DE3839397A1 - Verfahren zur sequenzierung von nukleinsaeuren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren durch Markierung der Nukleinsäuren, chemische Modifizierung an basenspezifischen Positionen, partiellen Strangbruch an den modifizierten Positionen durch Zugabe von Basen und Erhitzen auf erhöhte Tempe­ ratur, Auftrennung und Detektion der so erhaltenen mar­ kierten Nukleinsäurefragmente durch Gelelektrophorese und Sichtbarmachen von Banden im Gel.

Allgemein sind für Sequenzierung von DNA zwei Methoden bekannt, nämlich das chemische Abbauverfahren nach Maxam und Gilbert (A.M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560 und A.M. Maxam und W. Gilbert, Methods in Enzymol. Vol. 65, (1980) Seite 499) und die enzymatische Dideoxykettenterminations­ methode (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). Bei der Methode nach Sanger werden, ausgehend von einer DNA-Matrize, viele ver­ schieden lange markierte DNA-Moleküle durch enzymatische Extension eines synthetischen Primers mit Hilfe von DNA-Polymerase und einer Mischung von Deoxy- und Dideoxy­ nukleosid-triphosphaten hergestellt. Hierbei wird jeweils in vier Ansätzen eine Mischung eines bestimmten Deoxynukleosid-triphosphates und eines entsprechenden Dideoxynukleosid-triphosphates zusammen mit den drei anderen Deoxynukleosid-triphosphaten eingesetzt. Hier­ durch wird ein statistischer Einbau der Dideoxynukleoside in die wachsenden DNA-Ketten erreicht, wobei nach dem Einbau eines Dideoxynukleosids die DNA-Kette aufgrund des Fehlens einer 3′-OH- Gruppe nicht mehr weiterwachsen kann. Es entstehen daher viele DNA-Fragmente, die statistisch gesehen, mindestens an jeder möglichen Einbaustelle ein Dideoxynukleosid enthalten und dort enden. Diese vier Ansätze mit jeweils an den Positionen einer Base endenden Fragmenten werden auf Polyacrylamid­ gelen in jeweils einer Spur getrennt und die Sequenz nach Autoradiographie ermittelt.

Bei der Maxam-Gilbert-Methode werden endmarkierte DNA- Moleküle chemisch in basenspezifischer Weise modifi­ ziert, ein partieller Strangabbruch bewirkt und die so erhaltenen Fragmente durch Polyacrylamidgel-Elektropho­ rese getrennt und die Sequenz nach Autoradiographie be­ stimmt.

Beide der bisher bekannten Methoden weisen Vor- und Nachteile auf. So ist es ein Vorteil der Sanger-Dideoxy­ methode, daß die Markierung und die Herstellung von basenspezifischen Fragmenten in einem Schritt kombiniert werden kann. Auch kann sowohl einzelsträngige- und auch doppelsträngige DNA sequenziert werden. Außerdem werden Möglichkeiten zur Sequenzierung von längeren DNA-Frag­ menten durch sogenannte "shot gun"-Experimente in M13-Abkömmlingen etc. ermöglicht. Bis etwa 1986 wurde die DNA-Sequenzierung unter Verwendung von radioaktiven (³²P oder ³⁵S) Markierungen durchgeführt. Nach der Gelelektrophorese und Autoradiographie wurde die Nukleo­ tidsequenz entweder manuell oder halbautomatisch bestimmt. Seither wurden aber auch Fluoreszenzmarkierungen für die Dideoxysequenzierung verwendet (L.M. Smith et al., Nature, 321 (1986) 674-679; W. Ansorge et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 13 (1986) 315-323). Die Nukleo­ tidsequenz konnte dabei automatisch während der Elektro­ phorese gelesen werden und direkt in einen Computer eingegeben werden.

Gegenüber diesen Vorteilen weist die Dideoxymethode nach Sanger jedoch auch Nachteile auf, nämlich können enzymatische Extensionen nicht gleich gut mit allen Arten von DNA durchgeführt werden, da besonders DNA mit einem hohen Grad an Sekundärstruktur (hoher GC-Gehalt oder hochrepititive DNA) nicht unzweideutig sequenziert werden kann. Zusätzlich variieren die Intensitäten von benachbarten Peaks beträchtlich. Diese Variation ist abhängig von dem verwendeten Enzym. Hierdurch wird die automatisierte Sequenzbestimmung stark beeinträchtigt.

Demgegenüber wird die Maxam-Gilbert-Methode für die Sequenzierung von langen DNA-Fragmenten aufgrund der folgenden Nachteile ungern angewandt: so müssen die DNA-Markierung und die Bildung von basenspezifischen Fragmenten in zwei getrennten Schritten durchgeführt werden, die vorhandenen Markierungstechniken sind auf­ wendig und erfordern das Vorhandensein von geeigneten Restriktionsstellen der zu sequenzierenden Nuklein­ säuren. Hierzu müssen für Standard-Markierungsmethoden nach Maxam und Gilbert vier Schritte durchgeführt wer­ den, nämlich die Spaltung von DNA mit einer Restrik­ tionsendonuklease, die enzymatische Markierung, Spal­ tung der markierten DNA-Fragmente mit einer zweiten Restriktionsendonuklease um zu erreichen, daß die mar­ kierten DNA-Fragmente nur an einer Seite markiert sind, und Isolierung der nur an einem Ende markierten DNA- Fragmente durch Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektro­ phorese. Hierzu wurden bereits Vereinfachungen vorge­ schlagen. Beispielsweise haben U. Rüther et al., Nucl. Acids Res. 9 (1981) 4087 vorgeschlagen, nach der Markie­ rung durch eine zweite Endonukleasespaltung ein langes und ein kurzes Fragment herzustellen, wobei das kurze Fragment während der Elektrophorese aufgrund seiner schnellen Laufgeschwindigkeit entfernt wird.

Nach der Methode, die von Volckaert et al., (Methods in Enzymol. 155 (1987) 231-250 und Gene Anal. Techn. 1 (1984) 52) beschrieben ist, wird die Markierung an nur einer Seite der DNA derart bewirkt, daß mit einer Restriktionsendonuklease gespalten wird, die verschie­ dene überhängende Enden ergibt, und darauffolgend enzymatische Endmarkierung an nur einem der Enden.

Weitere Nachteile der Maxam-Gilbert-Methode sind, daß die Sequenzierung von einzelsträngiger DNA nicht ein­ fach möglich ist und Zufalls- und systematische Stra­ tegien, wie sie in Verbindung mit der enzymatischen Dideoxymethode durchgeführt werden, zur Sequenzierung von langen DNA-Fragmenten nicht angewandt werden können. Außerdem sind die chemischen Reaktionen in Lösung (wie von Maxam und Gilbert beschrieben) arbeitsaufwendig aufgrund der benötigten Fällungsschritte. Dieses Ver­ fahren wurde bisher auch nur in Verbindung mit radio­ aktiven Markierungen beschrieben.

Auch für diese Methode wurden bereits Verbesserungen vorgeschlagen, bei denen Abbau ausgeführt wurde, während die DNA auf einer festen Phase immobilisiert war, und dadurch die Präzipitationsschritte eliminiert werden konnten (A. Rosenthal et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), 1173, A. Rosenthal et al., Gene 42, (1986), 1; A. Rosenthal et al., Methods in Enzymol. 155 (1987), 301-331. Jedoch blieben bei der chemischen Abbaumethode die anderen obengenannten Nachteile weitgehend bestehen.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden und eine leicht automatisierbare Sequenzierungsmethode bereitzu­ stellen, die einfach durchzuführen ist, und die Nach­ teile der Verwendung von Radioaktivität vermeidet.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren durch Markierung der Nukleinsäuren, chemische Modifizierung an Basen-spezi­ fischen Positionen, partiellen Strangbruch an den modifizierten Positionen durch Zugabe von Base und Erhitzen auf erhöhte Temperatur, Auftrennung und Detek­ tion der so erhaltenen markierten Nukleinsäurefragmente durch Gelelektrophorese und Sichtbarmachen von Banden im Gel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Markierung einen oder mehrere Fluoreszenzfarbstoffe an die Nukleinsäure koppelt, und zur Modifizierung und Auftrennung

• a) vier verschiedene für jeweils eine Base oder zwei Basen spezifischen Modifikationsreaktionen in vier verschiedenen Ansätzen durchführt und diese nach partiellem Strangbruch auf vier verschiedene Spuren eines Gels aufträgt, oder
• b) zwei für je eine bzw. zwei der vier Basen spezi­ fische Modifikationsreaktionen in zwei Ansätzen durchführt und diese nach partiellem Strangbruch auf zwei Spuren eines Gels aufträgt, oder
• c) zwei für je eine bzw. zwei der vier Basen spezi­ fische Modifikationsreaktionen nacheinander in nur einem Ansatz durchführt und diesen nach partiellem Strangbruch auf eine Spur eines Gels aufträgt, oder
• d) eine für eine bzw. zwei der vier Basen spezifische Modifikationsreaktion durchführt, anschließend den Ansatz einer weiteren chemischen Reaktion unter­ wirft, bei der für mindestens drei der vier Basen ein spezifischer Strangbruch erfolgt und den Ansatz danach auf eine Spur eines Gels aufträgt, oder
• e) anstelle der spezifischen Modifikationsreaktionen gefolgt von einem partiellen Strangabbruch nur einen für mindestens drei Basen spezifischen, partiellen Strangabbruch in einem Ansatz bewirkt und diesen auf eine Spur eines Gels aufträgt,

und die Nukleinsäure-Sequenz über die Lage und Inten­ sität der Banden im Gel bestimmt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es ohne Ver­ wendung von radioaktiver Markierung, eine Sequenzierung von Nukleinsäuren durchzuführen, wobei prinzipiell vier verschiedene Möglichkeiten zur Modifizierung bestehen. Es können gemäß Punkt a) vier verschiedene Modifikations­ reaktionen in vier Ansätzen durchgeführt werden, wonach diese vier Ansätze auf vier verschiedene Spuren eines Gels aufgetragen werden. Dies entspricht im allgemeinen dem Verfahren von Maxam und Gilbert, erfindungsgemäß wird jedoch die Verwendung von Radioaktivität vermieden. Gemäß Punkt b) des Patenthauptanspruches ist die Durch­ führung von zwei für je eine der vier Basen spezifischen Modifikationsreaktionen in zwei Ansätzen möglich und die Aufbringung der beiden Ansätze nach partieller Strangspaltung auf zwei Spuren eines Gels. Die Unter­ scheidung der vier Basen erfolgt dann über die unter­ schiedlichen Intensitäten der fluoreszierenden Banden im Gel, die von B.J.B. Ambrose und R.C. Pless (1985) Biochemistry 24 6194 und B.J.B. Ambrose und R.C. Pless, Methods in Enzymology 152 (1987) 522 bereits beobachtet wurde, in Verbindung mit den beiden Modifikationsreakto­ ren. Hierfür wurde festgestellt, daß die Intensitäten abhängig von der Base am 3′-Ende des Nukleinsäurefrag­ ments variieren, wobei die Intensitäten A < G = C < T sind. Ebenfalls über die Intensität der Fluoreszenz der Banden erfolgt die Detektion bei den Modifikationen nach Punkt c), d) und e) des Patenthauptanspruches. Hierbei wird unter Punkt c) und d) noch eine oder zwei Modifikationsreaktionen ausgeführt, um die Intensitäten von G oder C so zu verändern, daß diese beiden Basen leicht unterschieden werden können. Die Unterscheidung dieser Basen nach Punkt e) des Hauptanspruches erfolgt über unterschiedliche Bandenabstände bei diesen beiden Basen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung syn­ thetisiert man zur Markierung über enzymatische Exten­ sion eines fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid-Primers in Anwesenheit aller vier Deoxyribonukleosid-triphos­ phate, einer Matrize der zu sequenzierenden Nuklein­ säure und einer DNA-Polymerase einen der zu sequenzie­ renden Nukleinsäure komplementären Strang, der an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist, nämlich über den Primer, und sequenziert diesen komplementären Strang. Erfindungsgemäß wird es überraschenderweise ermöglicht, Nukleinsäuren mit einem Fluoreszenzfarbstoff derart zu markieren, daß die Markierung nicht bei einer darauffol­ genden Modifikations- und Strangabbruchs-Reaktion verlorengeht. Hierdurch wird es auch ermöglicht; die sonst nur mit der Sanger-Technik durchführbaren Sequen­ zierungsmethoden, wie die sogenannte "shot gun"-Sequen­ zierung sowie die Sequenzierung von einzelsträngiger Nukleinsäure durchzuführen.

Bevorzugt wird hierzu der Fluoreszenzfarbstoff an die 5′-Phosphatgruppe des Oligonukleotid-Primers über einen Linker gebunden (Fig. 1B). Um eine weitere Unterscheidung auch bei Durchführung der Sequenzierung gemäß Punkt d) des Patenthauptanspruches zu ermöglichen, können anstelle von einem oder mehreren der unmodifizierten Deoxynukleo­ sid-triphosphate entsprechende basenmodifizierte Deoxy­ nukleosid-triphosphate verwendet werden, von denen be­ kannt ist, daß sie sich anders als die unmodifizierten Deoxynukleosid-triphosphate bei den Modifikations-Strang­ abbruchreaktionen verhalten und dadurch eine unterschied­ liche Bandenintensität im Gel zeigen. Hierzu verwendet man besonders bevorzugt 7-Deazadesoxyguanosin-triphosphat, 7-Deazadesoxyadenosin-triphosphat oder 5-substituierte Pyrimidindesoxynucleosid-triphosphate.

Als DNA-Polymerasen können alle hierzu geeigneten Enzyme verwendet werden, bevorzugt das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, modifizierte oder unmodifizierte T7-DNA-Polymerase, Taq-Polymerase oder reverse Trans­ kriptase.

Weiter kann die enzymatische Extension auch zur Ampli­ fizierung der zu sequenzierenden klonierten oder geno­ mischen Nukleinsäure eingesetzt werden, indem mehrere Primer verwendet werden, von denen jedoch nur einer markiert ist. Von den nicht markierten Primern ausgehend werden ebenfalls komplementäre Stränge zu der Matrize hergestellt, die dann wiederum für die markierten Primer als Matrizenstrang dienen können, wodurch eine bedeutend größere Menge an markierten Nukleinsäuren gebildet werden kann. Anschließend wird die auf diese Weise markierte und amplifizierte Nucleinsäure den che­ mischen Sequenzierungsreaktionen ohne weitere Reinigungs­ schritte direkt unterworfen.

In einer weiteren bevorzugten Methode zur Markierung der Nukleinsäuren mit einem Fluoreszenzfarbstoff ligiert man fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid-Kas­ setten in Restriktionsfragmente der zu sequenzierenden Nukleinsäure mit 5′- oder 3′-überhängenden Enden ein.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht hierbei die Oligonukleotid-Kassette aus zwei miteinan­ der verbundenen Oligonukleotiden, wobei das am 5′-Ende gelegene Oligonukleotid wiederum an seinem 5′-Ende einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden aufweist und das andere Oligonukleotid unmarkiert ist, jedoch zu den zu sequenzierenden Doppelsträngen überhängenden Enden kom­ plementäre DNA-Sequenz aufweist, so daß es mit diesen überhängenden Enden hybridisieren kann. Vorzugsweise hybridisiert es mit überhängenden Enden zwischen 2 und 20 Basenpaaren.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man Oligonukleotide mit Ketten­ längen zwischen 4 und 100 Basenpaaren.

In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zur Markierung der zu sequenzierenden Nukleinsäuren füllt man Restriktionsfragmente der zu sequenzierenden Nuklein­ säuren, welche überhängende 5′-Enden aufweisen, mit Polymerase oder Reverser Transkriptase in Anwesenheit mindestens eines Desoxy- oder Didesoxynukleosid-triphos­ phates, das über einen Linkerarm an die heterocyclische Base eines Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt aufweist, auf (Fig. 1A). Besonders bevorzugt ist der Farbstoff über einen Linker an die C5-Position von Pyrimidinen oder an die N7-, C8- oder C7-Position von Purinen gekoppelt.

Als Linker wird erfindungsgemäß bevorzugt eine gerad­ kettige oder verzweigte Amino- oder Mercapto-Kohlenwas­ serstoffeinheit mit mehr als 2 C-Atomen in der unver­ zweigten Kette verwendet. Besonders bevorzugt sind hierbei Aminoalkyl-, Aminoalkenyl- oder Aminoalkinyl­ gruppen.

Der erfindungsgemäß bevorzugte Fluoreszenzfarbstoff ist Fluorescein, Analoga davon oder Rhodamin. Besonders bevorzugt wird Fluorescein verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich sowohl in Lösung, als auch gebunden an eine feste Phase durch­ führen, wobei die Durchführung der Modifikations­ und/oder Abbruchreaktion in fester Phase bevorzugt ist, da hierdurch größere Mengen verschiedener Nukleinsäuren gleichzeitig sequenziert werden können, und die Automa­ tisierung erleichtert wird.

Als feste Phase wird besonders bevorzugt Hybond M & G-Pa­ pier der Firma Amersham International PLC verwendet.

Als Base zum Strangabbruch wird vorzugsweise Piperidin verwendet. Weiter wird bevorzugt Natriumchlorid oder ein anderes Salz zugegeben. Vor dem Auftragen auf das Gel wird im Stand der Technik das Piperidin durch Lyophilisation entfernt. Hierbei ist es jedoch nicht möglich, gleichzeitig anwesende Salze zu entfernen, die wiederum bei der Gelelektrophorese die Wanderung der Nukleinsäurefragmente behindern und dadurch die Ergeb­ nisse verfälschen können. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, vor dem Auftragen der Ansätze der modifi­ zierten Nukleinsäuren auf das Gel eine Ethanolfällung in Anwesenheit von 0,3 M Natriumacetat durchzuführen. Hierdurch werden nicht nur die Base Piperidin, sondern auch eventuell anwesende Salze entfernt. Folgendes Waschen der Nukleinsäuren mit z.B. 70%igem Ethanol führt zu einer weiteren Erhöhung der Reinheit der Nukleinsäurefragmente.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird gemäß Merkmal d) des Hauptanspruches zuerst eine Alkylierungsreaktion mit einem Alkylierungs­ mittel und sodann eine Piperidin-Spaltungsreaktion mit Piperidin in Anwesenheit von Natriumchlorid durchge­ führt. Hierzu wird besonders bevorzugt als Alkylierungs­ mittel 0,001 bis 10% Dimethylsulfat z.B. in Ammonium-For­ miat-Puffer, pH 3,5 bis 10, oder in Natriumcacodylat­ puffer, pH 7 bis 10 verwendet.

In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird gemäß Merkmal e) des Hauptanspruches der Strangabbruch mit 0,1 bis 2 mol/l Piperidin in Anwesenheit von 0,2 bis 1 mol/l Natriumchlorid und Erhitzen der Reaktionsmischung für 1 bis 10 Stunden auf zwischen 50 und 100°C durchgeführt.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform führt man gemäß Schritt d) des Patenthauptanspruches eine Depurinierungsreaktion mit Ameisensäure und dann eine Piperidin-Spaltungsreaktion in Anwesenheit von Natriumchlorid durch.

Vor allem zur Automatisierung der Sequenzierung ist es vorteilhaft, die Markierung und/oder chemische Modifi­ zierung und/oder partiellen Strangabbruch in Mikrotiter­ platten durchzuführen.

Zur Detektion können die aus dem Stand der Technik für Fluoreszenzmarkierung von Proteinen oder Fluoreszenz­ markierungen nach der Sanger-Methode bekannten Verfah­ ren angewandt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird nach der Auftrennung der Fragmente in der Gelelektrophorese der Fluoreszenzfarbstoff durch Laserbestrahlung angeregt, die Fluoreszenz maschinell gemessen und ausgewertet.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es auf ein­ fache Weise, die Vorteile der Maxam-Gilbert- und Sanger-Ver­ fahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren zu kombinie­ ren, wobei durch die Verwendung von Fluoreszenzmarkie­ rung die Gefahren, die mit Radioaktivität einhergehen, vermieden werden. Hierdurch wird es außerdem ermöglicht, nur eine spezifische Spaltungsreaktion, bzw. zusätzlich eine oder mehrere Modifikationsreaktionen durchzuführen, es sind nicht mehr unbedingt die Durchführung von vier verschiedenen Modifikationsreaktionen nötig. Auch er­ möglicht das erfindungsgemäße Verfahren Nukleinsäuren unabhängig von der Anwesenheit geeigneter Schnittstellen für Restriktionsenzyme zu markieren sowie eine Anpassung der Sequenzierung an viele experimentelle Gegebenheiten, wie z.B. An- oder Abwesenheit von 5′-überhängenden Enden, Sequenzierung von langen Nukleinsäuren, Sequen­ zierung von vielen Nukleinsäuren gleichzeitig durch Verwendung eines festen Trägers mit getrennten Abtei­ lungen für verschiedene Nukleinsäuren, Auftragen von mehr als 10 bis 20 zu sequenzierenden Nukleinsäuren gleichzeitig auf je eine Spur eines Gels und bei auto­ matischem Ablesen und Speichern der Daten im Computer nach einiger Zeit der Elektrophorese erneutes Anfragen von neuen Proben.

Das folgende Beispiel erläutert in Verbindung mit der Abbildung die Erfindung weiter.

Fig. 1A und 1B zeigt die Lage der Fluoreszenz-Farb­ stoffmarkierung an einem Deoxynukleo­ sid-triphosphat bzw. Dideoxynukleosid­ triphosphat und an einem erfindungsgemäß verwendeten Oligonukleotid-Primer.

Beispiel 1

Zur Markierung von DNA mit Fluoreszenzfarbstoffen werden folgende Methoden verwendet:

• 1.1 Fluoreszenzmarkierung von einzelsträngiger DNA durch Primer-Extension
  In einem 0,5 ml Eppendorf-Gefäß werden 1,0 µl (1,8 µg) M13mp18 DNA mit 10,5 µl Wasser, 2,5 µl 10× TM-Puffer und 1,0 µl (3 pmol) fluoreszenzmar­ kierter Universalprimer zugegeben, miteinander ge­ mischt und 10 Minuten bei 65°C erwärmt. Anschließend kühlt man das Annealinggemisch langsam auf 37°C in einem thermostatierbaren Wasserbad und inkubiert die Mischung für weitere 30 Minuten bei 37°C. Zu den 15 µl Annealinggemisch gibt man dann 7 µl eines Gemisches aller vier Desoxynukleosidtriphos­ phate (dNTP′s) einer Konzentration von 500 µM, addiert dann 1 µl 100 µM DTT und 2 µl (3 Einheiten) einer verdünnten T7 DNA-Polymerase (Pharmacia). Die Mischung wird für ca. 10 Minuten bei 37°C inkubiert und anschließend durch Inkubation bei 90°C für 3 Minuten und nachfolgendem sofortigem Abkühlen in Eiswasser denaturiert.
• Die enzymatische Extension kann auch mit ca. 1 µl (5 Einheiten) des Klenow-Fragments der E. coli DNA Polymerase I (Boehringer) erfolgen, wobei hier die Mischung mindestens 45 Minuten bei 37°C inkubiert werden muß.
• 1.2 Fluoreszenzmarkierung doppelsträngiger DNA durch Primer-Extension
  In einem 1,5 ml Eppendorf-Gefäß werden 2,0 µl (6 µg) eines doppelsträngigen Plasmides, z.B. Bluescribe gegeben. Man addiert 40 µl 0,2 M NaOH, 0,1 mM EDTA und inkubiert die Mischung 10 Minuten bei Raumtemperatur zur Denaturierung. Anschließend addiert man 5 µl 3 M NaAc, pH 5,2, 150 µl 96% Ethanol, mixt die Mischung sorgfältig und inkubiert 15 Minuten bei -80°C. Die DNA wird durch 5minütiges Zentrifugieren bei 13 000 g präzipitiert, der Überstand wird entfernt und das DNA-Pellet mit 150 µl 70% Ethanol gewaschen. Der Überstand wird wiederum entfernt und das Pellet in einer Vakuum­ zentrifuge (Speed Vac) für 5 Minuten getrocknet. Das Pellet wird in 11,5 µl Wasser aufgenommen, man addiert 2,5 µl 10× TM Puffer und 1,0 µl (3,1 pmol) fluoreszenzmarkierten Universalprimer. Nach guter Durchmischung und einer kurzen Zentrifugation (2 Sekunden) inkubiert man das Gemisch 30 Minuten bei 37°C. Zu den 15 µl des Annealinggemisches gibt man 7 µl 500 µM dNTP′s, 1 µl 100 µM DTT und 2 µl (3 Einheiten) verdünnter T7 DNA-Polymerase (Phar­ macia) und inkubiert die Mischung für 10 Minuten bei 37°C. Die Hitzedenaturierung erfolgt wie in 1.1 angegeben.
• 1.3 Fluoreszenzmarkierung durch Ligation von fluores­ zenzmarkierten Oligokassetten in DNA 5 µl (6 µg) eines Plasmides, z.B. Bluescribe, pUC18 oder pUC19 werden in einem 0,5 ml Eppendorf- Gefäß mit 17,5 µl Wasser und 3 µl 10× EcoRI-Puffer vereinigt. Man addiert 4,5 µl (15 Einheiten) EcoRI und inkubiert eine Stunde bei Raumtemperatur. Das Restriktionsenzym wird durch 20minütiges Erwärmen der Mischung auf 80°C zerstört. Zur Ligation werden 10 µl der restringierten DNA mit 10 µl einer Oligonukleotidkassetten (5- bis 500facher molarer Überschuß), bestehend aus den beiden Oligonukleotiden Fluorescein-Anker-d(GGCCCCGG) und d(AATTCCGGGGCC), 4 µl 10× Ligase-Puffer und 10 µl Wasser gemischt, für 5 Minuten bei 60°C inkubiert und danach in einem temperierbaren Wasserbad auf 14°C abgekühlt. Anschließend gibt man 3 µl 10 mM rATP und 2 µl (10 Einheiten) T4 DNA Ligase (Boehringer) hinzu, inkubiert 3 Stunden bei 14°C, und nach weiterem Abkühlen auf 5°C bei dieser Temperatur für 12 Stunden. Die T4-DNA-Ligase wird durch 20minütiges Erwärmen der Mischung auf 65°C denaturiert. Danach addiert man zu den 45 µl des Ligationsansatzes 20 µl Wasser. 8 µl 10× HindIII Puffer und 3 µl HindIII (30 Einheiten, Boehringer). Die Mischung wird 2 bis 6 Stunden bei 37°C inku­ biert und anschließend die DNA durch Phenolextrak­ tion und Ethanolpräzipitation gereinigt. In analoger Weise kann man andere 5′- bzw. 3′-über­ hängende Enden mit fluoreszenzmarkierten Oligo­ kassetten markieren, man muß jedoch die entsprechen­ den anderen Restriktionsenzymkombinationen bzw. andere Oligonukleotidkassetten verwenden.

Beispiel 2

Zur chemischen Degradation werden folgende Methoden verwendet:

• 2.1 Vier verschiedene DNA-Modifikationsreaktionen in vier separaten Ansätzen, gefolgt von partiellem Strangbruch und Auftragen der Produkte auf vier Spuren des Gels.
• Zur Modifikation eines Aliquots der nach Beispiel 1 fluoreszenzmarkierten DNA (2 bis 5 µl Aliquots) werden folgende Reaktionen eingesetzt: G mit 1% Dimethylsulfat (DMS) in 50 mM Ammoniumformiat, pH 3,5, bzw. 50 mM Natriumcacodylat, pH 8,0; A+G mit 66% Ameisensäure, T:Purine mit 0,1 bis 0,4 mM Kaliumpermanganat, C mit 2 bis 4 M Hydroxylamin bei pH 6, C : T mit 60% wäßrigem Hydrazin, C < T mit Hydrazinacetat und A < C mit 1,2 M Natronlauge. Die Reaktionen werden in Lösung mit anschließender Ethanolpräzipitation (Maxam-Gilbert-Protokoll) oder an der festen Phase Hybond M & G Papier durchgeführt.

Zur Sequenzierung werden folgende Reagenzien zur basen­ spezifischen Modifikationsreaktion verwendet:

• a) T < Pu/T+Pu-Modifizierung:
  Kaliumpermanganat-Vorratslösung:
  Man löst 2 mg Kaliumpermanganat in 1 ml Wasser. Die verschlossene Lösung wird bei 4°C aufbewahrt und vor Licht geschützt. Diese Lösung kann eine Woche unter diesen Bedingungen verwendet werden.
• b) C-Modifikation:
  Hydroxylamin-hydrochlorid, pH 6,0:
  Man löst 2,75 g Hydroxylamin-hydrochlorid in 5 ml Wasser. Hierzu werden 3 ml Triethylamin zugegeben und die Lösung sorgfältig gemischt. Nach dem Ver­ mischen wird der pH bei der Lösung überprüft und auf pH 6,0 mit Triethylamin eingestellt. Schließ­ lich wird die Lösung auf ein Endvolumen von 10 ml mit Wasser eingestellt. Die Lösung ist einige Monate in einem verschlossenen Behälter bei 4°C stabil. Der pH-Wert sollte regelmäßig überprüft werden und wenn nötig auf pH 6 eingestellt werden.
• c) G-Modifizierung:
  Ammoniumformiat-Puffer, pH 3,5:
  Man löst 31,5 g Ammoniumformiat in 5 ml Wasser und stellt den pH-Wert auf 3,5 mit Ameisensäure ein. Schließlich wird die Lösung auf 10 ml mit Wasser eingestellt. Die Lösung ist mehrere Monate bei 4°C stabil.
• d) A+G-Modifizierung
  Ameisensäurelösung:
  Eine 88%ige (v/v) wäßrige Lösung von Ameisensäure wird verwendet zur Sequenzierung von Oligonukleo­ tiden und eine 66%ige (v/v) wäßrige Lösung für lange DNA-Fragmente. Diese Lösung sollte vor der Verwendung frisch zubereitet werden.
• e) T+C-Modifizierung:
  Hydrazinlösung:
  Eine 60%ige (v/v) wäßrige Lösung von Hydrazin wird verwendet zur Sequenzierung von langen DNA-Frag­ menten. Man stellt die Lösung her durch Vermischen von 60 µl 98%igem wasserfreiem Hydrazin mit 40 µl Wasser direkt vor der Verwendung.
• f) Piperidinlösung zur Spaltung:
  Eine 10%ige (v/v) wäßrige Piperidinlösung sollte direkt vor der Verwendung hergestellt werden.

Es wurden die folgenden Mengen der einzelnen Reaktions­ lösungen zugegeben: (die Reaktionslösungen sind in Tabelle 1 genauer angegeben):

G-Reaktion 1 µl
A/G-Reaktion 4 µl
T/C-Reaktion 1 µl
C-Reaktion 3 µl.

Die Reaktionstemperatur ist für alle Reaktionen 20°C. Die Reaktionen werden durch Waschen der vier Streifen des Papiers mit 20 bis 50 µl doppelt destilliertem Wasser in einem 100 ml Becher beendet. Die Streifen werden dann geblottet, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und gegebenenfalls nochmal gewaschen. Danach werden die Papiere getrocknet und in Zentrifugenröhr­ chen übergeführt. Zu jedem dieser Röhrchen wird genug wäßrige Piperidinlösung (10% v/v) zugegeben, um das Papier zu bedecken (ca. 50 µl). Sodann wird auf 90°C erhitzt, das Papier aus den Röhrchen entfernt und die Proben in einem Speed-Vac-Konzentrierapparat lyophili­ siert. Dies dauert in etwa 30 Minuten für 20 bis 120 Röhrchen. Sodann werden 25 µl doppelt destilliertes Wasser zugegeben und erneut lyophilisiert. Zu den lyo­ philisierten DNA-Fragmenten wird Gel-Laufpuffer zuge­ geben und die Proben vorsichtig in 1 µl Portionen auf ein 20%iges Polyacrylamid-Sequenziergel (20 cm×40 cm×0,5 mm), enthaltend 7 M Harnstoff, aufgetragen. Die Sequenz kann durch Anregen des Fluoreszenzfarbstoffes und Detektion der Banden ermittelt werden.

Tabelle 1

Anschließend führt man die Piperidinreaktion mit 10% wäßrigem Piperidin für 30 Minuten bei 90°C durch und entfernt das Piperidin durch wiederholte Lyophilisie­ rung.

• 2.2 Zwei verschiedene DNA-Modifikationsreaktionen in zwei separaten Ansätzen gefolgt von partiellem Strangbruch und Auftragen der Produkte auf zwei Spuren des Gels.
• Folgende Paare von DNA-Modifikationsreaktionen werden kombiniert und wie in 2.1 in Lösung oder an fester Phase durchgeführt: A+G mit 66% Ameisen­ säure und A < C mit 1,2 M Natronlauge, G mit 1% DMS in 50 mM Ammoniumformiat bei pH 3,5 und C < T mit Hydrazinacetat, gefolgt von der partiellen Strang­ bruchreaktion mit 10% wäßrigem Piperidin für 30 Minuten bei 90°C und anschließender Entfernung des Piperidins durch wiederholte Lyophilisierung.
• 2.3 Eine DNA-Modifikationsreaktion, gefolgt von einer für mindestens drei der vier Basen spezifischen partiellen Strangbruchreaktion in einem Ansatz
  Zunächst werden 2 bis 5 µl der nach Beispiel 1 fluoreszenzmarkierten DNA G-spezifisch mit 10 bis 20 µl 1% DMS in 50 mM Ammoniumformiat, pH 3,5, für 1 bis 2 Minuten bei Raumtemperatur modifiziert. Anschließend addiert man 90 µl einer 0,5 M wäßri­ gen Piperidinlösung, die 0,5 M an NaCl ist und inkubiert den Ansatz in einem 0,2 ml, 0,5 ml oder 1,5 ml Eppendorf-Gefäß bzw. in einem Gefäß einer Mikrotiterplatte für ca. 4 bis 6 Stunden bei 90°C.
  Danach gibt man 10 µl einer 3 M NaAc-Lösung, pH 5,2 hinzu addiert 300 µl 96% Ethanol, mischt den Ansatz gut durch und inkubiert 30 Minuten bei -80°C oder 12 Stunden bei -20°C. Anschließend wer­ den die DNA-Fragmente durch 10 Minuten Zentrifu­ gation bei 13 000 g präzipitiert, der Überstand entfernt, das DNA-Pellet mit 300 µl 70% Ethanol gewaschen und das Pellet in der Speed Vac getrocknet. Die Abbauprodukte werden in einer Spur des Gels aufgetragen.
  Anstelle der Methylierungsreaktion mit DMS kann man in einer anderen Variante zunächst auch eine A+G-Modifikation mit 10 µl 66% Ameisensäure für 5 Minuten bei Raumtemperatur durchführen. Man fährt dann, wie weiter oben bereits beschrieben, fort und führt die partielle Strangbruchreaktion mit 0,5 M wäßrigem Piperidin/0,5 M NaCl durch.
• 2.4 Eine für mindestens drei der vier Basen spezifische partielle Strangbruchreaktion und Auftragen der Produkte in einer Spur des Gels
  2 bis 5 µl der nach Beispiel 1 fluoreszenzmarkier­ ten DNA wird mit 100 µl einer 0,5 M wäßrigen Pipe­ ridinlösung versetzt, die 0,3 M an NaCl ist. Die Mischung wird in einem 0,2 ml, 0,5 ml oder 1,5 ml Eppendorf-Gefäß bzw. in einem Gefäß einer Mikro­ titerplatte für 4 bis 6 Stunden bei 90°C inkubiert. Danach addiert man 10 µl 3 M NaAc, pH 5,2, 300 µl 96% Ethanol, mischt sorgfältig und inkubiert den Ansatz 30 Minuten bei -80°C oder 12 Stunden bei -20°C. Die DNA-Fragmente werden durch 10 Minuten Zentrifugation bei 13 000 g präzipitiert, der Überstand entfernt, anschließend das DNA-Pellet mit 300 µl 70% Ethanol gewaschen und anschließend das Pellet für 5 Minuten in einer Speed-vac ge­ trocknet. Die Abbauprodukte werden in einer Spur eines Gels aufgetragen.

Claims (26)

1. Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren durch Markierung der Nukleinsäuren, chemische Modifizierung an Basen-spezifischen Positionen, partiellen Strangbruch an den modifizierten Posi­ tionen durch Zugabe von Base und Erhitzen auf erhöhte Temperatur, Auftrennung und Detektion der so erhaltenen markierten Nukleinsäurefragmente durch Gelelektrophorese und Sichtbarmachen von Banden im Gel, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Markierung einen oder mehrere Fluoreszenzfarbstoffe an die Nukleinsäure koppelt, und zur Modifizierung und Auftrennung

• a) vier verschiedene für jeweils eine Base bzw. zwei Basen spezifischen Modifikationsreaktionen in vier verschiedenen Ansätzen durchführt und diese nach partiellem Strangbruch auf vier verschiedene Spuren eines Gels aufträgt, oder
• b) zwei für je eine bzw. zwei der vier Basen spezifische Modifikationsreaktionen in zwei Ansätzen durchführt und diese nach partiellem Strangbruch auf zwei Spuren eines Gels auf­ trägt, oder
• c) zwei für je eine bzw. zwei der vier Basen spezifische Modifikationsreaktionen nach­ einander in nur einem Ansatz durchführt und diesen nach partiellem Strangbruch auf eine Spur eines Gels aufträgt, oder
• d) eine für eine bzw. zwei der vier Basen spezi­ fische Modifikationsreaktion durchführt, an­ schließend den Ansatz einer weiteren chemi­ schen Reaktion unterwirft, bei der für minde­ stens drei der vier Basen ein spezifischer Strangbruch erfolgt und den Ansatz danach auf eine Spur eines Gels aufträgt, oder
• e) anstelle der spezifischen Modifikations­ reaktionen gefolgt von einem partiellen Strangabbruch nur einen für mindestens drei Basen spezifischen partiellen Strangabbruch in einem Ansatz bewirkt und diesen auf eine Spur eines Gels aufträgt,

und die Nukleinsäure-Sequenz über die Lage und Intensität der Banden im Gel bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Markierung über enzymatische Extension eines fluo­ reszenzmarkierten Oligonukleotidprimers in Anwe­ senheit aller vier Deoxyribonukleosid-triphosphate, einer Matrize der zu sequenzierenden Nukleinsäure und einer DNA-Polymerase, einen zu der zu sequen­ zierenden Nukleinsäure komplementären Strang syn­ thetisiert, der an einen Fluoreszenzfarbstoff ge­ koppelt ist, und diesen komplementären Strang sequenziert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluo­ reszenzfarbstoff an die 5′-Phosphatgruppe des Oligonukleotidprimers über einen Linker gebunden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet daß man eine einzelsträngige oder doppelsträngige Nukleinsäure-Matrize für die Primer-Extension verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle eines oder zwei der unmodifizier­ ten Desoxynukleosid-triphosphate entsprechende basenmodifizierte Desoxynukleosid-triphosphate verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man 7-Deaza­ desoxyguanosin-triphosphat, 7-Deaza-desoxyadenosin­ triphosphat oder 5-substituierte Pyrimidindesoxy­ nukleosid-triphosphate verwendet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als DNA-Polymerase das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, modifizierte oder unmodifizierte T7-DNA-Polymerase, Taq-Polymerase oder Reverse Transkriptase verwendet.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man fluoreszenzmarkierte Nukleinsäuren durch enzymatische Extension unter Verwendung verschiede­ ner Oligonukleotidprimer, von denen einer eine Fluoreszenzmarkierung aufweist und der oder die anderen nicht markiert sind, in Anwesenheit einer Nukleinsäure-Matrize, den vier Desoxynukleosid-tri­ phosphaten und einer DNA-Polymerase herstellt und amplifiziert.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Markierung fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidkas­ setten in Restriktionsfragmente der zu sequenzie­ renden Nukleinsäure mit 5′- oder 3′-überhängenden Enden einligiert.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oli­ gonukleotidkassetten aus zwei verbundenen Oligonuk­ leotiden bestehen, wovon eines an seinem 5′-Ende den Fluoreszenzfarbstoff enthält und das andere unmarkiert ist und mit zu sequenzierenden Doppel­ strängen mit überhängenden Enden zwischen 2 und 20 Basenpaaren hybridisiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Oligo­ nukleotide mit Kettenlängen zwischen 4 und 100 Basenpaare verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Markierung Restriktionsfragmente der zu sequenzie­ renden Nukleinsäuren mit überhängenden 5′-Enden mit Polymerase oder Reverser Transkriptase in An­ wesenheit mindestens eines Desoxy- oder Didesoxy­ nukleosid-triphosphates, das über einen Linkerarm an die heterocyclische Base einen Fluoreszenzfarb­ stoff gekoppelt aufweist, auffüllt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Farb­ stoff über einen Linker an die C5-Position von Pyrimidinen oder an die N7-, C8- oder C7-Position von Purinen gekoppelt ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Linker eine geradkettige oder verzweigte Amino- oder Mercapto-Kohlenwasserstoffeinheit mit mehr als 2 C-Atomen in der unverzweigten Kette verwendet wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Linkerarm eine Aminoalkyl- oder Aminoal­ kenyl- oder Aminoalkinylgruppe ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein, Analoga davon oder Rodamin ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die markierten Nukleinsäuren an einen festen Träger bindet, und dann die Modifikations- und/oder Abbruchreaktionen in fester Phase durch­ führt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man als Base zum Strangabbruch Piperidin oder andere primäre oder sekundäre Amine verwendet.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man vor dem Auftragen der Ansätze der modifi­ zierten Nukleinsäuren auf das Gel eine Ethanol­ fällung in Anwesenheit von 0,3 M Natriumacetat durchführt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Alkylierungsreaktion mit einem Alky­ lierungsmittel und eine Piperidin-Spaltungsreak­ tion mit Piperidin in Anwesenheit von Natriumchlo­ rid durchführt.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkylierungsmittel 0,001 bis 10% Dimethylsulfat in Ammoniumformiatpuffer, pH 3,5 bis 10 oder in Natriumcacodylatpuffer, pH 7 bis 10, durchführt.

22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man den Strangabbruch mit 0,1 bis 2 mol/l Piperidin in Anwesenheit von 0,2 bis 1 mol/l Natriumchlorid und Erhitzen der Reaktionsmischung für 1 bis 10 Stunden auf zwischen 50 und 100°C durchführt.

23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Depurinierungsreaktion mit Ameisensäure und eine Piperidinspaltungsreaktion in Anwesenheit von Natriumchlorid durchführt.

24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Markierung und/oder chemische Modifi­ zierung und/oder partiellen Strangabbruch in Mikrotiterplatten durchführt.

25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Detektion nach Auftrennung der Frag­ mente in der Gelelektrophorese den Fluoreszenz­ farbstoff durch Laser anregt.