JPH10504974A

JPH10504974A - 標識ヌクレオシド三リン酸を安定化する方法及び組成物

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Publication number: JPH10504974A
Application number: JP8522303A
Authority: JP
Inventors: アール．デユーテイー，スコツト; チアールズケー．ブラツシユ，; ユージーンピー．ステアチアツク，; マークイー．フリーマン，; ローレンスジエー．ブレージン，
Original assignee: フアーマシアバイオテツクインコーポレーテツド
Priority date: 1995-01-18
Filing date: 1996-01-05
Publication date: 1998-05-19
Anticipated expiration: 2016-01-05
Also published as: WO1996022298A1; EP0804446A4; EP0804446B1; JP3093275B2; CA2210900A1; US5808043A; DE69629011T2; CA2210900C; EP0804446A1; DE69629011D1; AU4749796A

Abstract

(57)【要約】１×１０^-11〜１×１０^-2のＭｇ²⁺会合定数を有する少なくとも１つの化合物を含む標識ヌクレオチドの調製剤。前記化合物は好ましくはクエン酸塩、イソクエン酸塩、リン酸塩、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ及びＣＤＴＡからなる群から選択される。前記化合物の濃度は好ましくは少なくとも５ｍＭである。

Description

【発明の詳細な説明】標識ヌクレオシド三リン酸を安定化する方法及び組成物発明の背景発明の分野一般的に、本発明の分野は標識ヌクレオシド三リン酸の安定化された調製剤である。より詳細には、本発明の分野は、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ及び／またはＣＤＴＡを含む緩衝液中で保存される標識ヌクレオシド三リン酸である。技術の背景ＤＮＡ配列決定は一般にサンガー（Sanger）らの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U SA．７４巻、１９７７、５４６３−５４６７ページ）によって行われ、１本鎖または２本鎖ＤＮＡ鋳型から出発する１本鎖ＤＮＡの in vitro 酵素的合成を含む。配列決定プロトコルの最初の実施態様では、最初に、通常は１５〜３０塩基長を有する合成オリゴヌクレオチドのプライマーが、配列決定すべき１本鎖ＤＮＡの鋳型上の相補的配列にアニーリングされた。上記論文、及びここに言及するその他すべての論文及び特許の開示は、ここに参照してその記載を明細書の一部となす。このプライマーの３’末端を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントによって、２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄＮＴＰ）類（このうちの１つは放射性標識を含む）の存在下で伸長させた。４つの配列決定反応を別々に行い、その各々は、４種類すべてのｄＮＴＰ（２’ −デオキシアデノシン５’−三リン酸（ｄＡＴＰ）、２’−デオキシシチジン５ ’−三リン酸（ｄＣＴＰ）、２’−デオキシグアノシン５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）、及び２’−デオキシチミジン５’−三リン酸（ｄＴＴＰ））と、１つの少量の特異的２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−三リン酸鎖終結剤（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、もしくはｄｄＴＴＰのいずれか；または一般にｄｄＮＴＰ）を含む緩衝化反応であった。特定の反応における特異的鎖終結ｄｄＮＴＰのそのｄＮＴＰ同族体に対する比率を変えることによって、ポリメラーゼは、特異的ｄｄＮＴＰのＤＮＡ鋳型に沿ったすべての可能な位置（ここに対応するｄＮＴＰが挿入されるであろう）で置換されたフラグメントの集団を生成した。一段階標識化及びターミネーション工程が完了すると直ぐ、過剰量の４種類すべてのｄＮＴＰ類を各反応に加え、特異的ｄｄＮＴＰによって止まらず、より高分子量のＤＮＡになろうとするすべてのフラグメントを“追いかけた（chase）”。４つの別々の反応の生成物は、その後、高分解能変性ポリアクリルアミドゲル装置上の隣接レーンで分画化される。分離したＤＮＡフラグメントを可視化するためには、そのゲルをＸ線フィルムにさらし、その後そのフィルムを現像した。オートラジオグラム上の各バンドは、プライマーから５’（オートラジオグラムの底）から３’（オートラジオグラムの頂点）への方向のＤＮＡ鋳型の配列におけるその特異的相補的ヌクレオチド塩基に対応する。１９８７年にテイバー及びリチャードソン（Tabor,S.及びC.C.Richardson，Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA．８４巻、１９８７年、４７６７〜４７７１ページ）は、ターミネーション工程から標識化を分離した、Ｔ7 ＤＮＡポリメラーゼを使用する基本的サンガー・プロトコルの変法を記載した。Ｔ7 ＤＮＡポリメラーゼ及び４種類すべてのｄＮＴＰ（その１つは放射性標識されていた）の限定量を、アニールした鋳型及びプライマーに加えた。部分最適重合温度（室温）における短時間の温置工程中に、ポリメラーゼは１００〜数百のｄＮＴＰをプライマーの３’−末端に付加し、その間放射性標識ｄＮＴＰも伸長したフラグメントのすべてに挿入された。標識工程の終わりに、その混合物を等分して４つの別々のターミネーション反応に用いた。各ターミネーション反応は非制限的濃度の４種類すべてのｄＮＴＰ及び１つの特異的ｄｄＮＴＰを含んでいた。ポリメラーゼの最適重合温度（３７℃）で行った第２の短い温置工程後、サンガープロトコルに概略記載されている方法で、ＤＮＡフラグメントの検出が行われた。上記の放射性標識配列決定プロトコルのどちらでも、最終的プロセスは、オートラジオグラムを読んで、規則正しいＤＮＡ配列を生成し、その後、手動でこの配列をデータベースにエントリーし、その後操作することを含んだ。マレイ（Murray,V.Nucl.Acids Res.１７巻、１９８９年、８８８９ページ）は、ＤＮＡフラグメントのｄｄＮＴＰターミネーションを用いて、ＤＮＡ鋳型から配列を生成する新規な方法を記載した。マレイは種々のポリメラーゼ連鎖反応を用い（Mullis,K.B．ら、Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.５１巻、１９８６年、２６３〜２７３ページ；Saiki,R.K.ら、Science ２３０巻、１９８５年、１３５０〜１３５４）、“サイクル配列決定”と名付けた。サイクル配列決定法は、少量の鋳型ＤＮＡを過剰のプライマー、ｄＮＴＰ類、放射性標識ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ類及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて用いる。その混合物は熱サイクルを２０〜３０サイクル受ける。各サイクルは変性、アニーリング及び重合工程からなる。変性温度は典型的には９４℃〜９５℃、一方アニーリング温度は、プライマー、及びＤＮＡ鋳型上のその相補的配列の間の融点（通常は３７℃〜７２℃）に従って計算される。重合温度は反応に用いる熱安定性ポリメラーゼに最適であるように選ぶ。完了したサイクル配列決定反応の処理は、上記の他の２つの方法と同じく、ゲル電気泳動、データ・エントリー及び操作を含む。１９８０年代中頃以降、自動ＤＮＡ配列決定機器類は、上記の放射性標識法を含むゲル電気泳動、データ収集、配列作成及びデータエントリー工程を自動化した。これらの自動機器は、レーザーで励起したときに光子エネルギーを放出するある種の色素を利用し、個別のＤＮＡフラグメントを検出するために放射能を使用する必要がない。これらの機器はすべて、標識ＤＮＡフラグメントを分離するための高分解能ポリアクリルアミドゲル装置を含む。各機器はその底部近くにゲルの長さを横切る点に或る形の検出装置を含み、電気泳動中に蛍光標識フラグメントが移動するとき、それらを検出する。現在、市販の自動機器類は、次の検出技術に基づくものである：（１）ゲルの分離したレーンで行われ検出される配列決定反応の単独蛍光標識プライマーまたはｄＮＴＰ類（Ansorge,W.，ら、Nucl.Acids Res．１５巻、１９８７年、４５９３〜４６０２ページ）、（２）４種類の別々のフッ素で標識したプライマー（スミス（Smith,L.）ら、Nucl.Acids Res.１３巻、１９８５年、２３９９〜２４１２ページ；スミスら,Nature ３２１巻、６７４〜６７９ページ）、この場合は４つの全ての反応物をゲル上の１つのレーンを移動させ、検出することができる、または（３）（２）のやり方と同じであるが、標識プライマーのための４種類の異なる蛍光標識ｄｄＮＴＰ類で置き換える点で異なる方法（プロバー（Prober,J．）ら、Science ２３８巻、１９８７年、３３６〜３４１ページ）。自動レーザー蛍光（ＡＬＦ）ＤＮＡシークエンサー^TM（Pharmacia Biotech In c.）で用いる配列決定反応は、配列データの生成及び収集のためにプライマーまたはｄＮＴＰ分子かどちらかに付着結合した単一の蛍光標識を含む。蛍光標識プライマーを反応に用いるとき、先に基本的に述べたように、Ｔ7 ＤＮＡポリメラーゼとサイクル配列決定とを両方用いる方法によって配列が生成される。両方法とも、放射性標識ｄＮＴＰに代わる標識プライマーを用いて使用するように容易に適応できる。それに加えて、Ｔ7 反応は、プライマーの伸長（標識化）及びターミネーションの両方を単一の工程で行うように若干変更することができ（ボス（Voss,H．）ら、Meth.Mol.& Cell.Biol.,１巻、１９８９年、１５５〜１５９ページ）、非特異的終止フラグメントを除去するために追いかける工程が必要ない。フルオレッセイン−１２−ｄＵＴＰ（２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）またはフルオレッセイン−１５−ｄＡＴＰのどちらかを非標識プライマーと組み合わせて用いてフラグメントの内部を標識することもできる（それぞれ、ボスら、Meth.Mol.& Cell.Biol.，３巻、１９９２年、３０〜３４ページ；ボスら、M eth.Mol.＆Cell.Biol.，３巻、１９９２年、１５３〜１５５ページ）。現在ではＡＬＦＤＮＡシークエンサー^TM（Pharmacia Biotech Inc．）とともに使用するための上記の配列決定法のすべてに使用できる市販品がある。Ｔ7 ＤＮＡポリメラーゼとともに用いるためのフルオレッセイン−１５−ｄＡＴＰ（図１）を含む市販の標識ミックス（フルオロ−ｄＡＴＰ標識ミックス；Ph armacia Biotech Inc.）は、その配列中のデータコレクション４０〜５０塩基に重大な影響を与える蛍光性分解生成物を含んでいた（図２）。この蛍光性分解生成物は配列データの５〜７塩基を規則的に不明瞭にし、この配列決定法を用いる研究者は失われた配列を得るために余分の時間、労力及び経費を消費しなければならなかった。歴史的にｄＮＴＰ類の安定性及び純度と関連するいくつかの問題がある。それらの合成中、出発材料の純度が、糖部分の酸化状態に関して（すなわちＤ−リボース、２’−デオキシ−Ｄ−リボース及び２’，３’−ジデオキシ−Ｄ−リボースの汚染混合物）重大であった（P-L Analects、P-L Biochemicals,Inc.９巻、４号、１９８１年、１及び４ページ）。それに加えて、合成し、精製したｄＮＴＰ類の保存は、−７６℃で固体状であった。しかし、凍結乾燥したｄＮＴＰ類の保存は、その固体を放置して室温にまで温める場合、なお不安定であった。高度に精製した凍結乾燥ｄＮＴＰ類は不均化（disproportionation）を受けやすく、室温に保持するときには１日に１％〜２％の二リン酸塩が生じ（P-L Analects， P-L Biochemicals,Inc．９巻、４号、１９８１年、１及び４ページ）、または溶液中で−２０℃で保存するときには６カ月以内に４％〜１０％の範囲の分解を示した（Boehringer Mannheim Corp.,１９９３年カタログ、７２ページ）。今では、溶液中のｄＮＴＰ類は凍結乾燥形ほど不均化を受けないし（濃度依存性反応）、−２０℃で長期保存した場合もより安定であることが確認されている（３０カ月も保存した後でさえ、＞９９％の三リン酸がある；Analects，Pharmacia Biotech Inc.２２巻、１号、１９９３年、８ページ）。１９８０年代の初期の非同位元素標識ｄＮＴＰ類の出現時には安定性はまだ問題にならなかった（ランガー（Langer,P.R．）ら、Proc．Natl.Acad.Sci.US A７８巻、１９８１年、６６３３〜６６３７ページ）。これらの化合物を使用する反応のタイプは、最終生成物（例えばハイブリダイゼーション）の可視化前に或る形の精製または洗浄工程を含むのが普通であった。配列決定反応における自動的可視化のために、１９９０年代初期に蛍光標識ｄＮＴＰ類が使用されるようになって、始めてｄＮＴＰ溶液の安定性が重要になった。ＤＮＡ配列決定の技術に必要とされるのは、標識ヌクレオシド三リン酸を安定化し、希溶液で保存するときに、配列決定フラグメントの検出に有害である分解生成物の生成を防ぐことができる方法である。発明の要約我々は、驚くべき安定性を示し、先行技術の有害な分解生成物を回避する標識ヌクレオシド三リン酸の調製剤を見い出した。標識ヌクレオチドの安定化された調製剤の一つの形態は、１×１０^-11〜１×１０^-2のＭｇ²⁺会合定数及び少なくとも５ｍＭの濃度を有する少なくとも１つの化合物を含んでなる。標識ヌクレオチドは好ましくは式ＰＭ−ＳＭ−ＢＡＳＥ−ＳＩＧを有し、式中、ＰＭはリン酸塩部分であり、ＳＭは糖部分であり、ＢＡＳＥはピリミジン、プリンまたは７−デアザプリン部分であり、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであるときはＰＭはＳＭの３’または５’位置に及びヌクレオチドがリボヌクレオチドであるときは２ ’、３’または５’位置に付着結合し、ＢＡＳＥがピリミジンであるときはＢＡＳＥはＮ¹位置からＳＭの１’位置に又はＢＡＳＥがプリンもしくは７−デアザプリンであるときはＮ⁹位置に付着結合し、ＳＩＧはＢＡＳＥに共有的に付着結合し、および式中ＳＩＧは検出可能な部分を表わす。好ましくは、前記少なくとも１つの化合物は、クエン酸塩、イソクエン酸塩、リン酸塩、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、及びＣＤＴＡからなる群から選択される。ＳＩＧは好ましくは発蛍光団、発色団、及び放射性標識からなる群から選択される。ＳＩＧはフルオレッセイン類、カルボシアニン類及びローダミン類からなる群から選択するのがより好ましい。ＳＩＧはフルオレッセインであってもよい、したがって標識ヌクレオチドはフルオレッセイン標識ｄＡＴＰであってもよい。ＳＩＧはカルボシアニンであってもよい、したがって標識ヌクレオチドはカルボシアニン標識ｄＡＴＰであってもよい。標識ヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオシドに共有的に付着結合できる。前記化合物は好ましくはカルボン酸、または少なくとも１つのカルボン酸基を有する化合物である。本発明の別の形態は、標識ヌクレオチドに、その化合物の最終濃度が少なくとも５ｍＭとなるように１×１０^-11〜１×１０^-2のＭｇ²⁺会合定数を有する少なくとも１つの化合物を加える工程を含んでなる標識ヌクレオチドを安定化する方法を提供する。その方法は、成分から最初に発熱物質(pyrogen)を除去する工程をさらに含むのが好ましい。ろ過を用いて発熱物質を除去するのが好ましい。本発明の別の形態は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素の存在下で調製剤を温置することを含んでなる前記調製剤の使用方法を提供する。別の面では、標識ヌクレオチドはフルオレッセイン−１５−ｄＡＴＰである。この面では、Ｆ−ｄＡＴＰストック溶液（保存溶液）のための最も好ましいから最も少なく好ましい緩衝液は、順に、ＥＧＴＡ＞クエン酸塩ｐＨ７．７＝ＥＤＴＡ＝ＣＤＴＡ＝イソクエン酸塩ｐＨ７．７＞イソクエン酸塩ｐＨ６．４＝クエン酸塩ｐＨ６．６＞リン酸塩＞ｄＨ₂Ｏであり、他方、希Ｆ−ｄＡＴＰ標識ミックス(labelling mix)のための最も好ましいから最も少なく好ましい緩衝液は、クエン酸塩ｐＨ７．７＝ＥＧＴＡ＝イソクエン酸塩ｐＨ７．７＞ＣＤＴＡ＞クエン酸塩ｐＨ６．６＞ＥＤＴＡ＞イソクエン酸塩ｐＨ６．４＞リン酸塩＞ｄＨ₂Ｏである。また別の面では、標識ヌクレオチドはカルボシアニン−１３−ｄＡＴＰである。この面では、カルボシアニン−ｄＡＴＰストック溶液のための最も好ましいから最も少なく好ましい緩衝液は、ＣＤＴＡ＞ＥＧＴＡ＞ＥＤＴＡ＝イソクエン酸塩ｐＨ６．４＞リン酸塩＞イソクエン酸塩ｐＨ７．７＞クエン酸塩ｐＨ７．７＞クエン酸塩ｐＨ６．６＞ｄＨ₂Ｏであり、他方、希カルボシアニン−ｄＡＴＰ標識ミックスのための最も好ましいから最も少なく好ましい緩衝液は、ＥＤＴＡ＞イソクエン酸塩ｐＨ７．７＞イソクエン酸塩ｐＨ６．４＞ＣＤＴＡ＝クエン酸塩ｐＨ７．７＝クエン酸塩ｐＨ６．６＞ＥＧＴＡ＞リン酸塩＞ｄＨ₂Ｏである。上記の各調製剤における緩衝液の濃度は少なくとも５ｍＭ、好ましくは少なくとも５０ｍＭである。したがって本発明の目的は、上記の種類の標識ヌクレオチドの調製剤であって、（ａ）ＤＮＡ配列決定を妨害する有害な分解生成物を回避し；（ｂ）ＰＣＲ中、標識ｄＮＴＰ類を安定化し；（ｃ）ＰＣＲ中、標識プライマーを安定化し；（ｄ）凍結乾燥中、ｄＮＴＰ類を安定化し；そして（ｅ）標識分子の脱プリン化を防ぐ調製剤を提供することを含む。本発明のこれらの及びその他の目的及び利点は下記の説明から明らかになるであろう。しかしこの説明は好ましい実施態様のためのみのものである。そこで本発明の範囲全体を評価するためには請求の範囲が見られるべきである。図面の簡単な説明図１は、フルオレッセイン−１５−ｄＡＴＰの構造を示す。図２は、配列データを不明瞭にするフルオレッセイン−１５−ｄＡＴＰの脱プリン生成物を示す。図３は、Ｃｙ５^TM−１３−ｄＡＴＰの構造を示す。図４は、５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ７．７、中で安定化したＦ−ｄＡＴＰを用いた配列決定結果を示す。発明の詳細な説明一面において、本発明は、溶液として保存中のフルオレッセイン−１５−ｄＡＴＰ（Ｆ−ｄＡＴＰ）を安定化し、分子の脱プリン化を防ぐ方法を開示する。この安定化方法はＴ7 配列決定反応に容易に組み込まれ、ポリメラーゼの配列データ生成能力に有害な影響を与えるようにはみえない。また別の実施態様において、本発明は、Ｔ7 配列決定反応に他の市販の自動ＤＮＡ配列決定機器、ＡＬＦｒｅｄ^TMＤＮＡシークエンサー（Pharmacia Biotech Inc.）とともに用いるＣｙ５^TM−１３−ｄＡＴＰ含有溶液（Biological Detecti on Systems，Inc.）を保存するための方法及び組成物である。本発明は、ＰＣＲ反応中に使用する標識ｄＮＴＰ、標識プライマー、凍結乾燥中の標識ｄＮＴＰ類、標識ｄｄＮＴＰ類、及びｒＮＴＰ類の安定化のためにも有用である。例下記の例は説明のためのものであり、制限するものではない。温度はすべて摂氏度である（２５°が周囲温度または室温である）。下記の略語を用いる：ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス−（β−アミノ−エチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；ＣＤＴＡ（トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’ −四酢酸）；ｄＨ₂Ｏ（滅菌蒸留水）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ（マイクロモル）；Ｆ−ｄＡＴＰ（フルオレッセイン−１５−ｄＡＴＰ）；ＦＰＬ。Ｍｇ²⁺会合定数（安定度定数）とは、次の文献中で定義され、求められたものを意味する：シレン（L.G.Sillen）ら編、金属イオン錯体の安定度定数（１９６４年）、Special Pub.１７巻、The Chemical Sosiety 、ロンドン；シレンら編、金属イオン錯体の安定度定数、増補１巻（１９７１年）、Special Pub．２５巻、The Chemical Sosiety、ロンドン；ペリン（D.D.Per rin）編、金属- イオン錯体の安定度定数：有機リガンド（１９７９年）、Perga mon Press、オックスフォード；ロソッティ（F.Rossotti）ら著、安定度定数の決定、マグローヒル、ニューヨーク（１９６１年）；及び生化学研究データ、第３版（１９８６年）、ドーソン（R.Dawson）ら編、Clarendon Press、オックスフォード。クエン酸塩ではＭｇ²⁺会合定数は１×１０^-3.6であり、イソクエン酸塩では１ ×１０^-2.6、ＣＤＴＡでは１×１０^-11、ＥＤＴＡでは１×１０^-8.7、ＥＧＴＡでは１×１０^-5.2である。検出可能な部分とは、例えば、蛍光を発するすべての部分、ビオチン、放射性標識、磁気標識、抗体などを意味する。蛍光を発する部分とは、例えば、発蛍光団及び発色団を意味する。安定調製剤のための好ましい化合物は、少なくとも１つのカルボン酸基をもつものである。例１、２、４、５、及び６における種々の試料の電気泳動プロットは、混入（不均化及び脱プリン化）ピークの巾及び高さを基準にして“＋”印（または“− ”印もありうる）を割り当てることによって定性的及び比較的に分析した。各“ ＋”はより大きい程度の安定性を意味する。安定性は、ここでは−２０℃で保持される溶液に比較したものを意味する。すべての緩衝液は、任意に３個の“＋” （＋＋＋）の価を与えたクエン酸塩ｐＨ７．７中の標識ヌクレオチドの安定性と比較した。例１下記の表１に示すように、Ｆ−ｄＡＴＰのストック溶液を、表中の緩衝液で、指示されたｐＨ及び濃度で調製した。各Ｆ−ｄＡＴＰストックからとったアリコートを＋５０°で３日間保存した；同じアリコートを−２０°でも３日間保存した。この期間の終わりに、各アリコートを適当な緩衝液またはｄＨ₂Ｏを用いて０．３μＭに希釈した。５０°での保存は促進安定度テストであることを意味する。それから希釈試料の７μｌを色素担持ゲル５μｌ（ブルーデキストラン２０００、５ｍｇ／ｍｌを含む〜１００％脱イオン化ホルムアミド）と混合し、生成した溶液８μｌを配列決定ゲルのウェルに入れた。自動レーザー蛍光（ＡＬＦ）ＤＮＡシークエンサー^TMを用いて試料の電気泳動を行った。これらの各溶液の電気泳動からのプロットを評価し、下記の表１に列挙した。これらの結果は、次に示す緩衝液の効果を示す：ＥＧＴＡ＞クエン酸塩ｐＨ７．７＝ＥＤＴＡ＝ＣＤＴＡ＝イソクエン酸塩ｐＨ７．７＞イソクエン酸塩ｐＨ６．４＝クエン酸塩ｐＨ６．６＞リン酸塩＞ｄＨ₂Ｏ。例２例１からのＦ−ｄＡＴＰ保存溶液（−２０℃で保存）の各々を希釈し、下記の処方により、Ｔ7 ＤＮＡポリメラーゼとともに使用する標識ミックスを調製した：成分濃度Ｆ−ｄＡＴＰ１０．０μＭｄＣＴＰ１．０μＭｄＧＴＰ１．０μＭｄＴＴＰ１．０μＭ適切な緩衝液５０ｍＭｄＨ₂Ｏを用いた場合以外は、Ｆ−ｄＡＴＰの濃ストックを調製するために用いた同一の緩衝液を用いて標識ミックスを調製した。標識ミックスのアリコートも＋５０°または−２０℃で３日間温置した（例１のように）。温置期間後、適切な緩衝液またはｄＨ₂Ｏを用いて標識ミックスを１：３１に希釈した。希釈標識ミックス７ μｌを、その後、色素担持ゲル５μｌと混合し、生成溶液８μｌを適切な配列決定ゲルのウェルに入れた。これらの溶液の各々の電気泳動からのプロットは次に示す緩衝液の効果を示す：クエン酸塩ｐＨ７．７＝ＥＧＴＡ＝イソクエン酸塩ｐＨ７．７＞ＣＤＴＡ＞クエン酸塩ｐＨ６．６＞ＥＤＴＡ＞イソクエン酸塩ｐＨ６．４＞リン酸塩＞ｄＨ₂Ｏ。加えて、標識ミックスの各々を用いてＴ7 ＤＮＡポリメラーゼ、ＡｕｔｏＲｅａｄ^TM配列決定キット（Pharmacia Biotech Inc.）、非標識プライマー、及びＤＮＡ鋳型としてのＭ１３ｍｐ１８（＋）ストランドでＤＮＡ配列を生成した。ＤＮＡ配列決定反応の結果は上記の電気泳動プロットの結果を反映する。結果を下記の表２にまとめた。例３ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの１００ｍＭストックを、次のような異なるｐＨの１Ｍクエン酸塩ストックを用いて９０ｍＭに希釈した：ｐＨ４．５、ｐＨ６．５、またはｐＨ７．５。すべての希釈液においてクエン酸塩の最終濃度は１００ｍＭであった。すべての試料を、−４０°〜＋１６°の温度勾配を用いて２０時間にわたり凍結乾燥した。乾燥すると直ぐ、試料のすべてをｄＨて、ｐＨ７．５で塩化ナトリウム勾配で分析した。凍結乾燥したｄＮＴＰ類と不均化生成物との統合した数値を下記の表３にまとめる。これらの結果は、凍結乾燥プロセス中、これらの溶液が不均化生成物に対して良い安定性を維持することを示す。例４下記の表４に示すように、Ｃｙ５^TM−ｄＡＴＰのストック溶液を表に示す緩衝液で、指示されたｐＨ及び濃度で調製した。加えて、この試料に用いる適切な緩衝液またはｄＨ₂Ｏも、分子カットオフ１０，０００ｄを有する膜（Centriprep- 10^TM,Amicon,Inc．）を通してろ過した。各Ｃｙ５^TM−ｄＡＴＰストックからのアリコートを＋５０°または−２０°で３日間保存した（例１のように）。この期間の終わりに、各アリコートを適切な緩衝液またはｄＨ₂Ｏを用いて０．３μＭに希釈した。希釈試料７μｌを、その後、色素担持ゲル５μｌと混合し、生成した溶液８μ ｌを配列決定ゲルのウェルに入れた。その試料をＡＬＦｒｅｄ^TMＤＮＡシークエンサー（Pharmacia Biotech Inc.）を用いて電気泳動した。これらの溶液の各々の電気泳動からのプロットを分析し、下記の表４に列挙した。これらの結果は、次の緩衝液の効果を示す：ＣＤＴＡ＞ＥＧＴＡ＞ＥＤＴＡ＝イソクエン酸塩ｐＨ６．４＞リン酸塩＞イソクエン酸塩ｐＨ７．７＞クエン酸塩ｐＨ７．７＞クエン酸塩ｐＨ６．６＞ｄＨ₂Ｏ。例５例４からのＣｙ５^TM−ｄＡＴＰストック溶液（−２０℃で保存したもの）をそれぞれ希釈して、下記の処方により、Ｔ7 ＤＮＡポリメラーゼとともに用いるための標識ミックスを調製した：成分濃度Ｃｙ５−ｄＡＴＰ１０．０μＭｄＣＴＰ１．０μＭｄＧＴＰ１．０μＭｄＴＴＰ１．０μＭ適切な緩衝液５０ｍＭｄＨ₂Ｏを用いた場合を除き、Ｃｙ５^TM−ｄＡＴＰの濃ストックを調製するために用いた同じ緩衝液を用いて、標識ミックスを調製した。標識ミックスのアリコートを＋５０°または−２０℃で３日間温置した（例１と同様）。温置期間後、標識ミックスを適切な緩衝液またはｄＨ₂Ｏを用いて１：３１に希釈した。希釈した標識ミックス７μｌを、その後、色素担持ゲル５μｌと混合し、生成した溶液８μｌを配列決定ゲルのウェルに入れた。これらの溶液の各々の電気泳動からのプロットを分析し、次の緩衝液の効果を示す：ＥＤＴＡ＞イソクエン酸塩ｐＨ７．７＞イソクエン酸塩ｐＨ６．４＝ＣＤＴＡ＝クエン酸塩ｐＨ７．７＝クエン酸塩ｐＨ６．６＞ＥＧＴＡ＞リン酸塩＞ｄＨ₂Ｏ。加えて、標識ミックスの各々を用いて、Ｔ7 ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＬＦｒｅｄ^TMＡｕｔｏＲｅａｄ^TM配列決定キット（Pharmacia Biotech Inc.）、非標識プライマー、及びＤＮＡ鋳型としてのＭ１３ｍｐ１８（＋）ストランドでＤＮＡ配列を生成した。ＤＮＡ配列決定反応結果は、上記の電気泳動プロットの結果を反映している。結果を表５にまとめた。例６Ｃｙ５^TM−標識Ｍ１３ユニバーサルプライマー（５’−Ｃｙ５−ＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’−ＯＨ）を、ろ過した（１０，０００ＭＷカットオフ）ｄＨ₂Ｏ、またはろ過した１０ｍＭイソクエン酸塩、ｐＨ６．６、中に３μＭの濃度で再懸濁した。各溶液のアリコートを −２０°または＋５０°で１７日間保存した（例１のように）。各プライマーの試料をｄＨ₂Ｏまたは１０ｍＭイソクエン酸塩、ｐＨ６．６、で１：１５に適切に希釈し、それから、２μｌプライマー＋５μｌｄＨ₂Ｏ＋５μｌストップ（Sto p）溶液の比率で、ストップ溶液と混合した。各溶液から８μｌを装填し、ＡＬＦｒｅｄ^TMＤＮＡシークエンサーを用いて電気泳動した。さらに、各プライマー溶液２μｌを、ＡＬＦｒｅｄ^TMＡｕｔｏＲｅａｄ^TM配列決定キット、鋳型としてのＭ１３ｍｐ１８（＋）ストランド、及びＡＬＦｒｅｄ^TMＤＮＡシークエンサーを用いるＴ7 配列決定反応に直接用いた。これらのＡＬＦｒｅｄ^TM工程からの結果を分析し、イソクエン酸塩ｐＨ６．６緩衝液が安定化剤として作用したことを示す（下記表６に示すように）。

【手続補正書】【提出日】１９９７年８月１３日【補正内容】（１）請求の範囲の記載を別紙の通り補正します。（２）明細書５頁５行及び２３行の「ＤＮＡシークエンサー^TM」を「ＤＮＡシークエンサー」に補正します。（３）同書１０頁１８行の「Ｃｙ５^TM」を「カルボシアニン」に補正します。（４）同書１１頁５行の「ＡＬＦｒｅｄ^TMＤＮＡ」を「ＡＬＦＲＥＤＤＮＡ」に補正します。（５）同書同頁６〜７行の「Ｃｙ５^TM−１３−ｄＡＴＰ」を「ＣＹ５−１３−ｄＡＴＰ（カルボシアニン−１３−ｄＡＴＰ）」に補正します。（７）同書１３頁１２行の「ＤＮＡシークエンサー^TM」を「ＤＮＡシークエンサー」に補正します。（８）同書１５頁７行「ＡｕｔｏＲｅａｄ^TM」を「ＡＵＴＯＲＥＡＤ」に補正します。るＦＰＬＣ」に補正します。（１０）同書同頁下から７行及び下から２行の「Ｃｙ５^TM」を「ＣＹ５」に補正します。（１１）同書同頁下から４行の「Centriprep-10^TM」を「CENTRIPREP-10」に補正します。（１２）同書１７頁４行の「ＡＬｒｅｄ^TMＤＮＡ」を「ＡＬＦＲＥＤＤＮＡ」に補正します。（１３）同書同頁表４の記載を下記の通りに補正します。（１４）同書同頁下から７行及び１８頁３行の「Ｃｙ５^TM」を「ＣＹ５」に補正します。（１５）同書１８頁１４行の「ＡＬＦ・・・配列」を「ＡＬＦＲＥＤＡＵＴＯＲＥＡＤ配列」に補正します。（１６）同書１９頁表５の記載を下記の通りに補正します。（１７）同書同頁下から１７行の「Ｃｙ５^TM」を「ＣＹ５」に補正します。（１８）同書同頁下から８行及び下から５行の「ＡＬＦ・・・ＤＮＡ」を「ＡＬＦＲＥＤＤＮＡ」に補正します。（１９）同書同頁下から６行の「ＡＬＦ・・・配列」を「ＡＬＦＲＥＤＡＵＴＯＲＥＡＤ配列」に補正します。（２０）同書同頁下から４〜３行の「ＡＬＦｒｅｄ^TM」を「ＡＬＦＲＥＤ」に補正します。請求の範囲１．標識ヌクレオチド、及び１×１０^-11〜１×１０^-2のＭｇ²⁺会合定数を有する少なくとも１つの化合物を含んでなり、前記化合物の濃度が少なくとも５ｍＭであることを特徴とする調製剤。２．標識ヌクレオチドが式ＰＭ−ＳＭ−ＢＡＳＥ−ＳＩＧを有し、式中、ＰＭはリン酸塩部分であり、ＳＭは糖部分であり、ＢＡＳＥはピリミジン、プリンまたは７−デアザプリン部分であり、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであるときはＰＭはＳＭの３’または５’位置に及びヌクレオチドがリボヌクレオチドであるときは２’、３’または５’位置に付着結合し、ＢＡＳＥがピリミジンであるときはＢＡＳＥはＮ¹位置からＳＭの１’位置に又はＢＡＳＥがプリンもしくは７−デアザプリンであるときはＮ⁹位置に付着結合し、ＳＩＧはＢＡＳＥに共有的に付着結合し、および式中ＳＩＧは検出可能な部分を表わす請求項１記載の調製剤。３．前記少なくとも１つの化合物が、クエン酸塩、イソクエン酸塩、リン酸塩、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ及びＣＤＴＡからなる群から選択される請求項２記載の調製剤。４．ＳＩＧが発蛍光団及び発色団からなる群から選択される請求項３記載の調製剤。５．ＳＩＧがフルオレッセイン類、カルボシアニン類及びローダミン類からなる群から選択される請求項３記載の調製剤。６．ＳＩＧがフルオレッセインである請求項５記載の調製剤。７．標識ヌクレオチドがフルオレッセイン標識ｄＡＴＰである請求項６記載の調製剤。８．ＳＩＧがカルボシアニンである請求項５記載の調製剤。９．標識ヌクレオチドがカルボシアニン標識ｄＡＴＰである請求項８記載の調製剤。１０．標識ヌクレオチドが少なくとも１つのヌクレオシドに共有的に付着結合している請求項１記載の調製剤。１１．前記化合物がカルボン酸である請求項１記載の調製剤。１２．標識ヌクレオチドに、その化合物の最終濃度が少なくとも５ｍＭとなるように１×１０^-11〜１×１０^-2のＭｇ²⁺会合定数を有する少なくとも１つの化合物を加える工程を含んでなることを特徴とする標識ヌクレオチドを安定化する方法。１３．成分から最初に発熱物質を除去する工程をさらに含む請求項１２記載の方法。１４．除去工程がろ過により行われる請求項１３記載の方法。１５．ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される重合方法であって、基質として請求項１の調製剤を用いることを含んでなることを特徴とする方法。１６．ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される重合方法であって、基質として請求項１の調製剤を用いることを含んでなることを特徴とする方法。１７．逆転写酵素によって触媒される重合方法であって、基質として請求項１の調製剤を用いることを含んでなることを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ブラツシユ，チアールズケー. アメリカ合衆国 53217 ウイスコンシンホワイトフイシユベイノースアルドモアアベニユー 5118 (72)発明者ステアチアツク，ユージーンピー. アメリカ合衆国 53223 ウイスコンシンブラウンデイアーノース 62ンドストリート 8684 (72)発明者フリーマン，マークイー. アメリカ合衆国 08846 ニユージヤージーミドルセツクスジヤイルズアベニユー 200 (72)発明者ブレージン，ローレンスジエー. アメリカ合衆国 53235 ウイスコンシンセントフランシスサウスエレンストリート 3637

Claims

【特許請求の範囲】１．１×１０^-11〜１×１０^-2のＭｇ²⁺会合定数及び少なくとも５ｍＭの濃度を有する少なくとも１つの化合物を含んでなる標識ヌクレオチドの調製剤。２．標識ヌクレオチドが式ＰＭ−ＳＭ−ＢＡＳＥ−ＳＩＧを有し、式中、ＰＭはリン酸塩部分であり、ＳＭは糖部分であり、ＢＡＳＥはピリミジン、プリンまたは７−デアザプリン部分であり、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであるときはＰＭはＳＭの３’または５’位置に及びヌクレオチドがリボヌクレオチドであるときは２’、３’または５’位置に付着結合し、ＢＡＳＥがピリミジンであるときはＢＡＳＥはＮ¹位置からＳＭの１’位置に又はＢＡＳＥがプリンもしくは７−デアザプリンであるときはＮ⁹位置に付着結合し、ＳＩＧはＢＡＳＥに共有的に付着結合し、および式中ＳＩＧは検出可能な部分を表わす請求項１記載の調製剤。３．前記少なくとも１つの化合物が、クエン酸塩、イソクエン酸塩、リン酸塩、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ及びＣＤＴＡからなる群から選択される請求項２記載の調製剤。４．ＳＩＧが発蛍光団、発色団及び放射性標識からなる群から選択される請求項３記載の調製剤。５．ＳＩＧがフルオレッセイン類、カルボシアニン類及びローダミン類からなる群から選択される請求項３記載の調製剤。６．ＳＩＧがフルオレッセインである請求項５記載の調製剤。７．標識ヌクレオチドがフルオレッセイン標識ｄＡＴＰである請求項６記載の調製剤。８．ＳＩＧがカルボシアニンである請求項５記載の調製剤。９．標識ヌクレオチドがカルボシアニン標識ｄＡＴＰである請求項８記載の調製剤。１０．標識ヌクレオチドが少なくとも１つのヌクレオシドに共有的に付着結合している請求項１記載の調製剤。１１．前記化合物がカルボン酸である請求項１記載の調製剤。１２．標識ヌクレオチドに、その化合物の最終濃度が少なくとも５ｍＭとなるように１×１０^-11〜１×１０^-2のＭｇ²⁺会合定数を有する少なくとも１つの化合物を加える工程を含んでなる標識ヌクレオチドを安定化する方法。１３．成分から最初に発熱物質を除去する工程をさらに含む請求項１２記載の方法。１４．除去工程がろ過により行われる請求項１３記載の方法。１５．ＤＮＡポリメラーゼの存在下で調製剤を温置することを含んでなる請求項１の調製剤の使用方法。１６．ＲＮＡポリメラーゼの存在下で調製剤を温置することを含んでなる請求項１の調製剤の使用方法。１７．逆転写酵素の存在下で調製剤を温置することを含んでなる請求項１の調製剤の使用方法。