JPS62502423A

JPS62502423A - Ｄｎａの塩基配列決定

Info

Publication number: JPS62502423A
Application number: JP61502315A
Authority: JP
Inventors: オーゲル，レスリー・エリーザー; パトリツク，ジエームズ・ワーナー
Original assignee: ザ・サーク・インステチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズ
Priority date: 1985-04-01
Filing date: 1986-03-31
Publication date: 1987-09-17
Anticipated expiration: 2010-04-05
Also published as: EP0216905A1; WO1986005817A1; EP0216905A4; JPH0728760B2; US4865968A; CA1288069C

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡの塩基配列決定本発明は単純化されたＤＮＡの塩基配列決定に関する。

比較的最近まで、ＤＮＡの塩基配列決定は時間のかがる退屈な仕事であった。そのＤＮＡ塩基配列決定を大いに単純化するＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．５４６３〜５４６７（１９７７）。

マクサム（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　）　＆ギルバー）　（Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、　）のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５６０〜５６４（１９７７）　；およびマート（Ｊ、　Ｍａａｔ）　＆ｘミス（Ａ、　Ｊ、　Ｓｍ１ｔｈ　）のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　５．４５３７〜４５４５　（１９７８）に記載の方法などがある。

サンガーらの上記文献に記載の方法は、プライマーとして直接近傍にアニールされた制限フラグメント鎖を用いて、ＤＮＡポリメラーゼにより一本鎖標的配列の放射性相補鎖のコピーを合成することを伴う。異なるジデオキシヌクレオシド三リン酸（ａａＮＴＰ）ターミネータ−と、さらに４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ａＮＴＰ）（そのうちの１種以上はα位を３２ｐで標識される）を含む４つの別個の反応混合物を使用して、伸長反応の放射性標識生成物中へ上記のターミネータ−を部分的に取り込ませる。１つの反応において、すべてが共通の５′末端をもつが、ヌクレオチド配列の全体を通して様々な位置（その位置のヌクレオチドとターミネータ−ａａＮＴＰとが類似する）で終わる３′末端をもつ異なる鎖長の標識オリゴヌクレオチドが合成される。４つの別個の反応（それぞれ４種類のｄａＮＴＰチェインターミネータ−のうちの１種を含む）の生成・物を変性ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけて平行分画化することにより、異なる鎖長のオリ！ヌクレオチドを分離する。これらはそれぞれの塩基の位置を順序正しく示し、それにより塩基配列が決定される。

マートらの上記文献に記載の方法では、４つの別々の反応において５′３２Ｐ− 標識フラグメントがＤＮＡ＃？リメラーゼＩおよび膵臓ＤＮＡａｓｅ　Ｉの存在下でインキュベートされる。それぞれの反応は４種類すべてのａＮＴＰと、異なる１種類の　ｄａＮＴＰを順に含む。膵臓ＤＮＡａｓｅｌはニックを導入し、その了ヒビロキシル基はＤＮＡポリメラーゼ【のＤＮＡ合成開始点として役立つ。

その後鎖伸長反応があらゆるニックの３′末端から進行し、そして各反応にお（・て塩基特異的鎖伸長停止へと導かれる。反応生成物は変性ホ＋）アクリルアミドゲル板上で分画化されて、共通の標識５′末端をもつオリゴヌクレオチビが分離される。

ニラキングおよびその後の鎖伸長反応は両頭に対して起こるが、一方のみが標識されるので、放射性バンドのパターンはその鎖のみに現われ、それによりその塩基配列を推定することが可能である。ＤＮＡａｓｅ　ｌ　によるフラグメントのニラキングはその長さに沿ったあらゆる残基で起こるわけではないが、各反応混合物中にデオキシ−およびジグオキシ−ＮＴＰの両方が存在するとり・５８実は、鎖伸長がニック部位から同一塩基の数個の残基にわたって連続することを確実にする。それ故にその塩基配列中のあらゆる残基がバンドを生じさせる。

サンガーらおよびマートらのターミネータ−を用いる鎖伸長反応の変法では、両方とも、ヌクレオチビ配列を推定するのにのうちの１種類の位置を定め、その位置は他の３つのレーンのそれぞれにおけるバンドと比較して決定される。４つのレーンはすべて一度に比較されねばならず、また往々にして４つのレーンのパターンを横切って解読するときに精神的誤りをおかす。

４レーンパターンの解読はゲルが曲がったり（このような事例がしばしばおこる）、あるいは他のゲル人工産物が生ずる場合に相当困難である。

マクサムおよびギルバートの上記文献に記載の方法は、ヌクレオチドの特定塩基に特異的な部位で一本鎖ＤＮＡを切断する化学反応に基づいており、また異なる長さの切断ヌクレオチド録がポリアクリルアミドゲル上を異なる速度で泳動するという事実に基づいている。一本９ＤＮＡ配列はその一端を例えば放射性同位体で標識される。その後、標識鋲の種々のアリコートを、平均してＤＮＡ鎖の単一切断を１種またはそれ以上（例えば４種のうち２種）の特定ヌクレオチド部位で生じさせる別々の反応混合物に加える。次いで、断片化したＤＮＡ鎖のアリコートをポリアクリルアミドゲルにのせて並列レーンで泳動させる。′ｎ個”のヌクレオチド（ｎは一般に２００より小さい）の場合は、数個のレーンが一緒になって原点からｎ個の隔たりでバンドを与える。しかしながら、マクサムおよびギルバートの上記文献に記載されるように、各レーンは１種またはそれ以上の特定切断部位に対応するバンドのみを含む。原点からの各バンドの隔たりに対応するヌクレオチドはゲルを横切って、すなわち泳動方向に対して直角の方向に、バンド・ξターンがら推論される。

マクサムおよびギルバ−トは、各レーンが１種または２種の特定ヌクレオチド部位での断片化を表わす４レーン系を提案した。マクサム−ギルバート法の１つの好適な具体例では、４つのレーンが１）Ａ（アデニン）十Ｇ（グアニン）、２）　Ｇ。

３）Ｃ（シトシン）および４）Ｃ−１−Ｔ（チミン）を表わす。この系において、レーン１の単一バンドはその切断部位にＡを結論づけ、レーン１および２の並列バンドはその切断部位にＧを結論づけ、レーン４の単一バンドはその位置にＴを結論づけ、そしてレーン３および４の並列バンドはその切断部位にＣを結論づける。

これらの結果は、ゲルが十分に鮮明であるという条件ならば疑う余地がない。しかしながら、当業者ならよく知っているように、ゲル分離能はしばしば希望する品質のものではない。鮮明度に伴う諸問題には圧縮、人工産物、堆積およびゴーストバンドが含まれる。さらに、異なるレーンのバンドは一般に希望するほどまっすぐに横切って整列せず、むしろ曲がってしまうことがよ（ある。このために、ゲルの解読は若干の経験を必要とし、まだなお誤りをおかしやすい。

いくつかの技法が誤りをなくすために採用される。これらの技法の１つは重複である。マクサムおよびギルバートは彼等の４レーン系が塩基配列を推定するのに必要とされるよりも多くの情報を含み、各レーンが単一ヌクレオチド切断を表わす３レーン系が塩基配列を推定するのに十分な情報を提供するであろうと認めている。しかしながら、彼等はこのような重複が信頼できる結果を得るために必要であることを強く示唆している。

それぞれが単一部位での切断を示す３レーンの解読（または上記の鎖伸長法においてはそれぞれが単一部位での鎖伸長停止を示す３レーンの解読）は第４番目のヌクレオチドの位置を推定するのに隔たりの判断を必要とし、このことはノ；ンド間の隔たりが末端ヌクレオチドに応じて変化するという事実により複雑になってくる。誤りを減らす別の方法は、コード鎖とその相補鎖の両方の塩基配列を決定することである。

上記方法は比較的よく進行してヌクレオチドの塩基配列決定に要する時間をかなり減縮するが、より一層正確でしかも迅速な環基配列決定法がめられている。遺伝暗号は４種のヌクレオチド１の配列から成り、且つ電気泳動ゲル系を横切る対応のバンドパターンは原理的にその判読が簡単であるので、この方法はコンピュータやマイクロプロセッサ−による判読を含めた塩基配列の自動決定に適している。マイクロプロセッサ−による解読は、時間の節約に加えて、広範囲の塩基配列を解読するという退屈な仕事の性質ゆえにしはしばおこる精神上の誤り、すなわち各バンドを各レーンに誤って割り当てることが原因でおこる部類の技術者の精神的な誤りを減らすことが期待できる。

コンピュータを用いる方法は各バンドをそれぞれの適切なレーンに割り当てることに関する誤りやその他のこのような精神上の誤りを実質的に排除しうるが、自動装置は多（の場合に、どのバンドがゲルを横切って実際に共直線性であるのかを正しく判断する際に、技術者はどに有効でない。往々にしてバンドはかなり曲がるので、どのバンドが原点から等距離を泳動したと見なすべきか正しく同定することは光学走差装置にとって非常に難しいことである。この仕事は特定のゲル・モターンの曲がりぐあいを認識することができ且つそれに応じて適宜にその解読を調整し得る熟練技術者によって比較的よく成し遂げられる。

ロジャーースターデ７　（Ｒｏｄｇｅｒ　５ｔａｄｅｎ）のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、１２，４９９〜５０３（１９８４）はコンピュータを使用するＤＮＡ塩基配列解析法を開示している。この方法では、技術者が各レーンに沿って彼の検出用啄ンを動かし、それを各バンドの位置に下ろしてそれをコンピュータに記録する。コンピュータはそのデータの記録を取って、ヌクレオチドの塩基配列を解析する。このシステムでさえ、特に不確実なコードが入力されるときには、相当に不確実である。

ゲルの曲がりが原因で起こりうる誤りを減らすＤＮＡの塩基配列決定法を開発することが望まれるだろう。これはマイクロプロセッサ−のようなコンピュータ手段を用いる光学走差装置による完全自動塩基配列決定を可能にするだろう。

発明の要約ゲルパターンを横切って解読する際の誤り（例えばゲルが曲がることによりおこる）を実質的に排除する改良されたＤＮＡの塩基配列決定法が提供される。これは光学走差手段とそれに関連したコンピュータ手段を含む自動装置を用いることにより、ゲルを簡単に解読せしめる。本発明方法は数種の反応混合物（ＤＮＡ鎖全体に分布する特定ヌクレオチドで鎖伸長の停止をおこすような手法で鎖伸長反応中にそのＤＮＡ鎖を停止させる反応混合物、またはＤＮＡ鎖全体に分布する１種またはそれ以上の特定ヌクレオチドでの切断をおこすような手法でそのＤＮＡ鎖を選択的に切断する反応混合物）を使用するいくつかの上記方法の改良法である。これらの方法の各々において、上述したように、一連の反応混合物はヌクレオチド鎖の伸長および停止または切断のために配合され、そしてその反応混合物はゲル塗布用混合物を形成するために適当に組み合わされる。塗布用混合物は鎖長に応じて鎖フラグメントを分離するゲル上で並列に泳動され、４種のヌクレオチドのそれぞれに対して別個のバンドパターンが、そのヌクレオチドが存在する鎖中のそれぞれの位置に関連するゲル上の位置に現われる。上記の塩基配列決定法では、それぞれのゲル塗布用混合物は１種または２種のヌクレオチドに特異的であって、疑う余地のない確読や必要とされる重複のために４つのレーンを必要としたが、本発明の改良点はあらゆる長さのヌクレオチド鎖フラグメントを含む第１混合物（そのゲル塗布用第１混合物は中央レーンとして泳動するＸ第１および第２ヌクレオチビの位置で終わるヌクレオチド鎖フラグメントを含むゲル塗布用第２混合物（その第２混合物は２つの隣接レーンの一方として泳動する）、および第１および第３ヌクレオチドの位置で終わるヌクレオチド鎖フラグメントを含むゲル塗布用第３混合物（その第３混合物は隣接レーンの他方として泳動する）を提供する。ゲルパターンの疑う余地のない解読は、直接隣接するレーンのみを比較することによって可能である。

好適な実施態様の詳細な説明本発明によれば、ゲルの３つのレーンで泳動したときに中央レーンと各隣接レーンとを直接比較することによって、４種のヌクレオチドのそれぞれの位置の正確な解読が可能になるバンドパターンを示す３つのヌクレオチド鎖７ラグメント混合物を用いることによって、ヌクレオチド配列が決定される。第１混合物は一端から測定してそれぞれの鎖長に対応する（すなわち４種のヌクレオチド部位のそれぞれの各位置で終わる）ランダムに生成された鎖フラグメントを含む。第２混合物は第１または第２ヌクレオチド部位のそれぞれの各位置で特異的に終わるランダムに生成された鎖フラグメントを含む。第３混合物は第１または第３ヌクレオチビ部位の各位置で特異的に終わるランダムに生成された鎖フラグメントを含む。鎖７ラグメントの３つの混合物はヌクレオチド鎖フラグメントなそれらの大きさく長さ）に応じて分離するポリアクリルアミドゲルのような電気泳動用ゲルの並列レーン（第１ヌクレオチド鎖混合物は中央レーンに置かれ、第２および第３ヌクレオチ）＃鎖混合物は左側レーンと右側レーンに置かれる）で泳動される。

ｎ個の連続したヌクレオチド鎖では、中央レーンがｎ個のすべての位置（原点からの隔たり）にバンドを示す。隣接レーンは特定のヌクレオチド停止部位に対応する位置にのみバンドを示す。鎖中０４種のヌクレオチドのそれぞれの位置は、特異なバンドパターンをレーンを横切って（すなわちバンド泳動の方１ヌクレオチドは３つの隣接レーンのそれぞれに現われる）２ンドによって認識される。第２ヌクレオチドは左側レーンと中央レーンだけに現われるバンドによって認識される。第３ヌクレオチドは中央レーンと右側レーンだけに現われるバンドによって認識される。（左側レーンと右側レーンは相互に交換可能であり、ここでは説明を簡略化する目的でのみ使用されることをもちろん理解すべきである。）第４のヌクレオチドは中央レーンだけに現われるバンドによって認識される。

ゲルの好適な解読方法は、最初に中央レーンと比較して左側レーンを読み取り、次に中央レーンと比較して右側レーンを読み取り、その後そのデータをアセンブルして３つのパントノミターンを識別することである。すなわち、中央レーンによって定められるヌクレオチド鎖のはしご状の各位置で、他の２つのレーンのそれぞれの読み取りを＋または−に分類する。データをアセンブルする際に、＋、＋は第１ヌクレオチドとして解釈され；十、−は第２ヌクレオチドとして解釈されニー、十は第３ヌクレオチドとして解釈され；そして−１−は第４ヌクレオチドとして解釈される。

ゲルの手動解読のために、このシステムは少なくとも２つの利点を提供する。まず第一に、ゲルの解読者は彼が読み取ってそのデータを表にするまで評価するのを待って、彼の観察を単に記録するだけでよい。たとえバンドパターン系が４つであってその解読が単純であるとしても、恐らくは多数のバンドパターンを読み取ることの退屈さゆえに、しばしば誤りをおかすことが分かつている。この性質の誤りは、読み取りながら判読する必要がないときに実質的に減少する。第二に、読み取りが非常に簡単であって、技術者は完全にバンド列の段が付けられた中央レーンのバンドに隣接するレーンにバンドが存在するがどうかを調べるだけでよい。数個のレーン（そのうちのい（っかはブランクであるだろう）を横切って記録する必要がな（、また数個のバンドが確かに横方向に一直線に並んでいると判断する必要もな（・。このことはバンドパターンに相当の曲がりが生じたときに特にＭ要である。

塩基配列の自動決定法にとって、このシステムの主な利点はバンドが曲がる影響を実質的に無視できるということである。

たとえ相当の曲がりが生じたとしても、隣接バンドの末端同士は実質的に整列されるはすであり、光学走査装置によって整列していると容易に認識されるはずである。この走査装置はそれぞれの次の段について中央レーンを走食し、次に〕くンドの有無について隣接レーンを走査し、そしてバンドの有無を＋または−として記録するだけでよ（・。この方法を繰り返して他の隣接バンドを中央バントゝと比較し、そしてその結果を＋または−として記録する。このシステムの場合は左側レーンと右側レーンを直接比較する必要がな（、従って、たとえゲルの曲がりが左側レーンと右側レーンとを一直線に整列させな（とも、走査装置は隣接ゲルの末端の位置だけを比較するように調整できるのでゲルを読み違えることはないだろう。

提案された３レーン系はヌクレオチド鎮の塩基配列を決定する唯一の３レーン系ではないことに気かつ（かも知れない。先に述べたように、マクサムおよびギルバートは３レーン（各し一ンは４種のヌクレオチド部位の第１、第２または第３の切断部位を含む）が必要な情報を指供するであろうと認めた。゛同様に、３組の２種の停止部位または３組の３種の停止部位はそれぞれ各ヌクレオチド部位についてゲルを横切る特異なバンド・ξターンを与えるだろう。ｌ−かしながら、本発明の主題である独特のバンドパターンは唯一無比のバンドパターンであって、３レーンのうちの１つ（すなわち中央レーン）は隣接レーンのバンドの有無が直接対比されるはしご状のそれぞれの段を含む。

また、このシステムはどのヌクレオチドを第１、第２、第３および第４ヌクレオチドと考えるかにかかわりなく塩基配列の決定を与える。それ故に、鎖伸長法では３バンドパターンを与えるゲル塗布層ヌクレオチド鎖混合物をどのように組合せてもよ℃・。

本発明の好適な面によれば、電気泳動ゲル上を並列レーンで泳動する３つのヌクレオチビ鎖混合物は、別々の反応（各反応は異なる特定のヌクレオチド位置で終わる鎖フラグメントを生成する）から得られる４つのヌクレオチド鎖試料のアリコートを適切に混合することによって用意される。中央レーンとして泳動される混合物は４つの試料（各試料は異なるヌクレオチド位置で終止したヌクレオチド鎖を含む）の各々のアリコートを混合することにより得られる。隣接レーンとして泳動される混合物は選択された第１試料と第２試料からのアリコートを混合するか、または選択された第１試料と第３試料からのアリコートを混合することにより得られる。

４つの別個の反応試料（それぞれは異なる特定のヌクレオチド８位置を表わす）を混合してゲル塗布用混合物を調製することの重要な利点は、それぞれのゲル塗布用混合物に反応試料の類似したアリコートを加える（そしてその混合物を適当に希釈して等しい容量となす）ことによって、それぞれの隣接レーンのバンドの強さが中央レーンのバンドの強さと実質的に同じになるということである。しばしばヌクレオチド鎖の電気泳動ゲルはゲルを見分けすらい状態にして誤読の原因となり得る“ゴースト”バンドによって悩まされる。真のバンドの強さが３つのレーンのどの位置においても実質的に同じになるように各試料のアリコートを混合することによって、ゴーストバンドは考慮すべき対象から一般に排除される。

例えば、ゴーストバンドが真のバンドの強さの約２０％以下であると仮定すると、走査装置は中央レーンのバンドの強さの８０％以上の強さをもつ隣接レーンバンドを受け入れ、中央レーンの対応バンドの強さの２０％以下の強さをもつ隣接レーンバンドを無視し、そして中央レーンの対応バンドの強さの２０％〜８０チの範囲にある強さをもつバンドの決定をどれも保留するようにプログラミングされる。

特定のヌクレオチド位置で終わるヌクレオチド鎖を含む４つの別々の試料の混合物を用意することが望ましいので、鎖切断法または鎖断片化法よりも知伸長停止法の方が好適である。今日の方法による鎖切断法に対する実際上の制限は、４つのそれぞれのヌクレオチド位置で効率よくしかも選択的に切断するための反応混合物の全必要量が存在しないということである。むしろ、現在知られている切断塩基配列決定法は、４種のヌクレオチド位置のあるヌクレオチドでまたは４種のヌクレオチド位置のある１対のヌクレオチドで選択的に切断する反応の組合せそれらの反応は一般にその対の各ヌクレオチドの位置で等しく切断しない。゛それにもかかわらず、既知の反応試料を適切に混合することによって、鎖切断法は３レーンパターンで泳動するよ５に適応させることができ、完全に段差のついた中央レーンと隣接レーンとを直接比較するという利点を与える。４つの位置のそれぞれで選択的に切断する反応方法が開発されるとき、等しいバンド９強度の利点が４つの別々の切断反応からのアリコートの混合物を使用することによって３バンドパターンゲルに与えられるであろう。

本発明の改良点は一般に特定のヌクレオチドで終わる鎖フラグメントの生成に基づ（ＤＮＡ塩基配列決定法に応用される。

本発明の改良点は主として上記のサンガーら、マートとスミスおよびマクサムとギルバートの方法の改良点に関してここで説明される。しかしながら、その改良点は対応する３バンドパターンが生ずる他の技術または上記方法の変法にも応用できると理解されるべきである。

本発明の１つの実施態様は、プライマーとして直接近傍にアニールされた制限フラグメント銭を用いて、ＤＮＡポリメラーゼにより一本鎖標的配列の放射性相補コピーを合成することを伴う。４つの別個の反応混合物はそれぞれ４種のデオキシヌクレオシド二リン酸（ａＮＴＰ）（そのうちの少なくとも１種はα位が３２ｐまたは３５３で標識されている）を含有し、そして各混合物はポリメラーゼの基質として役立つがその後の鎖伸長を停止させる４種類の対応するａａＮＴＰまたは他のヌクレオチド類似体のうちの１種をさらに含有する。これらの反応混合物はそれぞれ、全てが共通の５′末端をもつが、特定のヌクレオチド（それとａａＮＴＰとが対応する）が存在するそれぞれの位置で終わる３′末端をもつオリゴヌクレオチドの混合物を生成する。電気泳動用の混合物は適当な反応試料の等しいアリコートを混合することによって調製される。中央レーンの混合物は４つの反応試料のそれぞれからの等しいアリコートを混合することにより、ゲル塗布用に調製される。隣接レーンの混合物は選択された第１および第２反応試料、ならびに選択された第１および第３反応試料の等しいアリコートを希釈剤の２倍アリコートと混合して中央レーンの混合物の容量と等しくすることにより調製される。これらの３つのヌクレオチド鎖混合物のそれぞれの等しいアリコートはゲル電気泳動上で並列に泳動され、本発明の３バンドパターンが見られる。

本発明の別の実施態様では、４つの別個の反応において５′３２ｐ−標識二本鎖ＤＮＡ７ラグメントがＤＮＡポリメラーゼＩおよび膵臓ＤＮＡａｓｅｌの存在下でインキュイードされる。各反応混合物は４種類すべてのａＮＴＰ　と４種類の対応する（１（ＩＮＴＰのうち１種（または他の鎖伸長停止用ヌクレオチド類似体）とを含有する。

膵臓ＤＮＡａｅｅｌはニックを導入し、その３′ヒドロキシル基はＤＮＡポリメラーゼ■の開始点として役立つ。その後、鎖伸長反応があらゆるニックの３′末端から進行し、そしてそれぞれの反応において塩基特異的鎖伸長停止へと導かれる。この反応の生成物は３レーンの変性ポリアクリルアミドゲル板上で分ニツキングおよびその後の鎖伸長は側鎖において起こるが、一方だけが標識されるのでその鎖のみに放射性バンドパターンが現われ、それによりその塩基配列を推定することが可能である。ＤＮＡａｓｅｌによるフラグメントのニラキングはその長さに沿ってあらゆる残基で起こるわけではないが、デオキシ−およびジデオキシ −ＮＴＰの両方がそれぞれの反応に存在するという事実は、鎖伸長がニックの部位から同一塩基の数個の残基にわたって連続するということを確実にする。それ故にその配列の蔦らゆる残基はバンドを生じさせる。上記のように混合された４つの反応試料のアリコートを用いることにより、本発明の３ノＺ／ドパターンがゲル電気泳動上で見られる。

上記の鎖伸長法のそれぞれにおいて、３レーン用のフラグメント混合物は別法で調製されるということが理解される。例え　、ばどちらの場合にも、３つの反応混合物（１つは４種類すべてのｄｄＮＴＰを含み、他の２つは第１および第２のａａＮＴＰ。

ならびに第１および第３のａａＮＴＰを含む）は直接ゲル上で電気泳動される。

この方法の変法は反応混合物の数を減らすが、レーンからレーンに均一のバンド強度が得られないので好ましくない。

本発明の別の実施態様では、フラグメントが鎖伸長法ではなく鎖切断法によって作られる。この塩基配列決定法は次の通りである。二本鎖ＤＮＡは一般にそれより長いＤＮＡ鎖を制限酵素で切断することにより得られる。塩基配列決定のために、その鎖は約５００ヌクレオチドまたはそれ以下の長さに切断されるべきである。次に、切断鎖はその３′末端または５′末端を、一般には３２ｐ　を含むリン酸基のような放射性標識で標識する。

これは二重標識された二本１ＤＮＡをもたらす。この時点で、この分子は変性され、そしてその後の塩基配列決定のためにヘイワード”　（Ｈａｙｗａｒｄ、　Ｇ、　Ｓ、　）、　ＶｉｒｏｌＯｇ７＋　４９．　３４２〜３４４（１９７２）に記載の方法に従ってゲル上で分離される。この技術は２本の相補的な標識一本領をもたらすので、両方の塩基配列を決定して他方の塩基配列決定について確かめることができる。

また、その鎖を単一部位で切断する制限酵素によりさらに切断して異なる大きさのフラグメントを生成させ、この２つのフラグメントをポリアクリルアミドゲル上で分離し、それぞれのフラグメントをその後の塩基配列決定のために変性する。この手法は非標識相補鎖部分の７ラグメントが検出されないので、変性された一本鎖の分離を必要としない。

その後、標識された一本鎖ＤＮＡは断片化反応のためのアリコートに分けられる。断片化反応の条件は、その鎖が平均して、それぞれの反応混合物が特異的に反応する塩基を含むヌクレオチド位置で１回ランダムに断片化されるように調整される。℃・くつかの好適な反応はマクブムとギルバートの上記文献に記載されている。

グアニンおよびアデニン位置はこれらのプリンをジメチル硫酸でメチル化し、次いで加熱することによって特異的に切断される。ＡおよびＣ位置での相対的な切断の程度は反応混合物の酸性度のような反応条件に関係し、反応条件はＡおよびＣ位置の切断を一般に等しくするように適切に調整される。ジェトキシピロカルボネートを用いるＡおよびＧの別の切断法はクレイエフ　（Ｋｒａｙｅｖ、Ａ、　Ｓ、　）　、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１３０　＋　１９〜２２に記載されている。

ＣおよびＴの特異的切断はヒドラジンとの反応によってその塩基を切断し、その後ピロ　１ＪジンでそのＤＮＡ鎖を切断することにより行われる。

ＡおよびＣ位置に特異的な切断はこれらの塩基を強アルカリで破壊し、次にビイリジンでそのＤＩ’ＪＡ鎖を切断することにより行われる。

ゲル混合物を調製するためＫ、異なる塩基対、例えばＩ）　Ａ＋Ｇ　、　１７）　Ａ＋Ｃ、および］１）Ｃ−）−Ｔを切断する３つの反応混合物が使用される。

鎖切断の後、混合物Ｉおよび■の切断生成物の一部を一緒に混合して完全に段差がついた中央レーンとして泳動させ、一方■および■の切断生成物は左側および右側レーンとして泳動させる。この方法は現在利用可能な、よ（解明された反応手法の修飾を何ら必要としない。

ヌクレオチド鎖フラグメントが上記方法のいずれかによって生成された後、適切に混合された反応試料を電気泳動ゲルの別々のウェル（凹部）（中央ウェルはすべての断片化段階を表わすヌクレオチビ鎖７ラダメントを含む）に適用し、そして慣用方法でゲル泳動させる。続いて、そのゲルはバンドの線状整列を維持しやすい方法で凍結または乾燥させる。もしも標識が慣例通りに放射性標識である場合に、そのバンドはオ、７トラジオグラフイーによって視覚化される。末端ヌクレオチドが他の手段で標識される場合には、バンドはそれにふされしい方法で視覚化されるだろう。

上記の塩基配列決定法のすべては、決定され得るヌクレオチド鎖の部分に関して制限を有する。それぞれの方法は１つの共通の末端をもつが、鎖伸長停止または鎖切断の位置に応じて、その共通末端からいろいろな隔たりで終わる標識鎖フラグメントを利用する。一般に、塩基配列は共通の末端からすぐに出発して解読されず、むしろそれに近接したヌクレオチドから出発して解読される（第１の解読可能なヌクレオチドは議論のために″１番目”のヌクレオチドであると見なされるだろう）。そこから０番目までのヌクレオチド’（ｎは１番目のヌクレオチドから数える）がゲル上に現われて読み取り可能である。使用される技術に応じてＤは最大約５００である。長いヌクレオチド鎖の塩基配列はいくつかの個々の塩基配列決定実験の複合体として決定されねばならな（・。

本発明は３レーンバンドパターンとして説明されるが、かなりの鎖長のヌクレオチドの塩基配列決定は一般に１群３レーンの電気泳動ゲルを多数使用することにより達成される。一般的にゲル」二のバンドの間隔は変化し、最初に泳動する比較的短いフラグメントはその間隔が遠（に離れており、そして最後に泳動する長いフラグメントはその間隔がともに接近している。より均一な間隔でもってゲルのすべての部分をはっきりと読み取るだめに、３つの混合物は時間をずらして各群のレーンのゲルに塗布される。初めに塗布された組の３レーンは今やその間隔が十分遠くに離れた長いフラグメントの塩基配列を読み取るのに有用であり、− 力抜から塗布された組の３レーンは速やかに離れて泳動する短いフラグメントの塩基配列を読み取るために使用される。

内部チェックを構じる手段として、本発明はまた５レーンバンビパターン（それによって２つの独立した３レーンバンドパターンの評価がなされる）の使用を包含する。５レーンバンドパターンでは、２番目と４番目のレーンが完全に段差をつげられる。残りの３つのレーンはそれぞれ異なる対のヌクレオチド位置での鎖伸長停止を示す。例えばレーン１はＡとＧでの鎖伸長停止を示し、レーン３はＡとＣでの鎖伸長停止を示し、そしてレーン５はＣとＴでの停止を示す。電気泳動および視覚化の後、ヌクレオチド配列は初めにレーン１および３をレーン２と比較することによって解読され、次に独立してレーン３および５をレーン４と比較することによって解読される。

このバンドパターンは先に述べたように手動で解読され、しかもバンドパターンは誤りを減らすように解読や判読が単純化されている。しかしながら、このシステムの主な利点は自動コンピュータを備えた走査装置を使ってオートラジオグラフを解読するときに生じる。走査装置はバンドの中央を調べて中央レーンのそれぞれの連続する段状バンドを検出するようにプログラミングされる。その装置がバント９を検出した後、それはバンドのヘリ、すなわち左側のヘリを走査し、次に同じ方向で所定の横方向距離へ走査し始める。それは隣接レーンにバンドが検出されるかどうかを認識し、その後コンピュータによって指示レーンの片側に沿ったレーンのバンドの有無が検出され、記録される。片側の読み取りを完了した後、この方法は反対側すなわち右側と対して繰り返される。両方の隣接レーンからのデータを解読および記録した後、関連コンピュータ装置がデータを判読し、そしてヌクレオチド配列を送り出す。

ゲル解読用のコンピュータを備えた走査装置は、明らかな人工産物を排除するのに十分な技術の複雑化を備えているべきである。例えば、バンド間のレーンの間隔は一般にバックグラウンド（例えばレーン間の、レーンに沿った横方向領域）よりも暗いであろう。このようなレーンのわずかなぼけは、レーンの暗さに応じてバンドの有無を決定し得る走査コンピュータ装置により排除されるべきである。また、それはいろいろなバックグラウンドの暗さに調整可能であるべきである。例えば、もしもそれがいずれか一方の隣接ｌノーンの実質的に全部の位置で″ バンド″を検出したならば、暗いバックグラウンドを適当に調整してそのレーンを再度解読すべきである。

本発明は今や特定の実施例によりさらに詳しく説明されるで本発明方法を試験するために、塩基配列がすでに知られている一重鎖ＤＮＡ７アージＭ１３ｍｐ１９の塩基配列を決定しまた。

一本領ＤＮＡは共通のプライマ＝（バイオラブズ社１ｍ１３プライマー１７　ｍａｒ）にアニールされ、そしてそのプライマーはり伸長させた。それぞれの場合において、ａＡＴＰはα３５Ｓ訪導体として使用された。塩基特異的反応混合物の組成は下記の表Ｉに示す。

表　１混合物１（Ａ）混合物２（Ｇ）混合物３（Ｃ）混合物４α）ａＣＴＰ　３３μＭ　３３μＭ　１．６μＭ　３３μＭａＧＴＰ　３３μＭ１．６μＭ　３３μＭ　３３μＭＴＴＰ　３３μＭ　３３μＭ　３３μＭ　１．６μＭａａＡＴＰ　６．２μＭａａＣＴＰ　１２．５μＭａａＧＴＰ　□、１ｍＭａＴＴＰ　０．４ｍＭ各混合物はまた７ｍＭ）リス−Ｈ（Ｊ（ｐ）（＝　７．５　）、７ｍＭＩＡｇＣ１２，５Ｑ　ｍＭ　ＮａＣｌ、　５　ｍＭ　：）チオチンドールを含んでいた。

３７℃で１５分間インキュベーション後、１００μＭずつのａＡ、ａＧ、ａＣ，ａＴを含むチェース溶液ｌμｌを加え、インキュベーションを室温でさらに１５分間続げた。この反応は１０％ＸＣＦ’Ｆ’　を含む脱イオン化ホルムアミド５ μｌを加えることにより停止した。

各混合物からのアリコートは表■に示すように５つの並列つエルに装填するために調製された。

表　■ ウェル１　ウェル２　ウェル３　ウェル４　ウェル５混合物１　１ｐｌ　１μｌ！１μｌ　１ｐｌ混合物２　１μｌ　１μｌ　ｌμ！混合物３　１μ１１μｌ　１μｌ　ｌμ！混合物４　１μｌ　１μ！　１μｌこの混合物は１００℃で２分間熱変性し、電気泳動用の６チアクリルアミトゲルにそれぞれ１μｌずつ塗布した。

ゲルは０．３圏ワツトマン３脳クロマトグラフイーバーバーによって分離された３０鋼および５０ｃｍのガラス板の間でゲル化した。装填用ウェルは幅が５咽であり、シャークトゥース・コーム（５ｈａｒｋｔｏｏｔｈ　ｃｏｍｂ）によって形成された。アクリルアミドゲル溶液は６％アクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＃１９：１）および４６０９／ＩＩ　の尿素を含んでいた。

アクリルアミドゲル混合物はｏ５×および２．５×ＴＢＥ（１゜ｘＴＢＥは１１当たり１０８９）リス、５５ｇホウ酸およびｇ、３ｇＥＤＴＡである）を用いて作った。２．５×ゲル混合物はまた１０％ショ楯および５０　ｍ９／１３　のブロモフェノールブルーを含んでいた。ゲル混合物はガス抜きを巳なかった。

アクシルアミドの重合はゲル混合物１ｍＡ’当たり２５％過硫酸アンモニウム１ μｌおよびＮ、ＮＪ’、Ｎ／−テトラメチルエチレンジアミン１μ−４を加えることにより開始された。重合剤の添加の直後に勾配ゲルを流し込んだ。電極タンクの緩衝液は０．５ｘＴＢＥであった。ゲルは色素の前面が３０ｃｍ泳動する。

まで１５００Ｖで泳動した。ガラス板の分離後、ゲルを３１の５チメタノールおよび５％酢酸（容量／容量）中で１５分間固定した。その後ゲルをワットマン３ ■クロマトグラフイーＲ−ノξ−に移し、サランランプで被覆し、頂部１ｏｃｒｎを切り取った。ゲルはゲル乾燥器にて８０℃で２５分間乾がし、サランラップを除き、増感スクリーンを使わずに室温で一晩オートラジオグラフイーをとった。

その後ゲルは次の方法で解読した。それぞれのはしご状のバンドの位置で、レーン１，３および５のバンドの強さを初めにレーン２および４のバンドの強さと比較した。レーン１，３または５のどれかに現われたバンドはいつも、レーン２および４のバンドとほぼ同じ強さをもっていた。

次にバンド１〜３の・ξターンを比較することによって塩基配列を解読し、ヌクレオチド位置の解釈を表■Ａに従って行った。

表ＩＩＡレーン１　レーン２　レーン３その後バンド３〜５のパターンからその塩基配列を再解読し、ヌクレオチド位置の独立した解釈を表■Ｂに従って行った。

」ｕＬジレーン３　レーン４　レーン５この方法を続けて行うことにより、ＤＮＡのヌクレオチド位置は初めにバンド１〜３から、次にバンド３〜５から得られたそれぞれの組のバンドから得られた塩基配列は互いに完全に一致し、また発表された塩基配列とも一致した。解読は簡単であって、しかも疑う余地がなかった。

本発明はある特定の好ましい実施態様について説明してきたが、当分野で通常の知識を有する者にとって明らかな修飾が本発明の範囲を逸脱することなくなし得るであろう。例えば、本発明はＤＮＡヌクレオチド配列の解読に関して説明され例示されたが、ここに記載の３バンドパターンはＲＮＡの塩基配列決定にも同様に応用できる。ダレツシオ（Ｊ、　Ｍ、　Ｄ’Ａ１ｅｓｓｉｏ）　。

核酸のゲル電気泳動（Ｇｅｌ　Ｅ１ｅｃｔｒｏｐｈｏ？ｅｓｉｓ　ｏｆ　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ）、リツクウｙ　）ｌ’　（Ｒ，Ｒｌｃｋｗｏｏａ　）　＆ホームズ（Ｂ、　Ｄ。

Ｈａｍｅｓ）編集、ＩＲＬプレス、オツクスフオー）”（１９８２）。

ｐ、１７３〜１９７に記載されるような方法によるＲ　Ｎ　Ａの塩基配列決定の明らかな修飾は、完全に段（バンド列）を付けられた中央レーン、第１および第２ヌクレオチド停止を含む左側レーン、ならびに第１および第３ヌクレオチド停止を含む右側レーンを生じさせる。

中央レーンとして電気泳動ゲルを泳動する鎖フラグメント混合物は試験しようとする塩基配列の７ラグメントを含む。しかしながら、完全に段を付けられた中央レーンは適当な長さのヌクレオチド鎖の鎖フラグメントであるか、またはいろいろな長さの合成ポリヌクレオチド鎖の混合物でさえもあり得るだろう。

鎖フラグメント混合物であり得る。

本発明の様々な特徴は次の請求の範囲において説明される。

国際謀査＠久

Claims

【特許請求の範囲】

（１）１番目のヌクレオチドからｎ番目のヌクレオチドまでのヌクレオチド鎖の一部の塩基配列決定法であって、標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第１混合物を調製し、ここで該標識鎖はそれぞれ上記の１番目のヌクレオチドに近接した共通の末端から伸長して、上記の１番目のヌクレオチドから上記のｎ番目のヌクレオチドまでの範囲にある１つのヌクレオチド位置まで伸長しており、そして上記の第１混合物は１番目のヌクレオチドで終わるものからｎ番目のヌクレオチドで終わるものまでのあらゆる鎖長の標識フラグメントを含み；標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第２混合物を調製し、ここで該標識鎖フラグメントは上記の共通末端から伸長して、４種のヌクレオチドのうち第１のものが存在するところおよび４種のヌクレオチドのうち第２のものが存在するところの１番目のヌクレオチドからｎ番目のヌクレオチドまでのそれぞれの位置で終わり；標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第３混合物を調製し、ここで該標識鎖フラグメントは上記の共通末端から伸長して、上記の第１ヌクレオチドが存在するところおよび４種のヌクレオチドのうち第３のものが存在するところの１番目のヌクレオチドからｎ番目のヌクレオチドまでのそれぞれの位置で終わり；上記のフラグメント混合物をそれらの鎖長に応じてフラグメントを分離するゲル上で電気泳動にかけ、その際上記フラグメントをゲルに塗布して並列レーンで泳動させ；上記ゲル上の標識ヌクレオチドフラグメントのバンドを視覚化し；そしてレーンに対して直角の方向でバンドパターンに従ってヌクレオチド配列を解読する；ことから成る塩基配列決定法。
（２）上記のヌクレオチド鎖フラグメントは、鋳型として使用される一本鎖ヌクレオチドを得；該一本鎖鋳型ヌクレオチドを二本鎖プライマーにアニールし；そしてポリメラーゼ、４種のヌクレオチド、および４種のヌクレオチドの１種に対応して上記ポリメラーゼの基質として作用するが取り込まれた位置で鎖伸長を停止させる選択された類似体を含む混合物により上記鋳型ヌクレオチドの相補的コピーを作製する；ことによって複数の反応で作られる、請求の範囲第１項記載の方法。
（３）上記混合物はそれぞれ視覚化のために標識された少なくとも１種のヌクレオチドを含む、請求の範囲第２項記載の方法。
（４）上記のヌクレオチド鎖フラグメントは、二本鎖ヌクレオチドを得；該二本頭ヌクレオチドの一方の５′末端を標識し；そして該標識ヌクレオチド鎖を複数の反応混合物中でニツクトランスレーシヨンに付す；ことによって作り、それぞれの反応混合物がニツクトランスレーシヨン用酵素、４種のヌクレオチド、および４種のヌクレオチドの１種に対応して上記ポリメラーゼの基質として作用するが取り込まれた位置で鎖伸長を停止させる選択された類似体を含有する、請求の範囲第１項記載の方法。
（５）鎖フラグメントの上記混合物は、一本鎖ヌクレオチドを一端で標識し、そして複数の反応混合物中で該標識鎖のアリコートを４種のヌクレオチドのうち特定のヌクレオチドで各鎖あたり平均して１回断片化する条件下に該標識鎖を断片化することによって得られる、請求の範囲第１項記載の方法。
（６）上記の第１混合物は中央レーンとして泳動させる、請求の範囲第１項記載の方法。
（７）４種のヌクレオチドの相異なる１種の位置で終わる標識ヌクレオチド鎖フラグメントを含む４つの試料を作り、その４つの試料のアリコートから上記の第１、第２および第３混合物を調製する、請求の範囲第１項記載の方法。
（８）１番目のヌクレオチドからｎ番目のヌクレオチドまでのヌクレオチド鎖の塩基配列決定システムであって、標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第１混合物を調製する手段であって、各標識鎖が１番目のヌクレオチドに近接した共通の末端から伸長して、１番目のヌクレオチドからｎ番目のヌクレオチドまでの範囲の１つのヌクレオチド位置まで伸長しており、そして上記の第１混合物が１番目のヌクレオチドで終わるものからｎ番目のヌクレオチドで終わるものまでのあらゆる鎖長の標識フラグメントを含む上記の手段；標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第２混合物を調製する手段であって、該標識鎖フラグメントが上記の共通末端から伸長して、４種のヌクレオチドのうち第１のものが存在するところおよび４種のヌクレオチドのうち第２のものが存在するところの１番目のヌクレオチドからｎ番目のヌクレオチドまでのそれそれの位置で終わる上記の手段；標識ヌクレオチド鎖フラグメントの第３混合物を調製する手段であって、該標識鎖フラグメントが上記の共通末端から伸長して、上記の第１ヌクレオチドが存在するところおよび４種のヌクレオチドのうち第３のものが存在するところの１番目のヌクレオチドからｎ番目のヌクレオチドまでのそれぞれの位置で終わる上記の手段；上記のヌクレオチド鎖フラグメントをそれらの鎖長に応じてレーンごとに分離するゲル電気泳動手段；上記の鎖フラグメントの３つの混合物を３つの並列レーンで上記のゲル電気泳動手段に塗布するアプリケーター手段；標識フラグメントの存在により上記レーンのそれぞれのバンドを視覚化するりポーター手段；上記レーンのそれぞれにおいて視覚化されたバンドの位置を検出する光学走査手段；および走査されたバンドパターンに従ってヌクレオチド鎖配列を判読するコンピュータ手段；から成る塩基配列決定システム。
（９）上記の走査手段はプログラミング可能な関連手段を有し、それにより走査手段は初めに第１混合物を含むレーンの名バンドの位置で第２混合物を含むレーンのバンドの有無を検出して、この情報を上記のコンピュータ手段に送り、次いで走査手段は第１混合物を含むレーンの各バンドの位置で第３混合物を含むレーンのバンドの有無を検出して、この情報を上記のコンピュータ手段に送り、上記のコンピュータ手段はその情報を相互に関連づけてヌクレオチド配列を判読すべくプログラミングされる、請求の範囲第８項記載のシステム。