게 나타나는 결과이며, 이는 본 발명에서 개발된 단백질 고정화용 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층이 무변성 단백질을 발표된 최소 시간에 초고속으로 단백질을 단분자층 수준으로 고정화한다는 것을 보여주고 있으며, 특히 고체기질에서 단백질의 고정화시 물리흡착이 많이 일어나서 재현성에 문제가 나타 나 제품화를 진행하는데 많은 어려움이 있지만 400 내지 500 mM 이상의 고농도 이온에서는 물리흡착이 거의 일어나지 않는다고 알려져 있어서 물리흡착이 대부분 제거되어 제품 제조의 핵심기술인 단백질 칩 제조시의 재현성을 확보하는 신기술이다.

추가로, 본 발명은 무변성 단백질을 초고속으로 높은 재현성으로 최고밀도 수준으로 단백질 단분자층을 제조하는 기술(즉, 단백질 칩), 이러한 단백질이 고정화 되는 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층(즉, 단백질 고정화 기판)을 제조하는 기술, 이러한 유도체 단분자층 제조시에 사용되는 신규한 이민캘릭스아렌 유도체, 및 그의 제조기술에 관한 것이다.

도 5 는 최대치로 고정화된 항체 (1.4 ug/cm²)와 1:1로 항원(35 ng/0.0314cm², 직경 2 mm 건상 스팟(dry spot), 결합밀도는 1.1 ug/cm²)을 결합시킬 경우와 동일한 양의 형광부착된 항원을 고체기질에 도포한 뒤 말려서 형광측정한 것과, 그것의 2배와 1/2배를 도포하여 형광밀도를 분석한 실제 실험 결과이다. 1배에서 형광부착된 항원의 밝기는 도 4의 NH₄ ⁺ 100 mM 이상에서 30분 고정화된 항체와 형광부착된 항원이 나타내는 결과와 동일하며, 1/2배를 사용한 경우에는 형광이 약 1배의 절반으로 줄어있음을 보여준다.

도 6 은 항체 단백질의 고정화가 실제로 이온 인식에 의해 일어나는지를 보여주는 경쟁반응의 모식도이다. PH 7에서 아민 화합물은 100% 암모늄 이온형태 로 존재하며 이러한 아민 화합물을 적정량 넣어주며 단백질의 고정화를 방해할 수 있다는 모식도이다.

도 7 은 도 6 의 모식도에 따라 실제로 진행된 연구결과를 보여주고 있다. 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층에 인식이 가장 빠른 것 중 하나인 페네틸아민(phenethylamine), 그 다음 수준이며 아미노산 중 하나인 페닐알라닌(phenylalanine), 및 인식이 상대적으로 느린 알라닌(alanine)을 이용하여 도 4에서 진행된 것과 동일한 실험을 단순히 각각의 아민화합물을 30 mM 수준의 농도가 되게 혼합한 뒤 고정화 결과를 비교하였다. 인식이 잘되는 페네틸아민과 페닐알라닌은 없을 때와 비교해 고정화가 1/10 내지 1/3 수준으로 진행되는데 비해서 인식이 느리게 이루어지는 알라닌인 경우 (NMR을 이용한 측정결과) 고정화 속도에 큰 차이를 보이지 않는 결과를 보여주고 있다. 이런 결과는 실제로 단백질의 고정화가 이온 인식에 의해 진행되며, 특히 이민캘릭스아렌 고리와 아민 화합물의 벤젠고리 사이에 Π-Π 적층 상호반응(stacking interaction)이 존재하면 아민 화합물이 이민캘릭스아렌유도체 내부에 더 쉽게 인식되는 특성을 보이는 것을 알 수 있으며, 단백질의 고정화를 더 빠르게 방해 할 수 있음을 보여주는 결과로서 본 발명에서 개발된 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층에 단백질의 고정화가 주로 단백질 외부의 아민 작용기의 인식에 의해 단백질이 고정화됨을 보여주고 있다.

도 8 은 본 발명의 이민캘릭스아렌 유도체가 네 개의 아민화합물(용액상에서 암모늄이온)을 인식하는 모식도이다. 둥근 구체형태로 암모늄 사이에 끼어있는 것은 음이온이다. 네 개의 아민화합물이 인식된다는 것은 다양한 아민화합물을 비 가역적으로 분자인식시켜 확인하였다.

도 9 는 네 개의 암모늄 형태로된 아민 화합물이 이민캘릭스아렌 유도체에 실제로 용액상에서 인식된 것을 보여주는 NMR 결과이다. NMR 결과는 이민캘릭스아렌의 네 개의 이민 수소가 동일한 위치로 이동하는 것을 보여주고 있으며, 캘릭스아렌의 8 개의 수소도 1 ppm 정도 이동하는 것을 보여주고 있어서 이 아민인식이 가역적인 평형상태가 아니라 비가역적인 인식임을 보여주고 있다. 인식되는 속도는 벤젠고리가 달려있는 아민화합물인 페닐알라닌이나 페네틸아민이 벤젠고리가 없는 화합물인 알라닌에 비해 수십 배나 빠르게 인식된다는 것을 보여주어서 도 7 의 경쟁반응 결과를 확증해 주는 결과이다.

도 10 은 알릴아민을 이용하여 네 개의 알릴아민이 인식된 후 알릴아민의 CH₂의 수소 4x2=8개가 0.8 ppm 이동한 것과 이중결합에 부착된 수소들이 4개 알릴아민 비율로 다른 위치로 이동하여 네 개의 아민화합물이 비가역적으로 인식되는 것을 보여주는 또 다른 실험 결과이다. 이민캘릭스아렌의 이민수소와 캘릭스아렌의 수소는 도 9 의 다른 아민화합물 인식 때와 비슷한 이동형태를 보이고 있다.

이와 같이, 본 발명은 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층의 표면에 네 개의 아민화합물, 즉 암모늄기가 비가역적으로 인식된다는 것을 알 수 있으며, 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층의 표면에 단백질 외부의 암모늄 작용기가 비가역적으로 인식되면서 단백질이 고밀도로 고정화된다는 것을 보여주고 있다. 추가로, 본 발명은 10 내지 30분 정도에 고밀도 고정화가 가능한 초고속고정화 기술, 단백질에 아 무런 조작을 가하지 않은 단백질 그 자체, 즉 무변성 단백질 고정화를 가능하게 하는 신규한 이민캘릭스아렌 유도체와 그의 단분자층, 및 단분자층 제조기술과 그의 표면에서 단백질의 고정화에 의해 제조되는 단백질 단분자층 제조 기술을 제공한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1

5,11,17,23-테트라아미노캘릭스[4]아렌의 제조

5,11,17,23-테트라니트로캘릭스[4]아렌(TNCA, 5,11,17,23-테트라니트로캘릭스[4]아렌)을 출발물질로 사용하여 하기 참고 논문에 제시된 합성방법으로 합성하여 연한 황색의 고체 생성물 5, 11,17,23-테트라아민캘릭스[4]아렌(YACA, 5,11,17,23-테트라아미노캘릭스[4]아렌)을 75% 수율로 얻었다.

[참고논문 : Van Wagenigen, A. M. A.; Snip, E.; Verboom. W.; Reinhoudt, D. N.; Boerrigter, H.; Liebigs Ann/Recueil 1997년. pp 2235-2245]

실시예 2

5,11,17,23-테트라-2,4-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌 의 합성

건조된 둥근바닥 플라스크에 TACA (100 mg, 0.2 mmol)과 마그네틱 바를 넣고 준비한다.　 반응용기에 15 ml 의 아세토니트릴을 넣어준 뒤 교반시킨다. 2,4-디메톡시벤즈알데히드(330 mg, 2.4 mmol)을 넣어준 뒤 질소 교류 하에서 2시간 동안 상온에서 교반 반응시킨다. 반응 후 감압 여과하여 감압 하에 용매를 제거 한 뒤 반응물을 3 ml CH₂Cl₂ 에 녹여준 뒤 n-헥산 15 ml을 부어주어 연갈색의 고체 생성물을 얻었다. 생성물은 다시 한번 3 ml 의CH₂Cl₂ 에 녹여준 뒤 n-헥산 15ml을 서서히 부어주어 밝은 연갈색의 고체 생성물 TMBICA (5,11,17,23-테트라-2,4-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌) 196 mg(수율 88 %)을 얻었다.

실시예 3

5,11,17,23-테트라-2,4-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-디헥산알의 합성

건조된 둥근바닥 플라스크에　 마그네틱 바와 TMBICA(100 mg, 0.1 mmol), K₂CO₃(145 mg, 1.1 mmol), 요오드화 나트륨 (142 mg, 0.9 mmol)를 차례로 넣어준 뒤 감압하게 건조시킨 후에 무수 아세토니트릴 15 ml를 질소교류 하에서 반응 용기에 넣어준 뒤 가열기에서 교반시킨다. 6-브로모헥산알 (113 mg, 0.6 mmol)을 넣어준 뒤 80℃ 로 올려주어 24시간 동안 교반 반응시킨다. 반응 후 반응물을 상온으로 식혀준 뒤 감압 하에서 용매를 제거한다. 반응중간에 생기는 불용성 여분의 고체생성물을 제거하기 위해 10 ml의 CH₂Cl₂로 반응물을 녹인 뒤에 불용성 고 체생성물은 감압 여과하여 제거한다. 여과된 여과액은 감압 하에 제거한다.

2 ml의 CH₂Cl₂로 반응물을 녹인 후 15 ml n-헥산을 천천히 부어주어 반응물을 용출시킨다. 용출된 것은 감압 여과하여 노란색의 고체 생성물을 얻는다. 이 생성물을 건조시킨 후 정제하기 위해 2 ml의 CH₂Cl₂로 반응물을 녹인 후 20 ml n-헥산을 천천히 부어주어 반응물을 천천히 용출시켜서 연노란색의 고체생성물 TMBICADA (5,11,17,23-테트라-2,4-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-디헥산알) 100 mg (수율 85%)을 얻었다.

실시예 4

5,11,17,23-테트라-2,4-메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-부틸브로마이드의 합성

TMBICA TMBICAB

건조된 둥근바닥 플라스크에 TMBICA (500 mg, 0.46 mmol)과 무수 K₂CO₃ (636 mg, 4.6 mmol)와 요오드화 나트륨 (620 mg, 4.14 mmol)를 넣고 무수 아세토니트릴 160 ml를 넣어주어 상온에서 15분간 교반시킨다. 반응용기에 1,4-디브로모부탄(1.0 g, 0.55 ml, 4.6 mmol)을 넣어주고 반응용기의 온도를 80℃ 까지 올려주고 24시간 동안 반응시킨다. 반응 후 반응용기를 상온으로 식힌 뒤 용매는 감압하여 제거시키고 CH₂Cl₂ 150 ml로 잔여물을 녹인다. 반응시 생성된 고체 침전물 KBr, KI, K₂CO₃ 등은 감압 여과하여 제거하고 여과액은 감압하여 용매를 제거한 뒤 에틸 아세테이트/헥산으로 석출시킨 뒤, 감압 여과하여 연갈색의 고체생성물 5,11,17,23-테트라-2,4-메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-부틸브롬(TMBICAB, 5,11,17,23-테트라-2,4-메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-부틸브로마이드)을 얻었다. 이 고체를 CHCl₃/헥산으로 재결정하여 엷은 연노란색의 TMBICAB(490 mg, 79 %)를 얻었다.

실시예 5

5,11,17,23-테트라-2,4-메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-부틸머캡탄의 합성

건조된 둥근바닥 플라스크에 TMBICAB(500 mg, 0.37mmol)과 포타슘 티오아세테이트 (170 mg, 1.48 mmol)을 넣고 무수 아세톤 50 ml에 녹여서 질소 교류 하에서 90분 동안 상온에서 소닉반응시켜 준다. 반응 후 용매를 감압하에 제거한 후 30 ml CH₂Cl₂으로 녹여주어 불용성 고체 침전물은 감압 여과하여 거른 뒤 여과액을 물로 2번 닦아주고 유기층을 분리하여 MgSO₄로 건조시킨다. 유기층을 감압 여과하고 여과액을 감압 건조시킨 뒤 얻어진 고체를 EA/n-헥산을 이용하여 재결정하고 감압 여과하여 연한 황색의 고체 결정을 얻는다. 얻어낸 고체결정을 둥근바닥 플라스크에 넣고 CH₂Cl₂ : 메탄올 = 5 : 1 비율의 혼합용액에 녹이고 상온에서 질소 교류하에서 소닉 반응 시킨다. 1분 뒤 1.0 M KOH (1.5 ml, 1.5 mmol)을 넣고 30분 도안 소닉반응 시킨다. 반응 후 용매를 감압하에 제거한 뒤 4 ml 의 CH₂Cl₂에 녹여서 0.1 M HCl 수용액으로 1번 닦아주고 유기층을 분리한 뒤 MgSO₄ 로 건조시킨 뒤 감압 여 과하여 여과액은 감압하에 용매를 제거하여 소량 남긴 뒤 n-헥산 25 ml를 서서히 부어주어 고체 생성물을 용출시켜 연한 노란색의 5,11,17,23-테트라-2,4-메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-부틸머캡탄(TMBICAT, 5,11,17,23-테트라-2,4-메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-부틸머캡탄)을 얻는다. 이렇게 얻어진 TMBICAT를 EA/n-헥산 으로 재결정하여 흰색의 고체결정 TMBICAT(370mg, 수율 79%)을 얻었다.

실시예 6

5,11,17,23-테트라-2,5-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌의 합성

건조된 둥근바닥 플라스크에 TACA(500 mg, 1.0mmol)과 마그네틱 바를 넣고 준비한다.　 반응 용기에 60ml 의 아세토니트릴을 넣어준 뒤 교반시킨다. 2,5-디 메톡시벤즈알데히드 (1.65 g, 12 mmol)을 넣어준 뒤 질소 교류 하에서 2시간 동안 상온에서 교반 반응시킨다. 반응 후 감압 여과하여 감압 하에 용매를 제거 한 뒤 반응물을 5 ml CH₂Cl₂ 에 녹여준 뒤 n-헥산 30 ml을 부어주어 연갈색의 고체 생성물을 얻었다. 생성물은 다시 한번 5 ml 의CH₂Cl₂ 에 녹여준 뒤 n-헥산 30 ml 을 서서히 부어주어 생성물을 용출시켜서 밝은 색의 연갈색 고체 생성물 5,11,17,23-테트라(2,5-디메톡시)벤질이민캘릭스[4]아렌(2,5-TMBICA, 5,11,17,23-테트라-2,5-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌) 920 mg(수율 85 %)을 얻었다.

실시예 7

5,11,17,23-테트라-2,5-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-디헥산알의 합성

건조된 둥근바닥 플라스크에　 마그네틱 바와 2,5-TMBICA(500 mg, 0.46 mmol), K₂CO₃ (625 mg, 4.6 mmol), 요오드화 소듐 (630 mg, 4.2 mmol)를 차례로 넣어준 뒤 감압하게 건조시킨 후에 무수 아세토니트릴 130 ml 를 질소교류 하에서 반응 용기에 넣어준 뒤 가열기에서 교반시킨다. 6-브로모헥산알 (520 mg, 2.76 mmol)을 넣어준 뒤 온도를 80℃ 로 올려주어 24시간 동안 교반 반응시킨다. 반응 후 반응 용기를 상온으로 식혀준 뒤 감압 하에서 용매를 제거한다. 반응시 생기는 불용성 여분의 고체 생성물을 제거하기 위해 120 ml의 CH₂Cl₂로 반응물을 녹인 뒤에 불용성 고체생성물은 감압 여과하여 제거한다. 여과된 여과액은 감압 하에 제거한다. 5 ml의 CH₂Cl₂로 반응물을 녹인 후 30 ml n-헥산을 천천히 부어주어 반응물을 용출시킨다. 용출된 것은 감압 여과하여 노란색의 고체 생성물을 얻는다. 이 생성물을 건조시킨 후 정제하기 위해 5 ml의 CH₂Cl₂로 반응물을 녹인 후 30 ml n-헥산을 천천히 부어주어 반응물을 천천히 용출시켜서 연노란색의 고체 생성물 5,11,17,23-테트라-2,5-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-디헥산알 (2,5-TMBICADA, 5,11,17,23-테트라-2,5-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-디헥산알) 510 mg (수율 87 %)을 얻었다.

실시예 8

5,11,17,23-테트라-2,5-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-부틸브로마이드의 합성

건조된 둥근바닥 플라스크에 2,5-TMBICA (300 mg, 0.28 mmol)과 무수 K₂CO₃ (387 mg, 2.8 mmol)와 요오드화 나트륨 (378 mg, 2.52 mmol)를 넣고 무수 아세토니트릴 150 ml를 넣어주어 상온에서 10분 동안 교반시킨다. 반응 용기에 1,4-디브로모부탄(600 mg, 0.34 ml, 2.8 mmol)을 넣어주고 반응 용기의 온도를 80℃ 까지 올려주고 24시간 동안 반응 시킨다. 반응 후 반응 용기를 상온으로 식힌 뒤 용매는 감압하여 제거시키고 CH₂Cl₂ 140 ml 로 잔여물을 녹인다. 반응시 생성된 고체 침전물 KBr, KI, K₂CO₃ 등은 감압 여과하여 제거하고 여과액은 감압하에서 용매를 제거한 뒤 에틸아세테이트/n-헥산으로 용출시킨 뒤, 감압 여과하여 연갈색의 고체생성물 5,11,17,23-테트라-2,5-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌(2,5-TMBICA, 5,11,17,23-테트라-2,5-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-부틸브로마이트)을 얻 었다. 이 고체를 CHCl₃/헥산으로 재결정하여 엷은 연노란색의 2,5-TMBICA (300 mg, 79%)를 얻었다.

실시예 9

5,11,17,23-테트라-2,5-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-부틸머캡탄의 합성

건조된 둥근바닥 플라스크에 2,5-TMBICAB(500 mg, 0.37 mmol)과 포타슘 티오아세테이트 (200 mg, 1.75 mmol)을 넣고 무수 아세톤 60 ml에 녹여서 아르곤 교류 하에서 90분 동안 상온에서 소닉반응시켜 준다. 반응 후 용매를 감압하에 제거한 후 30 ml CH₂Cl₂으로 녹여주어 불용성 고체 침전물은 감압 여과하여 거른 뒤 여 과액을 물로 2번 닦아주고 유기층을 분리하여 MgSO₄로 건조시킨다. 건조 후 유기층을 감압 여과하고 여과액을 감압하에 제거하여 건조시킨 뒤 얻어진 고체를 EA/n-헥산을 이용하여 재결정하고 감압 여과하여 연한 황색의 고체 결정을 얻는다. 얻어낸 고체결정을 둥근바닥 플라스크에 넣고 CH₂Cl₂ : 메탄올 = 5 : 1 비율의 혼합용액에 녹이고 상온에서 아르곤 교류 하에서 소닉 반응 시킨다. 1분 뒤 1.0 M KOH (1.5 ml, 1.5 mmol)을 넣고 30분 도안 소닉반응시킨다. 반응 후 용매를 감압하에 제거한 뒤 5 ml 의 CH₂Cl₂에 녹여서 0.1 M HCl 수용액과 물로 1번씩 닦아주고 유기층을 분리한 뒤 MgSO₄ 로 건조시킨 뒤 감압 여과하여 여과액은 감압하에 용매를 제거하여 소량 남긴 뒤 n-헥산 30 ml 를 서서히 부어주어 고체 생성물을 용출시켜 연한 노란색의 5,11,17,23-테트라-2,5-메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-부틸머캡탄(2,5-TMBICAT, 5,11,17,23-테트라-2,5-디메톡시벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-부틸머캡탄)을 얻는다. 이렇게 얻어진 2,5-TMBICAT를 EA와 n-헥산 으로 재결정하여 흰색의 고체 결정 2,5-TMBICAT (385 mg, 수율 82%)을 얻었다.

실시예 10

도 1 과 같은 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 제조

CHCl₃등의 유기용매에 실시예 3에서 합성된 TMBICADA를 0.1-5mM 농도로 녹인 용액을 제조한다. 도 1 과 같이 아민작용기가 부착된 슬라이드글라스(아민칩)을 제조된 용액에 1 내지 24시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤, 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시키면 도 1 에 있는 이민캘릭스아렌 단분자층이 제조된다. 실시예 7 과 같은 이민캘릭스아렌의 다른 유도체 단분자층도 동일한 방법에 따라 제조된다.

실시예 11

도 2 와 같은 금기질에서의 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 제조

CHCl₃등의 유기용매에 실시예 5 에서 합성된 TMBICAT 를 0.1 내지 5 mM 농도로 녹인 용액을 제조한다. 도 2 와 같이 금 기질을 제조된 용액에 1 내지 24시간 동안 담근 뒤 꺼내어 이를 클로로포름, 아세톤, 및 물로 각각 세척한 뒤 건조시키면 도 2 에 있는 이민캘릭스아렌 단분자층이 제조된다. 이민캘릭스아렌의 다른 유도체도 동일한 방법에 따라 단분자층이 제조된다. 여기에 사용되는 금기질은 여러 가지 형태로 사용될 수 있으나 일반적으로 유리, 용융석영(fused silica), 실리콘웨이퍼, 플라스틱 등에 크롬(Cr)이나 티타늄(Ti)등을 5 내지 20 nm 로 진공증착 시킨 후 금을 100 내지 300 nm 두께로 진공증착 시킨 기질이다. 이렇게 제조된 금기질은 사용 직전에 피라니아(piranha) 용액 (진한황산:과산화수소수 30% = 3:1로 섞은 혼합용액)에 10초 내지 1분 정도 담근 후 물로 세척하고 질소교류하에 건조시켜 곧바로 사용한다. 단분자층의 생성은 표면반사적외선광분석법(FTIR-ERS) 을 이용하여 분석한다.

실시예 9 와 같은 이민캘릭스아렌의 다른 유도체 단분자층도 동일한 방법에 따라 제조된다.

실시예 12

도 3 에서 보여진 분자인식에 의한 일반적인 무변성 단백질 고정화 방법

-항체 단백질의 고정화

실시예 1 에서 제조된 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 위에 단백질의 고정화에 사용되는 샘플용액 및 농도, 조성 등은 표 1 과 같다. 먼저 단백질의 고정화를 위하여 2 mm 직경으로 구멍이 뚫린 웰 플라스틱(well plastic)을 칩 위에 부착시켜 사용하였다. 웰 플라스틱이 부착된 칩 위에 표 1 에서처럼 준비된 단백질 샘플용액을 마이크로파이펫(micropipet)을 이용하여 3 ul 씩 도포한 후에 플라스틱 챔버(plastic chamber)에서 1 시간 동안 상온에서 고정화하였다. 이때 도포한 항체의 양은 표면을 1 배 덮을 수 있는 양의 세 배이다. 고정화 후에 칩은 단백질이 고정화된 스팟(spot) 이외의 부분을 블로킹(blocking)해주기 위하여 블로킹 용액에 담궈 칩 위에 부착된 웰 플라스틱은 탈착시킨 후 상온에서 30분 동안 담궈 둔다. 블로킹한 후 칩을 세척하기 위하여 세척 용액 1 에서 2분 동안 담궈준 후 세척 용액 2 에서 2분 동안 담궈 두었다가 꺼내어 건조시켰다.

-항원 단백질과의 반응

항체가 고정화된 칩은 건조 후에 형광이 부착된 항원과 반응하기 위하여 준비된 항원용액 15 ml 에 담궈서 챔버(chamber)에서 1시간 동안 37 ^oC에서 인큐베이션(incubation)시켰다. 항원-항체 반응이 끝나면 칩은 세척 용액 1 에서 2분 동안 담궈 두었다가 세척 용액 2 에서 2분 동안 담근 후에 건조시켜 형광스캐너 (GSI Lumonics,USA) 를 이용하여 분석한다.

실시예 13

- 항체의 고정화시 이온농도 효과

이민캘릭스아렌 유도체 단분자층위에 이온이 포함된 단백질의 고정화에 사용되는 샘플용액 및 농도, 조성 등은 표 2 내지 4 와 같다. 먼저 단백질의 고정화를 위하여 2 mm 직경으로 구멍이 뚫린 웰 플라스틱(well plastic)을 칩 위에 부착시켜 사용하였다. 웰 플라스틱이 부착된 칩 위에 표 2 내지 4 에서처럼 준비된 단백질 샘플용액을 이온별 농도별로 마이크로파이펫을 이용하여 3 ul 씩 도포한 후에 플라스틱 챔버에서 이온별로 각각 10분, 30분, 1시간 동안 상온에서 고정화하였다. 고정화 후에 칩은 단백질이 고정화된 스팟(spot) 이외의 부분을 블로킹(blocking)해주기 위하여 표 1 의 블로킹 용액에 담궈 칩 위에 부착된 웰 플라스틱은 탈착시킨 후 상온에서 30분 동안 담궈 둔다. 블로킹한 후 칩을 세척하기 위하여 표 1의 세척 용액 1 에서 2분 동안 담궈 준 후 표 1 의 세척 용액 2 에서 2분 동안 담궈 두었다가 꺼내어 건조시켰다.

-고정화된 항체와 항원과의 반응

항체가 단분자층으로 고정화된 칩은 건조 후에 형광이 부착된 항원과 반응하기 위하여 표 1 의 형광 부착된 단백질(항원)용액 2 의 15ml 에 담궈 챔버(chamber)에서 1시간 동안 37^oC 에서 인큐베이션(incubation)시켰다. 항원-항체 반응이 끝나면 칩은 표 1 의 세척용액 1 에서 2분 동안 담궈 두었다가 표 1 의 세척용액 2 에서 2분 동안 담근 후에 건조시켜 형광스캐너(GSI Lumonics,USA) 를 이용하여 분석한 결과가 도 4 에 나타나 있다. 도 4 의 결과에 따르면 Na+, K+를 이용하여 고정화를 진행하면 100 mM 이상의 이온농도에서는 1시간에서 최대치의 형광밝기가 나타나는 것을 알 수 있다. 30분에서의 형광부착된 항원과 결합된 항체단백질의 고정화밀도는 최대치의 약 80% 수준이며, 1시간에서 90% 수준까지 증가되고 있다. 이에 비해 NH₄ ⁺ 이온을 이용하는 경우 100 mM 이상부터 800 mM 농도수준에서는 10분 고정화에서 최대 고정화 밀도의 약 90%, 30분에서는 거의 100% 수준에 도달하였음을 보여주고 있다. 용액상의 단백질이 시간이 지남에 따라 활성이 감소되는 현상에 비추어 최대 활성을 유지한 채로 고정화하는데 수시간 내지1일 정도 걸리는 기존의 고정화기술에 비해 이민캘릭스아렌 유도체 기판에서는 초고속으로 30분 정도에 단백질이 고정화되는 초고속 고정화가 가능하기 때문에 기존 기술에 비해 빠르게 제품을 제조할 수 있으면서 동시에 용액상에서 단백질이 존재하는 시간이 수시간 이상에서 수십분대로 감소하기 때문에 단백질의 활성이 기존기술에 의한 고정화 보다 상대적으로 재현성 있게 유지되고 수회 반복실험에서도 동일한 결과를 나타낸다.

실시예 14

-. 단백질 고정화 최대밀도 분석을 위한 형광분석기술

도 5 에서 보이는 결과는 유리슬라이드에 형광부착된 항원을 항체가 아민캘릭스아렌 유도체 단분자층 표면의 1cm² 의 면적에 1 배를 덮는데 필요한 1.4 ug/cm² 의 항체 (CRP Ab 160 kD) 와 1:1로 결합하는데 필요한 형광부착된 항원의 양(1.1 ug/cm²)의 0.5 배, 1배, 및2배를 도포한 뒤 말려서 직접 형광스캐너(GSI Lumonics,USA) 로 형광감도를 분석한 결과이다. 형광부착된 항원 1 ul 가 도포되면 직경 2 mm의 원형 스팟(spot)이 생기며 이 면적은 0.0314 cm² 이므로 3(5 ug/ml) x 1 ul /0.0314 cm² = 1.1 ug/cm² 형광부착된 항원이 고정화된 항체와 도포된 공간에서 1:1로 결합할 수 있는 양을 도포한 것이다. 고정화된 항체와 결합하는데 사용된 항원과 동일한 항원을 사용하여 본 실시예를 진행하여 도 5 에서 나타나는 결과를 얻을 수 있었다. 0.5배일 때의 형광감도는 도 4 에서 암모늄 이온을 이용하여 30분 진행된 결과의 약 55% 수준의 형광감도를 나타내며, 1 배인 경우에는 도 4 에서 암모늄 이온을 이용하여 30분 고정화하고 동일한 형광부착된 항원과 반응시켜 얻어진 형광감도와 거의 동일한 수준으로 나타나기 때문에 도 4 에서 암모늄을 이용하여 진행된 단백질 고정화에서 얻어진 항체단백질 고정화 밀도가 이론적 최대치, 즉 완전한 단분자층을 이루며, 동시에 항원과 1:1 결합을 수행할만큼 활성이 뛰어나다는 것을 보여주는 결과이다.

실시예 15

- 단백질 고정화시 아민작용기 화합물과의 경쟁적인 고정화

도 6 의 모식도에서 보여지는 이민 캘릭스아렌 칩 위에 아민 작용기 화합물과의 경쟁적인 단백질의 고정화는 실시예 12 의 항체단백질 고정화 방법과 동일하게 진행하였으며, 사용되는 샘플용액 및 농도, 조성 등은 표 5 과 같다. 30 mM의 알라닌, 페닐알라닌, 페네틸아민 등과 혼합하여 고정화가 1 시간 동안 진행한 뒤 실시예 12의 항체단백질 고정화 후 처리방법과 동일하게 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층을 씻고, 블로킹(blocking) 을 진행한 뒤 표 1의 형광부착된 단백질(항원)용액 2 를 이용하여 실시예 12 와 동일하게 항체-항원 반응을 진행한 뒤 동일하게 처리하여 형광스캐너(GSI Lumonics,USA) 를 이용하여 분석한 결과가 도 7 에 나타나 있다. 알라닌을 이용한 경우에는 고정화 속도에 거의 영향을 미치지 못하지만 이민캘릭스아렌에 빠르게 분자인식되는 페닐알라닌이나 페네틸아민을 이용한 경우에는 형광의 급격한 감소가 나타나 이러한 아민화합물들이 항체 단백질과 경쟁적으로 이민캘릭스아렌 유도체의 내부에 인식되어 결과적으로 항체 단백질의 고정화를 방해하게 되어 고정화가 대단히 낮은 밀도로 이루어진 결과로 나타난다. 이는 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층에서 단백질의 고정화가 아민작용기(용액상에서 암모늄기)가 있는 부분이 비가역적으로 고정화되면서 궁극적으로는 단백질이 고정화된다는 것을 보여주는 결과이다.

추가로, 본발명에서 개발된 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층에서는 단백질의 고정화가 분자/이온 인식에 의해 고속으로 진행된다는 것을 보여주는 결과이다.

실시예 16

- 도 9와 도 10에서 이민캘릭스아렌 유도체와 아민화합물과의 NMR 분석에 사용된 이민캘릭스아렌 유도체 TBICAP(5,11,17,23-테트라벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-디프로필)의 합성

건조된 둥근바닥 플라스크에 TBICA (500 mg, 0.59 mmol)과 무수 K₂CO₃(826 mg, 5.9 mmol)와 요오드화 나트륨(1.3 g, 8.9 mmol)를 넣어주고 감압 하에 30분 동안 건조시킨다. 그리고, 질소 교류하에서 무수 아세토니트릴120 ml를 넣어준 후 가열기에서 교반시킨다. 10분 후 1-브로모프로판(0.51 ml, 5.9 mmol)을 반응용기에 넣어주고 온도를 80℃로 서서히 올려주면서 24시간 동안 교반반응 시킨다. 반응 후 용매는 감압하여 제거시켜주고 CH₂Cl₂ 로 잔여물을 녹여준다. 반응 중간에 생성되는 고체 침전물 KBr, KI, K₂CO₃등은 감압 여과하여 제거하고 여과액은 감압하에 제거한 후 플라스크에 남아있는 액체 생성물은 CH₂Cl₂ 2 ml에 녹인 후에 13 ml 의 n-헥산을 서서히 부어주어 생성물을 용출시킨다. 용출된 고체 생성물은 다시 한번 CH₂Cl₂ 2 ml 에 녹인 후에 13 ml 의 n-헥산을 서서히 부어주어 연한노란색의 고체생성물 TBICAP(5,11,17,23-테트라벤질이민캘릭스[4]아렌-1,3-디프로필)을 495 mg (수율 90%) 을 얻었다.

실시예 17

NMR을 이용한 알릴아민과 TBICAP 와의 분자인식 연구

실시예 16 에서 합성된 TBICAP 13.8 mg (920 g/mol , 0.015 mmole)을 측정하여 바이얼에 넣은 후 3 mM 이 되도록 5 ml DMSO에 녹여 준비한다. 그리고, 이 TBICAP 용액 500 ul 를 NMR 뷰트에 넣은 후,　 용액을 염기성 조건으로 만들기 위하여 뷰트 내에 2.5 ul의 트리에틸아민을 넣는다. 그리고, 알릴아민은 D₂O에 녹여 500 mM 농도가 되도록 제조한 후 50 ul 를 취하여 준비된 NMR 튜브에 넣어서 분자인식을 진행시키면서 NMR을 측정한 결과가 도 10 에 나타나 있다. (TBICAP : 알릴아민= 1 : 16) 이민캘릭스아렌이 아민화합물인 알릴아민과 비가역적으로 결합하는 것은 8.6 ppm 부근에서 나타나는 이민수소 a, a' 이 8.3 에서 단일 피크로 나타나며 동시에 7.2 ppm 부근에서 나타나는 캘릭스아렌의 8 개의 수소가 6.2 ppm 으로 약 1 ppm 가까이 이동한 것에서 캘릭스아렌이 알릴아민과 비가역적으로 분자인식에 의해 결합한다는 것을 알 수 있다. 추가로, 인식된 알릴아민의 개수는 알릴아민의 CH₂-NH₂ , 즉 아민옆에 부착된 탄소에 달린 수소에 의해 파악할 수 있는데 3.4 ppm 에서 나타나던 수소의 일부가 4.2 ppm 에서 나타나는 것을 확인하였으며, 적분값이 8개의 수소로 나타나서 4개의 알릴아민이 이민캘릭스아렌유도체 내에 비가역적으로 분자인식된다는 것을 보여주었다. 추가로 알릴아민의 수소는 아민이 암모늄으로 변환되었을 때 3.2 ppm 에서 3.4 ppm 을 이동되어 나타나므로, 이 NMR 튜브 내에서 분자인식이 진행된 알릴아민은 알릴암모늄 상태로 분자/이온 인식된 것을 알 수 있다. 알릴아민의 다른 수소들도 일부, 즉 사용된 16 배의 알릴아민 중 4 배만이 이동된 NMR 결과가 도 10 의 NMR 분석에 나타나 있다. 이러한 결과로 이민캘릭스아렌 유도체는 이민위치의 질소 4개와 4개의 암모늄 이온이 이온/분자 인식을 수행한다는 모식도가 도 8 에 나타나 있다.

실시예 18

NMR을 이용한 TBICA와 알라닌, 페닐알라닌, 페네틸아민등 과의 분자인식연구

실시예 16 에서 합성된 합성된 TBICAP 물질을 (13.8 mg, 0.015 mmole)을 측정하여 바이얼에 넣은 후 3 mM 이 되도록 5 ml DMSO에 녹여 준비한다. 그리고, 각각의 아민 화합물을 실시예 16 과 동일하게 준비한 다음 실시예 17 과 같이 1:16의 비율로 NMR 튜브에 넣어 NMR 스펙트럼을 시간대 별로 얻어 분자인식이 완전하게 진행되는데 필요한 시간을 파악하여 분자인식이 쉽게 즉 강하게 진행되는 화합물을 분석하였다. 도 9에서 나타난 결과에 따르면 벤젠고리가 포함된 화합물은 2시간 이내에 완전한 분자인식이 진행된 이민캘릭스아렌 유도체 NMR을 보여주고 있는데 반해, 알라닌인 경우 분자인식이 대단히 느리게 진행되어 4일이 지난후에야 분자인식이 대부분 진행된 결과를 보여주고 있다. 이 결과는 이민캘릭스아렌 유도체의 벤질이민의 벤젠고리와 분자인식되는 아민화합물의 벤젠고리가 서로 Π-Π 적층 상호반응(stacking interaction)이 있으면 분자인식이 더욱 빠르게 진행된다는 것을 보여주는 결과이다. 추가로, 이 결과는 도 7에서 진행된 단백질 고정화와 아민 화합물간의 경쟁반응에서 벤젠고리가 부착된 아민화합물이 강하게 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층에 분자/이온 인식되어 단백질 고정화를 효과적으로 방해한다는 것을 보여주는 결과와 일치하는 결과이다. 추가로, 본 발명에서 개발된 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층은 분자/이온 인식에 의해 단백질을 변성없이 단분자층의 표면에 30분정도의 짧은 시간에 초고속으로 고정화가 진행되어 단백질 칩을 제작할 수 있는 세계 최초의 초고속 무변성 단백질 고정화 기술이다.

본 발명은 세계적으로 일반화되어 사용되어지고 있는 기존의 화학결합, 물리흡착, 바이오틴-스트렙토에버딘 등을 이용하여 단백질을 고정화하여 단백질 칩을 제작하는 방식과 완전히 차별화되게 무변성 단백질을 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층에 도포하기만 하면 초고속으로, 비가역적으로, 이온/분자 인식을 통해 단백질이 단분자층 표면에 고정화 되며 동시에 최고밀도의 고정화를 가능하게 하는 신기술이다. 추가로, 언제나 최고수준으로 단백질이 표면에 고정화되기 때문에 고정화된 단백질의 양, 즉 밀도가 균일하고, 초고속으로 고정화되어 단백질의 활성이 균일하게 유지되어 높은 재현성이 확보된 단백질 칩 제조 신기술에 관한 것이다.

본 발명에서 개발된 신규한 이민캘릭스아렌 유도체를 이용하여 제조되는 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층은 기존의 다양한 단백질 고정화 방법에서 발생하는 고정화 밀도의 불균일성 및 활성감소 문제, 및 느린 속도의 고정화 기술 때문에 용액상에 오랜시간 방치된 단백질의 활성 감소에 의한 고정화 단백질 활성의 불균일성 문제 등을 모두 해결할 수 있는 신기술이다. 추가로, 단백질의 활성을 나타내는 활성위치는 주로 수소결합에 의해 유지되는데 알데히드 칩 등을 이용하여 진행되는 화학결합시 수소결합력보다 강력한 고체기질과의 화학결합력에 의해 활성위치의 변성이 나타나게 되어 고정화된 단백질의 활성이 불균일 하게 감소되는 문제를 분자인식을 이용하여 해결할 수 있는 신기술이다.

추가로, 본 발명은 단백질 고정화용 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 제조기 술, 신규한 이민캘릭스아렌 유도체, 및 그의 제조방법을 제공하여 기존의 단백질 칩 제품화에서 가장 문제시 되었던 단백질 칩의 재현성 문제를 완전히 해결한 단백질 칩 제조기술을 제공한다.

추가로, 본 발명은 화학식 2 또는 4 에서 나타난 이민캘릭스아렌 유도체를 아민작용기가 부착된 유리기질(아민 슬라이드 글래스), 실리콘웨이퍼, 용융실리카 (fused silica) 등에 혹은 화학식 2 또는 4 에서 나타난 이민캘릭스아렌 티올 유도체를 금 기질에 부착함으로서 분자량에 관계없이 모든 종류의 단백질을 아무런 가공과정 없이 용액상에서 30분 내지 1시간 정도의 짧은 시간내에 초고속으로 고체기질에 고정화되어 단백질 단분자층을 제조할 수 있는 이민캘릭스아렌 유도체의 단분자층을 제공한다.

추가로, 본 발명은 도 4 의 이온농도에 따른 고정화나 도 7 의 경쟁반응 등과 같이 고정화 속도를 이온농도를 증가시켜 더욱 빠르게 하거나 아민화합물을 일부 포함시켜 고정화 속도를 최적 상태로 조절이 가능한 세계 최초의 고정화 속도조절 기능을 가진 단백질 고정화용 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층을 제공하여 10000(10kD) 이상의 다양한 크기와 형태를 가진 단백질을 최적의 조건에서 최고 활성을 유지한 채 고정화가 가능하게 하는 단백질 칩 제조기술을 제공한다.

추가로, 본 발명에서는 고정화 최고밀도를 이루는데 필요한 단백질 양의 3배 수준의 소량의 단백질만으로 초고속으로 단백질 칩의 제조가 가능하여 단백질 칩 제조공정의 단순화 및 저가로 단백질 칩을 제조할 수 있는 단백질 칩 제조기술을 제공한다.

특히, 도 4 와 도 5 의 형광분석 결과에 따르면, 고정화된 단백질은 이론적 최대수준의 고밀도를 유지하며 항원과 결합하는 활성도 높게 유지되어 최고 감도를 보이는 진단용 단백질 칩을 제조할 수 있는 기술을 제공한다. 이러한 기술은 다양한 종류의 단백질 칩, 진단용 항체칩, 바이오칩 제조 신기술 개발등에 응용될 것이다.

Claims

하기 화학식 1의 이민캘릭스아렌 유도체:

(식 중, R₁, R'₁, R₂, R'₂, R₃, R'₃, R₄, 및 R'₄ 는 서로 독립적으로 -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -OCH₃, -Cl, -C₆H₅ ,-OH, -OCH₂CH₃, -Br, -CF₃, -OCH₂C₆H₅, -OC₆H₅, -OC₆H₄CH₃, -OC₆H₄C(CH₃)₃, -OC₆H₄CF₃, -OC₆H₄Cl, -OCOCH₃, -NHCOCH₃, -CONHCH₃, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH₃ 또는 -C₂H₅ 를 나타낸다.)
하기 화학식 2의 이민캘릭스아렌 유도체 :

(식 중, R₁, R'₁, R₂, R'₂, R₃, R'₃, R₄, 및 R'₄ 는 서로 독립적으로 -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -OCH₃, -Cl, -C₆H₅ ,-OH, -OCH₂CH₃, -Br, -CF₃, -OCH₂C₆H₅, -OC₆H₅, -OC₆H₄CH₃, -OC₆H₄C(CH₃)₃, -OC₆H₄CF₃, -OC₆H₄Cl, -OCOCH₃, -NHCOCH₃, -CONHCH₃, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH₃ 또는 -C₂H₅ 를 나타낸다. 또한, 상기 Y₁, Y₂, Y₃ 및 Y₄ 는 서로 독립적으로 -H, -(CH₂)_n-CH=O, -(CH₂)_n-SH, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-CH=O, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-SH, -(CH₂)_m-C₆H₄-(CH₂)c-Z, 및 -CO-(CH₂)_m-1-C₆H₄-(CH₂)_c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH₂, 그리고 -C₆H₄- 와 -C₆H₅ 는 페닐기로 정의됨)).
하기 화학식 3 의 이민캘릭스아렌 유도체 :

(식 중, R₁, R'₁, R₂, R'₂, R₃, R'₃, R₄, 및 R'₄ 는 서로 독립적으로 -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -OCH₃, -Cl, -C₆H₅ ,-OH, -OCH₂CH₃, -Br, -CF₃, -OCH₂C₆H₅, -OC₆H₅, -OC₆H₄CH₃, -OC₆H₄C(CH₃)₃, -OC₆H₄CF₃, -OC₆H₄Cl, -OCOCH₃, -NHCOCH₃, -CONHCH₃, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH₃ 또는 -C₂H₅ 를 나타낸다.)
하기 화학식 4 의 이민캘릭스아렌 유도체 :

(식 중, R₁, R'₁, R₂, R'₂, R₃, R'₃, R₄, 및 R'₄ 는 서로 독립적으로 -H, -CH₃, -C₂H₅, -C₃H₇, -OCH₃, -Cl, -C₆H₅ ,-OH, -OCH₂CH₃, -Br, -CF₃, -OCH₂C₆H₅, -OC₆H₅, -OC₆H₄CH₃, -OC₆H₄C(CH₃)₃, -OC₆H₄CF₃, -OC₆H₄Cl, -OCOCH₃, -NHCOCH₃, -CONHCH₃, -CN, COOH, 및 -COOR 로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 -COOR 에서 R 은 -CH₃ 또는 -C₂H₅ 를 나타낸다. 또한, 상기 Y₁, Y₂, Y₃ 및 Y₄ 는 서로 독립적으로 -H, -(CH₂)_n-CH=O, -(CH₂)_n-SH, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-CH=O, -(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-SH, -(CH₂)_m-C₆H₄-(CH₂)c-Z, 및 -CO-(CH₂)_m-1-C₆H₄-(CH₂)_c-Z 로 이루어진 군에서 선택된다 (n= 2~15, m= 1~10, c= 0~10, Z=-SH, -CHO, -COOH, -NH₂, 그리고 -C₆H₄- 와 -C₆H₅ 는 페닐기로 정의됨)).
화학식 5 의 화합물과 벤즈알데히드 유도체가 이민결합하여 제 1 항 또는 제 3 항의 이민캘릭스아렌 유도체를 제조하는 방법.
아민 작용기가 부착된 유리, 실리콘웨이퍼 및 수정결정등의 고체기질에 화학식 2 또는 4 의 이민캘릭스아렌 유도체 중 알데히드 말단기를 가진 유도체를 용액상에서 이민결합 방식으로 화학결합시켜 제조한 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 고체기질.
작용기가 부착된 유리, 실리콘웨이퍼 및 수정결정등의 고체기질에 화학식 2 또는 4 의 이민캘릭스아렌 유도체를 에스테르, 에테르, 아민 및 아미드결합 등으로 이민캘릭스아렌 유도체를 고체기질과 결합시켜 제조한 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 고체기질.
화학식 2 또는 4 의 이민캘릭스아렌 유도체 중 티올 말단기를 가진 유도체를 금 기질에 자기조립단분자층으로 제조한 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 금기질.
제 6 항 또는 제 7 항에서 제조된 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 고체기질 또는 제 8 항에서 제조된 이민캘릭스아렌 유도체 단분자층 금기질에 분자/이온 인식에 의한 무변성 단백질 고정화 방법에 따라 비가역적인 분자/이온 인식에 의한 자발적인 단백질 고정화에 의해 제조되며, 고정화 가능한 단백질의 분자량이 10kD 이상인 단백질 칩.