JP2009143946A - 置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下の構造を有する置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドが開示されている:ここで、Xは、アミノアルカン酸、アルキルアミノ安息香酸、α−アミノ酸、及び4−アミノ−2−ブチン酸からなる群から選択される。R1及びR2は、別個に、−H、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される;R3は、−H及び低級アルキルからなる群から選択される。Bは、7−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である。さらに、プライマー伸長方法が提供され、これは、上記X置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドを使用し、そして、上記X置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドを含有するポリヌクレオチドが提供される。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般に、ポリメラーゼ酵素の基質として有用なヌクレオチド化合物、プライマー伸長反応でこのようなヌクレオチド化合物を使用する方法、およびこのようなヌクレオチド化合物を含有するポリヌクレオチドに関する。
核酸配列決定は、現代の生物学および生物工学において必須の重要な技術となっており、基本的な生物研究から薬剤の発見や臨床医学までの範囲の分野に関連した情報を提供する。大容量のDNA配列データが収集されているので、核酸配列決定法のスループットを高めると共にコストを下げるために、自動化技術が開発されている(Smith;Connell;Trainor)。
本発明は、プライマー伸長反応(例えば、Sanger型DNA配列決定反応またはPCR反応)において、鎖終止ヌクレオチドおよび鎖伸長ヌクレオチドとして有用な、新規なクラスの置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドの本発明者らによる発見に関する。
(項目1) 以下の構造を有するヌクレオシド化合物:
R 1 およびR 2 は、別個に、−H、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される;
R 3 は、−Hおよび低級アルキルからなる群から選択される;
Bは、7−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である;
ここで、Bがプリンまたは7−デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンまたはデアザプリンのN 9 位にて結合しており、Bがピリミジンのとき、その糖部分は、該ピリミジンのN 1 位にて結合している;そして
ここで、Bがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの8位に結合しており、Bが7−デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該7−デアザプリンの7位に結合しており、Bがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該ピリミジンの5位に結合している;
W 1 は、−Hおよび−OHからなる群から選択される;
W 2 は、−OH、または該ヌクレオシドがその3’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である;そして
W 3 は、−PO 4 、−P 2 O 7 、−P 3 O 10 、ホスフェートアナログ、および−OHからなる群から選択される。
(項目2) R 1 およびR 2 の1個が、標識である、項目1に記載のヌクレオシド化合物。
(項目3) 前記標識が、フルオレセイン型色素である、項目2に記載のヌクレオシド化合物。
(項目4) 前記標識が、ローダミン型色素およびFLAN型色素からなる群から選択される、項目2に記載のヌクレオシド化合物。
(項目5) W 1 が、−Hであり;
W 2 が、−OH、または前記ヌクレオシドがその3’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分であり;そして
W 3 が、−P 3 O 10 である、
項目1に記載のヌクレオシド化合物。
(項目6) W 2 が、−OH、−H、アジド、アミノ、ハロ、およびメトキシからなる群から選択される、項目1に記載のヌクレオシド化合物。
(項目7) W 2 が、−Hおよびフルオロからなる群から選択される、項目1に記載のヌクレオシド化合物。
(項目8) Bが、ウラシル、シトシン、7−デアザアデニン、および7−デアザグアノシンからなる群から選択される、項目1に記載のヌクレオシド。
(項目9) Xが、パラ立体配置を有するアルキルアミノ安息香酸であり、そしてn=1である、項目1に記載のヌクレオシド化合物。
(項目10) プライマー伸長反応を行う方法であって、該方法は、以下の工程を包含する:
テンプレート核酸を提供すること;
該テンプレート核酸の一部にオリゴヌクレオチドプライマーをアニールすること;および
該プライマーを伸長するために、該プライマー−テンプレートハイブリッドに、プライマー伸長試薬を添加することであって、該プライマー伸長試薬は、以下の構造を有するヌクレオシド化合物を含有する:
R 1 およびR 2 は、別個に、−H、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される;
R 3 は、−Hおよび低級アルキルからなる群から選択される;
Bは、7−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である;
ここで、Bがプリンまたは7−デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンまたはデアザプリンのN 9 位にて結合しており、Bがピリミジンのとき、その糖部分は、該ピリミジンのN 1 位にて結合している;そして
ここで、Bがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの8位に結合しており、Bが7−デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該7−デアザプリンの7位に結合しており、Bがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該ピリミジンの5位に結合している;
W 1 は、−Hおよび−OHからなる群から選択される;
W 2 は、−OH、または該ヌクレオシドがその3’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である;そして
W 3 は、−PO 4 、−P 2 O 7 、−P 3 O 10 、ホスフェートアナログ、および−OHからなる群から選択される。
(項目11) R 1 およびR 2 が、標識であり、そして他が、−Hである、項目10に記載の方法。
(項目12) 以下の構造を有するヌクレオチド化合物を含有するポリヌクレオチド:
R 1 およびR 2 は、別個に、−H、低級アルキル、保護基、および標識からなる群から選択される;
R 3 は、−Hおよび低級アルキルからなる群から選択される;
Bは、7−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基である;
ここで、Bがプリンまたは7−デアザプリンのとき、その糖部分は、該プリンまたはデアザプリンのN 9 位にて結合しており、Bがピリミジンのとき、その糖部分は、該ピリミジンのN 1 位にて結合している;そして
ここで、Bがプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該プリンの8位に結合しており、Bが7−デアザプリンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該7−デアザプリンの7位に結合しており、Bがピリミジンのとき、その隣接する三重結合炭素は、該ピリミジンの5位に結合している;
W 1 は、−Hおよび−OHからなる群から選択される;
W 2 は、−OH、または該ヌクレオシドがその3’位でホスホジエステル結合を形成できなくする部分である;そして
W 3 は、−PO 4 、ホスフェートアナログ、および−OHからなる群から選択される。
ここで、本発明の好ましい実施態様に対して、詳細な参照がなされ、その実施例は、添付の図面に例示されている。本発明は、その好ましい実施態様に関連して記述されているものの、それらは、本発明をこれらの実施態様に限定する意図はないことが分かる。反対に、本発明は、その代替、改変および等価物を含むことを意図しており、これらは、添付の請求の範囲で規定される本発明の範囲内に含まれ得る。
他に述べられていなければ、本明細書中で使用する以下の用語および語句は、以下の意味を有することを意図している:
「低級アルキル」との用語は、1個〜8個の炭素原子を含有する直鎖および分枝炭化水素部分(すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、tert−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、ネオペンチル、tert−ペンチルなど)を表わす。
第一の局面では、本発明は、すぐ下の式Iで示す一般構造を有する新規なクラスの置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド化合物を包含する。(本開示全体で提供された全ての分子構造は、提示した正確な電子構造だけでなく、それらの全ての共鳴構造およびプロトン化状態を含むことを意図することに留意のこと)。
図2〜9は、本発明の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオシドのいくつかの代表的な合成を示す。この合成では、ブロモエタノール1は、フタルイミドカリウム2と反応して、フタルイミド誘導体3が得られる。このフタルイミド誘導体は、次いで、NaHの存在下にて、プロパルギルブロマイド4でO−アルキル化されて、保護した3−(2−フタルイミドエトキシ)プロピン連結アーム5が得られる。図2を参照せよ。次いで、ヨードヌクレオシド6は、ジメチルホルムアミド中、ヨウ化第一銅、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム、およびトリエチルアミンの存在下にて、室温でおよそ12時間またはこの反応がTLCで決定されるように完結するまで、保護連結アームと反応されて、それにより、化合物7が形成される。この溶液は、次いで、真空下で濃縮され、生成物は、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製され、そして同定および純度測定のために、プロトンNMRおよび分析用逆相HPLCにより分析される。エチレンジアミンでの処理に続いて、トリフルオロ酢酸エチルでのアセチル化により、ヌクレオシド連結アーム化合物8が得られる。図3を参照せよ。リン酸トリメチル中にて、−30℃で、このヌクレオシド連結アーム化合物8に、新たに蒸留したオキシ塩化リンを添加して、対応するジクロロモノホスフェート9を形成する。反応混合物を2M重炭酸テトラエチルアンモニウム(TEAB)(pH 8.0)でクエンチして、モノホスフェート10を得、これは、次いで、分取逆相HPLCにより精製される。図4を参照せよ。モノホスフェート10は、カルボニルジイミダゾール(CDI)で活性化され、過剰のCDIは、MeOHでクエンチされて、活性化モノホスフェート11が得られる。この活性化モノホスフェートは、室温で、ピロリン酸トリブチルアンモニウムと反応される。この反応は、完結したとき、0.2M TEABでクエンチされ、そして逆相HPLCにより精製されて、保護トリホスフェート12が得られる。精製した保護トリホスフェートは、乾燥するまでエバポレートされ、そして濃NH4OH水溶液中に再懸濁されて、TFA基が除去され、プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド13が得られる。図5を参照せよ。
本発明のプロパルギルエトキシアミド化合物は、以下の工程を包含するタイプのテンプレート媒介プライマー伸長反応を含めた方法での使用によく適合する:(i)テンプレート核酸を提供する工程;(ii)このテンプレート核酸の一部に、オリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし、それにより、プライマー−テンプレートハイブリッドを形成する工程;および(iii)このプライマーを伸長するために、このプライマー−テンプレートハイブリッドに、プライマー伸長試薬を添加する工程。特に、本発明の化合物は、プライマー伸長生成物に標識を直接含入させる手段を提供する。
配列決定反応に必要なターミネーター過剰を決定するためのターミネーター滴定アッセイ
完全な配列決定ラダー(ladder)(すなわち、約20ヌクレオチドと約600ヌクレオチドの間の長さを有する特定の塩基で終止する全てのフラグメントを含有する配列決定ラダー)を作るのに必要な最小量の色素標識ターミネーターを決定するために、ターミネーター滴定アッセイを使用した。このターミネーター滴定アッセイの不可欠な成分は、(i)第一色素で標識したプライマー、および(ii)この第一色素とスペクトル分解可能な第二色素で標識したターミネーターであった。このアッセイでは、この配列決定反応物に、不充分な濃度の色素ターミネーターを添加したとき、ジデオキシ終止フラグメントは形成されず、配列決定ゲル上では、第一色素のみで標識した「偽スポット」により形成された生成物だけが見られた。本明細書中で使用する「偽スポット」との用語は、ジデオキシターミネーターで終止していないプライマー伸長生成物を意味し、このような生成物は、おそらく、ポリメラーゼ酵素がテンプレート核酸鎖から自発的に分離するときに形成される。多すぎるターミネーターを使用したときには、短い終止生成物(すなわち、長さが約50個未満のヌクレオチド)しか形成されず、このような生成物は、第一色素および第二色素の両方を含有していた。適切な量のターミネーターを使用したとき、完全な配列決定ラダーが生成し、ラダーの各フラグメントは、第一色素および第二色素の両方で標識されていた。
リンカー型の関数として、完全配列決定ラダーを形成するのに必要なHEX−1−標識したC−ターミネーターの量
以下の表は、実施例1にて上で記述のターミネーター滴定アッセイに従って、完全配列決定ラダーを形成するのに必要な色素標識したC−ターミネーターの相対モル過剰(molar excess)を示す。この相対モル過剰は、完全配列決定ラダーを形成するのに必要な非標識ジデオキシターミネーターの量が1の値となるように、定義される。各場合では、C−ターミネーターは、HEX−1色素に連結した。
5−{3−(2−アミノエトキシ)プロピン−1−イル}−2’,3’−ジデオキシシチジン三リン酸(13)の合成
A.物質および方法
薄層クロマトグラフィー(TLC)を、250μm層のシリカゲル60−F254で予め塗装したガラス板上で行った。蛍光のクエンチおよび/または5%硫酸での炭化により展開した後、化合物をTLC板上に配置した。SIPブランドシリカゲル60Å、230〜400 Mesh ASTM(Baxter Scientific p/n C4582−87)上で、フラッシュカラムクロマトグラフィーを行った。以下のようにして、NMRスペクトルを得た:1H NMRスペクトルを、室温で、CDCl3(内部Me4Si、δ0)またはD2O(外部Me4Si、δ0)に溶解した溶液で300 MHzにて記録した;13C NMRスペクトルを、CDCl3(内部Me4Si、δ0)に溶解した溶液で、75.5 MHzにて記録した;19F NMRスペクトルを、CDCl3またはD2O(外部CFCl3、δ0)に溶解した溶液で、282.23 MHzにて記録した;そして31P NMRスペクトルを、D2O中の溶液で、121.44 MHzにて記録した。全ての場合において、NMRデータは、提案した構造に一致していた。他に指示がなければ、全ての反応は室温で行い、後処理において、有機溶媒の溶液を、等容量の水溶液で洗浄した。有機溶液を、40〜50℃の浴温を用いた真空下でのロータリーエバポレーターでの濃縮の前に、無水Na2SO4で一般的に乾燥した。分析および分取目的で使用したHPLC系は以下の通りであった:
分析用逆相HPLC:カラム:Spheri−5 RP−C18、5μmの粒子サイズ、220×4.6 mm(PE Applied Biosystems p/n 0711−0017);勾配:0〜50%アセトニトリルで1.5 ml/分にて20分間に続いて、50%アセトニトリル〜100%アセトニトリルで1.5 ml/分にて10分間。
フタルイミドカリウム2(2.7g、14.6 mmol)を、ブロモエタノール1のN,N−ジメチルホルムアミド溶液(12 mL、14.1 mmol)に添加した。70℃で12時間撹拌した後、この混合物を濃縮し、次いで、ジクロロメタン(100 mL)で希釈した。濾過により固形分を除去した後、その有機層を水で洗浄し、乾燥し、そして濃縮した。この濃縮物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(3:2〜2:3ヘキサン−酢酸エチル)により精製して、0.22のRF(3:2のヘキサン−酢酸エチル)を有する白色固形分(1.19g、44.12%)として、化合物3を得た。図2を参照せよ。
化合物3(1.14g、5.96 mmol)のN,N−ジメチルホルムアミド(20 mL)撹拌溶液に、NaH(0.36g、80%)を滴下した。NaHを完全に添加した後、撹拌を室温で0.5時間継続し、その反応系を0℃まで冷却した。プロパルギルブロマイド4(1.5 mL、13.47 mmol)を添加し、この撹拌を、0℃でさらに0.5時間、次いで、室温で2時間継続した。メタノールを注意深く添加して過剰のNaHを分解した後、溶媒を蒸発させ、その粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(3:2〜1:1〜2:3ヘキサン−酢酸エチル)により精製して、0.22のRF(3:2のヘキサン−酢酸エチル)を有する固形物(495 mg、36.2%)として、化合物5を得た。図2を参照せよ。
5−ヨード−2’,3’−ジデオキシシチジン6(100 mg、0.3 mmol)を、N,N−ジメチルホルムアミド(1 mL)中、ヨウ化第一銅(11.4 mg、0.06 mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(69 mg、0.06 mmol)、およびトリエチルアミン(84μL、0.6 mmol)の存在下にて、アルゴン雰囲気下にて、室温で12時間にわたり、化合物5(158 mg、0.69 mmol)と反応させた。次いで、この反応物を、メタノール中の重炭酸塩形態のDowex−1アニオン交換樹脂2gで希釈した。室温で1時間撹拌した後、この反応混合物を濾過し、そして濃縮した。この生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(13:1のジクロロメタン−メタノール)により精製して、0.23のRF(溶媒は9:1のジクロロメタン−メタノール)を有する化合物7(75 mg、57.66%)を得た。図3を参照せよ。
化合物7(73 mg、0.17 mmol)およびエチレンジアミン(400μL)の混合物を、エタノール(4 mL)中にて、80℃で1時間加熱した。次いで、この反応系を乾燥状態までエバポレートし、その残留物を、N,N−ジメチルホルムアミド(2 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸メチル(6.5 mL)を添加した。80℃で1時間撹拌した後、この溶媒をエバポレートし、その残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー(溶媒は9:1のジクロロメタン−メタノール)により精製して、0.24のRF(9:1のジクロロメタン−メタノール)を有する化合物8(36 mg、50.7%)を得た。図3を参照せよ。
新たに蒸留したオキシ塩化リン(16.2μL、0.17 mmol)を、−30℃で、リン酸トリメチル(150μL)中のヌクレオシド8(18.8 mg、0.046 mmol)に添加して、対応するジクロロモノホスフェート9を形成した。この反応混合物を、80分間にわたって−5℃まで暖めて、撹拌を、室温でさらに1時間継続した。この反応物を、2 M TEAB緩衝液(pH 8.0)でクエンチし、そして上記のような分取逆相HPLCにより精製した。生成物に対応する画分を濃縮して、モノホスフェート10(12.3 mg、54.56%)を得た。図4を参照せよ。
N,N−ジメチルホルムアミド(200μl)に溶解したモノホスフェート10(7.4 mg、15.3 mmol)を、室温で1時間にわたって、カルボニルジイミダゾール(CDI)(4.2 mg、25.9 mmol)と共に撹拌した。過剰のCDIを、乾燥メタノール(40μL)の添加によりクエンチした。活性化モノホスフェート11を、室温で24時間にわたって、n−トリブチルアミン(16μL)を含有するN,N−ジメチルホルムアミド(160μL)中のピロリン酸トリブチルアンモニウムの溶液と共に撹拌した。この反応物を、2 M TEAB(pH 8.0)でクエンチし、そして上記のような分取逆相HPLCにより精製した。生成物に対応する画分を濃縮して、トリホスフェート12を得た。図5を参照せよ。
精製し保護したトリホスフェート12を、濃NH4OH水(4 mL)に取り出し、そして室温で2.5時間撹拌した。この反応混合物を濃縮して、プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド13を得た。次いで、この濃縮した化合物を、2.6 mMの濃度まで、0.1 M TEAB(pH 7.0)で、バルクとして調合した。調合したバルクの濃度および純度は、それぞれ、UV/Vis分光分析および上記の分析用イオン対HPLCにより、確認した。図5を参照せよ。
5−[3−{2−[N−(2−アミノアセチル)]アミノエトキシ}プロピン−1−イル]−2’,3’−ジデオキシシチジン三リン酸(23)[グリシン置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド]の合成
A.トリフルオロアセトアミドグリシンNHSエステル(15)の合成−−図6A
トリフルオロアセトアミドグリシン14(0.96g、5.6 mmoles)を、室温で1時間にわたって、乾燥DMF(10 mL)中にて、N−ヒドロキシスクシンイミド(0.65g、5.7 mmoles)および1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミドメチオジド(methiodide)(1.68g、5.7 mmoles)と反応させた。この反応溶液を酢酸エチル(200 mL)で希釈し、そして0.1 N HCl(2×100 mL)で洗浄した。次いで、この酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮して、このトリフルオロアセトアミドグリシンNHSエステル15(1.43g、100%)を得た。
100 mM TEA−重炭酸塩(pH 7.0)中のプロパルギルエトキシアミドヌクレオチド13(200μl、15.2 mM)を、乾燥状態までエバポレートした。次いで、それを、250 mMの重炭酸塩緩衝液(pH 9.0)100μlに再懸濁させた。このトリフルオロアセトアミドグリシンNHSエステル15の溶液(50μl、DMSO中で23% w/w)を添加し、そして室温で一晩撹拌した。次いで、この反応混合物を、以下のようにして、分取逆相HPLC(C−18逆相)により精製した:カラム:Aquapore ODS、20μmの粒子サイズ、250×10 mm(PE Applied Biosystems p/n 0711−0163);勾配:0〜50%アセトニトリルで4.5 ml/分にて20分間に続いて、40%アセトニトリル〜100%アセトニトリルで、4.5 ml/分にて10分間。生成物に対応する画分をプールし、そして等容量の100 mM TEA−重炭酸塩(pH 7.0)で希釈し、次いで、真空中で濃縮して、精製し保護したトリホスフェート22を得た。
5−[3−{2−[N−(4−アミノメチルベンゾイル)]アミノエトキシ}プロピン−1−イル]−2’,3’−ジデオキシシチジン三リン酸(25)[メチルアミノ安息香酸(パラ)置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチド]の合成
A.4−(トリフルオロアセトアミドメチル)安息香酸NHSエステル(18)の合成−−図6B
4−アミノメチル安息香酸16(4g、26.5 mmol)を、DMSO(60 mL)およびトリフルオロ酢酸メチル(3 mL)に溶解し、この溶液に、トリエチルアミン(3 mL)を添加した。60℃で5時間撹拌した後、この反応溶液を酢酸エチル(500 mL)で希釈し、そして水(6×200 mL)で洗浄した。次いで、この酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、そして濃縮して、白色の固形物として、トリフルオロアセトアミドメチル安息香酸17(4.6g、70.3%)を得た。
100 mM TEA−重炭酸塩(pH 7.0)中のプロパルギルエトキシアミドヌクレオシド13(200μl、15.2 mM)を、乾燥状態までエバポレートした。次いで、それを、250 mM重炭酸塩緩衝液(pH 9.0)150μlに再懸濁させた。4−(トリフルオロアセトアミドメチル)安息香酸NHSエステル18の溶液(100μl、100μlのDMSO中で25 mg)を添加し、そして室温で一晩撹拌した。この反応混合物を、実施例4にて上で記述した分取逆相HPLCにより精製した。生成物に対応する画分をプールし、そして等容量の100 mM TEA−重炭酸塩(pH 7.0)で希釈し、次いで、真空中で濃縮して、精製し保護したトリホスフェート22を得た。
置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドへの色素の結合
100 mM TEA−重炭酸塩(pH 7.0)中の置換プロパルギルエトキシアミドヌクレオチドを、乾燥状態まで蒸発させた。次いで、それを、250 mM重炭酸塩緩衝液(pH 9.0)に再懸濁させた。所望の色素−NHS溶液(DMSO中)を添加し、そして暗所中にて、室温で一晩撹拌した。この反応混合物を、上記の分取アニオン交換HPLCにより精製した。生成物に対応する画分を濃縮し、そして上記の分取逆相HPLCにより再精製した。最終生成物を真空中で乾燥し、そして1 mMの濃度まで、50 mM CAPSO(pH 9.6)で希釈した。調合したバルクの濃度および純度は、それぞれ、UV/VIS分光分析および上記の分析用イオン対HPLCにより確認した。
本発明の置換プロパルギルエトキシアミドジデオキシヌクレオチドを用いて改良したピーク高さ均等性
図10は、HEX−1−標識ddCTPを用いた単色配列決定反応の電気泳動図であり、この場合、このHEX−1色素は、3個の異なるタイプのリンカーのそれぞれを用いて、ターミネーターに結合している。上記ターミネーター滴定アッセイに基づき、各リンカータイプについて、その最適なターミネーター濃度を使用した。上のパネルは、50 pmでのプロパルギルエトキシアミドリンカーを用いた結果を示し、中央のパネルは、25 pmでのメチルアミノ安息香酸(パラ)置換プロパルギルエトキシアミドリンカーを用いた結果を示し、下のパネルは、250 pmでのグリシン置換プロパルギルエトキシアミドリンカーを用いた結果を示す。図10の上の電気泳動図における番号により示されるように、図10で示した配列決定ラダー部分は、−21 M13配列決定プライマー(前方)を用いたpGEM−3Zf(+)の配列の塩基63から塩基104までに及んでいる。各実験の相対誤差は、以下のようであり、この場合、本明細書中で使用する用語「相対誤差」は、この図で示した電気泳動図部分にわたるピーク高さの比または標準偏差および中間ピーク高さ(mean peak height)を意味する。
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