JPH0661280B2 - ヌクレオシド−５’−ｏ−（１−チオトリホスフェート）を用いる改良された核酸シーケンス分析 - Google Patents
ヌクレオシド−５’−ｏ−（１−チオトリホスフェート）を用いる改良された核酸シーケンス分析Info
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- JPH0661280B2 JPH0661280B2 JP3517034A JP51703491A JPH0661280B2 JP H0661280 B2 JPH0661280 B2 JP H0661280B2 JP 3517034 A JP3517034 A JP 3517034A JP 51703491 A JP51703491 A JP 51703491A JP H0661280 B2 JPH0661280 B2 JP H0661280B2
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は一般に核酸シーケンス分析に関し、さらに特
に、ＤＮＡシーケンシングへの鎖終結のアプローチにお
けるＤＮＡポリメラーゼ基質としてのヌクレオシド−
５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）の使用に関す
るものである。
に、ＤＮＡシーケンシングへの鎖終結のアプローチにお
けるＤＮＡポリメラーゼ基質としてのヌクレオシド−
５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）の使用に関す
るものである。
背景 ＤＮＡシーケンスを決定するための能力は遺伝子の機能
およびコントロールを理解するため、および分子生物学
の多くの基礎技術に応用するために重要である。本来の
ＤＮＡは２つの線状ポリマーまたはヌクレオチドのらせ
ん構造から成る。各らせん構造はホスホジエステル結合
によって結合したヌクレオシドの鎖である。２つのらせ
ん構造は共に２つのらせん構造のヌクレオチドの相補的
塩基の間：チミジン（Ｔ）とデオキシアデノシン（Ａ）
のペア、およびデオキシシチジン（Ｃ）とデオキシグア
ノシン（Ｇ）のペアの、水素結合によって逆平行の配向
で保持される。
およびコントロールを理解するため、および分子生物学
の多くの基礎技術に応用するために重要である。本来の
ＤＮＡは２つの線状ポリマーまたはヌクレオチドのらせ
ん構造から成る。各らせん構造はホスホジエステル結合
によって結合したヌクレオシドの鎖である。２つのらせ
ん構造は共に２つのらせん構造のヌクレオチドの相補的
塩基の間：チミジン（Ｔ）とデオキシアデノシン（Ａ）
のペア、およびデオキシシチジン（Ｃ）とデオキシグア
ノシン（Ｇ）のペアの、水素結合によって逆平行の配向
で保持される。
現在、ＤＮＡシーケンスの決定には２つの基本的なアプ
ローチがある：ジデオキシチェインターミネーター法、
例えば、サンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.）、第74巻、5463-5467頁 (1977)；および化学的分解方法、例えば、マクサムら、
プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、
第74巻、560-564頁(1977)。チェインターミネーター法
は幾つかの方法で改良され、現在入手できる自動化ＤＮ
Ａシーケンシング機械のすべてに対して基準として役に
立つ、例えばサンガーら、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジイ（J.Mol.Biol.），第143巻、161-17
8頁(1980)；シュライヤーら、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジイ（J.Mol.Biol.）、第129巻、16
9-172頁(1979)；ミルスら、プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.、第76巻、2232-2235頁(1979)；
スミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nuclei
c Acids Research）、第13巻、2399-2412頁(1985)；ス
ミスら、ネイチャー（Nature）、第321巻、674-679頁(1
987)；プロバーら、サイエンス（Science）、第238巻、
336-341頁(1987)、セクションII、メソッズ・イン・エ
ンザイモロジイ（Meth.Enzymol.）、第155巻、51-334頁
(1987)；チャーチら、サイエンス（Science），第240
巻、185-188頁(1988)；タボールら、プロシーディング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）第84巻、4767-4771頁
(1987)；タボールら、プロシーディングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.）、第86巻、4076-4080頁(1989)；イ
ンニスら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）、第85巻、9436-9440頁(1988)；およびコンネ
ルら、バイオテクニクス（Biotechniques）、第５巻、3
42-348頁(1987)。
ローチがある：ジデオキシチェインターミネーター法、
例えば、サンガーら、プロシーディングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.）、第74巻、5463-5467頁 (1977)；および化学的分解方法、例えば、マクサムら、
プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、
第74巻、560-564頁(1977)。チェインターミネーター法
は幾つかの方法で改良され、現在入手できる自動化ＤＮ
Ａシーケンシング機械のすべてに対して基準として役に
立つ、例えばサンガーら、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジイ（J.Mol.Biol.），第143巻、161-17
8頁(1980)；シュライヤーら、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジイ（J.Mol.Biol.）、第129巻、16
9-172頁(1979)；ミルスら、プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.、第76巻、2232-2235頁(1979)；
スミスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nuclei
c Acids Research）、第13巻、2399-2412頁(1985)；ス
ミスら、ネイチャー（Nature）、第321巻、674-679頁(1
987)；プロバーら、サイエンス（Science）、第238巻、
336-341頁(1987)、セクションII、メソッズ・イン・エ
ンザイモロジイ（Meth.Enzymol.）、第155巻、51-334頁
(1987)；チャーチら、サイエンス（Science），第240
巻、185-188頁(1988)；タボールら、プロシーディング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）第84巻、4767-4771頁
(1987)；タボールら、プロシーディングス・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.）、第86巻、4076-4080頁(1989)；イ
ンニスら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）、第85巻、9436-9440頁(1988)；およびコンネ
ルら、バイオテクニクス（Biotechniques）、第５巻、3
42-348頁(1987)。
チェインターミネーター法と化学的分解方法の両者は、
各々が共通の起源をもち、各々が既知の塩基で終結して
いる１組またはそれ以上の標識ＤＮＡフラグメントの世
代を必要とする。次に単数または複数の組のフラグメン
トは大きさによって分離されてシーケンス情報が得られ
る。両方法において、ＤＮＡフラグメントは高分解ゲル
電気泳動によって分離される。通常、ＤＮＡフラグメン
トは放射活性ヌクレオシドトリホスフェート前駆物質に
よって、または蛍光染料によって標識化される。
各々が共通の起源をもち、各々が既知の塩基で終結して
いる１組またはそれ以上の標識ＤＮＡフラグメントの世
代を必要とする。次に単数または複数の組のフラグメン
トは大きさによって分離されてシーケンス情報が得られ
る。両方法において、ＤＮＡフラグメントは高分解ゲル
電気泳動によって分離される。通常、ＤＮＡフラグメン
トは放射活性ヌクレオシドトリホスフェート前駆物質に
よって、または蛍光染料によって標識化される。
大抵の自動化ＤＮＡシーケンシング機械において、異な
る末端塩基をもつフラグメントは異なる蛍光染料を用い
て標識化され、プライマー、例えばスミスら（1987、上
記引用）、または末端ジデオキシヌクレオチド、例えば
プロバーら（上記引用）のいずれかに結合している。蛍
光により標識化されたフラグメントは電気泳動分離のた
めに同じゲルカラムに一緒に装填される。塩基シーケン
スは分離工程中に固定検出器を通過するときフラグメン
トによって放出される蛍光信号を分析して決定される。
る末端塩基をもつフラグメントは異なる蛍光染料を用い
て標識化され、プライマー、例えばスミスら（1987、上
記引用）、または末端ジデオキシヌクレオチド、例えば
プロバーら（上記引用）のいずれかに結合している。蛍
光により標識化されたフラグメントは電気泳動分離のた
めに同じゲルカラムに一緒に装填される。塩基シーケン
スは分離工程中に固定検出器を通過するときフラグメン
トによって放出される蛍光信号を分析して決定される。
このような分析は、多くの現象によって複雑であった、
例えばバンド圧縮、部分的に重なる蛍光標識の発光バン
ド、人為バンドの出現、標識化ジデオキシヌクレオシド
の誤混入によるノイズ、および高度にシーケンスに依存
する方法での強度において幅広く変化するバンド、例え
ばミルスら（上記引用）、コンネルら（上記引用）、お
よびタボールら（1987および1989、上記引用）。後の２
つの現象は、一定の鋳型シーケンスを通して読みこむ際
におよび／または若干の普通に用いられるヌクレオシド
類似体を適応させる際に、若干のＤＮＡポリメラーゼが
もたらす問題点によって生じると信じられている。バン
ドの均等性は多くの事例において修飾Ｔ７ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Sequenase（登録商標））を使用しておよびポ
リメラーゼ反応において二価のカチオンとしてＭｎ+2を
Ｍｇ+2と置換して改良されてきた、タボールら（1987お
よび1989、上記引例）。しかし、問題は残っており、最
新の自動化ＤＮＡシーケンスのアプローチには今なお重
大な制限がある。
例えばバンド圧縮、部分的に重なる蛍光標識の発光バン
ド、人為バンドの出現、標識化ジデオキシヌクレオシド
の誤混入によるノイズ、および高度にシーケンスに依存
する方法での強度において幅広く変化するバンド、例え
ばミルスら（上記引用）、コンネルら（上記引用）、お
よびタボールら（1987および1989、上記引用）。後の２
つの現象は、一定の鋳型シーケンスを通して読みこむ際
におよび／または若干の普通に用いられるヌクレオシド
類似体を適応させる際に、若干のＤＮＡポリメラーゼが
もたらす問題点によって生じると信じられている。バン
ドの均等性は多くの事例において修飾Ｔ７ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Sequenase（登録商標））を使用しておよびポ
リメラーゼ反応において二価のカチオンとしてＭｎ+2を
Ｍｇ+2と置換して改良されてきた、タボールら（1987お
よび1989、上記引例）。しかし、問題は残っており、最
新の自動化ＤＮＡシーケンスのアプローチには今なお重
大な制限がある。
発明の概要 本発明は異なる大きさのＤＮＡフラグメントをヌクレオ
シド−５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）前駆体
から重合するＤＮＡシーケンス分析のチェインターミネ
ーター法に関する。本発明は、一部は、通常のヌクレオ
シドトリホスフェート前駆体の代りにこのような前駆体
を使用すると、(i)重合においてシーケンス特有の小休
止が少なくなり、(ii)重合中のＤＮＡフラグメントの個
体群が一層均一になり、順番に、電気泳動分離中にバン
ドが一層均一な大きさになり、そして(iii)蛍光標識化
したジデオキシヌクレオチドを鎖終結ヌクレオチドとし
て使用するときは常にデオキシグアノシントリホスフェ
ートの代りにヌクレオシド類似体を使用する必要がなく
なるという発見に基づくものである。好ましくは、本方
法はタボールら（1987および1989、上記引用）によって
教示されたような修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼおよびＭ
ｎ+2を用いる。
シド−５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）前駆体
から重合するＤＮＡシーケンス分析のチェインターミネ
ーター法に関する。本発明は、一部は、通常のヌクレオ
シドトリホスフェート前駆体の代りにこのような前駆体
を使用すると、(i)重合においてシーケンス特有の小休
止が少なくなり、(ii)重合中のＤＮＡフラグメントの個
体群が一層均一になり、順番に、電気泳動分離中にバン
ドが一層均一な大きさになり、そして(iii)蛍光標識化
したジデオキシヌクレオチドを鎖終結ヌクレオチドとし
て使用するときは常にデオキシグアノシントリホスフェ
ートの代りにヌクレオシド類似体を使用する必要がなく
なるという発見に基づくものである。好ましくは、本方
法はタボールら（1987および1989、上記引用）によって
教示されたような修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼおよびＭ
ｎ+2を用いる。
ここで使用されるように、“鎖終結ヌクレオチド”の用
語は、核酸ポリメラーゼによって成長するＤＮＡ鎖に混
入した後に、さらにポリヌクレオチド鎖の伸長、または
拡大を妨げるヌクレオチドまたはその類似体を意味す
る。通常、このようなヌクレオチドの鎖終結の性質は糖
部分の３′水酸基が存在しないかまたは修飾されている
ことに原因がある。好ましくは、鎖終結ヌクレオチドは
２′，３′−ジデオキシヌクレオチドである。
語は、核酸ポリメラーゼによって成長するＤＮＡ鎖に混
入した後に、さらにポリヌクレオチド鎖の伸長、または
拡大を妨げるヌクレオチドまたはその類似体を意味す
る。通常、このようなヌクレオチドの鎖終結の性質は糖
部分の３′水酸基が存在しないかまたは修飾されている
ことに原因がある。好ましくは、鎖終結ヌクレオチドは
２′，３′−ジデオキシヌクレオチドである。
ここで使用されるように、１組の染料に関して“スペク
トルによって分解できる”の用語は、染料の蛍光放出バ
ンドが十分に明確である、即ち十分に部分的な重なりが
ないことを意味し、各染料が結合している標的物質、例
えばポリヌクレオチドが、標準の光検出システムによっ
て各染料によって発生した蛍光信号に基づき、識別する
ことができ、このようなシステムには、例えば米国特許
第4,230,558号、4,811,218号等に、あるいはホイーレス
ら（Flow Cytometry：Instrumentation and Data Analy
sis、21−76頁、アカデミック・プレス、ニューヨー
ク、1985）に記載されたシステムによって例示されるよ
うな、バンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシス
テムを用いる。
トルによって分解できる”の用語は、染料の蛍光放出バ
ンドが十分に明確である、即ち十分に部分的な重なりが
ないことを意味し、各染料が結合している標的物質、例
えばポリヌクレオチドが、標準の光検出システムによっ
て各染料によって発生した蛍光信号に基づき、識別する
ことができ、このようなシステムには、例えば米国特許
第4,230,558号、4,811,218号等に、あるいはホイーレス
ら（Flow Cytometry：Instrumentation and Data Analy
sis、21−76頁、アカデミック・プレス、ニューヨー
ク、1985）に記載されたシステムによって例示されるよ
うな、バンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシス
テムを用いる。
ここに用いるように、“バンド”の用語は、類似または
同一の物理化学的性質に基づくポリヌクレオチドの任意
の空間的配置または集合を含む。通常バンドはゲル電気
泳動による標識化ＤＮＡフラグメントの分離で生じる。
同一の物理化学的性質に基づくポリヌクレオチドの任意
の空間的配置または集合を含む。通常バンドはゲル電気
泳動による標識化ＤＮＡフラグメントの分離で生じる。
図面の簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂはヌクレオシドトリホスフェート前駆
体（１Ａ）およびヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオ
トリホスフェート）前駆体（１Ｂ）を用いて重合化した
ＤＮＡフラグメントのバンドの蛍光強度を示す。ＤＮＡ
フラグメントは２′，７′−ジクロロフルオレセインを
用いて標識化した末端ジデオキシシチジンを含む。
体（１Ａ）およびヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオ
トリホスフェート）前駆体（１Ｂ）を用いて重合化した
ＤＮＡフラグメントのバンドの蛍光強度を示す。ＤＮＡ
フラグメントは２′，７′−ジクロロフルオレセインを
用いて標識化した末端ジデオキシシチジンを含む。
図２Ａおよび２Ｂはヌクレオシドトリホスフェート前駆
体（２Ａ）およびヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオ
トリホスフェート）前駆体（２Ｂ）を用いて重合化した
ＤＮＡフラグメントのバンドの蛍光強度を示す。ＤＮＡ
フラグメントはフルオレセインを用いて標識化した末端
ジデオキシチミジンを含む。
体（２Ａ）およびヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオ
トリホスフェート）前駆体（２Ｂ）を用いて重合化した
ＤＮＡフラグメントのバンドの蛍光強度を示す。ＤＮＡ
フラグメントはフルオレセインを用いて標識化した末端
ジデオキシチミジンを含む。
発明の詳細な説明 ＤＮＡシーケンシングへの鎖終結のアプローチの基本的
な工程は、（１）オリゴヌクレオチドプライマーおよ
び、サブシーケンスとして、そのシーケンスが決定され
ることになっている標的核酸を含有する鋳型核酸を与
え、（２）鋳型核酸に対してオリゴヌクレオチドプライ
マーをハイブリッド形成し、（３）核酸ポリメラーゼ、
例えばエキソヌクレアーゼ活性を実質的に失活させたＴ
７ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ（登録商標）、リ
バーストランスクリプターゼ等を用いて、ヌクレオシド
トリホスフェート前駆体および少なくとも１種の鎖終結
ヌクレオチドを含有する反応混合物において、プライマ
ーを伸長し、各短いＤＮＡフラグメントが各長いＤＮＡ
フラグメントのサブシーケンスであるように、そして同
じ大きさの各ＤＮＡフラグメントが同じ鎖終結ヌクレオ
チドを用いて終結するように、ＤＮＡフラグメント個体
群のネストシリーズを形成し、（４）大きさによってＤ
ＮＡフラグメント個体群を分離し、そして（５）各ＤＮ
Ａフラグメント個体群と結合した鎖終結ヌクレオチドを
同定する。ここで使用するように、“ヌクレオシドトリ
ホスフェート前駆体”の用語はデオキシアデノシントリ
ホスフェート（ＡＴＰ）、デオキシシチジントリホスフ
ェート（ＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェー
ト（ＧＴＰ）、およびチミジントリホスフェート（ＴＴ
Ｐ）、またはそれらの類似体、例えばデオキシイノシン
トリホスフェート（ＩＴＰ）、７−デアザデオキシグア
ノシントリホスフェート等を意味する。上記工程の各々
の詳細は、異なる鎖終結ヌクレオチドを同定するための
標識化方法の性質、異なるＤＮＡフラグメント個体群を
分離するための手段、鋳型核酸がハイブリッド形成工程
のために提供される方法等、当該分野において良く知ら
れた幾つかの要素に従って変更する。例えば、ＤＮＡフ
ラグメント個体群がプライマーに結合した蛍光染料によ
って同定されるならば、そのとき４種のプライマーが与
えられ、各々は異なる蛍光標識を有し、プライマーは４
種の鎖終結ヌクレオチドに対応する４つの異なる反応混
合物において伸長する。あるいは、ＤＮＡフラグメント
個体群が伸長工程中に放射活性により標識化されたヌク
レオシドトリホスフェートを混入させて同定されるなら
ば、そのとき伸長工程は通常４つの別の反応混合物を含
み、各々は異なる鎖終結ヌクレオチドを含み、そして分
離工程は通常大きさに従って各反応混合物のＤＮＡフラ
グメント個体群を別々に分離することを含む。一般に、
背景のセクションの第２節で引用した文献はＤＮＡシー
ケンシングの工程とその重要な変更を開示する。従っ
て、これらの文献は参考文献として組み込まれる。
な工程は、（１）オリゴヌクレオチドプライマーおよ
び、サブシーケンスとして、そのシーケンスが決定され
ることになっている標的核酸を含有する鋳型核酸を与
え、（２）鋳型核酸に対してオリゴヌクレオチドプライ
マーをハイブリッド形成し、（３）核酸ポリメラーゼ、
例えばエキソヌクレアーゼ活性を実質的に失活させたＴ
７ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ（登録商標）、リ
バーストランスクリプターゼ等を用いて、ヌクレオシド
トリホスフェート前駆体および少なくとも１種の鎖終結
ヌクレオチドを含有する反応混合物において、プライマ
ーを伸長し、各短いＤＮＡフラグメントが各長いＤＮＡ
フラグメントのサブシーケンスであるように、そして同
じ大きさの各ＤＮＡフラグメントが同じ鎖終結ヌクレオ
チドを用いて終結するように、ＤＮＡフラグメント個体
群のネストシリーズを形成し、（４）大きさによってＤ
ＮＡフラグメント個体群を分離し、そして（５）各ＤＮ
Ａフラグメント個体群と結合した鎖終結ヌクレオチドを
同定する。ここで使用するように、“ヌクレオシドトリ
ホスフェート前駆体”の用語はデオキシアデノシントリ
ホスフェート（ＡＴＰ）、デオキシシチジントリホスフ
ェート（ＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェー
ト（ＧＴＰ）、およびチミジントリホスフェート（ＴＴ
Ｐ）、またはそれらの類似体、例えばデオキシイノシン
トリホスフェート（ＩＴＰ）、７−デアザデオキシグア
ノシントリホスフェート等を意味する。上記工程の各々
の詳細は、異なる鎖終結ヌクレオチドを同定するための
標識化方法の性質、異なるＤＮＡフラグメント個体群を
分離するための手段、鋳型核酸がハイブリッド形成工程
のために提供される方法等、当該分野において良く知ら
れた幾つかの要素に従って変更する。例えば、ＤＮＡフ
ラグメント個体群がプライマーに結合した蛍光染料によ
って同定されるならば、そのとき４種のプライマーが与
えられ、各々は異なる蛍光標識を有し、プライマーは４
種の鎖終結ヌクレオチドに対応する４つの異なる反応混
合物において伸長する。あるいは、ＤＮＡフラグメント
個体群が伸長工程中に放射活性により標識化されたヌク
レオシドトリホスフェートを混入させて同定されるなら
ば、そのとき伸長工程は通常４つの別の反応混合物を含
み、各々は異なる鎖終結ヌクレオチドを含み、そして分
離工程は通常大きさに従って各反応混合物のＤＮＡフラ
グメント個体群を別々に分離することを含む。一般に、
背景のセクションの第２節で引用した文献はＤＮＡシー
ケンシングの工程とその重要な変更を開示する。従っ
て、これらの文献は参考文献として組み込まれる。
好ましくは、異なるＤＮＡフラグメント個体群は鎖終結
ヌクレオチドに結合した蛍光染料によって同定される。
従って、本発明の方法において、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴ
Ｐ、およびＴＴＰの４種の１−チオトリホスフェート類
似体、および４種の鎖終結ヌクレオチドを含有する反応
混合物中のＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、各々
は米国特許第4,855,225号にフングらによって、または
プロバーら（上記引用）等によって開示されたように、
スペクトルによって分解できる１組の蛍光染料の異なる
部分を用いて標識化される。
ヌクレオチドに結合した蛍光染料によって同定される。
従って、本発明の方法において、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴ
Ｐ、およびＴＴＰの４種の１−チオトリホスフェート類
似体、および４種の鎖終結ヌクレオチドを含有する反応
混合物中のＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、各々
は米国特許第4,855,225号にフングらによって、または
プロバーら（上記引用）等によって開示されたように、
スペクトルによって分解できる１組の蛍光染料の異なる
部分を用いて標識化される。
ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＴＴＰの１−チオトリ
ホスフェート類似体はヌクレオシドホスホロチオエート
と呼ばれる一般クラスの化合物の良く知られたサブセッ
トであり、酵素学において大量に使用されている、例え
ばエックスタイン、アニュアル・レビュー・バイオケミ
ストリイ（Ann.Rev.Biochem.）、第54巻、367-402頁(19
85)；およびエックスタインら、トレンズ・イン・バイ
オケミカル・サイエンス（Trends in Biochemical Scie
nce）、第14巻、97-100頁(1989)。ヌクレオシド−５′
−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）は市販品として入
手でき、例えばアマーシャム（アーリントン・ハイツ・
ＩＬ）あるいはルドウイグら、ジャーナル・オブ・オー
ガニック・ケミストリイ（J.Org.Chem.）、第54巻、631
-635頁(1989)に従って合成することができる。
ホスフェート類似体はヌクレオシドホスホロチオエート
と呼ばれる一般クラスの化合物の良く知られたサブセッ
トであり、酵素学において大量に使用されている、例え
ばエックスタイン、アニュアル・レビュー・バイオケミ
ストリイ（Ann.Rev.Biochem.）、第54巻、367-402頁(19
85)；およびエックスタインら、トレンズ・イン・バイ
オケミカル・サイエンス（Trends in Biochemical Scie
nce）、第14巻、97-100頁(1989)。ヌクレオシド−５′
−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）は市販品として入
手でき、例えばアマーシャム（アーリントン・ハイツ・
ＩＬ）あるいはルドウイグら、ジャーナル・オブ・オー
ガニック・ケミストリイ（J.Org.Chem.）、第54巻、631
-635頁(1989)に従って合成することができる。
鋳型は当該分野の技術、例えば、テクニカル・マニュア
ル・フォア・モデル370AＤＮＡシーケンサー（アプライ
ド・バイオシステムス社、フォスター・シティ、ＣＡ）
によって提供される。例えば、標的シーケンスは適当な
クローニングベクター、例えばＭ13クローニングベクタ
ーの複製型に挿入でき、次に標的シーケンスのコピーの
数を増幅するように増殖される。Ｍ13の一本鎖型は鋳型
として使用するために単離される。あるいは、鋳型を当
該分野で教示されているようにポリメラーゼ鎖反応（Ｐ
ＣＲ）によって与えることができ、例えばインニスら、
（上記引用）；ウィルソンら、バイオテクニクス（Biot
echniques）、第８巻、184-189頁(1990)；ギレンステ
ン、バイオテクニクス（Biotechniques）、第７巻、700
-708頁(1989)等がある。増幅後、液相中または固相支持
体に結合して重合反応で鋳型を使用することができ、例
えばスタールら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Nucleic Acids Research）、第16巻、3025-3038頁(19
88)；フルトマンら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucleic Acids Research）、第17巻、4937-4946頁
(1989)等によって教示されている。
ル・フォア・モデル370AＤＮＡシーケンサー（アプライ
ド・バイオシステムス社、フォスター・シティ、ＣＡ）
によって提供される。例えば、標的シーケンスは適当な
クローニングベクター、例えばＭ13クローニングベクタ
ーの複製型に挿入でき、次に標的シーケンスのコピーの
数を増幅するように増殖される。Ｍ13の一本鎖型は鋳型
として使用するために単離される。あるいは、鋳型を当
該分野で教示されているようにポリメラーゼ鎖反応（Ｐ
ＣＲ）によって与えることができ、例えばインニスら、
（上記引用）；ウィルソンら、バイオテクニクス（Biot
echniques）、第８巻、184-189頁(1990)；ギレンステ
ン、バイオテクニクス（Biotechniques）、第７巻、700
-708頁(1989)等がある。増幅後、液相中または固相支持
体に結合して重合反応で鋳型を使用することができ、例
えばスタールら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Nucleic Acids Research）、第16巻、3025-3038頁(19
88)；フルトマンら、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucleic Acids Research）、第17巻、4937-4946頁
(1989)等によって教示されている。
本発明方法のためのプライマーは市販のＤＮＡシンセサ
イザーで合成することができ、あるいは単独またはＤＮ
Ａ増幅および／またはシーケンシングキット中の成分と
して、例えば、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカ
ル・コーポレイション（クリーブランド、ＯＨ）、クロ
ンテク（パロ・アルト、ＣＡ）等から購入することがで
きる。プライマーを鋳型にハイブリッド形成する工程は
引用した参考文献に十分に開示されており、本発明の任
意の特定例に応用するための詳細な手引きとなる。
イザーで合成することができ、あるいは単独またはＤＮ
Ａ増幅および／またはシーケンシングキット中の成分と
して、例えば、ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカ
ル・コーポレイション（クリーブランド、ＯＨ）、クロ
ンテク（パロ・アルト、ＣＡ）等から購入することがで
きる。プライマーを鋳型にハイブリッド形成する工程は
引用した参考文献に十分に開示されており、本発明の任
意の特定例に応用するための詳細な手引きとなる。
好ましくは蛍光により標識化した本発明の鎖終結ヌクレ
オチドは次式で表される： ＸＴＰ−Ｌ−Ｒ 式中のＸＴＰは鎖終結ヌクレオシドトリホスフェートで
あり；Ｒは蛍光染料であり；そしてＬはヌクレオシドト
リホスフェートの塩基と蛍光染料との間の結合基であ
る。
オチドは次式で表される： ＸＴＰ−Ｌ−Ｒ 式中のＸＴＰは鎖終結ヌクレオシドトリホスフェートで
あり；Ｒは蛍光染料であり；そしてＬはヌクレオシドト
リホスフェートの塩基と蛍光染料との間の結合基であ
る。
ＸＴＰは用いられるＤＮＡポリメラーゼの自然のヌクレ
オシドトリホスフェート基質の類似体であり、混入後は
さらに鎖が伸長しないようにする。このような幾つかの
類似体は４種の自然のヌクレオシドトリホスフェートの
各々に対して入手でき、例えばホッブズら（上記引用）
がリストを与えている。好ましくは、ＸＴＰは２′，
３′−ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートであ
る。さらに好ましくは、ＸＴＰは２′，３′−ジデオキ
シ−７−デアザアデノシントリホスフェート、２′，
３′−ジデオキシシチジントリホスフェート、２′，
３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン、２′，３′
−ジデオキシウリジントリホスフェート、および２′，
３′−ジデオキシ−７−デアザイノシントリホスフェー
トから成る群から選ばれる。ここで使用されるように、
“ジデオキシヌクレオシド”の用語は糖部分が環式また
は非環式であるヌクレオシド類似体を含む。ヌクレオシ
ドの塩基または糖の特定の炭素原子を参照するときは常
に従来の番号の付け方を使用する、例えばコルンベル
グ、ＤＮＡ複製（フリーマン、サン・フランシスコ、19
80）。
オシドトリホスフェート基質の類似体であり、混入後は
さらに鎖が伸長しないようにする。このような幾つかの
類似体は４種の自然のヌクレオシドトリホスフェートの
各々に対して入手でき、例えばホッブズら（上記引用）
がリストを与えている。好ましくは、ＸＴＰは２′，
３′−ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートであ
る。さらに好ましくは、ＸＴＰは２′，３′−ジデオキ
シ−７−デアザアデノシントリホスフェート、２′，
３′−ジデオキシシチジントリホスフェート、２′，
３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシン、２′，３′
−ジデオキシウリジントリホスフェート、および２′，
３′−ジデオキシ−７−デアザイノシントリホスフェー
トから成る群から選ばれる。ここで使用されるように、
“ジデオキシヌクレオシド”の用語は糖部分が環式また
は非環式であるヌクレオシド類似体を含む。ヌクレオシ
ドの塩基または糖の特定の炭素原子を参照するときは常
に従来の番号の付け方を使用する、例えばコルンベル
グ、ＤＮＡ複製（フリーマン、サン・フランシスコ、19
80）。
Ｌは、ジデオキシヌクレオシドと染料との間の結合の長
さと剛性が大いに変えられるような多数の異なる形態を
取ることができる。例えば、本発明を用いて使用できる
幾つかの適当な塩基標識方法が報告されている、例えば
ギブソンら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl
eic Acids Research）、第15巻、6455-6467頁(1987)；
ゲベイエフら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nu
cleic Acids Research）、第15巻、4513-4535頁(198
7)；ハララムビジスら、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ（Nucleic Acids Research）、第15巻、4856-4876
頁(1987)等がある。好ましくは、Ｌは本発明の染料のＮ
−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとジデ
オキシヌクレオチドのアルキニルアミノ誘導化塩基と反
応させて形成する。この場合に、Ｌは（１）ローダミン
の５−または６−炭素と（２）ローダミンを結合する塩
基の炭素との間の部分として得られる。好ましくは、Ｌ
は３−カルボキシアミン−１−プロピニルである。シト
シン、チミン、およびアデニンのこのようなアルキニル
アミノ−誘導化ジデオキシヌクレオチドの合成は、ホッ
ブズらのヨーロッパ特許出願番号87305844.0およびホッ
ブズのジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリイ
（J.Org.Chem.）、第54巻、3420頁(1989)によって教示
され、これらを参考文献としてここに加入する。簡単に
は、アルキニルアミノ誘導化ジデオキシヌクレオチド
は、適当なハロジデオキシヌクレオシド（通常はホッブ
ズら（上記引用）によって教示されたような５−ヨード
ピリミジンおよび７−ヨード−７−デアザプリンジデオ
キシヌクレオシド）およびＣｕ（１）をフラスコに入
れ、空気を除くようにＡｒを流しこみ、乾燥ＤＭＦを添
加し、続いてアルキニルアミン、トリエチルアミンおよ
びＰｄ（０）を添加して形成される。反応混合物を数時
間、あるいは薄層クトマトグラフィがハロジデオキシヌ
クレオシドの消費を示すまで、撹拌することができる。
保護されていないアルキニルアミンを使用するとき、ア
ルキニルアミノヌクレオシドは反応混合物を濃縮し、カ
ップリング反応で生成したハイドロハライドを中性にす
るように水酸化アンモニウムを含有する溶出溶媒を用い
てシリカゲルクロマトグラフィーによって単離すること
ができる。保護されたアルキニルアミンを使用すると
き、メタノール／塩化メチレンを反応混合物に添加し、
続いて強塩基アニオン交換樹脂で重炭酸塩を形成するこ
とができる。次にスラリーを約45分間撹拌し、濾過し、
樹脂を追加のメタノール／塩化メチレンを用いて洗浄す
ることができる。合わせた濾液を濃縮しメタノール／塩
化メチレングラディエントを用いるシリカゲルフラッシ
ュクロマトグラフィーによって精製することができる。
トリホスフェートが標準技法によって得られる。
さと剛性が大いに変えられるような多数の異なる形態を
取ることができる。例えば、本発明を用いて使用できる
幾つかの適当な塩基標識方法が報告されている、例えば
ギブソンら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucl
eic Acids Research）、第15巻、6455-6467頁(1987)；
ゲベイエフら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nu
cleic Acids Research）、第15巻、4513-4535頁(198
7)；ハララムビジスら、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ（Nucleic Acids Research）、第15巻、4856-4876
頁(1987)等がある。好ましくは、Ｌは本発明の染料のＮ
−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルとジデ
オキシヌクレオチドのアルキニルアミノ誘導化塩基と反
応させて形成する。この場合に、Ｌは（１）ローダミン
の５−または６−炭素と（２）ローダミンを結合する塩
基の炭素との間の部分として得られる。好ましくは、Ｌ
は３−カルボキシアミン−１−プロピニルである。シト
シン、チミン、およびアデニンのこのようなアルキニル
アミノ−誘導化ジデオキシヌクレオチドの合成は、ホッ
ブズらのヨーロッパ特許出願番号87305844.0およびホッ
ブズのジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリイ
（J.Org.Chem.）、第54巻、3420頁(1989)によって教示
され、これらを参考文献としてここに加入する。簡単に
は、アルキニルアミノ誘導化ジデオキシヌクレオチド
は、適当なハロジデオキシヌクレオシド（通常はホッブ
ズら（上記引用）によって教示されたような５−ヨード
ピリミジンおよび７−ヨード−７−デアザプリンジデオ
キシヌクレオシド）およびＣｕ（１）をフラスコに入
れ、空気を除くようにＡｒを流しこみ、乾燥ＤＭＦを添
加し、続いてアルキニルアミン、トリエチルアミンおよ
びＰｄ（０）を添加して形成される。反応混合物を数時
間、あるいは薄層クトマトグラフィがハロジデオキシヌ
クレオシドの消費を示すまで、撹拌することができる。
保護されていないアルキニルアミンを使用するとき、ア
ルキニルアミノヌクレオシドは反応混合物を濃縮し、カ
ップリング反応で生成したハイドロハライドを中性にす
るように水酸化アンモニウムを含有する溶出溶媒を用い
てシリカゲルクロマトグラフィーによって単離すること
ができる。保護されたアルキニルアミンを使用すると
き、メタノール／塩化メチレンを反応混合物に添加し、
続いて強塩基アニオン交換樹脂で重炭酸塩を形成するこ
とができる。次にスラリーを約45分間撹拌し、濾過し、
樹脂を追加のメタノール／塩化メチレンを用いて洗浄す
ることができる。合わせた濾液を濃縮しメタノール／塩
化メチレングラディエントを用いるシリカゲルフラッシ
ュクロマトグラフィーによって精製することができる。
トリホスフェートが標準技法によって得られる。
上記文献に従ってアルキニルアミン誘導化ジデオキシグ
アノシンの合成は特に改質されたグアニン前駆体（６−
メトキシ−２−メチルチオ−７−デアザプリン、Ｘ）を
必要とし、これは出発物質、６−ヒドロキシ−２−メチ
ルチオ−７−ジアザプリン、ＸＸから得られる。ＸＸを
６−クロロ−２−メチルチオ−７−デアザプリン、ＸＸ
Ｘへ変換するには、ロビンスおよびノエル（ジャーナル
・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリィ（J.Hetero
cyc 1ic.Chem.）、第１巻、34頁(1964)に従い、続いて
塩素置換基をメトキシド（還流メタノール中ナトリウム
塩）と置換してＸを生成する： 本発明を用いることができるローダミン染料のスペクト
ルによる分割ができるセットは、テトラメチルローダミ
ン、ローダミンＸ、ローダミン110、およびローダミン
６Ｇから成り、これらは、それぞれ、式１〜４によって
示される。全体にわたって、カラー・インデックス（ア
ソシエイション・オブ・テキスタイル・ケミスツ、第２
版、1971）炭素番号図を使用する。即ち、プライムを付
けた数字はキサンテン構造の炭素であり、プライムを付
けていない数字は９′−フエニルの炭素である。
アノシンの合成は特に改質されたグアニン前駆体（６−
メトキシ−２−メチルチオ−７−デアザプリン、Ｘ）を
必要とし、これは出発物質、６−ヒドロキシ−２−メチ
ルチオ−７−ジアザプリン、ＸＸから得られる。ＸＸを
６−クロロ−２−メチルチオ−７−デアザプリン、ＸＸ
Ｘへ変換するには、ロビンスおよびノエル（ジャーナル
・オブ・ヘテロサイクリック・ケミストリィ（J.Hetero
cyc 1ic.Chem.）、第１巻、34頁(1964)に従い、続いて
塩素置換基をメトキシド（還流メタノール中ナトリウム
塩）と置換してＸを生成する： 本発明を用いることができるローダミン染料のスペクト
ルによる分割ができるセットは、テトラメチルローダミ
ン、ローダミンＸ、ローダミン110、およびローダミン
６Ｇから成り、これらは、それぞれ、式１〜４によって
示される。全体にわたって、カラー・インデックス（ア
ソシエイション・オブ・テキスタイル・ケミスツ、第２
版、1971）炭素番号図を使用する。即ち、プライムを付
けた数字はキサンテン構造の炭素であり、プライムを付
けていない数字は９′−フエニルの炭素である。
式中： Ａはカルボシキル、スルホニル、またはアミノのよう
な、連結官能基に転化することができる基であり；そし
て Ｂはアニオン酸性基、好ましくはカルボキシルまたはス
ルホニル、そして最も好ましくはカルボキシルである。
な、連結官能基に転化することができる基であり；そし
て Ｂはアニオン酸性基、好ましくはカルボキシルまたはス
ルホニル、そして最も好ましくはカルボキシルである。
ローダミンＮＨＳエステルは米国特許出願第06/941,985
号の教示に従って合成される、ローダミンＮＨＳエステ
ルを合成する方法の重要な特徴は（１）ローダミン染料
の５−または６−形態のエステル化のために存在する実
質的に理論量のジ−Ｎ−スクシンイミジルカーボネート
（ＤＳＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡ
Ｐ）を有する反応条件で、室温にて高収率の生成物を生
成すること、および（２）酸性の、好ましくは５以下の
pKaを有する化合物を用いて新しく合成された生成物を
処理して、反応物に逆転化しないようにすることを含
む。本発明の一般的な反応図は式５によって示される。
号の教示に従って合成される、ローダミンＮＨＳエステ
ルを合成する方法の重要な特徴は（１）ローダミン染料
の５−または６−形態のエステル化のために存在する実
質的に理論量のジ−Ｎ−スクシンイミジルカーボネート
（ＤＳＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡ
Ｐ）を有する反応条件で、室温にて高収率の生成物を生
成すること、および（２）酸性の、好ましくは５以下の
pKaを有する化合物を用いて新しく合成された生成物を
処理して、反応物に逆転化しないようにすることを含
む。本発明の一般的な反応図は式５によって示される。
この方法は５−または６−カルボキシルローダミン（異
性体の混合物または純異性体として）の酸の形態を当量
のＤＳＣおよびＤＭＡＰの極性非プロント性溶媒中で反
応させて、カルボキシル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルを形成することから成る。適当な極性非プロ
ント性溶媒は、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）、ピリジン、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰ
Ａ）等を含む。最も好ましくはＤＭＦを反応溶媒として
使用する。異性体として混合したＮＨＳエステルはさら
に使用するために個々の異性体に分離することができ
る。最も好ましくは、試薬を保存するために、５−また
は６−カルボキシルローダミンの酸の形態をまず標準の
分離技術、例えばエドムンドソンら、モレキュラー・イ
ムノロジイ（Molecular Immunology）、第21巻、561頁
(1984)によって個々の異性体に分離し、次に各５−また
は６−カルボキシル異性体を上述のように反応させて５
−または６−カルボキシルＮＨＳエステルをそれぞれ生
成し、再び標準技法を用いて反応混合物から分離する。
性体の混合物または純異性体として）の酸の形態を当量
のＤＳＣおよびＤＭＡＰの極性非プロント性溶媒中で反
応させて、カルボキシル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルを形成することから成る。適当な極性非プロ
ント性溶媒は、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）、ピリジン、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰ
Ａ）等を含む。最も好ましくはＤＭＦを反応溶媒として
使用する。異性体として混合したＮＨＳエステルはさら
に使用するために個々の異性体に分離することができ
る。最も好ましくは、試薬を保存するために、５−また
は６−カルボキシルローダミンの酸の形態をまず標準の
分離技術、例えばエドムンドソンら、モレキュラー・イ
ムノロジイ（Molecular Immunology）、第21巻、561頁
(1984)によって個々の異性体に分離し、次に各５−また
は６−カルボキシル異性体を上述のように反応させて５
−または６−カルボキシルＮＨＳエステルをそれぞれ生
成し、再び標準技法を用いて反応混合物から分離する。
好ましくは、新しく合成したローダミンＮＨＳエステル
はpKa＜５の揮発性の有機溶解性酸；そしてさらに好ま
しくは、pKa＜１の揮発性の有機溶解性酸化合物、例え
ばメタノール中のHClまたはHBr、または最も好ましく
は、トリフルオロ酢酸を用いて処理される。
はpKa＜５の揮発性の有機溶解性酸；そしてさらに好ま
しくは、pKa＜１の揮発性の有機溶解性酸化合物、例え
ばメタノール中のHClまたはHBr、または最も好ましく
は、トリフルオロ酢酸を用いて処理される。
本発明に用いるためのローダミン染料の若干の異性体混
合物は市販品として、例えばモレキュラー・プローブス
社（ユージン、ＯＲ）から入手でき、他のものは米国特
許第2,242,572；2153,059；3,822,270；3,932,415；お
よび4,005,092号の技法に従って合成することができ、
これらすべてを参考文献として加入する。
合物は市販品として、例えばモレキュラー・プローブス
社（ユージン、ＯＲ）から入手でき、他のものは米国特
許第2,242,572；2153,059；3,822,270；3,932,415；お
よび4,005,092号の技法に従って合成することができ、
これらすべてを参考文献として加入する。
好ましくは、フルオレセイン標識鎖終結ヌクレオチドの
スペクトルにより分割できるセットを本発明の方法に用
いる。多くのフルオレセイン染料は市販品として、例え
ばモレキュラー・プローブス社（ユージン、ＯＲ）、ま
たはリサーチ・オーガニックス（クレベランド、ＯＨ）
から入手でき、あるいは当該分野で知られている技法、
例えば、ガタクら、ジャーナル・オブ・インディアン・
ケミカル・ソサイアティ（J.Ind.Chem.Soc.）、第６
巻、465-471頁(1929)；およびカンナら、米国特許第4,4
39,356号で知られた技法によって合成することができ
る。また、フルオレセイン類似体を、置換レゾルシノー
ルを置換ベンゾフェノンまたは置換トリメリット酸とプ
ロピオン酸の存在で、当該分野で良く知られた反応で反
応させて合成することができる。スルホニルフルオレセ
インはリーらのサイトメトリイ（Cytometry）、第10
巻、151-164頁(1989)によって開示された方法に従って
合成され、適当な反応物を置換して改変し、５−または
６−カルボキシル−またはスルホニルフルオレセイン生
成物を与える。好ましくは、ＤＮＡシーケンシングにお
いてポリヌクレオチドを標識するとき、染料の５−およ
び６−異性体は、一般に電気泳動の移動度が僅かに異な
り、これら異性体の混合物を使用するとバンドが広がる
原因となるので別々に使用される。染料の５−および６
−異性体は逆相ＨＰＬＣ、例えばエドムンドソンら（上
記引用）によって容易に分離される。一般に、最初に溶
出するピークは６−異性体であり、二番目に溶出するピ
ークは５−異性体であると考えられる。好ましくは、フ
ルオレセイン染料のＮＨＳエステルはジデオキシヌクレ
オチドに適当な連結官能価で反応し、標識化したジデオ
キシヌクレオチドを形成する。
スペクトルにより分割できるセットを本発明の方法に用
いる。多くのフルオレセイン染料は市販品として、例え
ばモレキュラー・プローブス社（ユージン、ＯＲ）、ま
たはリサーチ・オーガニックス（クレベランド、ＯＨ）
から入手でき、あるいは当該分野で知られている技法、
例えば、ガタクら、ジャーナル・オブ・インディアン・
ケミカル・ソサイアティ（J.Ind.Chem.Soc.）、第６
巻、465-471頁(1929)；およびカンナら、米国特許第4,4
39,356号で知られた技法によって合成することができ
る。また、フルオレセイン類似体を、置換レゾルシノー
ルを置換ベンゾフェノンまたは置換トリメリット酸とプ
ロピオン酸の存在で、当該分野で良く知られた反応で反
応させて合成することができる。スルホニルフルオレセ
インはリーらのサイトメトリイ（Cytometry）、第10
巻、151-164頁(1989)によって開示された方法に従って
合成され、適当な反応物を置換して改変し、５−または
６−カルボキシル−またはスルホニルフルオレセイン生
成物を与える。好ましくは、ＤＮＡシーケンシングにお
いてポリヌクレオチドを標識するとき、染料の５−およ
び６−異性体は、一般に電気泳動の移動度が僅かに異な
り、これら異性体の混合物を使用するとバンドが広がる
原因となるので別々に使用される。染料の５−および６
−異性体は逆相ＨＰＬＣ、例えばエドムンドソンら（上
記引用）によって容易に分離される。一般に、最初に溶
出するピークは６−異性体であり、二番目に溶出するピ
ークは５−異性体であると考えられる。好ましくは、フ
ルオレセイン染料のＮＨＳエステルはジデオキシヌクレ
オチドに適当な連結官能価で反応し、標識化したジデオ
キシヌクレオチドを形成する。
好ましくは次のセットのスペクトルにより分割できるフ
ルオレセイン染料を本発明の方法と共に用いる；フルオ
レセイン（“ＦＡＭ”）；２′，７′−ジクロロフルオ
レセイン（“２′，７′−ジクロロＦＡＭ”）；２′，
７′−ジメトキシ−４′，５′−ジクロロ−４，７−ジ
クロロフルオレセイン（“ＬＯＵ”）；および１′，
２′，７′，８′−ジベンゾ−４′，７′−ジクロロフ
ルオレセイン（“ＮＡＮ”）、番号はフルオレセイン染
料のためのカラーインデックス番号図に対応する。さら
に好ましくは、ＦＡＭを６炭素によってジデオキシチミ
ジンに連結する（“ｄｄＴ−６−ＦＡＭ”）；２′，
７′−ジクロロフルオレセインを５炭素によってジデオ
キシシチジンに連結する（“ｄｄＣ−２′，７′−ジク
ロロ−５−ＦＡＭ”）；ＬＯＵを５炭素によってジデオ
キシアデノシンに連結する（“ｄｄＡ−５−ＬＯ
Ｕ”）；およびＮＡＮを５炭素によってジデオキシグア
ノシンに連結する（“ｄｄＧ−５−ＮＡＮ”）。最も好
ましくは、次のフルオレセイン標識化ジデオキシヌクレ
オチドを用いる： 好ましくは、重合化反応で生成した標識化ＤＮＡフラグ
メントをゲル電気泳動によって大きさに従って分離す
る。例えばゴウルドおよびマシュウズ、上記引用；リッ
クウッドおよびハメス編、核酸のゲル電気泳動（Gel El
ectrophoresis of Nucleic Acids）：実際のアプローチ
（ＩＲＬプレス・リミテッド、ロンドン、1981）；また
はオスターマン、蛋白質と核酸の研究方法（Mehtods of
Protein and Nucleic Acid Research）、第１巻（スプ
リンガー・ベルラク、ベルリン、1984）。好ましくはゲ
ルのタイプは約２〜20パーセントの濃度（重量対容量）
をもつポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、
ポリアクリルアミドゲル濃度は約４〜８パーセントであ
る。好ましくはゲルはストランド分離、または変性剤を
含む。このようなゲルを構成するための詳細な方法はマ
ニアチスらのメソッズ・イン・エンザイモロジイ（Meth
ods in Enzymology）、第65巻、299-305頁(1980)；マニ
アチスら、バイオケミストリイ（Biochemistry）、第14
巻、3787-3794頁(1975)；およびマニアチスら、モノキ
ュラー・クローニング：（Molecular Cloning）：実験
室マニュアル（コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリイ、ニューヨーク、1982）、179-185頁によって
与えられる。従ってこれらの文献を参考文献として加え
る。特定の分離に用いられる最適のゲル濃度、pH、温
度、変性剤の濃度等は分離すべき核酸の大きさの範囲、
それらの塩基構成物、それらが一本鎖または二本鎖であ
るかどうか、そして情報を電気泳動によってサーチする
種類の性質を含めて、多くの要素に依存する。従って、
本発明の出願は特定の分離のための条件を最適にするた
めに標準の予備的な試験を必要とするかも知れない。好
ましくは、ポリヌクレオチド鎖の伸長中に、デオキシイ
ノシントリホスフェートをデオキシグアノシントリホス
フェートと置換して、電気泳動中にいわゆる“バンドの
圧縮”を避けるようにする、例えばミルスら、プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ
・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第76巻、2
232-2235頁(1979)。例えば、約10〜500塩基の範囲の大
きさをもつポリヌクレオチドを分離して次のゲル中で本
発明に従って検出する：１部のビスアクリルアミドに対
して19部〜１部のアクリルアミドから作られた６パーセ
ントのポリアクリルアミドを、48パーセント（重量／容
量）の尿素を用いて、pH8.3（25℃で測定）でトリス−
ボレートＥＤＴＡ緩衝液中に形成させる。ゲルは約40℃
で走行させる。
ルオレセイン染料を本発明の方法と共に用いる；フルオ
レセイン（“ＦＡＭ”）；２′，７′−ジクロロフルオ
レセイン（“２′，７′−ジクロロＦＡＭ”）；２′，
７′−ジメトキシ−４′，５′−ジクロロ−４，７−ジ
クロロフルオレセイン（“ＬＯＵ”）；および１′，
２′，７′，８′−ジベンゾ−４′，７′−ジクロロフ
ルオレセイン（“ＮＡＮ”）、番号はフルオレセイン染
料のためのカラーインデックス番号図に対応する。さら
に好ましくは、ＦＡＭを６炭素によってジデオキシチミ
ジンに連結する（“ｄｄＴ−６−ＦＡＭ”）；２′，
７′−ジクロロフルオレセインを５炭素によってジデオ
キシシチジンに連結する（“ｄｄＣ−２′，７′−ジク
ロロ−５−ＦＡＭ”）；ＬＯＵを５炭素によってジデオ
キシアデノシンに連結する（“ｄｄＡ−５−ＬＯ
Ｕ”）；およびＮＡＮを５炭素によってジデオキシグア
ノシンに連結する（“ｄｄＧ−５−ＮＡＮ”）。最も好
ましくは、次のフルオレセイン標識化ジデオキシヌクレ
オチドを用いる： 好ましくは、重合化反応で生成した標識化ＤＮＡフラグ
メントをゲル電気泳動によって大きさに従って分離す
る。例えばゴウルドおよびマシュウズ、上記引用；リッ
クウッドおよびハメス編、核酸のゲル電気泳動（Gel El
ectrophoresis of Nucleic Acids）：実際のアプローチ
（ＩＲＬプレス・リミテッド、ロンドン、1981）；また
はオスターマン、蛋白質と核酸の研究方法（Mehtods of
Protein and Nucleic Acid Research）、第１巻（スプ
リンガー・ベルラク、ベルリン、1984）。好ましくはゲ
ルのタイプは約２〜20パーセントの濃度（重量対容量）
をもつポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、
ポリアクリルアミドゲル濃度は約４〜８パーセントであ
る。好ましくはゲルはストランド分離、または変性剤を
含む。このようなゲルを構成するための詳細な方法はマ
ニアチスらのメソッズ・イン・エンザイモロジイ（Meth
ods in Enzymology）、第65巻、299-305頁(1980)；マニ
アチスら、バイオケミストリイ（Biochemistry）、第14
巻、3787-3794頁(1975)；およびマニアチスら、モノキ
ュラー・クローニング：（Molecular Cloning）：実験
室マニュアル（コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリイ、ニューヨーク、1982）、179-185頁によって
与えられる。従ってこれらの文献を参考文献として加え
る。特定の分離に用いられる最適のゲル濃度、pH、温
度、変性剤の濃度等は分離すべき核酸の大きさの範囲、
それらの塩基構成物、それらが一本鎖または二本鎖であ
るかどうか、そして情報を電気泳動によってサーチする
種類の性質を含めて、多くの要素に依存する。従って、
本発明の出願は特定の分離のための条件を最適にするた
めに標準の予備的な試験を必要とするかも知れない。好
ましくは、ポリヌクレオチド鎖の伸長中に、デオキシイ
ノシントリホスフェートをデオキシグアノシントリホス
フェートと置換して、電気泳動中にいわゆる“バンドの
圧縮”を避けるようにする、例えばミルスら、プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ
・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、第76巻、2
232-2235頁(1979)。例えば、約10〜500塩基の範囲の大
きさをもつポリヌクレオチドを分離して次のゲル中で本
発明に従って検出する：１部のビスアクリルアミドに対
して19部〜１部のアクリルアミドから作られた６パーセ
ントのポリアクリルアミドを、48パーセント（重量／容
量）の尿素を用いて、pH8.3（25℃で測定）でトリス−
ボレートＥＤＴＡ緩衝液中に形成させる。ゲルは約40℃
で走行させる。
ゲル上の蛍光により標準化したＤＮＡフラグメントのバ
ンドは標準方法によって、例えば高圧水銀灯、レーザー
等によって照射される。好ましくは、バンドはアルゴン
イオンレーザー、特にアルゴンイオンレーザーの488お
よび514nm発光線によって生成したレーザー光によって
照射される。幾つかのアルゴンイオンレーザーはこれら
の線で同時にレーザー光を発するものを市販品として入
手できる、例えばシオニクス社（サニーベール、ＣＡ）
モデル2001等がある。
ンドは標準方法によって、例えば高圧水銀灯、レーザー
等によって照射される。好ましくは、バンドはアルゴン
イオンレーザー、特にアルゴンイオンレーザーの488お
よび514nm発光線によって生成したレーザー光によって
照射される。幾つかのアルゴンイオンレーザーはこれら
の線で同時にレーザー光を発するものを市販品として入
手できる、例えばシオニクス社（サニーベール、ＣＡ）
モデル2001等がある。
本発明の重要な特色はＤＮＡシーケンシング方法におい
て鎖伸長のために使用される核酸ポリメラーゼである。
好ましくは、本発明の方法に用いられるポリメラーゼ
は、マンガン緩衝液を用いて改質したＴ７ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Sequenase（登録商標））であり、タボールら
のプロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）、第86巻、4076-4080頁(1989)によって記載されて
いる。さらに好ましくは、また重合反応混合物は、タボ
ールらのジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リイ（J.Biol.Chem.）、第26巻、8322-8328頁(1990)に
よって教示されるようなピロホスファターゼを含み、こ
の文献は参考文献として加えられる。
て鎖伸長のために使用される核酸ポリメラーゼである。
好ましくは、本発明の方法に用いられるポリメラーゼ
は、マンガン緩衝液を用いて改質したＴ７ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Sequenase（登録商標））であり、タボールら
のプロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンシーズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）、第86巻、4076-4080頁(1989)によって記載されて
いる。さらに好ましくは、また重合反応混合物は、タボ
ールらのジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リイ（J.Biol.Chem.）、第26巻、8322-8328頁(1990)に
よって教示されるようなピロホスファターゼを含み、こ
の文献は参考文献として加えられる。
実施例 次の実施例は本発明を説明するためのものである。試薬
の濃度、温度、および他の変化しうるパラメータの値は
本発明を例示するものであり、これらに制限されるもの
ではない。
の濃度、温度、および他の変化しうるパラメータの値は
本発明を例示するものであり、これらに制限されるもの
ではない。
実施例１．６−ＴＭＲ−ＮＨＳ カラムクロマトグラフィーによって５−および６−ＴＭ
Ｒ酸異性体の混合物から６−ＴＭＲ酸を分離した。8.82
mgの６−ＴＭＲ酸および10.5mgのＤＳＣをアルゴン下に
0.5mlの乾燥ＤＭＦに溶解した。テトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）中ＤＭＡＰの0.5モル溶液0.09mlを一滴ずつ
添加した。室温で２時間後、混合物を50mlのクロロホル
ムに入れて塩水：水の１：１溶液を用いて３回洗浄し
た。クロロホルムを蒸発させて、残渣を20gのシリカゲ
ルカラム（300：30：８の塩化メチレン：メタノール：
酢酸溶出）で精製した。約0.4のＲfをもつ画分を蒸発さ
せて乾燥し、8.6mgの６−ＴＭＲ−ＮＨＳをその酢酸塩
として生成した。
Ｒ酸異性体の混合物から６−ＴＭＲ酸を分離した。8.82
mgの６−ＴＭＲ酸および10.5mgのＤＳＣをアルゴン下に
0.5mlの乾燥ＤＭＦに溶解した。テトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）中ＤＭＡＰの0.5モル溶液0.09mlを一滴ずつ
添加した。室温で２時間後、混合物を50mlのクロロホル
ムに入れて塩水：水の１：１溶液を用いて３回洗浄し
た。クロロホルムを蒸発させて、残渣を20gのシリカゲ
ルカラム（300：30：８の塩化メチレン：メタノール：
酢酸溶出）で精製した。約0.4のＲfをもつ画分を蒸発さ
せて乾燥し、8.6mgの６−ＴＭＲ−ＮＨＳをその酢酸塩
として生成した。
実施例２．６−ＲＯＸ−ＮＨＳ ６−ＲＯＸ酸をカラムクロマトグラフィーによって５−
および６−酸異性体の混合物から分離した。46.2mgの６
−ＲＯＸ酸および58mgのＤＳＣをアルゴン下で２mlの乾
燥ＤＭＦに溶解し、ＴＨＦ中ＤＭＡＰの0.5モル溶液0.4
5mlを一滴ずつ添加した。室温で1.5時間後、混合物を10
0mlのクロロホルムに入れて、塩水：水の１：１溶液を
用いて４回洗浄した。クロロホルムを蒸発させて40gの
シリカゲルカラム（300：30：８の塩化メチレン：メタ
ノール：酢酸溶出）で精製した。約0.5のＲfをもつ画分
を蒸発させて乾燥し、その酢酸塩として56.4mgの６−Ｒ
ＯＸ−ＮＨＳを生成した。
および６−酸異性体の混合物から分離した。46.2mgの６
−ＲＯＸ酸および58mgのＤＳＣをアルゴン下で２mlの乾
燥ＤＭＦに溶解し、ＴＨＦ中ＤＭＡＰの0.5モル溶液0.4
5mlを一滴ずつ添加した。室温で1.5時間後、混合物を10
0mlのクロロホルムに入れて、塩水：水の１：１溶液を
用いて４回洗浄した。クロロホルムを蒸発させて40gの
シリカゲルカラム（300：30：８の塩化メチレン：メタ
ノール：酢酸溶出）で精製した。約0.5のＲfをもつ画分
を蒸発させて乾燥し、その酢酸塩として56.4mgの６−Ｒ
ＯＸ−ＮＨＳを生成した。
実施例３．ローダミンＮＨＳエステルの安定な生成 ａ）実施例３からの0.44mgの６−カルボキシ−Ｘ−ロー
ダミンＮＨＳエステルおよび80μｌのメタノール中の0.
01モルのエタノールアミンを一緒にした。アセトニトリ
ルおよび0.1モルのトリエチルアンモニウムアセテート
緩衝液（pH＝７．０）を用いた反応混合物の逆相ＨＰＬ
Ｃは、生成物が70％のＸ−ローダミン酸および30％のＸ
−ローダミンＮＨＳエステルから成ることを示した（エ
タノールアミンとの反応から６−カルボキシ−Ｘ−ロー
ダミンのエタノールアミドとして観察された）。
ダミンＮＨＳエステルおよび80μｌのメタノール中の0.
01モルのエタノールアミンを一緒にした。アセトニトリ
ルおよび0.1モルのトリエチルアンモニウムアセテート
緩衝液（pH＝７．０）を用いた反応混合物の逆相ＨＰＬ
Ｃは、生成物が70％のＸ−ローダミン酸および30％のＸ
−ローダミンＮＨＳエステルから成ることを示した（エ
タノールアミンとの反応から６−カルボキシ−Ｘ−ロー
ダミンのエタノールアミドとして観察された）。
ｂ）実施例３からの0.15ｇの６−カルボキシ−Ｘ−ロー
ダミンＮＨＳエステルを100mlのクロロホルムに溶解し
た；クロロホルム溶液を0.5モルの重炭酸ナトリウムを
用いて２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、
0.1mlの酢酸を用いて処理し、蒸発乾燥させた。0.35mg
の生成物をａ）におけるように正確に処理した；逆相Ｈ
ＰＬＣは20％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸およ
び80％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンＮＨＳエステ
ルを示した。
ダミンＮＨＳエステルを100mlのクロロホルムに溶解し
た；クロロホルム溶液を0.5モルの重炭酸ナトリウムを
用いて２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、
0.1mlの酢酸を用いて処理し、蒸発乾燥させた。0.35mg
の生成物をａ）におけるように正確に処理した；逆相Ｈ
ＰＬＣは20％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸およ
び80％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンＮＨＳエステ
ルを示した。
ｃ）実施例３からの0.15ｇの６−カルボキシ−Ｘ−ロー
ダミンＮＨＳエステルを、トリフルオロ酢酸を酢酸と置
換したことを除いて、ｂ）におけるように正確に処理し
た。0.19mgの得られた個体をａ）におけるように正確に
処理した；逆相ＨＰＬＣは＜５％の６−カルボキシ−Ｘ
−ローダミン酸および＞95％の６−カルボキシ−Ｘ−ロ
ーダミンＮＨＳエステルを示した。
ダミンＮＨＳエステルを、トリフルオロ酢酸を酢酸と置
換したことを除いて、ｂ）におけるように正確に処理し
た。0.19mgの得られた個体をａ）におけるように正確に
処理した；逆相ＨＰＬＣは＜５％の６−カルボキシ−Ｘ
−ローダミン酸および＞95％の６−カルボキシ−Ｘ−ロ
ーダミンＮＨＳエステルを示した。
実施例４．Ｒ６Ｇ−標識化７−デアザ−２′，３′−ジ
デオキシアデノシントリホスフェート（ｄｄＡ−５Ｒ６
Ｇ）の調製 上記のように得られた2.0μモルのアミノ−７−デアザ
−２′，３′−ジデオキシアデノシントリホスフェート
（凍結乾燥した）に、100μｌのＤＭＦ、３mgの５−ロ
ーダミン６Ｇ−ＮＨＳエステルおよび50μｌの1.0トリ
エチルアンモニウムカーボネートを添加する、pH8.95。
これを渦巻撹拌し終夜室温で放置した。次に混合物をAX
−300の220×4.6mm、７ミクロンカラムのＨＰＬＣによ
って１分間につき1.5mlの流速で精製した。開始の溶出
は60％の0.1Ｍトリエチルアンモニウムカーボネート、p
H7.0、40％のCH3CNで、60％の0.1Ｍトリエチルアンモニ
ウムカーボネート、pH7.5、40％のCH3CNへと一次勾配で
40分間行った。溶媒を真空下に蒸発させて集めた生成物
から除去した。残渣を0.01Mトリエチルアンモニウムア
セテート、pH7.0に溶解し定量した。
デオキシアデノシントリホスフェート（ｄｄＡ−５Ｒ６
Ｇ）の調製 上記のように得られた2.0μモルのアミノ−７−デアザ
−２′，３′−ジデオキシアデノシントリホスフェート
（凍結乾燥した）に、100μｌのＤＭＦ、３mgの５−ロ
ーダミン６Ｇ−ＮＨＳエステルおよび50μｌの1.0トリ
エチルアンモニウムカーボネートを添加する、pH8.95。
これを渦巻撹拌し終夜室温で放置した。次に混合物をAX
−300の220×4.6mm、７ミクロンカラムのＨＰＬＣによ
って１分間につき1.5mlの流速で精製した。開始の溶出
は60％の0.1Ｍトリエチルアンモニウムカーボネート、p
H7.0、40％のCH3CNで、60％の0.1Ｍトリエチルアンモニ
ウムカーボネート、pH7.5、40％のCH3CNへと一次勾配で
40分間行った。溶媒を真空下に蒸発させて集めた生成物
から除去した。残渣を0.01Mトリエチルアンモニウムア
セテート、pH7.0に溶解し定量した。
実施例５．ＲＯＸ−標識化２′，３′−ジデオキシシチ
ジントリホスフェート（ｄｄＣ−６ＲＯＸ）の調製 上記のようにして得られた５−（３″−アミノ−１″−
プロピニル）−２′，３′−ジデオキシシチジントリホ
スフェート3.6μモルを150μｌのH2Oに溶かした溶液
に、60μｌのＤＭＳＯおよび50μｌの1.0Ｍトリエチル
アンモニウムカーボネートpH8.95中５mgの６−ローダミ
ンＸ−ＮＨＳエステルを添加した。これを渦巻撹拌し室
温で終夜放置した。生成物を実施例４におけるように精
製した。
ジントリホスフェート（ｄｄＣ−６ＲＯＸ）の調製 上記のようにして得られた５−（３″−アミノ−１″−
プロピニル）−２′，３′−ジデオキシシチジントリホ
スフェート3.6μモルを150μｌのH2Oに溶かした溶液
に、60μｌのＤＭＳＯおよび50μｌの1.0Ｍトリエチル
アンモニウムカーボネートpH8.95中５mgの６−ローダミ
ンＸ−ＮＨＳエステルを添加した。これを渦巻撹拌し室
温で終夜放置した。生成物を実施例４におけるように精
製した。
実施例６．Ｒ110−標識化２′，３′−ジデオキシイノ
シントリホスフェート（ｄｄＧ−５Ｒ110）の調製 上記のようにして得られた７−（３″−アミノ−１″−
プロピニル）−７−ジアザ−２′，３′−ジデオキシグ
アノシントリホスフェート（凍結乾燥した）の1.3μモ
ルに、100μｌのＤＭＦ、４mgの５−ローダミン110−Ｎ
ＨＳエステル、および100μｌの1.0Ｍトリエチルアンモ
ニウムカーボネートpH8.95を添加した。これを渦巻撹拌
し、室温で終夜放置した。生成物を実施例４におけるよ
うに精製した。
シントリホスフェート（ｄｄＧ−５Ｒ110）の調製 上記のようにして得られた７−（３″−アミノ−１″−
プロピニル）−７−ジアザ−２′，３′−ジデオキシグ
アノシントリホスフェート（凍結乾燥した）の1.3μモ
ルに、100μｌのＤＭＦ、４mgの５−ローダミン110−Ｎ
ＨＳエステル、および100μｌの1.0Ｍトリエチルアンモ
ニウムカーボネートpH8.95を添加した。これを渦巻撹拌
し、室温で終夜放置した。生成物を実施例４におけるよ
うに精製した。
実施例７．ＴＭＲ−標識化２′，３′−ジデオキシチミ
ジントリホスフェート（ｄｄＴ−６ＴＭＲ）の調製 上記のようにして得られた150μｌのH2Oに溶かした3.1
μモルの５−（３″−アミノ−１″−プロピニル）−
２′，３′−ジデオキシウリジントリホスフェートを、
150μｌのＤＭＦ、100μｌの1.0Ｍトリエチルアンモニ
ウムカーボネートpH8.95、および４mgの６−ＴＭＲ−Ｎ
ＨＳエステルと混合した。これを渦巻撹拌し、室温で終
夜放置した。生成物を実施例４におけるように精製し
た。
ジントリホスフェート（ｄｄＴ−６ＴＭＲ）の調製 上記のようにして得られた150μｌのH2Oに溶かした3.1
μモルの５−（３″−アミノ−１″−プロピニル）−
２′，３′−ジデオキシウリジントリホスフェートを、
150μｌのＤＭＦ、100μｌの1.0Ｍトリエチルアンモニ
ウムカーボネートpH8.95、および４mgの６−ＴＭＲ−Ｎ
ＨＳエステルと混合した。これを渦巻撹拌し、室温で終
夜放置した。生成物を実施例４におけるように精製し
た。
実施例８．２′，７′−ジメトキシ−４′，５′−ジク
ロロ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロ
ロフルオレセイン（“ＬＯＵ”） 0.60ｇの３，６−ジクロロトリメット酸、1.47ｇの４−
メトキシレゾルシノール、0.2mlの濃硫酸、および４ml
のプロピオン酸を12時間アルゴン下に還流した。反応混
合物を150mlの水に注入し；沈澱物を乾燥し、３mlのピ
リジンに入れ１時間かけて２mlの無水酢酸を用いてアセ
チル化した。アセチル化した混合物を100mlの酢酸エチ
ルに入れ、１Ｎ塩化水素酸で洗浄し、水で洗浄し、蒸発
乾固した。残渣を15グラムのシリカゲルに置き、50mlの
酢酸エチルで溶出し、次に４：１の酢酸エチル：メタノ
ールで溶出した。Ｒfが約0.2のＵＶ活性物質を含有する
画分（４：１の酢酸エチル：メタノール／シリカゲル）
を蒸発乾固した。この残渣を10mlのメタノールに溶解
し、次いで１mlの４Ｎ水酸化ナトリウムを添加した。10
分後、反応混合物を水で200mlまで稀釈し、次に0.5mlの
濃縮塩化水素酸を添加した。全混合物を200mlの酢酸エ
チルで抽出し、その後、酢酸エチルを硫酸ナトリウムで
乾燥し、蒸発乾固して0.180ｇの黄緑色の固体を生成し
た。この固体を次に水性水酸化ナトリウム中で次亜塩素
酸塩で処理しＬＯＵを生成した。
ロロ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロ
ロフルオレセイン（“ＬＯＵ”） 0.60ｇの３，６−ジクロロトリメット酸、1.47ｇの４−
メトキシレゾルシノール、0.2mlの濃硫酸、および４ml
のプロピオン酸を12時間アルゴン下に還流した。反応混
合物を150mlの水に注入し；沈澱物を乾燥し、３mlのピ
リジンに入れ１時間かけて２mlの無水酢酸を用いてアセ
チル化した。アセチル化した混合物を100mlの酢酸エチ
ルに入れ、１Ｎ塩化水素酸で洗浄し、水で洗浄し、蒸発
乾固した。残渣を15グラムのシリカゲルに置き、50mlの
酢酸エチルで溶出し、次に４：１の酢酸エチル：メタノ
ールで溶出した。Ｒfが約0.2のＵＶ活性物質を含有する
画分（４：１の酢酸エチル：メタノール／シリカゲル）
を蒸発乾固した。この残渣を10mlのメタノールに溶解
し、次いで１mlの４Ｎ水酸化ナトリウムを添加した。10
分後、反応混合物を水で200mlまで稀釈し、次に0.5mlの
濃縮塩化水素酸を添加した。全混合物を200mlの酢酸エ
チルで抽出し、その後、酢酸エチルを硫酸ナトリウムで
乾燥し、蒸発乾固して0.180ｇの黄緑色の固体を生成し
た。この固体を次に水性水酸化ナトリウム中で次亜塩素
酸塩で処理しＬＯＵを生成した。
実施例９．１′，２′，７′，８′，−ジベンゾ−５−
（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレ
セイン（“ＮＡＮ”） まず、３，６−ジクロロトリメット酸トリクロライドを
調製した：0.5ｇの３，６−ジクロロトリメット酸およ
び1.3ｇの五塩化燐の混合物を130℃で40分間加熱した。
混合物を室温まで冷却し氷中に注入した。次いで混合物
を40mlのエーテルで抽出し、有機画分を２回15mlの水で
洗浄し、MgSO4で乾燥し、透明油（0.7ｇ）まで濃縮し
た。酸三塩化物をさらに精製することなく使用した。Ｎ
ＡＮを次のように調製した：2.7ｇの１，３−ジヒドロ
キシナフタレン、2.84ｇの３，６−ジクロロトリメリッ
ト酸トリクロライド、および８mlのプロピオン酸の混合
物を２時間還流した。水（50ml）および酢酸エチル（50
ml）を添加した。層を分離し、有機層を３回50mlの１Ｍ
NaHCO3を用いて抽出した。水溶液を沸とうするまで加熱
し濃HClを用いて酸性にした。得られた赤い固体（0.2
ｇ）を濾過し乾燥した。
（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレ
セイン（“ＮＡＮ”） まず、３，６−ジクロロトリメット酸トリクロライドを
調製した：0.5ｇの３，６−ジクロロトリメット酸およ
び1.3ｇの五塩化燐の混合物を130℃で40分間加熱した。
混合物を室温まで冷却し氷中に注入した。次いで混合物
を40mlのエーテルで抽出し、有機画分を２回15mlの水で
洗浄し、MgSO4で乾燥し、透明油（0.7ｇ）まで濃縮し
た。酸三塩化物をさらに精製することなく使用した。Ｎ
ＡＮを次のように調製した：2.7ｇの１，３−ジヒドロ
キシナフタレン、2.84ｇの３，６−ジクロロトリメリッ
ト酸トリクロライド、および８mlのプロピオン酸の混合
物を２時間還流した。水（50ml）および酢酸エチル（50
ml）を添加した。層を分離し、有機層を３回50mlの１Ｍ
NaHCO3を用いて抽出した。水溶液を沸とうするまで加熱
し濃HClを用いて酸性にした。得られた赤い固体（0.2
ｇ）を濾過し乾燥した。
実施例１０．ローダミン標識化ジデオキシヌクレオチ
ド、ヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェ
ート）、およびSequenase（登録商標）とMn++緩衝液を
用いるＤＮＡシーケンス分析 実施例６〜９で調製したローダミン標識化ジデオキシヌ
クレオチドを使用して、アプライド・バイオシステムズ
（フォスター・シティ、ＣＡ）モデル370A自動化ＤＮＡ
シーケンサーを使用する鎖終結シーケンシングにおいて
ＤＮＡフラグメントに標識を付けた。ここに参考文献と
して加える製造者の実験計画書（ユーザー・ブレタン
ＤＮＡシーケンサーモデル370、第２刷、1987年８月12
日）に従って、M13mp18一本鎖鋳型を得た（M13それ自体
はテストシーケンスとして役立つ）。M13ユニバーサル
プライマーを用いた。次の溶液を調製した：5XT7Mn緩衝
液（100mMトリス−HCl pH7.5、75mMのイソクエン酸ナ
トリウム、10mMのMnCl2、および250mMのNaCl）；および
dNTPaSミックス（500μＭのdITPaS、500μＭのdATPaS、
500μＭのdTTPaS、および500μＭのdCTPaS、ここで“Ｎ
ＴＰａＳ”は指示されたヌクレオチドの１−チオトリホ
スフェート類似体を表わす）。アニール化反応はミクロ
遠心分離チューブ中に、2.0μｌの5XT7Mn緩衝液、0.4pm
olのＤＮＡ鋳型、0.8pmolのプライマー、および4.0μｌ
までの容量の水を合わせて行った。混合物を55〜60℃に
て５〜10分間インキュベートし、徐々に20〜30分かけて
４〜20℃の温度まで冷却し、次に一度遠心分離して縮合
物を収集し、混合し、氷上に置いた。次に混合物に1.0
μｌのdNTPaSミックス、ｄｄＧ−５Ｒ110(0.008μ
Ｍ）；ｄｄＡ−５Ｒ６Ｇ（0.1μＭ）；ｄｄＴ−６ＴＭ
Ｒ（0.7μＭ；ｄｄＣ−６ＲＯＸ（1.2μＭ）；２ユニッ
トのシーケナーゼ（Sequenase、登録商標）、１ユニッ
トのピロホスファターゼ（シグマ・ケミカル社）および
水を10.0μｌまでの容量で添加した。混合物を５分間37
℃にてインキュベートし、次に氷上に置き、25.0μｌの
10mMのＥＤＴＡpH8.0を合わせて反応物を冷却した。次
いで混合物中のＤＮＡをエタノール沈澱させた（４μｌ
の３Ｍ酢酸ナトリウムpH5.2および120μｌの95％エタノ
ールを添加し、氷上で10分間インキュベートし、15分間
遠心分離し、上清をデカントして排出し、70％のエタノ
ールに再懸濁し、渦巻撹拌し、15分間遠心分離し、上清
をデカントして排出し、５分間真空遠心分離で乾燥させ
た）。次に沈澱したＤＮＡを５部の脱イオン化ホルムア
ミドと１部の50mMのＥＤＴＡpH8.0から成る３μｌの溶
液に再懸濁し、十分に渦巻撹拌した。ゲルを装填する前
に混合物を90℃で２分間インキュベートしてＤＮＡを変
性させた。モデル370Aシーケンサーの塩基呼出ルーチン
は95％の精度でM13プラスミドの400塩基を同定した。不
正確な呼出はＧに続くＣとＴの呼出をミスしたことに原
因があった。
ド、ヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェ
ート）、およびSequenase（登録商標）とMn++緩衝液を
用いるＤＮＡシーケンス分析 実施例６〜９で調製したローダミン標識化ジデオキシヌ
クレオチドを使用して、アプライド・バイオシステムズ
（フォスター・シティ、ＣＡ）モデル370A自動化ＤＮＡ
シーケンサーを使用する鎖終結シーケンシングにおいて
ＤＮＡフラグメントに標識を付けた。ここに参考文献と
して加える製造者の実験計画書（ユーザー・ブレタン
ＤＮＡシーケンサーモデル370、第２刷、1987年８月12
日）に従って、M13mp18一本鎖鋳型を得た（M13それ自体
はテストシーケンスとして役立つ）。M13ユニバーサル
プライマーを用いた。次の溶液を調製した：5XT7Mn緩衝
液（100mMトリス−HCl pH7.5、75mMのイソクエン酸ナ
トリウム、10mMのMnCl2、および250mMのNaCl）；および
dNTPaSミックス（500μＭのdITPaS、500μＭのdATPaS、
500μＭのdTTPaS、および500μＭのdCTPaS、ここで“Ｎ
ＴＰａＳ”は指示されたヌクレオチドの１−チオトリホ
スフェート類似体を表わす）。アニール化反応はミクロ
遠心分離チューブ中に、2.0μｌの5XT7Mn緩衝液、0.4pm
olのＤＮＡ鋳型、0.8pmolのプライマー、および4.0μｌ
までの容量の水を合わせて行った。混合物を55〜60℃に
て５〜10分間インキュベートし、徐々に20〜30分かけて
４〜20℃の温度まで冷却し、次に一度遠心分離して縮合
物を収集し、混合し、氷上に置いた。次に混合物に1.0
μｌのdNTPaSミックス、ｄｄＧ−５Ｒ110(0.008μ
Ｍ）；ｄｄＡ−５Ｒ６Ｇ（0.1μＭ）；ｄｄＴ−６ＴＭ
Ｒ（0.7μＭ；ｄｄＣ−６ＲＯＸ（1.2μＭ）；２ユニッ
トのシーケナーゼ（Sequenase、登録商標）、１ユニッ
トのピロホスファターゼ（シグマ・ケミカル社）および
水を10.0μｌまでの容量で添加した。混合物を５分間37
℃にてインキュベートし、次に氷上に置き、25.0μｌの
10mMのＥＤＴＡpH8.0を合わせて反応物を冷却した。次
いで混合物中のＤＮＡをエタノール沈澱させた（４μｌ
の３Ｍ酢酸ナトリウムpH5.2および120μｌの95％エタノ
ールを添加し、氷上で10分間インキュベートし、15分間
遠心分離し、上清をデカントして排出し、70％のエタノ
ールに再懸濁し、渦巻撹拌し、15分間遠心分離し、上清
をデカントして排出し、５分間真空遠心分離で乾燥させ
た）。次に沈澱したＤＮＡを５部の脱イオン化ホルムア
ミドと１部の50mMのＥＤＴＡpH8.0から成る３μｌの溶
液に再懸濁し、十分に渦巻撹拌した。ゲルを装填する前
に混合物を90℃で２分間インキュベートしてＤＮＡを変
性させた。モデル370Aシーケンサーの塩基呼出ルーチン
は95％の精度でM13プラスミドの400塩基を同定した。不
正確な呼出はＧに続くＣとＴの呼出をミスしたことに原
因があった。
実施例１１．ヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオトリ
ホスフェート）を用いて、またこれを用いないで合成し
た電気泳動により分離したフルオレセイン標識化ＤＮＡ
フラグメントからの蛍光発光の比較 次に示すこと以外は実施例１０に記載したように２対の
ＤＮＡシーケンス決定を行った：(1)第１の対のシーケ
ンス決定では、単一のフルオレセイン標識化ジデオキシ
ヌクレオチド、ｄｄＴ−６−ＦＡＭのみを用いた；対の
ひとつのシーケンス決定にはヌクレオシド−５′−Ｏ−
（１−チオトリホスフェート）を用い、他の決定には通
常のヌクレオシドトリホスフェートを用いた；(2)シー
ケンス決定の第２の対では、単一のフルオレセイン標識
化ジデオキシヌクレオシド、ｄｄＣ−２′，７′−ジク
ロロ−５−ＦＡＭを用いた；そいて第１の対と同様に、
ひとつのシーケンス決定にはヌクレオシド−５′−Ｏ−
（１−チオトリホスフェート）を用い、そして、他の決
定には通常のヌクレオシドトリホスフェートを用いた。
重合反応はヌクレオシドトリホスフェートまたはそれら
の１−チオトリホスフェート類似体を50μＭ含有し、両
者の場合にはフルオレセイン標識化ジデオキシヌクレオ
チドを1.5μＭ含有した。図１Ａは通常のヌクレオシド
トリホスフェート前駆体を用いて重合化したｄｄＣ−
２′，７′−ジクロロ−５−ＦＡＭ−終結ＤＮＡフラグ
メントのバンドによって発生した蛍光強度を示す。図１
Ｂはヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェ
ート）前駆体を用いて重合化したｄｄＣ−２′，７′−
ジクロロ−５−ＦＡＭ−終結ＤＮＡフラグメントのバン
ドによって発生した蛍光強度を示す。白い矢印はノイズ
レベルが１−チオトリホスフェート類似体の使用によっ
て明らかに減少している各トレースの位置を示す。黒い
矢印は分解能が１−チオトリホスフェート類似体の使用
によって明らかに高められた各トレースのピークを示
す。同様に、図２Ａと２Ｂは通常のヌクレオシドトリホ
スフェート（２Ａ）およびヌクレオシド−５′−Ｏ−
（１−チオトリホスフェート）（２Ｂ）を用いて重合し
たｄｄＴ−６ＦＡＭ−終結ＤＮＡフラグメントのバンド
によって発生した蛍光強度を示す。また、白い矢印は１
−チオトリホスフェート類似体を用いるとき、殆どノイ
ズが発生しないことを示し、黒い矢印は１−チオトリホ
スフェート類似体を用いるとき、幾つかのバンドからの
信号が高くなったことを示している。
ホスフェート）を用いて、またこれを用いないで合成し
た電気泳動により分離したフルオレセイン標識化ＤＮＡ
フラグメントからの蛍光発光の比較 次に示すこと以外は実施例１０に記載したように２対の
ＤＮＡシーケンス決定を行った：(1)第１の対のシーケ
ンス決定では、単一のフルオレセイン標識化ジデオキシ
ヌクレオチド、ｄｄＴ−６−ＦＡＭのみを用いた；対の
ひとつのシーケンス決定にはヌクレオシド−５′−Ｏ−
（１−チオトリホスフェート）を用い、他の決定には通
常のヌクレオシドトリホスフェートを用いた；(2)シー
ケンス決定の第２の対では、単一のフルオレセイン標識
化ジデオキシヌクレオシド、ｄｄＣ−２′，７′−ジク
ロロ−５−ＦＡＭを用いた；そいて第１の対と同様に、
ひとつのシーケンス決定にはヌクレオシド−５′−Ｏ−
（１−チオトリホスフェート）を用い、そして、他の決
定には通常のヌクレオシドトリホスフェートを用いた。
重合反応はヌクレオシドトリホスフェートまたはそれら
の１−チオトリホスフェート類似体を50μＭ含有し、両
者の場合にはフルオレセイン標識化ジデオキシヌクレオ
チドを1.5μＭ含有した。図１Ａは通常のヌクレオシド
トリホスフェート前駆体を用いて重合化したｄｄＣ−
２′，７′−ジクロロ−５−ＦＡＭ−終結ＤＮＡフラグ
メントのバンドによって発生した蛍光強度を示す。図１
Ｂはヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェ
ート）前駆体を用いて重合化したｄｄＣ−２′，７′−
ジクロロ−５−ＦＡＭ−終結ＤＮＡフラグメントのバン
ドによって発生した蛍光強度を示す。白い矢印はノイズ
レベルが１−チオトリホスフェート類似体の使用によっ
て明らかに減少している各トレースの位置を示す。黒い
矢印は分解能が１−チオトリホスフェート類似体の使用
によって明らかに高められた各トレースのピークを示
す。同様に、図２Ａと２Ｂは通常のヌクレオシドトリホ
スフェート（２Ａ）およびヌクレオシド−５′−Ｏ−
（１−チオトリホスフェート）（２Ｂ）を用いて重合し
たｄｄＴ−６ＦＡＭ−終結ＤＮＡフラグメントのバンド
によって発生した蛍光強度を示す。また、白い矢印は１
−チオトリホスフェート類似体を用いるとき、殆どノイ
ズが発生しないことを示し、黒い矢印は１−チオトリホ
スフェート類似体を用いるとき、幾つかのバンドからの
信号が高くなったことを示している。
実施例１２．４種のフルオレセイン標識化ジデオキシヌ
クレオチドおよびヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオ
トリホスフェート）を用いたシーケンス決定 次に示すこと以外は実施例１０に記載したようにシーケ
ンス決定を行った：(1)次の標識化ジデオキシヌクレオ
チドを用いた：ｄｄＡ−５−ＬＯＵ（0.7μＭ）、ｄｄ
Ｃ−２′，７′−ジクロロ−５−ＦＡＭ（0.2μＭ）、
ｄｄＧ−５−ＮＡＮ（1.3μＭ）、および、ｄｄＴ−６
−ＦＡＭ（0.2μＭ）；および(2)ヌクレオシド−５′−
Ｏ−（１−チオトリホスフェート）を重合化反応で50μ
Ｍで使用した。370A自動化塩基呼出ルーチンによって４
個のエラーで500塩基が決定され；完全な正確度で400塩
基が決定された。
クレオチドおよびヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオ
トリホスフェート）を用いたシーケンス決定 次に示すこと以外は実施例１０に記載したようにシーケ
ンス決定を行った：(1)次の標識化ジデオキシヌクレオ
チドを用いた：ｄｄＡ−５−ＬＯＵ（0.7μＭ）、ｄｄ
Ｃ−２′，７′−ジクロロ−５−ＦＡＭ（0.2μＭ）、
ｄｄＧ−５−ＮＡＮ（1.3μＭ）、および、ｄｄＴ−６
−ＦＡＭ（0.2μＭ）；および(2)ヌクレオシド−５′−
Ｏ−（１−チオトリホスフェート）を重合化反応で50μ
Ｍで使用した。370A自動化塩基呼出ルーチンによって４
個のエラーで500塩基が決定され；完全な正確度で400塩
基が決定された。
本発明の好適例の前述の開示は例証と記述のために示さ
れた。正確な開示された形に本発明が限定されまたは網
羅されるつもりではなく、明らかに前記教示に照らして
多くの変更や改変が可能である。実施例は本発明の原理
およびその実際の応用を最良に説明するために選択し記
載したものであり、これによって予期された特定の用途
に合うように他の当業者が本発明を種々の具体化により
最良に利用することができる。本発明の範囲はここに添
付する請求の範囲によって明確にするつもりである。
れた。正確な開示された形に本発明が限定されまたは網
羅されるつもりではなく、明らかに前記教示に照らして
多くの変更や改変が可能である。実施例は本発明の原理
およびその実際の応用を最良に説明するために選択し記
載したものであり、これによって予期された特定の用途
に合うように他の当業者が本発明を種々の具体化により
最良に利用することができる。本発明の範囲はここに添
付する請求の範囲によって明確にするつもりである。
Claims (20)
- 【請求項１】標的核酸のヌクレオチドシーケンスを決定
する方法が： 鋳型核酸を用意し、この鋳型核酸は標的核酸を含有して
おり； 鋳型核酸のためのオリゴヌクレオチドプライマーを用意
し； オリゴヌクレオチドプライマーに鋳型核酸に対してハイ
ブリッドを形成し； 核酸ポリメラーゼを用いてヌクレオチド前駆体および少
なくとも１種の鎖終結ヌクレオチドから成る反応混合物
においてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、同じ
大きさの各ＤＮＡフラグメントが同じ鎖終結ヌクレオチ
ドを用いて終結するようにＤＮＡフラグメント個体群の
ネストシリーズを形成し、前記ヌクレオチド前駆体はヌ
クレオシド−５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）
から成り； ＤＮＡフラグメント個体群を大きさによって分離し； そして 各ＤＮＡフラグメント個体群と結合した鎖終結ヌクレオ
チドを同定する各工程から成る方法。 - 【請求項２】前記分離の工程がゲル電気泳動によって前
記ＤＮＡフラグメント個体群を分離し、各バンドが同じ
大きさのＤＮＡフラグメントに対応するようにＤＮＡフ
ラグメント個体群のバンドを形成する請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】前記少なくとも１種の鎖終結ヌクレオチド
が第１の染料で標識化されたジデオキシアデノシン、第
２の染料で標識化されたジデオキシシチジン、第３の染
料で標識化されたジデオキシグアノシン、および第４の
染料で標識化されたジデオキシチミジンから成り、第
１、第２、第３、および第４の染料が一方が他方に関し
てスペクトルにより分割でき、そして前記同定する工程
は第１、第２、第３、および第４の染料が蛍光を発生す
る原因となるようにＤＮＡフラグメントの前記バンドを
発光し、第１、第２、第３、および第４の染料の蛍光お
よび／または吸着特性を測定する各工程を含む請求項２
記載の方法。 - 【請求項４】前記核酸ポリメラーゼがエキソヌクレアー
ゼ活性を実質的に失活させたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ
である請求項３記載の方法。 - 【請求項５】前記ジデオキシアデノシンが２′，３′−
ジデオキシ−７−デアザアデノシンであり、前記第１の
染料が連結基によってその７炭素原子に結合しており；
前記ジデオキシシチジンが２′−３′−ジデオキシシチ
ジンであり、前記第２の染料が連結基によってその５炭
素原子に結合しており；前記ジデオキシグアノシンが
２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび
２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る
群から選ばれ、前記第３の染料が連結基によってその７
炭素原子に結合し；そして前記ジデオキシチミジンが
２′，３′−ジデオキシウリジンであり、前記第４の染
料が連結基によってその５炭素原子に結合している請求
項４記載の方法。 - 【請求項６】前記第１、第２、第３、および第４の染料
がローダミン染料およびフルオレセイン染料から成る群
から選ばれる請求項５記載の方法。 - 【請求項７】前記連結基が３−カルボキシアミノ−１−
プロピニルであり、前記２′，３′−ジデオキシ−７−
デアザアデノシン、および２′，３′−ジデオキシ−７
−デアザグアノシンおよび２′，３′−ジデオキシ−７
−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキ
シグアノシンの前記７炭素原子を、それぞれ、前記第１
および第３の染料の５または６炭素原子に結合し、そし
て前記ジデオキシシチジンおよび前記ジデオキシチミジ
ンの前記５炭素原子をそれぞれ、前記第２および第４の
染料の５または６炭素原子に結合する請求項６記載の方
法。 - 【請求項８】前記第１、第２、第３、および第４の染料
がローダミンＸ、テトラメチルローダミン、ローダミン
110、およびローダミン６Ｇから選ばれる請求項７記載
の方法。 - 【請求項９】前記２′，３′−ジデオキシ−７−デアザ
アデノシンをローダミン６Ｇの前記５炭素原子に結合
し、そして前記２′，３′−ジデオキシシチジンをロー
ダミンＸの前記６炭素原子に結合し、２′，３′−ジデ
オキシ−７−デアザグアノシンおよび２′，３′−ジデ
オキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前
記ジデオキシグアノシンをローダミン110の前記５炭素
原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシウリジンを
テトラメチルローダミンの前記６炭素原子に結合する請
求項８記載の方法。 - 【請求項１０】前記第１、第２、第３、第４の染料が５
−（および６−）カルボキシフルオレセイン、２′，
７′−ジクロロ−５−（および６−）カルボキシフルオ
レセイン、２′，７′−ジメトキシ−４′，５′−ジク
ロロ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジクロ
ロフルオレセイン、および１′，２′，７′，８′−ジ
ベンゾ−５−（および６−）カルボキシ−４，７−ジク
ロロフルオレセインから成る群から選ばれる請求項７記
載の方法。 - 【請求項１１】前記２′，３′−ジデオキシ−７−デア
ザアデノシンが２′，７′−ジメトキシ−４′，５′−
ジクロロ−４，７−ジクロロフルオレセインの前記５炭
素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシシチジン
が２′，７′−ジクロロフルオレセインの５炭素原子に
結合し、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシ
ンおよび２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシン
から成る群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンが
１′，２′，７′，８′−ジベンゾ−４，７−ジクロロ
フルオレセインの前記５炭素原子に結合し、そして前記
２′，３′−ジデオキシウリジンがフルオレセインの前
記６炭素原子に結合している請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】前記鋳型核酸を用意し、前記オリゴヌク
レオチドプライマーを用意し、ハイブリッドを形成し、
そして伸長する前記工程が、４種の分離した反応混合物
の各々において前記鋳型核酸のためのオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用意し、ＤＮＡフラグメント個体群の４
種のネストシリーズを形成するようにオリゴヌクレオチ
ドプライマーを別々に伸長する請求項１の記載の方法。 - 【請求項１３】前記ＤＮＡフラグメント個体群を放射活
性により標識化し、前記分離工程がゲル電気泳動によっ
て前記４種のＤＮＡフラグメント個体群の各々を分離し
て各バンドが同じ大きさのＤＮＡフラグメントに対応す
るようにＤＮＡフラグメント個体群のバンドの４種の別
々の組を形成する請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】前記オリゴヌクレオチドプライマーの各
々が標識をもつ請求項１２記載の方法。 - 【請求項１５】前記オリゴヌクレオチドプライマーの各
々のための前記標識が異なる請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】前記標識がスペクトルにより分割できる
１組の蛍光染料から選択される請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】標的核酸のヌクレオチドシーケンスを決
定する方法において、ＤＮＡフラグメント個体群のネス
トシリーズが１またはそれ以上の鎖終結ヌクレオチドの
存在で核酸ポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチドプ
ライマーを伸長することによって生成し、ＤＮＡフラグ
メント個体群のネストシリーズが大きさによって分離さ
れるタイプの方法の改良が： ヌクレオシド−５′−Ｏ−（１−チオトリホスフェー
ト）から成るヌクレオチド前駆体を含む反応混合物にお
いて核酸ポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチドプラ
イマーを伸長することから成る方法。 - 【請求項１８】前記ＤＮＡフラグメント個体群がゲル電
気泳動によって分離される請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】前記１またはそれ以上の鎖終結ヌクレオ
チドが、第１の蛍光染料を用いて標識化されたジデオキ
シアデノシン、第２の蛍光染料を用いて標識化されたジ
デオキシシチジン、第３の蛍光染料を用いて標識化され
たジデオキシグアノシン、および第４の蛍光染料を用い
て標識化されたジデオキシチミジンから成り、第１、第
２、第３、および第４の蛍光染料が一方が他方に関連し
て別々にスペクトルにより分割できる請求項１８記載の
方法。 - 【請求項２０】前記核酸ポリメラーゼがエキソヌクレア
ーゼ活性を実質的に失活させたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ
である請求項１９記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/590,218 US5187085A (en) | 1990-09-28 | 1990-09-28 | Nucleic acid sequence analysis with nucleoside-5'-o-(1-thiotriphosphates) |
| US590,218 | 1990-09-28 | ||
| PCT/US1991/007345 WO1992006219A1 (en) | 1990-09-28 | 1991-09-27 | Improved nucleic acid sequence analysis with nucleoside-5'-0-(1-thiotriphosphates) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05507000A JPH05507000A (ja) | 1993-10-14 |
| JPH0661280B2 true JPH0661280B2 (ja) | 1994-08-17 |
Family
ID=24361335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3517034A Expired - Lifetime JPH0661280B2 (ja) | 1990-09-28 | 1991-09-27 | ヌクレオシド−５’−ｏ−（１−チオトリホスフェート）を用いる改良された核酸シーケンス分析 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5187085A (ja) |
| EP (1) | EP0550646B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0661280B2 (ja) |
| AT (1) | ATE191511T1 (ja) |
| DE (1) | DE69132097T2 (ja) |
| WO (1) | WO1992006219A1 (ja) |
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