JP4554224B2 - 分子プローブとしての4,7−ジクロロフルオレセイン染料 - Google Patents
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Description
本発明は一般に蛍光標識技術に関し、そしてさらに特に、同じ試料中の多数の標的物質を検出するための4,7−ジクロロフルオレセインの使用に関するものである。
A’は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり;
B’はフルオロ、クロロ、または酸性アニオン基であり;
X’は水素、フルオロまたはクロロであり;
Z3およびZ4は別々に水素、ハロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり;そして
A’、Z3、およびZ4の少なくとも1個は連結官能体または連結官能体に変換できる基である、化合物、である。
本発明は4,7−ジクロロフルオレセイン染料を使用して空間的に重なる標的物質を同時に検出する方法、そして特に、4,7−ジクロロフルオレセイン染料を用いるDNA配列決定の方法にある。本発明はまた式1によって定義される2’,7’−ジクロロ−5(および6−)カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセインを含む。
X’は水素、フルオロまたはクロロであり、A’が6個の炭素原子の置換基であるときは必ずX’は5個の炭素原子の置換基であり、そしてA’が5個の炭素原子の置換基であるときは必ずX’は6個の炭素原子の置換基であり;好ましくはX’は水素であり;
Z3水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり;好ましくはZ3は水素またはクロロであり;
Z4は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、例えばイソチオシアネート、スクシンイミジルカルボキシレート、またはホスホルアミダイト、または連結官能体に変換できる基、例えばカルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり;好ましくはZ4は水素またはクロロであり;
B’はフルオロ、クロロ、または酸性アニオン基;好ましくはB’はカルボキシルまたはスルホニル、および最も好ましくはB’はカルボキシルであり;
そしてA’、Z3、およびZ4の少なくとも1個は連結官能体または連結官能体に変換できる基である。好ましくはA’、Z3、およびZ4の1個のみは連結官能体または連結官能体に変換できる基である。
全体にわたり、カラー・インデックス(アソシエーション・オブ・テキスタイル・ケミスツ、第2版、1971)炭素ナンバリング図式を使用する、すなわちプライムを付した数字はキサンテン構造の炭素を指し、プライムを付していない数字は9’−フェニルの炭素を指す。
上述のように、本発明は通常長い波長、狭い発光バンド幅および他の有利な蛍光性にて最大の吸収および発光を示すある種のフルオレセイン染料の発見に一部は基づくものである。さらに、本発明はこの種の染料の種類として式Iによって定義される新規のフルオレセイン類似体を含む。これらの染料はスペクトルにより分解できる、自動化DNA配列決定分析に特に利用できる物理化学的に類似の染料の新規なセットのアセンブリを可能にする。
は、染料の蛍光発光バンドが充分に明確であり、すなわち充分に重なっておらず、各染料が結合している標的物質、例えばポリヌクレオチドを、例えばバンドパスフィルターおよび光電子増倍管のシステムを用いる標準光検出システムまたはその類似のシステムによって各染料によって発生した蛍光信号に基づいて区別することができることを意味し、前記システムは米国特許4,230,558号、4,811,218号等、またはホイーレスら、フロー・シトメトリイ:インストルメンテージョン・アンド・データ・アナリシス(アカデミック・プレス・ニューヨーク、1985)の21〜76頁に記載されたようなシステムが挙げられる。
Z1は水素または、Z2と共にとるときは、ベンゾであり;
Z2は、単独でとるときは、水素、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、または活性連結官能体に変換できる基、例えば、カルボキシル、スルホニル、またはメチルアミノであり、またはZ1と共にとるときは、Z2は活性連結官能体に変換できるメチルアミノであり、またはZ5と共にとるときは、Z6はベンゾであり、好ましくは、単独でとるときは、Z6は水素、メチル、エチル、フルオロ、クロロ、メトキシ、またはエトキシであり;
そしてA、Z2、Z3、Z4、およびZ5の少なくとも1個は連結官能体に変換できる基である。好ましくは、A、Z2、Z3、Z4、およびZ5の1個のみが活性連結官能体に変換できる基である。
本発明の染料はDNA配列決定のためのジデオキシヌクレオチドに標識を付けるために使用されるとき、好ましくはこれらはピリミジン塩基の5番目の炭素および7−デアザプリン塩基の7番目の炭素に連結される。例えば、いくつかの適当な塩基標識化方法が本発明と共に使用できることが報告された、例えば、ギブソンら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第15巻、第6455〜6467頁(9187);ゲベイエフら、ヌクレイソク・アシッズ・リサーチ、第15巻、第4513〜4535頁(1987);ハララムビジスら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第15巻、第4856〜4876頁(1987)等。好ましくは、染料と塩基の間の連結基はジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ−誘導化塩基と本発明の染料のN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を反応させて形成される。好ましくは連結基は3−カルボキシアミノ−1−プロピニルである。このようなアルキニルアミノ−誘導化ジデオキシヌクレオチドの合成は、ここに参考文献として組み込まれるホッブスらのヨーロッパ特許出願番号87305844.0号および米国特許 5,047,519号によって教示されている。簡単に述べると、アルキニルアミノ−誘導化ジデオキシヌクレオチドは、適当なハロジデオキシヌクレオシド(ホッブスら(上記)によって教示されているように通常は5−ヨードピリミジンおよび7−ヨード−7−デアザプリンジデオキシヌクレオシド)およびCu(I)をフラスコに入れ、空気を除くようにArを吹き込み、乾燥DMFを添加し、続いてアルキニルアミン、トリエチルアミンおよびPd(O)を添加して生成される。反応混合物は数時間、または薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオソドの消費を示すまで攪拌することできる。保護されていないアルキニルアミンを使用するときは、アルギニルアミノ−ヌクレオシドは反応混合物を濃縮し、カップリング反応で生成したハイドロハライドを中和するように水酸化アンモニウムを含む溶出溶媒を使用してシリカゲルのクロマトグラフィーにかけることによって単離することができる。保護されたアルキニルアミンを使用するときは、メタノール/塩化メチレンを反応混合物に続いて強塩基性アニオン交換樹脂で重炭酸塩を形成させることができる。次にスラリーを約45時間攬拌し、濾過し、そして樹脂を追加のメタノール/塩化メチレンを用いて洗うことできる。一緒に合わせた濾液を濃縮し、メタノール−塩化メチレングラディエントを用いてシリカゲルのフラッシュ−クロマトグラフィーで精製することができる。トリホスフェートが標準技術によって得られる。
(4.7−ジクロロ−5−(および6−)カルボキシフルオレセイン(“ALF”))
0.58gの3,6−ジクロロトリメリット酸、0.72gのレゾルシノール、0.5mlの儂硫酸、および3mlのプロピオン酸をアルゴン下に12時間還流した。反応混合物を150mlの水に注入し、沈澱物を乾燥し、3mlのビリジンに入れ、2mlの無水酢酸塩で1時間アセチル化した。アセチル化混合物は100mlの酢酸エチルに入れ、1Nの塩酸、水で洗浄し、蒸発乾固した。残渣を15gのシリカゲルに置き、50mlの酢酸エチルで、次いで4:1の酢酸エチル:メタノールで溶出した。約0.2のRf(4:1の酢酸エチル:メタノール/シリカゲル)でUV活性物質を含有する画分を蒸発乾燥させた。この残渣を10mlのメタノールに溶解し、次いで1mlの4N水酸化ナトリウムを添加した。10分後、反応混合物を200mlに水で希釈し、次いで0.5mlの濃塩酸を添加した。全混合物を200mlの酢酸エチルで抽出し、その後酢酸エチルを硫酸ナトリウムで乾燥させ蒸発乾固させて102mgの黄緑色の固体を得た。
(4,7−ジクロロ−5−(および6−)カルボキシフルオレセインN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS))
エステル 実施例1からの13.7mgのフルオレセイン、3.3mgのNHS、6.4mgのDCC、および1mlの酢酸エチルを0.5時間攬拌した。固体を濾過し、そして上澄液を3回1:1のブライン:水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させて15mgのNHSエステルを得た。
(4,7−ジクロロ−5−(および6−)カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドの結合)
実施例2からの5mgのNHSエステルを20μlのDMSOに溶解した;3μlのこの溶液を20μlの1.0mnの5’−アミノヘキシルホスフェートオリゴヌクレオチド(18量体)水溶液および10μlの1M重炭酸ナトリウム/炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.0から成る溶液に添加した。暗所で1時間後、溶液を10mlのSephadex G−25(medium)カラムに0.1Mの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液、pH7.0を用いて通過させた。排除容量で溶出する着色物質のバンドを収集した。逆相HPLCは、DNAに結合した染料の5−および6−異性体に対応する2本の主要な蛍光ピークを示した。このビークを集め、pH8.0での50%尿素における蛍光スペクトルは528nmでの発光最大値と34nmのハーフマックスでの全幅を示した。
(2’,7’−ジメトキシ−5−(および6−)カルボキシ4,7−ジクロロフルオレセイン(“BUB”))
次の物質および分量に変えた以外は実施例1の方法に従った:1.47gの4−メトギシレゾルシノール、0.60gの3,6−ジクロロトリメリット酸、0.2mlの濃硫酸、および4mlのプロピオン酸。この方法は0.180gの4,7−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシ−5−(および6−)カルボキシフルオレセインを生成した。
(2’,7’−ジメトキシ−5−(および6−)カルボキシ4,7−ジクロロフルオレセインNHSエステル)
18mgのこの染料NHSエステルは実施例4からの18mgの染料、3.5mgのNHS、6.4mgのDCC、および2mlの酢酸エチルを用いて実施例2と同様に調製した。
(4,7−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシ−5−(および6−)カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドとの結合)
実施例5の染料NHSエステルを用いて実施例3の方法に従った。逆相HPLCの間に集められた2本のピークの蛍光スペクトルはpH8.2での50%尿素において544nmでの発光最大値と37nmのハーフマックスでの全幅を示した。
(2’,7’−ジメトキシ−4’,5’−ジクロロ−5−(および6−)カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン(“LOU”))
この染料は実施例4の染料および水性水酸化ナトリウムの次亜塩素酸ナトリウム溶液から調製された。
(4,7−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシ−4’,5’−ジクロロ−5−(および6−)カルボキシフルオレセインNHSエステル)
1.1mgのこの染料NHSエステルを実施例7からの0.7mgの染料、0.45mgのNHS,0.7mgのDCC、および0.2mlの酢酸エチルから実施例2のように調製した。
(4,7−ジクロロ−2’,7’−ジメトキシ−4’,5’−ジクロロ−5−(および6−)カルボキシフルオレセインとアミノアルキルオリゴヌクレオチドとの結合)
この実施例の染料オリゴヌクレオチド結合体を実施例8からの染料NHSエステルを用いて実施例3と同様に調製した。逆相HPLCの間に集められた2本のピークの蛍光スペクトルはpH8.2での50%尿素において558nmでの発光最大値と38nmのハーフマックスでの全幅を示した。
(1’,2’,7’,8’−ジベンゾ−5−(および6−)カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン(“NAN”))
まず、3,6−ジクロロトリメトリット酸トリクロリドを調製した:0.5gの3,6−ジクロロトリメリット酸と1.3gの五塩化リンの混合物を130℃で40分間加熱した。混合物を室温まで冷却し氷に注いだ。次いで混合物を40mlのエーテルで抽出し、有機画分を2回15mlの水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、透明油(0.7g)まで濃縮した。酸トリクロリドをさらに精製しないで使用した。NANを次のように調製した:2.7gの1,3−ジヒドロキシナフタレン、2.84gの3,6−ジクロロトリメリット酸トリクロリド、および8mlのプロピオン酸の混合物を2時間還流した。水(50ml)および酢酸エチル(50ml)を添加した。相を分離して、有機相を3回50mlの1MのNaHCO3で抽出した。水溶液を沸点まで加熱して濃HClで酸性にした。得られた赤色固体(0.2g)を濾過し乾燥した。
(1’,2’,7’,8−ジベンゾ−4’,5’−ジクロロ−5−(および6−)カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン(“DEB”))
20mgのNAN、水酸化ナトリウム(15%溶液34μl)、水(1ml)、および次亜塩素酸ナトリウム(5%溶液170μl)を一緒にした。逆相HPLCは92%の反応を示した。溶液をHClで酸性にして、20mlの酢酸エチルで抽出し、乾燥(Na2SO4)し、20mgまで濃縮した。固体をシリカゲルカラム(径1“×高さ2”)のクロマトグラフィーによって600:60:16の塩化メチレン:メタノール:酢酸で溶出して精製した。染料溶液を濃縮し、希HClおよび酢酸エチルを添加した。有機相を乾燥(MgSO4)し、20mgのDEBまで濃縮した。
(1’,2’,7’,8’−ジベンゾ−−5−(および6−)カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセインNHSエステルの生成)
NAN(10mg)を2mlの酢酸エチルに溶解し、NHS(10mg)とDCC(5mg)を添加した。20分後、溶液は暗赤色になり、結晶固体が現れた。600:60:16の塩化メチレン:メタノール:酢酸を用いたシリカゲルの薄層クロマトグラフィーはNHSエステルに完全に転換したことを示した。酢酸エチル溶液を希HClで洗浄し、乾燥(NaSO4)して赤色固体(15mg)まで濃縮した。
(DNA配列分析において染料標識プライマーとしてALF−、BUB−、LOU−、およびNAN−オリゴヌクレオチ)
結合体を使用 染料の全フルオレセインセットを使用してアプライド・バイオシステムズ(フォスター・シテイ、CA)モデル370A自動化DNAシーケンサーを用いてチェイン・ターミネーター法でDNAフラグメントに標識を付けた。製造業者のプロトコル(参考文献として組み込まれるユーザー・ブレタン・DNAシーケンサーモデル370、発行第2号、1987年8月2日)に従って、M13中の未知のDNAを増幅してゲル電気泳動分離のための別々に標識を付けたDNAフラグメントを調製した。染料標識プライマーは上記実施例に記載されたように調製した。即ち、各染料のNHSエステルを調製し、5’−アミノヘキシル誘導化M13ユニバーサルプライマー(5’−TCCCAGTCACGACGTTGT−3’)と反応させ4つに分かれるジデオキシ反応混合物に対する染色標識プライマーを生成した。次の変更は標準プロトコルでなされた:ジデオキシシチジン反応においてプライマーに標識を付けた5−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシアデノシン反応においてプライマーに標識を付けた2’,7’−ジメトキシ−5−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシグアノシン反応においてプライマーに標識を付けた2’,7’−ジメトキシ−4’,5’−ジクロロ−6−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、ジデオキシチミジン反応においてプライマーに標識を付けた1’,2’,7’,8’−ジベンゾ−5−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、各反応からの標識を付けたDNAフラグメントをゲルに装填するために次のモル比で一緒にした:1:4:2ddC反応:ddA反応:ddG反応:ddT反応、そして検出は535、550、565、および580nmに中心がある10−nmバンドパスフィルターを用い改良フィルターホイールで行った。
(DNA配列分析において染料−標識プライマーとしてALF−、BUB−、DEB−、およびNAN−オリゴヌクレオチド結合を使用)
次のことを除いて、実施例13に記載したと同様の方法に従った:(i)ジデオキシグアノシン反応においてプライマーに標識を付けた1’,2’,7’,8’−ジベンゾ−4’,5’−ジクロロ−5−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン、(ii)各反応からの標識を付けたDNAフラグメントをゲルに装填するために次のモル比で一緒にした:1:1:2:15ddC反応:ddA反応:ddG反応:ddT反応、そして(iii)5nmバンドパスフィルターは540、560、580、および610nmに中心があった。
(2’,7’−ジクロロ−5−(および6)−カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン(“5−(および6−)TET”))
4−クロロレゾルシノール(10g)、4,7−ジクロロトリメリット酸(10g)、およびメタンスルホン酸(30ml)の混合物を一緒にして2時間140〜150℃まで加熱した。赤色混合物を水(100ml)に注ぎ酢酸エチル(100ml)で抽出した。有機相を2回希塩酸で洗浄し、金褐色固体(19g)に濃縮した。ピリジン(40ml)と無水酢酸(10ml)を固体に添加し混合物を0.5時間還流した。溶液を1時間4℃で冷却させた。
(2’,4’,5’,7’−テトラクロロ−5−(および6−)カルボキシ−4,7−ジクロロフルオレセイン(“5−および6−HEX”))
磁気攬拌棒を備えた1リットルのエルレンマイヤーフラスコに5−または6−TET(6.3g)および1Mの炭酸塩/重炭酸塩緩衝液pH9.4(60ml)を添加した。家庭用漂白剤(次亜塩素酸ナトリウム、50ml)を20分かけて滴下した。反応の進行を逆相HPLCでモニターした。全部で67mlの漂白剤を添加した。濃HCl(15ml)で溶液を酸性にして酢酸エチル(100ml)で抽出した。有機相を明黄色固体(7.3g)まで儂縮した。1H NMR(DMSO−d6)δ8.1(1H);7.4(2H)。
Claims (1)
- 次式を有する4.7−ジクロロフルオレセイン染料であって:
式中、
A’は水素、フルオロ、クロロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり;
B’はフルオロ、クロロ、カルボキシルまたはスルホニルであり;
X’は水素、フルオロまたはクロロであり;
Z3およびZ4は各々独立して水素、ハロ、連結官能体、または連結官能体に変換できる基であり;そして
A’、Z3、およびZ4の少なくとも1個は連結官能体または連結官能体に変換できる基であり、
ここで、A’、Z 3 およびZ 4 の各々について、
該連結官能体は、イソチオシアネート、塩化スルホニル、4,6−ジクロロトリアジニルアミン、スクシンイミジルカルボキシレート、マレイミドおよびヨードアセトアミドから選択され、
該連結官能体に変換できる基は、カルボキシル、スルホニルおよびアミノから選択される、
4.7−ジクロロフルオレセイン染料。
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