JPH05507000A - ヌクレオシド−5’−o−(1−チオトリホスフェート)を用いる改良された核酸シーケンス分析 - Google Patents

ヌクレオシド−5’−o−(1−チオトリホスフェート)を用いる改良された核酸シーケンス分析

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JPH05507000A JP91517034A JP51703491A JPH05507000A JP H05507000 A JPH05507000 A JP H05507000A JP 91517034 A JP91517034 A JP 91517034A JP 51703491 A JP51703491 A JP 51703491A JP H05507000 A JPH05507000 A JP H05507000A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオシド−5’−0−(1−チオトリホスフェート)いる れな シー ン ス 光泗!υ灯(氷J 本発明は一般に核酸シーケンス分析に関し、さらに特に、DNAシーケンシング への鎖終結のアプローチにおけるDNAポリメラーゼ基質としてのヌクレオシド −5’−0−(1−チオトリホスフェート)の使用に関するものである。
■ DNAシーケンスを決定するための能力は遺伝子の機能およびコントロールを理 解するため、および分子生物学の多くの基礎技術に応用するために重要である。
本来のDNAは2つの線状ポリマーまたはヌクレオチドのらせん構造から成る。
各らせん構造はホスホジエステル結合によって結合したヌクレオシドの鎖である 。
2つのらせん構造は共に2つのらせん構造のヌクレオチドの相補的塩基の間:チ ミジン(T)とデオキシアデノシン(A>のベア、およびデオキシシチジンCC )とデオキシグアノシン(G)のペアの、水素結合によって逆平行の配向で保持 される。
現在、DNAシーケンスの決定には2つの基本的なアプローチがあるニジデオキ シチェインターミネータ−法、例えば、サンガーら、プロシーディンゲス・オブ ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ(Proc、 Natl 、 Acad、 Sci、) 、第74巻、5463−5467頁 (1977) ;および化学的分解方法、例えば、マクサムら、プロシーディン ゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ(Proc、  Natl、 Acad、 Sci、) 、第74巻、560−564頁(19 77)。チェインターミネータ−法は幾つかの方法で改良され、現在入手できる 自動化DNAシーケンシング機械のすべてに対して基準として役に立つ、例えば サンガーら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ (J、Mo1.  Biol、) 、第143巻、161−178頁(1980) ;シュライヤ ーら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ(J、 Mo1. Bi ol、)、第129巻、169−172頁(1979);ミルスら、プロシーデ ィンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アヵデミイ・オブ・サイエンシーズ(Pro c、 Natl、 Acad、 Sci、) 、第76巻、2232−2235 頁(1979) ;スミスら、ヌクレイ7り・アシッズ・リサーチ(Nucle ic Ac1ds Re5earcb) 、第131’、 2399−2412 頁(1985) ;スミスら、ネイチャー (Nature) 、第321巻、 674−679頁(1987) ;プロパーら、サイエンス(Science) 、第238巻、336−341頁(1987) 、セクション■、メソッズ・イ ン・エンザイモロジイ (Meth、 Enzysol、) 、第155巻、5 1−334頁(1987) ;チャーチら、サイエンス(Science)、第 240巻、185−188頁(1988);タボールら、プロシーディンゲス・ オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ(Proc、 Na tl、 Acad、 Set、)、第84S、4767−4771頁(1987 ) ;タボールら、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・ オブ・サイエンシーズ(Proc、 Natl、 Acad、 Sci、) 、 第86S、4076−4080頁(1989) ;インニスら、プロシーディン ゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ(Proc、  Natl、 Acad、 Sci、) 、第85巻、9436〜9440頁( 198B) ;およびコンネルら、バイオテクニクス(Biotechniqu es)、第5@、342−348頁(1987) 。
チェインターミネータ−法と化学的分解方法の両者は、各々が共通の起源をもち 、各々が既知の塩基で終結している1組またはそれ以上の標111iDNAフラ グメントの世代を必要とする0次に単数または複数の組のフラグメントは大きさ によって分離されてシーケンス情報が得られる0両方法において、DNAフラグ メントは高分解ゲル電気泳動によって分離される。通常、DNAフラグメントは 放射活性ヌクレオシドトリホスフェート前駆物質によって、または蛍光染料によ って標識化される。
大抵の自動化DNAシーケンシング機械において、異なる末端塩基をもつフラグ メントは異なる蛍光染料を用いて標識化され、プライマー、例えばスミスら(1 987、上記引用)、または末端ジデオキシヌクレオチド、例えばプロパーら( 上記引用)のいずれかに結合している。蛍光により標識化されたフラグメントは 電気泳動分離のために同じゲルカラムに一緒に装填される。塩基シーケンスは分 離工程中に固定検出器を通過するときフラグメントによって放出される蛍光信号 を分析して決定される。
このような分析は、多くの現象によって複雑であった、例えばバンド圧縮、部分 的に重なる蛍光標識の発光バンド、人為バンドの出現、標識化ジデオキシヌクレ オシドの誤混入によるノイズ、および高度にシーケンスに依存する方法での強度 において幅広く変化するバンド、例えばミルスら(上記引用)、コンネルら(上 記引用)、およびタボールら(1987および1989、上記引用)、、後の2 つの現象は、一定の鋳型シーケンスを通して読みこむ際におよび/または若干の 普通に用いられるヌクレオシド類似体を適応させる際に、若干のDNAポリメラ ーゼがもたらす問題点によって生じると信じられている。バンドの均等性は多く の事例において修飾T7DNAポリメラーゼ(Sequenase (登録商標 ))を使用しておよびポリメラーゼ反応において二価のカチオンとしてM n、  ” ”をMg“2と置換して改良されてきた、タボールら(1987および1 989、上記引例)。しかし、問題は残っており、最新の自動化DNAシーケン シングのアプローチには今なお重大な制限がある。
又里東量! 本発明は異なる大きさのDNAフラグメントをヌクレオシド−5’−〇−(1− チオトリホスフェート)前駆体から重合するDNAシーケンス分析のチェインタ ーミネータ−法に関する0本発明は、一部は、通常のヌクレオシドトリホスフェ ート前駆体の代りにこのような前駆体を使用すると、(1)重合においてシーケ ンス特有の小休止が少なくなり、(ii )重合中のDNAフラグメントの個体 群が一層均一になり、順番に、電気泳動分離中にバンドが一層均一な大きさにな り、そして(iii )蛍光標識化したジデオキシヌクレオチドを鎖終結ヌクレ オチドとして使用するときは常にデオキシグアノシントリホスフェートの代りに ヌクレオシド類イ以体を使用する必要がなくなるという発見に基づくものである 。好ましくは、本方法はタボールら(1987および1989、上記引用)によ って教示されたような修飾T7 DNAポリメラーゼおよびMn”を用いる。
ここで使用されるように、“鎖終結ヌクレオチド”の用語は、核酸ポリメラーゼ によって成長するDNA鎖に混入した後に、さらにポリヌクレオチド鎖の伸長、 または拡大を妨げるヌクレオチドまたはその類似体を意味する。通常、このよう なヌクレオチドの鎖終結の性質は糖部分の3′水酸基が存在しないかまたは修飾 されていることに原因がある。好ましくは、鎖終結ヌクレオチドは2′、3′− ジデオキシヌクレオチドである。
ここで使用されるように、1組の染料に関して“スペクトルによって分解できる ”の用語は、染料の蛍光放出ハンドが十分に明確である、即ち十分に部分的な重 なりがないことを意味し、各染料が結合している標的物質、例えばポリヌクレオ チドが、標準の光検出システムによって各染料によって発生した蛍光信号に基づ き、識別することができ、このようなシステムには、例えば米国特許第4 、2 30 、558号、4,811.218号等に、あるいはホイーレスら(Flo w Ctometr :Instrumentatfon and Data  Anal 5is−121−76頁、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、1 985)に記載されたシステムによって例示されるような、バンドパスフィルタ ーおよび光電子増倍管のシステムを用いる。
ここに用いるように、“バンド”の用語は、all、または同一の物理化学的性 質に基づくポリヌクレオチドの任意の空間的配置または集合を含む。通常バンド はゲル電気泳動による標識化DNAフラグメントの分離で生じる。
型皿■呈見星脱所 図IAおよびIBはヌクレオシドトリホスフェート前駆体(IA)およびヌクレ オシド−5’−0−(1−チオトリホスフェート)前駆体(IB)を用いて重合 化したDNAフラグメントのバンドの蛍光強度を示す。DNAフラグメントは2 ’、7’−ジクロロフルオレセインを用いて標識化した末端ジデオキシシチジン を含む。
図2Aおよび2Bはヌクレオシドトリホスフェート前駆体(2人)およびヌクレ オシド−5’−0−(1−チオトリホスフェート)前駆体(2B)を用いて重合 化したDNAフラグメントのバンドの蛍光強度を示す。DNAフラグメントはフ ルオレセインを用いて標識化した末端ジデオキシチミジンを含む。
l」且庇豊屑籠皿 DNAシーケンシングへの鎖終結のアプローチの基本的な工程は、(1)オリゴ ヌクレオチドブライマーおよび、サブシーケンスとして、そのシーケンスが決定 されることになっている標的核酸を含有する鋳型核酸を与え、(2)鋳型核酸に 対してオリゴヌクレオチドブライマーをハイブリッド形成し、(3)核酸ポリメ ラーゼ、例えばT7DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ(登録商標)、リバース トランスクリブターゼ等を用いて、ヌクレオシドトリホスフェート前駆体および 少なくとも1種の鎖終結ヌクレオチドを含有する反応混合物において、プライマ ーを伸長し、各短いDNAフラグメントが各長いDNAフラグメントのサブシー ケンスであるように、そして同じ大きさの各DNAフラグメントが同じ鎖終結ヌ クレオチドを用いて終結するように、DNAフラグメント個体群のネストシリー ズを形成し、(4)大きさによってDNAフラグメント個体群を分離し、そして (5)各DNAフラグメント個体群と結合した鎖終結ヌクレオチドを同定する。
ここで使用するように、1ヌクレオシドトリホスフ工−ト前駆体ゝの用語はデオ キシアデノシントリホスフェート(ATP) 、デオキシシチジントリホスフェ ート(CTP) 、デオキシグアノシントリホスフェート(GTP) 、および チミジントリホスフェート(TTP) 、またはそれらのR4m体、例えばデオ キシイノシントリホスフェート(ITP) 、7−ジアザデオキシグアノシント リホスフェート等を意味する。上記工程の各々の詳細は、異なる鎖終結ヌクレオ チドを同定するための標識化方法の性質、異なるDNAフラグメント個体群を分 離するための手段、鋳型核酸がノ\イブリッド形成工程のために提供される方法 等、当該分野において良く知られた幾つかの要素に従って変更する0例えば、D NAフラグメント個体群がプライマーに結合した蛍光染料によって同定されるな らば、そのとき4種のプライマーが与えられ、各々は異なる蛍光標識を有し、プ ライマーは4種の鎖終結ヌクレオチドに対応する4つの異なる反応混合物におい て伸長する。あるいは、DNAフラグメント個体群が伸長工程中に放射活性によ り標識化されたヌクレオシドトリホスフェートを混入させて同定されるならば、 そのとき伸長工程は通常4つの別の反応混合物を含み、各々は異なる鎖終結ヌク レオチドを含み、そして分離工程は通常大きさに従って各反応混合物のDNAフ ラグメント個体群を別々に分離することを含む、一般に、前景のセフシランの第 2節で引用した文献はDNAシーケンシングの工程とその重要な変更を開示する 。従って、これらの文献は参考文献として組み込まれる。
好ましくは、異なるDNAフラグメント個体群は鎖終結ヌクレオチドに結合した 蛍光染料によって同定される。従って、本発明の方法において、ATP、CTP SGTP、およびTTPの4種の1−チオトリホスフェート類似体、および4種 の鎖終結ヌクレオチドを含有する反応混合物中のDNAポリメラーゼによって伸 長され、各々は米国特許第4,855,225号にソングらによって、またはプ ロパーら(上記引用)等によって開示されたように、スペクトルによって分解で きる1&Hの蛍光染料の異なる部分を用いて標識化される。
ATP、CTP、、GTP、およびTTPの1−チオトリホスフェートW44Q 体はヌクレオシドホスホロチオエートと呼ばれる一般クラスの化合物の良く知ら れたサブセントであり、酵素学において大量に使用されている、例えばエックス タイン、アニュアル・レビュー・ハイオケミストリイ (Ann、 Rev、  Biochem、) 、第54巻、367−402頁(1985) ;およびエ ックスタインら、トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンス(Trends  tn Btochemical 5cience)、第14巻、97−100 頁(1989) 、ヌクレオシド−5’−0−(1−チオトリホスフェート)は 市販品として入手でき、例えばアマ−ジャム(アーリントン・ハイツ、IL)あ るいはルドウイグら、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリイ(J、O rg、 Chew、)、第54巻、631−635頁(1989)に従って合成 することができる。
鋳型は当該分野の技術、例えば、テクニカル・マニュアル・フォア・モデル37 0ADNAシーケンサ−(アプライド・バイオシステムス社、フォスター・シテ ィ、CA)によって提供される。
例えば、標的シーケンスは適当なりローニングベクター、例えばM13クローニ ングベクターの複製型に挿入でき、次に標的シーケンスのコピーの数を増幅する ように増殖される0M13の一本鎖型は鋳型として使用するために単離される。
あるいは、鋳型を当該分野で教示されているようにポリメラーゼ鎖反応(P C R)によって与えることができ、例えばインニスら、(上記引用);ウィルソン ら、バイオテクニクス(Biotechntques)、第8巻、184−18 9頁(1990) ;ギレンステン、バイオテクニクス(Biotechniq ueS)、第7S、700−708頁(1989)等がある。増幅後、液相中ま たは固相支持体に結合して重合反応で鋳型を使用することができ、例えばスター ルら、ヌクレイツク・アシフズ・リサーチ(NαcleicAcids Re5 earch) 、第16巻、3025−3038頁(1988) iフルトマン ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ(Nucleic Ac1ds Re5 earch)、第17巻、4937−4946頁(1989)等によッテ教示さ れテイル。
本発明方法のためのプライマーは市販のDNAシンセサイザーで合成することが でき、あるいは単独またはDNA増幅および/またはシーケンシングキット中の 成分として、例えば、ユナイテッド・ステイク・バイオケミカル・コーポレイシ ョン(クリーブランド、OH)、クロンチク(パロ・アルド、CA)等から購入 することができる。プライマーを鋳型にハイブリッド形成する工程は引用した参 考文献に十分に開示されており、本発明の任意の特定例に応用するための詳細な 手引きとなる。
好ましくは蛍光により標識化した本発明の鎖終結ヌクレオチドは次式で表される : XTP−L−R 式中のXTPは鎖終結ヌクレオシドトリホスフェートであり;Rは蛍光染料であ り;そしてLはヌクレオシドトリホスフェートの塩基と蛍光染料との間の結合基 である。
XTPは用いられるDNAポリメラーゼの自然のヌクレオシドトリホスフェート 基質の類似体であり、混入後にさらに鎖が伸長しないようにする。このような幾 つかの類似体は4種の自然のヌクレオシドトリホスフェートの各々に対して入手 でき、例えばホフブズら(上記引用)がリストを与えている。好ましくは、XT Pは2′、3′−ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートである。さらに好ま しくは、XTPは2′、3′−ジデオキシ−7−デアザアデノシントリホスフェ ート、2゛、3′−ジデオキシシチジントリホスフェート、2′、3′−ジデオ キシ−7−デアザグアノシン、2′、3゛−ジデオキシウリジントリホスフェー ト、および2′、3’−ジデオキシ−7−デアザイノシントリホスフェートから 成る群から選ばれる。ここで使用されるように、“ジデオキシヌクレオシド”の 用語は糖部分が環式または非環式であるヌクレオシド1144以体を含む。ヌク レオシドの塩基または糖の特定の炭素原子を参照するときは常に従来の番号の付 は方を使用する、例えばコルンベルグ、旦n(フリーマン、サン・フランシスコ 、1980) 。
Lは、ジデオキシヌクレオシドと染料との間の結合の長さと剛性が大いに変えら れるような多数の異なる形態を取ることができる。例えば、本発明を用いて使用 できる幾つかの適当な塩基標識方法が報告されている、例えばギプソンら、ヌク レイツク・アシッズ・リサーチ(Nucletc Ac1ds Re5earc h) 、第15巻、6455−6467 頁(1987) ;ゲベイエフら、ヌ クレイツク・アシフズ・リサーチ(Nucleic Ac1ds Re5ear ch)、第151!i、4513−4535頁(1987) ;ハララムビジス ら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ(Nucleic Ac1ds Re5 earch> 、第151!、4856−4876頁(198n等がある。
好ましくは、Lは本発明の染料のN−ヒドロキシスクシンイミド(NH3)エス テルとジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ誘導化塩基と反応させて形成 する。この場合に、Lは(1)ローダミンの5−または6−炭素と(2)ローダ ミンを結合する塩基の炭素との間の部分として得られる。好ましくは、Lは3− カルボキシアミノ−1−プロピニルである。シトシン、チミン、およびアデニン のこのようなアルキニルアミノ−誘導化ジデオキシヌクレオチドの合成は、ホッ プズらのヨーロッパ特許出願番号87305844.0およびホ、ブズのジャー ナル・オブ・オーガニック・ケミストリイ (J、 Org、Chew、)、第 54巻、3420頁(1989)によって教示され、これらを参考文献としてこ こに加入する。簡単には、アルキニルアミノ誘導化ジデオキシヌクレオチドは、 適当なハロジデオキシヌクレオシド(通常はホップズら(上記引用)によって教 示されたような5−ヨードピリミジンおよび7−ヨートー7−デアザブリンジデ オキシヌクレオシド)およびCu (I)をフラスコに入れ、空気を除くように Arを流しこみ、乾燥DMFを添加し、続いてアルキニルアミン、トリエチルア ミンおよびPd(0)を添加して形成される0反応混合物を数時間、あるいは薄 層クロマトグラフィがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、撹拌する ことができる。保護されていないアルキニルアミンを使用するとき、アルキニル アミノヌクレオシドは反応混合物を濃縮し、カンプリング反応で生成したハイド ロハライドを中性にするように水酸化アンモニウムを含有する溶出溶媒を用いて シリカゲルクロマトグラフィーによって単離することができる。保護されたアル キニルアミンを使用するとき、メタノール/塩化メチレンを反応混合物に添加し 、続いて強塩基アニオン交換樹脂で、濾過し、樹脂を追加のメタノール/塩化メ チレンを用いて洗浄することができる0合わせた濾液を濃縮しメタノール/塩化 メチレングラディエンドを用いるシリカゲルフランシェクロマトグラフィーによ って精製することができる。トリホスフェートが標準技法によって得られる。
上記文献に従ってアルキニルアミン誘導化ジデオキシグアノシンの合成は特に改 質されたグアニン前駆体(6−メドキシー2−メチルチオ−7−デアザプリン、 X)を必要とし、これは出発物質、6−ヒドロキシ−2−メチルチオ−7−ジア ザプリン、Xxから得られる。XXを6−クロロ−2−メチルチオ−7−デアザ プリン、XXXへ変換するには、ロビンスおよびノニル(ジャーナル・オプ・ヘ テロサイクリック・ケミストリイ(J、 Heterocyclie Che+ s、)、第1巻、34頁(1964))に従い、続いて塩素置換基をメトキシド (還流メタノール中ナトリウム塩)と置換してXを生木発明を用いることができ るローダミン染料のスペクトルによる分割ができるセットは、テトラメチルロー ダミン、ローダミンX10−ダミン110、およびローダミン6Gから成り、こ れらは、それぞれ、式1〜4によって示される。全体にわたって、左立二二ヱl ヱヱ久ス(アソシエイション・オブ・テキスタイル・ケミスツ、第2版、197 1)炭素番号図を使用する、即ち、プライムを付けた数字はキサンチン構造の炭 素であり、プライムを付けていない数字は9′−フェニルの炭素である。
犬上 皿 式」一 式( 式中: Aはカルボシキル、スルホニル、またはアミノのような、連結官能基に転化する ことができる基であり;そしてBはアニオン酸性基、好ましくはカルボキシルま たはスルホニル、そして最も好ましくはカルボキシルである。
ローダミンNHSエステルは米国特許出願第06/941,985号の教示に従 って合成される。ローダミンNHSエステルを合成する方法の重要な特徴は(1 )ローダミン染料の5−または6−形態のエステル化のために存在する実質的に 理論量のジ−N−スクシンイミジルカーボネート (D S C)および4−ジ メチルアミノピリジン(DMAP)を有する反応条件で、室温にて高収率の生成 物を生成すること、および(2)酸性の、好ましくは5以下の9Kmを有する化 合物を用いて新しく合成された生成物を処理して、反応物に逆転化しないように することを含む。本発明の一般的な反応図は式5によって示される。
この方法は5−または6−カルボキシルローダミン(異性体の混合物または純異 性体として)の酸の形態を当量のDSCおよびDMAPの極性非プロント性溶媒 中で反応させて、カルボキシルN−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成す ることから成る。
適当な極性非プロント性溶媒は、N、N−ジメチルホルムアミド(DMF) 、 ピリジン、ヘキサメチルホスホルアミド(HMPA)等を含む、最も好ましくは DMFを反応溶媒として使用する。異性体として混合したNHSエステルはさら に使用するために個々の異性体に分離することができる。最も好ましくは、試薬 を保存するために、5−または6−カルボキシルローダミンの酸の形態をまず標 準の分離技術、例えばエドムンドソンら、モレキュラー・イムノロシイ (Mo lecular Issunology) 、第21巻、561頁(1984) によって個々の異性体に分離し、次に各5−または6−カルボキシル異性体を上 述のように反応させて5−または6−カルボキシルNHSエステルをそれぞれ生 成し、再び標準技法を用いて反応混合物から分離する。
好ましくは、新しく合成したローダミンN1(SエステルはpKa〈5の揮発性 の有機溶解性酸;そしてさらに好ましくは、pKm 〈1の揮発性の有機溶解性 酸化合物、例えばメタノール中のffcIまたはHBr5または最も好ましくは 、トリフルオロ酢酸を用いて処理される。
本発明に用いるためのローダミン染料の若干の異性体混合物は市販品として、例 えばモレキュラー・ブローブス社(ニージン、OR>から入手でき、他のものは 米国特許第2,242,572 ;2.153゜059 ;3,822,270  ;3,932,415 ;および4.005.092号の技法に従って合成す ることができ、これらすべてを参考文献として加入する。
好ましくは、フルオレセイン標識鎖終結ヌクレオチドのスペクトルにより分割で きるセントを本発明の方法に用いる。多くのフルオレセイン染料は市販品として 、例えばモレキュラー・ブローブス社゛(ニージン、OR)、またはリサーチ・ オーガニ7クス(クレベランド、OH)から入手でき、あるいは当該分野で知ら れている技法、例えば、ガタクら、ジャーナル・オブ・インディアン・ケミカル −’/サイアティ(J、 Ind、 Chew、 Soc、) 、第6@、46 5−471頁(1929) ;およびカンナら、米国特許第4,439,356 号で知られた技法によって合成することができる。また、フルオレセイン類似体 を、置換レゾルシノールを置換ベンゾフェノンまたは置換トリメリー/ )酸と プロピオン酸の存在で、当該分野で良く知られた反応で反応させて合成すること ができる。スルホニルフルオレセインはリーらのサイトメトシイ <Cytom etry)、第10巻、151−164頁(1989)によって開示された方法 に従って合成され、適当な反応物を置換して改変し、5−または6−カルボキシ ル−またはスルホニルフルオレセイン生成物を与える。好ましくは、DNAシー ケンシングにおいてポリヌクレオチドを標識するとき、染料の5−および6−異 性体は、一般に電気泳動の移動度が僅かに異なり、これら異性体の混合物を使用 するとバンドが広がる原因となるので別々に使用される。染料の5−および6− 異性体は逆相HPLC1例えばエドムンドソンら(上記引用)によって容易に分 離される。一般に、最初に溶出するピークは6−異性体であり、二番目に溶出す るピークは5−異性体であると考えられる。
好ましくは、フルオレセイン染料のNHSエステルはジデオキシヌクレオチドに 適当な連結官能価で反応し、標識化したジデオキシヌクレオチドを形成する。
好ましくは次のセットのスペクトルにより分割できるフルオレセイン染料を本発 明の方法と共に用いる:フルオレセイン(“FAM”)i2’、7’−ジクロロ フルオレセイン(″2’、?’−ジクロロFAM”);2’、7′−ジメトキシ −4′、5’−ジクロロ−4,7−ジクロロフルオレセイン(’LOU″);お よびl’、2′、7’、8’−ジベンゾ−4,7〜ジクロロフルオレセイン(” NAN”)、番号はフルオレセイン染料のためのカラーインデックス番号図に対 応する。さらに好ましくは、FAMを6炭素によってジデオキシチミジンに連結 する(”ddT−6−FAM″);2’、7’−ジクロロフルオレセインを5炭 素によってジデオキシシチジンに連結する(″ddC−2’、7’−ジクロロー 5−FAM”)iLOUを5炭素によってジデオキシアデノシンに連結する(d dA−5−LOU″) ;およびNANを5炭素によってジデオキシグアノシン に連結する(“ddG−5−NAN”)、最も好ましくは、次のフルオレセイン 標識化ジデオキシヌクレオチドを用いる: ddA−5LOU 犬1 dde−2’、7’−ジクロロ−5FAM犬1 好ましくは、重合化反応で生成した標識化DNAフラグメントをゲル電気泳動に よって大きさに従って分離する、例えばゴクルドおよびマシュウズ、上記引用; リックウッドおよびハメス編、核酸のゲル電気泳動(Gel Electrop horests of Nuclejc Ac1ds):実際のアプローチ(I RLブレス・リミテッド、ロンドン、1981);またはオスターマン、蛋白質 と核酸の研究方法01ehtodsof Protein and Nucle ic Ac1d Re5earch) 、第1巻くスブリンガー・ベルラフ、ベ ルリン、1984) 、好ましくはゲルのタイプは約2〜20パーセントの濃度 (重量対容量)をもつポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、ポリアク リルアミドゲル濃度は約4〜8パーセントである。好ましくはゲルはストランド 分離、または変性側を含む、このようなゲルを構成するための詳細な方法はマニ アチスらのメソンズ・イン・エンザイモロジイ(Methodsin Enzy mology)、第65S、299−305頁(1980) 、マニアチスら、 バイオケミストリイ(Biochea+1stry) 、第14巻、3787− 3794頁(1975) ;およびマニアチスら、モレキュラー・クローニング :(Molecular Cloning) :実験室マニエアル(コールド・ スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ、ニューヨーク、1982) 、179− 11115頁によって与えられる。従ってこれらの文献を参考文献として加える 。特定の分離に用いられる最適のゲル濃度、pH1温度、変性側の濃度等は分離 すべき核酸の大きさの範囲、それらの塩基構成物、それらが−末鎖または二本、 鎖であるかどうか、そして情報を電気泳動によってサーチする種類の性質を含め て、多くの要素に依存する。従って、本発明の出願は特定の分離のための条件を 最適にするために標準の予備的な試験を必要とするかも知れない。
好ましくは、ポリヌクレオチド鎖の伸長中に、デオキシイノシントリホスフェー トをデオキシグアノシントリホスフェートと置換して、電気泳動中にいわゆる1 バンドの圧縮“を避けるようにする、例えばミルスら、プロシーディンゲス・オ ブ・ザ・ナシッナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ(Proc、 Nat l、 Acad。
Sci、) 、第76巻、2232−2235頁(1979) 、例えば、約1 0〜500塩基の範囲の大きさをもつポリヌクレオチドを分離して次のゲル中で 本発明に従って検出する=1部のビスアクリルアミドに対して19部〜1部のア クリルアミドから作られた6パーセントのポリアクリルアミドを、48パーセン ト(重量/容量)の尿素を用いて、pH8,3(25℃で測定)でトリス−ボレ ートEDTAil衝液中に形成させる。ゲルは約40℃で走行させる。
ゲル上の蛍光により標識化したDNAフラグメントのバンドは標準方法によって 、例えば高圧水銀灯、レーザー等によって照射される。好ましくは、バンドはア ルゴンイオンレーザ−1特にアルゴンイオンレーザ−の488および514nm 発光線によって生成したレーザー光によって照射される。幾つかのアルゴンイオ ンレーザ−はこれらの線で同時にレーザー光を発するものを市販品として入手で きる、例えばシオニクス社(サニーベール、CA)モデル2001等がある。
本発明の重要な特色はDNAシーケンシング方法において鎖伸長のために使用さ れる核酸ポリメラーゼである。好ましくは、本発明の方法に用いられるポリメラ ーゼは、マンガン緩衝液を用いて改質したT7DNAポリメラーゼ(Seque nase(登録商標))であり、タポールらのプロシーディンゲス・オブ・ザ・ ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンシーズ(Pro’c、Natl、 A cad、 Sci、)、第86巻、4076−4080頁(1989)によって 記載されている。さらに好ましくは、また重合反応混合物は、タボールらのジャ ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ(J、 Biol、 Chem、 ) 、第265巻、8322−8328頁(1990)によって教示されるよう なピロホスファターゼを含み、この文献は参考文献として加えられる。
1隻■ 次の実施例は本発明を説明するためのものである。試薬の濃度、温度、および他 の変化しうるパラメーターの値は本発明を例示するものであり、これらに制限さ れるものではない。
実施例1.6−TMR−NHS カラムクロマトグラフィーによって5−および6−TMR酸異性体の混合物から 6−TMR酸を分離した。 8.82mgの6−TMReI!および10.5m gのDSCをアルゴン下に0.5ml (71乾燥DMFに溶解した。テトラヒ ドロフラン(THF)中DMAPの0.5モル溶液0.09n+1を一滴ずつ添 加した。室温で2時間後、混合物を50a+1のクロロホルムに入れて塩水:水 の1=1溶液を用いて3回洗浄した。クロロホルムを蒸発させて、残渣を20g のシリカゲルカラム(300: 3078の塩化メチレン:メタノール:酢酸溶 出)で精製した。
約0.4のR1をもつ両分を蒸発させて乾燥し、8.6vgの6−TMR−NH Sをその酢酸塩として生成した。
実施例2.6−ROX−NH3 6−ROX酸をカラムクロマトグラフィーによって5−および6〜酸異性体の混 合物から分離した。46.2111gの6−ROX酸および5hgのDSCをア ルゴン下で2mlの乾燥DMFに溶解し、THF中DMAPの0.5モル溶液0 .45m1を一滴ずつ添加した。室温で1.5時間後、混合物を100m1のク ロロホルムに入れて、塩水:水の1:1ta液を用いて4回洗浄した。クロロホ ルムを蒸発させて40gのシリカゲルカラム(300:30:8の塩化メチレン :メタノール;酢酸溶出)で精製した。約0.5のR2をもつ百分を蒸発させて 乾燥し、その酢酸塩として56.4ffgの6−ROX−NH3を生成した。
実施例3.ロー゛ミンNHSエステルの なa)実施例3からの0.44mgの 6−カルボキシ−X=ローダミンNHSエステルおよび80μmのメタノール中 の0.01モルのエタノールアミンを一緒にした。アセトニトリルおよび0.1 モルのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液(pH= 7.0)を用いた反 応混合物の逆相HPLCは、生成物が70%のX−ローダミン酸および30%の X−ローダミンNHSエステルから成ることを示した(エタノールアミンとの反 応から6−カルボキシ−X−ローダミンのエタノールアミドとして観察された) 。
b)実施例3からの0.15gの6−カルボキシ−X−ローダミンNHSエステ ルを100m1のクロロホルムに溶解した;クロロホルム溶液を0.5モルの重 炭酸ナトリウムを用いて2回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、0.1  mlの酢酸を用いて処理し、莫発乾燥させた。0.35mgの生成物をa)に おけるように正確に処理した;逆相HPLCは20%の6−カルボキシ−X−ロ ーダミン酸および80%の6−カルボキシ−X−ローダミンNHSエステルを示 した。
C)実施例3からのO,15gの6−カルボキシ−X−ローダミンNHSエステ ルを、トリフルオロ酢酸を酢酸と置換したことを除いて、b)におけるように正 確に処理した。0.19mgの得られた固体をa)におけるように正確に処理し た;逆相HPLCは〈5%の6−カルボキシ−X−ローダミン酸および〉95% の6〜カルボキシ−X−ローダミンNHSエステルを示した。
実施例4.R2O−ヒフ−デアザ−2′、3”−ジデオキシアーノシント1ホス フヱー) (ddA−5R6G)の蚤上記のように得られた2、0μモルのアミ ノ−7−ジアザ−2′。
3′−ジデオキシアデノシントリホスフェート(凍結乾燥した)に、100μl のDMF、3■gの5−ローダミン6G−NHSエステルおよび50μlの1. 0トリエチルアンモニウムカーボネートを添加する、pH8,95,これを渦巻 撹拌し終夜室温で放置した0次に混合物をAX −300の220 X 4.6 s+s+、 7ミクロンカラムノHP L Cによって1分間につき1.5 m lの流速で精製した。開始の溶出は60%の0.1M)リエチルアンモニウムカ ーボネート、pH7,0,40%のCH3CNで、60%の0.1M )リエチ ルアンモニウムカーボネート、ptrr、s、40%のCHsCNへと一次勾配 で40分間行った。溶媒を真空下に蒸発させて集めた生成物から除去した。残渣 を0.0μMのトリエチルアンモニウムアセテート、PH7,0に溶解し定量し た。
実施例5.ROX−2’3’−ジデオキシシチジントリホスフェート(ddC− 6ROX)の量上記のようにして得られた5−(3”−アミノ−1”−プロピニ ル)−2’、3”−ジデオキシシチジントリホスフェート3.6μモルを150 μlのl(,0に溶かした溶液に、60μmのDMSOおよび50μIの1.0 M トリエチルアンモニウムカーボネートpH8,95中5mgの6−ローダミ ンX−NHSエステルを添加した。これを渦巻撹拌し室温で終夜放置した。生成 物を実施例4におけるように精製した。
実施例6.R110−2’、3”−ジデオキシイノシンΣ丈ホスフェート(d  d G −5RIIO)の調11上記のようにして得られた7−(3”−アミノ −1”−プロピニル)−7−ジアザ−2’、3’−ジデオキシグアノシントリホ スフェート(凍結乾燥した)の1.3μモルに、100μlのDMF。
4IIIgの5−ローダミン110−NHSエステル、および100μlの1. 0 M トリエチルアンモニウムカーボネートpH8,95を添加した。
これを渦巻撹拌し、室温で終夜放置した。生成物を実施例4におけるように精製 した。
実施例7.TMR−2’、3’−ジーオキシチミジント1ホスフェート(ddT −6TMR)の 上記のようにして得られた150μ!(7)lboに溶かした3、1μモルの5 −(3”−アミノ−1″−プロピニル)−2’、3’−ジデオキシウリジントリ ホスフェートを、150μIのDMF、100μlの1.0M )リエチルアン モニウムカーポネートp)+8.95、および4eegの6−TMR−NHSエ ステルと混合した。これを渦巻撹拌し、室温で終夜放置した。生成物を実施例4 におけるように精製した。
実施例8.2′、7’−ジメトキシ−4−”、5”−ジクロロ−5−(゛よび6 −)カルボキシ−47−ジクロロフルオレセイン(LOU”) 0.60gの3.6−ジクロロトリメット酸、1.47 gの4−メトキシレゾ ルシノール、0.2 mlの濃硫酸、および4抛lのプロピオン酸を12時間ア ルゴン下に還流した0反応混合物を150m1の水に注入し;沈澱物を乾燥し、 3++1のピリジンに入れ1時間かけて21の無水酢酸を用いてアセチル化した 。アセチル化した混合物を100m1の酢酸エチルに入れ、IN塩化水素酸で洗 浄し、水で洗浄し、蒸発乾固した。残渣を15グラムのシリカゲルに置き、50 m1の酢酸エチルで溶出し、次に4:1の酢酸エチル:メタノールで溶出した。
R1が約0.2のUV活性物質を含有する両分(4:1の酢酸エチル:メタノー ル/シリカゲル)を蒸発乾固した。この残渣を10m1のメタノールに溶解し、 次いで1抛lの4N水酸化ナトリウムを添加した。10分後、反応混合物を水で 200m1まで稀釈し、次に0.5 mlの濃縮塩化水素酸を添加した。全混合 物を200m1の酢酸エチルで抽出し、その後、酢酸エチルを硫酸ナトリウムで 乾燥し。
蒸発乾固して0.180gの黄緑色の固体を生成した。この固体を次に水性水酸 化ナトリウム中で次亜塩素酸塩で処理しLOUを生成した。
実施例9.1’、2”、7’、8”、 −ジベンゾ−5−(および6−)カルボ キシ−4,7−ジクロロフルオレセイン(′″NAN″) まず、3.6−ジクロロトリメット酸トリクロライドを調製した: 0.5gの 3.6−ジクロロトリメット酸および1..3gの五塩化燐の混合物を130℃ で40分間加熱した。混合物を室温まで冷却し水中に注入した0次いで混合物を 40■lのエーテルで抽出し、有機画分を2回15m1(7)水で洗浄し、Mg 5O* テ乾燥し、透明油(0,7g)まで濃縮した。酸三塩化物をさらに精製 することなく使用した。NANを次のように調製した: 2.7.の1.3−ジ ヒドロキシナフタレン、2.84gの3.6−ジクロロトリメリット酸トリクロ ライド、および8抛lのプロピオン酸の混合物を2時間還流した。水(5抛l) および酢酸エチル(50■l)を添加した。層を分離し、有機層を3回50m1 のI M NaHCOzを用いて抽出した。水溶液を沸とうするまで加熱しfi  HCIを用いて酸性にした。得られた赤い固体(0,2g)を濾過し乾燥した 。
およびSe uenase ()とMn−−′を いるDNAシー ンス 実施例6〜9で調製したローダミン標識化ジデオキシヌクレオチドを使用して、 アプライド・バイオシステムズ(フォスター・シティ、CA)モデル370A自 動化DNAシーケンサ−を使用する鎖終結シーケンシングにおいてDNAフラグ メントに標識を付けた。ここに参考文献として加える製造者の実験計画書くユー ザー・ブレタン DNAシーケンサ−モデル3701第2¥11.1987年8 月12日)に従って、M13sp1B−重鎖鋳型を得た(M2Sそれ自体はテス トシーケンスとして役立つ) 、 M13ユニバーサルブライマーを用いた。次 の溶液を調製した: 5X T7 MnW&衝液(100wM トリス−)IC IPH7,5,75mMのイソクエン酸ナトリウム、10mMのMnCIg、お よび2505MのNaC1) iおよびdNTPaSミックス(500,IJM のdrTPas、500 p MのdATPas、 500gMのdTTPas 、および5008MのdCTPaS。
ここで“NTPaS”は指示されたヌクレオチドの1−チオトリホスフェート類 似体を表わす)、アニール化反応はミクロ遠心分離チューブ中に、2.0μlの 5X T7 Mn 11衝液、0.4 pHolのDNA鋳型、0.8 pgA olのプライマー、および4.0μIまでの容量の水を合わせて行った。混合物 を55〜60℃にて5〜10分間イ分間インキトベート々に20〜30分かけて 4〜20℃の温度まで冷却し、次に一度遠心分離して縮合物を収集し、混合し、 氷上に置いた。次に混合物に1.0μlのdNTPas ミックス、a a c  −5RIIO(0,008gM)、ddA−5R6G (0,1μ旧、ddT −6TMR(0,7μM);d d C−6ROX (1,2、l) : 2ユ ニツトのシーケナーゼ(Sequ@!11aSe、登録商標)、1ユニツトのピ ロホスファターゼ(シグマ・ケミカル社)および水を10.0μlまでの容量で 添加した。混合物を5分間37℃にてインキュベートし、次に氷上に置き、25 .0μlの10mMのE D T ApH8,Oを合わせて反応物を冷却した0 次いで混合物中のDNAをエタノール沈澱させた(4μlの3M酢酸ナトリウム PH5,2および120μlの95%エタノールを添加し、氷上で10分間イン キュベートし、15分間遠心分離し、上滑をデカントして排出し、70%のエタ ノールに再懸濁し、渦を撹拌し、15分間遠心分離し、上清をデカントして排出 し、5分間真空遠心分離で乾燥させた)0次に沈澱したDNAを5部の脱イオン 化ホルムアミドと1部の505MのE D T ApH8,0から成る3μlの 溶液に再懸濁し、十分に渦巻撹拌した。ゲルを装填する前に混合物を90℃で2 分間インキュベートしてDNAを変性させた。モデル370シーケンサ−の塩基 呼出ルーチンは95%の精度でM13プラスミドの400塩基を同定した。不正 確な呼出はGに続くCとTの呼出をミスしたことに原因があった。
実施例11.ヌクレオシド−5’−0−(1−チオトチホスフェート) いて、  たこれ いないで人 した″ によ したフルオレセイン ゛ DNAフーグ メント1゛の の ・ 次に示すこと以外は実施例10に記載したように2対のDNAシーケンス決定を 行った=(1)第1の対のシーケンス決定では、単一のフルオレセイン標識化ジ デオキシヌクレオチド、ddT−6−FAMのみを用いた;対のひとつのシーケ ンス決定にはヌクレオシド−5’−0−(1−チオトリホスフェート)を用い、 他の決定には通常のヌクレオシドトリホスフェートを用いた;(2)シーケンス 決定の第2の対では、単一のフルオレセイン標識化ジデオキシヌクレオシド、d de−2’、7’−ジクロロ−5−FAMを用いた;そして第1の対と同様に、 ひとつのシーケンス決定にはヌクレオシド−5′−0−(1−チオトリホスフェ ート)を用い、そして、他の決定には通常のヌクレオシドトリホスフェートを用 いた。重合反応はヌクレオシドトリホスフェートまたはそれらの1−チオトリホ スフェート類似体を50μH含有し、両者の場合にはフルオレセイン標識化ジデ オキシヌクレオシドを1,5μH含有した。図IAは通常のヌクレオシドトリホ スフェート前駆体を用いて重合化したdde−2’、7”−ジクロロ−5−FA M−終結DNAフラグメントのバンドによって発生した蛍光強度を示す。図IB はヌクレオシド−5’−0−(1−チオトリホスフェート)前駆体を用いて重合 化したdde−2’、7”−ジクロロ−5−FAM−終結DNAフラグメントの バンドによって発生した蛍光強度を示す、白い矢印はノイズレベルが1−チオト リホスフェート類似体の使用によって明らかに減少している各トレースの位置を 示す、黒い矢印は分解能が1−チオトリホスフェートi似体の使用によって明ら かに高められた各トレースのピークを示す。同様に、図2Aと2Bは通常のヌク レオシドトリホスフェート(2A)およびヌクレオシド−5’−0−(1−チオ トリホスフェート)(2B)を用いて重合したddT−6FAM−終結DNAフ ラグメントのバンドによって発生した蛍光強度を示す。また、白い矢印は1−チ オトリホスフェート類似体を用いるとき、殆どノイズが発生しないことを示し、 黒い矢印は1−チオトリホスフェート類似体を用いるとき、幾つかのバンドから の信号が高くなったことを示している。
実施例12.4 のフルオレセイン ジデオキシヌクレオチ゛およびヌクレオシ ド−5”−0−(1−チオトリホスフェート)を いたシーケンス′ 次に示すこと以外は実施例10に記載したようにシーケンス決定を行った直1) 次の標識化ジデオキシヌクレオチドを用いた:ddA−5−LOU (0,7μ 旧、dde−2’、7’−ジクロロ−5−FAM(0,2μM)、d d G− 5−NAN (1,3μ門)、および、ddT−6−FAM (0,2μM)  iおよび(2)ヌクレオシド−5’−0−(1−チオトリホスフェート)を重合 化反応で50μ−で使用した。370A自動化塩基呼出ルーチンによって4個の エラーで500塩基が決定され;完全な正確度で400塩基が決定された。
本発明の好適例の前述の開示は例証と記述のために示された。
正確な開示された形に本発明が限定されまたは網羅されるつもりではなく、明ら かに前記教示に照らして多くの変更や改変が可能である。実施例は本発明の原理 およびその実際の応用を最良に説明するために選択し記載したものであり、これ によって予期された特定の用途に合うように他の当業者が本発明を種々の具体化 により最良に利用することができる。本発明の範囲はここに添付する請求の範囲 によって明確にするつもりである。
要 約 書 核酸シーケンス決定の鎖線結方法はヌクレオシドトリホスフェート前駆体を重合 化工程においてそれらの1−チオトリホスフェート類億体と置換して提供される 。この置換は、順番に、一層正確な塩基を決定することになる電気泳動により分 離されたDNAフラグメントの一層均一なバンドとなる。

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.標的核酸のヌクレオチドシーケンスを決定する方法が:鋳型核酸を用意し、 この鋳型核酸は標的核酸を含有しており;鋳型核酸のためのオリゴヌクレオチド プライマーを用意し;オリゴヌクレオチドプライマーに鋳型核酸に対してハイブ リッドを形成し; 核酸ポリメラーゼを用いてヌクレオシド−5′−O−(1−チオトリホスフェー ト)前駆体および少なくとも1種の鎖終結ヌクレオチドを含有する反応混合物に おいてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長し、同じ大きさの各DNAフラグメ ントが同じ鎖終結ヌクレオチドを用いて終結するようにDNAフラグメント個体 群のネストシリーズを形成し; DNAフラグメント個体群を大きさによって分離し;そして 各DNAフラグメント個体群と結合した鎖終結ヌクレオチドを同定する各工程か ら成る方法。
  2. 2.前記分離の工程がゲル電気泳動によって前記DNAフラグメント個体群を分 離し、各バンドが同じ大きさのDNAフラグメントに対応するようにDNAフラ グメント個体群のバンドを形成する請求項1記載の方法。
  3. 3.前記少なくとも1種の鎖終結ヌクレオチドが第1の染料で標識化されたジデ オキシアデノシン、第2の染料で標識化されたジデオキシシチジン、第3の染料 で標識化されたジデオキシグアノシン、および第4の染料で標識化されたジデオ キシチミジンから成り、第1、第2、第3、および第4の染料が一方が他方に関 してスペクトルにより分割でき、そして前記同定する工程は第1、第2、第3、 および第4の染料が蛍光を発生する原因となるようにDNAフラグメントの前記 バンドを発光し、第1、第2、第3、および第4の染料の蛍光および/または吸 着特性を測定する各工程を含む請求項2記載の方法。
  4. 4.前記核酸ポリメラーゼがシーケナーゼ(Sequenase(登録商標)) である請求項3記載の方法。
  5. 5.前記ジデオキシアデノシンが2′,3′−ジデオキシ−7−デアザアデノシ ンであり、前記第1の染料が連結基によってその7炭素原子に結合しており;前 記ジデオキシシチジンが2′,3′−ジデオキシシチジンであり、前記第2の染 料が連結基によってその5炭素原子に結合しており;前記ジデオキシグアノシン が2′,3′−ジデオキシ−7−デアザグアノシンおよび2′,3′−ジデオキ シ−7−デアザイノシンから成る群から選ばれ、前記第3の染料が連結基によっ てその7炭素原子に結合し;そして前記ジデオキシチミジンが2′,3′−ジデ オキシウリジンであり、前記第4の染料が連結基によってその5炭素原子に結合 している請求項4記載の方法。
  6. 6.前記第1、第2、第3、および第4の染料がローダミン染料およびフルオレ セイン染料から成る群から選ばれる請求項5記載の方法。
  7. 7.前記連結基が3−カルボキシアミノ−1−プロビニルであり、前記2′,3 ′−ジデオキシ−7−デアザアデノシン、および2′,3′−ジデオキシ−7− デアザグアノシンおよび2′,3′−ジデオキシ−7−デアザイノシンから成る 群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンの前記7炭素原子を、それぞれ、前記 第1および第3の染料の5または6炭素原子に結合し、そして前記ジデオキシシ チジンおよび前記ジデオキシチミジンの前記5炭素原子をそれぞれ、前記第2お よび第4の染料の5または6炭素原子に結合する請求項6記載の方法。
  8. 8.前記第1、第2、第3、および第4の染料がローダミンX、テトラメチルロ ーダミン、ローダミン110、およびローダミン6Gから選ばれる請求項7記載 の方法。
  9. 9.前記2′,3′−ジデオキシ−7−デアザアデノシンをローダミン6Gの前 記5炭素原子に結合し、そして前記2′,3′−ジデオキシシチジンをローダミ ンXの前記6炭素原子に結合し、2′,3′−ジデオキシ−7−デアザグアノシ ンおよび2′,3′−ジデオキシ−7−デアザイノシンから成る群から選ばれる 前記ジデオキシグアノシンをローダミン110の前記5炭素原子に結合し、前記 2′,3′−ジデオキシウリジンをテトラメチルローダミンの前記6炭素原子に 結合する請求項8記載の方法。
  10. 10.前記第1、第2、第3、第4の染料が5−(および6−)カルボキシフル オレセイン、2′,7′−ジクロロ−5−(および6−)カルボキシフルオレセ イン、2′,7′−ジメトキシ−4′,5′−ジクロロ−5−(および6−)カ ルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、および1′,2′,7′,8′− ジベンゾ−5−(および6−)カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセインか ら成る群から選ばれる請求項7記載の方法。
  11. 11.前記2′,3′−ジデオキシ−7−デアザアデノシンが2′,7′−ジメ トキシ−4′,5′−ジクロロ−4,7−ジクロロフルオレセインの前記5炭素 原子に結合し、前記2′,3′−ジデオキシシチジンが2′,7′−ジクロロフ ルオレセインの5炭素原子に結合し、2′,3′−ジデオキシ−7−デアザグア ノシンおよび2′,3′−ジデオキシ−7−デアザイノシンから成る群から選ば れる前記ジデオキシグアノシンが1′,2′,7′,8′−ジベンゾ−4,7− ジクロロフルオレセインの前記5炭素原子に結合し、そして前記2′,3′−ジ デオキシウリジンがフルオレセインの前記6炭素原子に結合している請求項10 記載の方法。
  12. 12.前記鋳型核酸を用意し、前記オリゴヌクレオチドプライマーを用意し、ハ イブリッドを形成し、そして伸長する前記工程が、4種の分離した反応混合物の 各々において前記鋳型核酸のためのオリゴヌクレオチドプライマーを用意し、D NAフラグメント個体群の4種のネストシリーズを形成するようにオリゴヌクレ オチドプライマーを別々に伸長する請求項1の記載の方法。
  13. 13.前記DNAフラグメント個体群を放射活性により標識化し、前記分離工程 がゲル電気泳動によって前記4種のDNAフラグメント個体群の各々を分離して 各バンドが同じ大きさのDNAフラグメントに対応するようにDNAフラグメン ト個体群のバンドの4種の別々の組を形成する請求項12記載の方法。
  14. 14.前記オリゴヌクレオチドプライマーの各々が標識をもつ請求項12記載の 方法。
  15. 15.前記オリゴヌクレオチドプライマーの各々のための前記標識が異なる請求 項14記載の方法。
  16. 16.前記標識がスペクトルにより分割できる1組の蛍光染料から選択される請 求項15記載の方法。
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