JP2002506347A

JP2002506347A - シラン化固相表面への非修飾核酸の付着

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Publication number: JP2002506347A
Application number: JP50294099A
Authority: JP
Inventors: シ，ジュファン; ボイス−ジャチノ，マイケル・ティ
Original assignee: オーキッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-06-05
Publication date: 2002-02-26
Also published as: US6387626B1; US6136962A; US5919626A; WO1998055593A1; EP0996705A4; AU7726098A; EP0996705A1; AU739412B2; CA2292896A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、固相支持体へ合成核酸分子を固定化するための簡単で低コストな方法を提供する。本発明はさらに、スクリーニング応用のための核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、ハイブリダイゼーションによる配列決定、および遺伝子分析および核酸またはタンパク質が関与するコンビナトリアル分析における該固定化分子の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称：シラン化固相表面への非修飾核酸の付着発明の技術分野：本発明は、核酸分子を固相支持体に簡単かつ、好ましくは低コストで固定化する方法に関する。本発明はさらに、かかる固定化分子の、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイによる配列決定、およびスクリーニングに適用するための核酸またはタンパク質が関与する遺伝子分析またはコンビナトリアル分析への使用に関する。発明の背景：核酸分子の構造、構成および配列の分析は、ヒトおよび動物の疾患の予測、診断および治療において、法医学において、疫学および公衆衛生において、および遺伝子発現および成長を制御する因子の解明においてすこぶる重要である。核酸を固定化する方法は、しばしば、これらのタイプの分析において重要である。特に重要な３つの分野は、ハイブリダイゼーションアッセイ、核酸配列決定およびゲノム多型の分析を含む。１．核酸ハイブリダイゼーション核酸「プローブ」分子が相補的な核酸「標的」分子にハイブリダイズ（すなわち、塩基対形成）できることは、広範な診断および治療手順の基礎を形成している。ハィブリダイゼーションアッセイは分子生物学および医学において広く用いられている。かかるハイブリダイゼーション反応を行う方法は、たとえば、Sambro ok,J.ら（Molecular Cloning,A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）中）、Haymes,B.D.ら（Nucleic Acid Hybridization,A Practica l Approach 、ＩＲＬプレス、ワシントンＤＣ（１９８５）中）およびKeller,G.H .およびManak,M.M.（DNA Probes 、第２版、ストックトン・プレス、ニューヨーク、ニューヨーク（１９９３）中）（これら文献を参照のため本明細書中に引用する）に開示されている。多くのハイブリダイゼーションアッセイは一つの成分の固定化を必要とする。 Nagataらは、未知量のクローニングＤＮＡを０.１ＭＭｇＣｌ₂の存在下でマイクロタイターウエルに結合させることを含むＤＮＡの定量法を記載した（Nagata ら、FEBS Letters 183:379〜382(1985)）。ついで、相補的なビオチン化プローブを各ウエル中のＤＮＡとハイブリダイズさせ、結合したプローブを比色分析により測定した。Dahlen,P.らは、ウエルに吸着させたクローニング捕捉ＤＮＡを用いたマイクロタイターウエル中でのサンドイッチハイブリダイゼーションを検討している(Dahlenら、Mol.Cell.Probes 1:159〜168(1987)）。ＰＣＲ増幅およびマイクロタイターウエル中での捕捉ハイブリダイゼーションを用いたＨＩＶ− １ＤＮＡの検出アッセイもまた検討されている（Keller,G.H.ら、J.Clin.Micro biol .29:638〜641,1991）。ＮａＣｌを媒体としたオリゴマーのポリスチレンウエルへの結合がCrosら（フランス特許第２，６６３，０４０号）および極最近、 Nikiforovら（PCR Methods Applic.3:285〜291,1994）により検討されている。陽イオン性界面活性剤を媒体としたオリゴマーのポリスチレンウエルへの結合が Nikiforovらにより記載されている（Nucleic Acids Res.22:4167〜4175）。 II．単一ヌクレオチドＤＮＡ多型の分析多くの遺伝病および特質（trait）（すなわち、血友病、鎌形赤血球貧血、嚢胞性繊維症など）は、種の幾つかの成員のゲノムに変異または進化により生じた突然変異の結果を反映している（Gusella,J.F.,Ann.Rev.Biochem.55:831〜854(1 986)）。幾つかの場合には、かかる多型は疾患または特質に関与する遺伝子ローカスと連鎖しており、他の場合には、多型は健康状態の確定的な特性である。そのような単一ヌクレオチド多型は、ヌクレオチドのジヌクレオチドまたはトリヌクレオチド繰り返しモチーフの自然タンデム重複により生じる可変ヌクレオチドタイプ多型（variable nucleotide type polymorphisms）（「ＶＮＴＲ」） (Weber,J.L.、米国特許第５,０７５,２１７号、Armour,J.A.L.ら、FEBS Lett.30 7 :113〜115(1992)、Jones,L.ら、Eur.J.Haematol.39:144〜147(1987)、Horn,G.T .ら、ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／１４００３号、Jeffreys,A.J.、米国特許第５,１７５,０８２号、Jeffreysら、Amer.J.Hum.Genet.39:11〜24(1986)；Je ffreysら、Nature 316:76〜79(1985)、Grey,I.C.ら、Proc.R.Acad.Soc.Lond.243 :241〜253(1991)、Moore,S.S.ら、Genomics 10:654〜660(1991)、Jeffreysら、A nim.Genet .18:1〜15(1987)、Hillel,J.ら、Anim.Genet.20:145〜155(1989)、Hil lelら、Genet.124:783〜789(1990)）とも、制限エンドヌクレアーゼ開裂により生成する断片の長さを変える変異を含む制限断片長多型（「ＲＦＬＰ」）（Gras sberg,J.、英国特許出願第２１３５７７４号、Skolnick,M.H.ら、Cytogen.Cell Genet .32:58〜67(1982)、Bostein,D.ら、Ann.J.Hum.Genet.32:314〜331(1980)、 Fischer，S.G.ら（ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１３６６８号）、Uhlen,M.、ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１１３６９号）とも有意に異なる。単一ヌクレオチド多型は不変配列の領域にフランキングされた変異部位からなるので、その分析には該変異部位に存在する単一ヌクレオチドの同定以上のことを必要とせず、各患者について完全な遺伝子配列を決定する必要はない。かかる単一ヌクレオチド多型の分析を容易にするために幾つかの方法が開発されている。たとえば、Mundy,C.R.（米国特許第４,６５６,１２７号）は、特別のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体を用いた特定の多型部位に存在するヌクレオチドの同定法を検討している。多型部位のすぐ３'側のアレル配列に相補的なプライマーを、特定の動物またはヒトから得られた標的分子にハイブリダイズさせる。標的分子上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含んでいる場合には、該誘導体はハイブリダイズしたプライマーの末端に導入されるであろう。かかる導入は該プライマーにエキソヌクレアーゼに対する耐性をもたらし、そのためにその検出が可能となる。試料中のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の同定法は知られているので、プライマーがエキソヌクレアーゼに対して耐性になったという知見は標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドが該反応に用いたヌクレオチド誘導体に相補的であることを明らかにするものである。Mundyの方法は、多数の無関係な配列データの決定を必要としないという利点を有する。該方法は、増幅した標的配列および非修飾プライマーの破壊という欠点および使用した特別のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドのポリメラーゼ導入速度に極めて敏感であるという欠点を有する。 Cohen,D.ら（フランス特許第２,６５０,８４０号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）は、多型部位のヌクレオチドの同定のための溶液ベースの方法を検討している。米国特許第４,６５６,１２７号のMundy法と同様に、多型部位のすぐ３'側のアレル配列に相補的なプライマーを用いる。この方法では、標識ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いて該部位のヌクレオチドを同定するが、該誘導体は多型部位のヌクレオチドに相補的であれば該プライマーの末端に導入されるであろう。ジェネティックビット分析（Genetic Bit Analysis^TM）法またはGBA^TM法がGoe let,P.らにより記載されている（ＰＣＴ出願第９２／１５７１２号）。Goelet,P .らの方法では、標識ターミネーターと多型部位の３'側配列に相補的なプライマーとの混合物を用いる。導入された標識ターミネーターは、評価しようとする標的分子の多型部位中に存在するヌクレオチドにより決定され、該ヌクレオチドに相補的である。Cohenらの方法（フランス特許第２,６５０,８４０号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）とは対照的に、Goelet,P.らの方法はプライマーあるいは標的分子が固相に固定化された不均一相アッセイであるのが好ましい。それゆえ、この方法はCohenにより検討された方法に比べて実行が容易であり、一層正確である。 Cheesman,P.（米国特許第５,３０２,５０９号）は、蛍光標識した３'保護ヌクレオチド三リン酸を用いて一本鎖ＤＮＡ分子の配列を決定する方法を記載している。液体試料中のＤＮＡ分子の分離、濃縮および検出のための装置が最近、Ritt erbandらにより記載されている（ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／１７６７６号）。別のアプローチである「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ」（「ＯＬＡ」）（Landegren,U.ら、Science 241:1077〜1080(1988)）もまた、単一ヌクレオチド多型を検出しうると記載されている。ＯＬＡプロトコールでは、標的一本鎖の隣接配列にハイブリダイズしうるように設計した２つのオリゴヌクレオチドを用いる。これらオリゴヌクレオチドの一方はビオチン化してあり、他方は検出可能なように標識してある。標的分子中に正確な相補的配列が見出された場合には、これらオリゴヌクレオチドはその末端が隣接しライゲーション基質を生成するようにハイブリダイズするであろう。ついで、ライゲーションはアビジンまたは他のビオチンリガンドを用いて標識オリゴヌクレオチドを回収することを可能にする。Nickerson,D.A.らは、ＰＣＲとＯＬＡとの特性を組み合わせた核酸検出アッセイを記載している（Nickerson,D.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 87:8923〜8927(1990)）。この方法では、ＰＣＲを用いて標的ＤＮＡの対数的増幅を達成し、ついで該標的ＤＮＡをＯＬＡを用いて検出する。複数かつ別々の処理工程が必要であることに加えて、かかる組み合わせに付随する一つの問題は、それがＰＣＲおよびＯＬＡに付随する全ての問題を継承していることである。最近、ＤＮＡ中の多型部位をアッセイするための幾つかのプライマー先導ヌクレオチド導入法が記載されている（Komher,J.S.ら、Nucl.Acids Res. 17:7779〜 7784(1989);Sokolov,B.P.、Nucl.Acids Res. 18:3671(1990);Syvanen,A.-C.ら、Genomics 8:684〜692(1990);Kuppuswamy,M.N.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 88 :1143〜1147(1991);Prezant,T.R.ら、Hum.Mutat. 1:159〜164(1992);Ugozzoli,L .ら、GATA 9:107〜112(1992);Nyren,P.ら、Anal.Biochem. 208:171〜175(1993) ）。これら方法はすべて、多型部位の塩基を識別するために標識デオキシヌクレオチドを導入することに拠っている点でＧＢＡ^TMとは異なる。かかるフォーマットにおいて、シグナルは導入されたデオキシヌクレオチドの数に比例するので、同じヌクレオチドのラン（runs）で生じる多型はランの長さに比例するシグナルという結果となりうる（Syvanen,A.-C.ら、Amer.J.Hum.Genet. 52:46〜59(1993) ）。かかる所定範囲の遺伝子座特異的シグナルは、とりわけヘテロ接合体の場合、ＧＢＡ^TM法によって生成される単純な３成分（２０、１１または０２）クラスのシグナルに比べて解釈が一層困難でありうる。さらに、ある種の遺伝子座においては、正しいジデオキシヌクレオチドの存在下でさえも正しくないデオキシヌクレオチドの導入が起こりうる（Komher,J.S.ら、Nucl.Acids Res. 17:7779 〜7784(1989)）。かかるデオキシヌクレオチドの誤導入は、幾つかの配列の状況ではミスペアしたデオキシ−基質に対するＤＮＡポリメラーゼのＫｍが、正しく塩基対形成したジデオキシ−基質の比較的小さなＫｍに匹敵することによる（Kornberg ,A.ら、DNA Replication、第２版(1992)、フリーマン・アンド・カンパニー、ニューヨーク中;Tabor,S.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 86:4076〜4080(1989)）。この効果は、多型部位の解明（interrogation）においてバックグラウンドノイズに貢献する。 III．固相への核酸の固定化法上記方法の幾つかには、１またはそれ以上の核酸反応物を固相支持体に固定化する手順が含まれる。現在、９６−ウエルポリスチレンプレートが固相イムノアッセイにおいて広く用いられており、固相支持体としてプレートを使用する幾つかのＰＣＲ生成物検出法が記載されている。これら方法の大抵の特性として、適当なオリゴヌクレオチドプローブをマイクロタイターウエルに固定化し、ついでハイブリダイゼーションによってＰＣＲ生成物を捕捉し、適当なハプテンを比色検出することが必要とされる。核酸分子をハイブリダイゼーション、配列決定または多型分析に使用する能力が保持され、迅速で、使用が便利で、安価な、オリゴヌクレオチドをポリスチレンに結合させるのに用いることができる改良された固定化法が所望される。本発明は、かかる改良法を提供するものである。巨大分子がポリスチレンおよびガラス表面に非共有結合により結合する手段は充分には理解されていない。それにもかかわらず、これら吸着現象は、イムノアッセイおよび一つの成分を固定化することが必要な他のタイプの診断試験の開発および製造において重要であることがわかっている。ポリスチレンは、通常、親水性基を含んでいないため非常に疎水性の物質である。マイクロタイタープレートの製造業者は、マイクロウエル表面の親水性特性を増大させるために該表面上にかかる基（ヒドロキシル、カルボキシレートおよびその他）を導入する方法を開発している。理論的には、このことは、疎水性および親水性相互作用の組み合わせにより巨大分子を結合させる（Baierら，Scien ce 162 1360-1368(1968),Baierら,J.Biomed.Mater.Res. 18 335-355(1984),Good ら,L.H.Lee（編）Foundations of Adhesion、プレナム、ニューヨーク、第４章（１９８９）中）（図１）。実際には、幾つかのタンパク質は、未処理の物質に比べてかかる処理した親水性ポリスチレンへより効率的に結合する。しかしながら、ポリスチレン、とりわけマイクロタイターウエルへの共有結合は困難であることがわかっており、それゆえ、かかるウエルへの巨大分子の結合には受動的な吸着が依然として最も一般的に用いられている。「ポリスチレン」なる語はまた、スチレン／ジビニルベンゼン、スチレン／ブタジエン、スチレン／ビニルベンジルクロライドその他のスチレン含有コポリマーを記載するのにも用いる。ポリスチレンが有機の疎水性基体であるのに対して、ガラスは無機の親水性表面を提供する。イムノアッセイにおける最も一般的なガラスフォーマットは、顕微鏡のスライドである。実験室グレードのガラスは殆どがＳｉＯ₂からなるが、Ｂ₂Ｏ₃、Ａｌ₂Ｏ₃並びに他の酸化物をも含む（図２）。それゆえ、そのような物質が関与する界面は、所望の不均質な環境を生成するため、または異なる相のバルク特性を均一な組成構造中に導入するために表面が修飾される、化学のダイナミックな領域となっている。本願における本発明者らの目的は、化学的に反応性のメルカプト（ＳＨ）および／またはエポキシで表面を仕立てるためにオルガノシランを用いることである。オリゴヌクレオチドやタンパク質を表面上に付着させるために多くの方法が記載されているが、これら方法は高価であり、また時間のかかるものである。前以て調製したオリゴヌクレオチドを修飾ガラス表面に付着させるためのこれまでに報告されている共有結合法では、常に、表面に対するオリゴヌクレオチドの反応性および選択性を高めるために修飾したオリゴヌクレオチドを用いている。典型的な修飾は、３'および／または５'オリゴヌクレオチドにアミノ基またはチオ基を導入するものである。たとえば、Stimpsonら（P.N.A:S.926379-6383(1995)）は、エポキシシラン化した表面に酸性触媒を用いて３'アミノオリゴヌクレオチドを共有結合することを報告しているが、この発明で達成される密度は１／１０にすぎない。Beattieら（Clin.Chem.41700-706(1995)）は、上昇温度下でのエポキシシラン化表面への３'および／または５'アミノオリゴヌクレオチドの付着を報告している。Lamtureら（Nucleic Acids Res.222121-2125(1994)）は、０.１ＭＫＯＨ下でエポキシシラン化スライドに３'アミノオリゴヌクレオチドを付着させる方法を報告している。これまで、Chriseyら（Nucleic Acids Res．24 303103039(1996)）およびGuoら（Nucleic Acids Res.22 4556-54 65(1994)）によって報告されているように、二官能性架橋試薬を用いて３'または５'チオ修飾またはアミノ修飾オリゴヌクレオチドをアミノプロピルシラン化表面にカップリングさせている。しかしながら、これら報告されている方法はすべて修飾オリゴヌクレオチドを必要とする。本発明は、共有エーテルまたはチオエーテル結合により核酸分子を固相に固定化するための新規な方法を記載するものである。この簡単な２工程法は、ＤＮＡアレイを調製するのに必要な特異性および効率性を有する。発明の要約：本発明は、核酸分子の固相への迅速かつ安価な固定化を可能にする改良固定化法を提供するものである。本発明は、シラン含有またはシラン処理固相とインキュベートすることによりオリゴヌクレオチドの固定化を可能にする。固定化した分子は、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定ハイブリダイゼーションアッセイ、遺伝子分析、核酸またはタンパク質を含むコンビナトリアル分析、およびタンパク質−ＤＮＡ結合アッセイなどの他のスクリーニング応用に用いることができる。詳細には、本発明は、核酸分子を固相に固定化する方法を提供するものであり、該方法は、（Ａ）該固相をシランでコーティングし、該シランコーティング固相をねかせ（ cure）、ついで（Ｂ）末端３'ＯＨかまたは末端５'ＯＨのいずれかを有する非修飾核酸分子を該シランコーティング固相にカップリングさせる工程を含む。本発明は、とりわけ、工程（Ａ）においてシランが３−メルカプトプロピルトリメトキシシランおよび３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランよりなる群から選ばれたものである上記方法の態様に関する。本発明はさらに、遺伝子分析およびタンパク質−ＤＮＡ結合アッセイなどの他のスクリーニング応用において有用なオリゴヌクレオチドコーティング表面に関する。本発明は、エポキシシランまたはメルカプトシランコーティング表面および該エポキシシランまたはメルカプトシランに共有結合した非修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドアレイに関し、そのようなアレイは核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定ハイブリダイゼーションアッセイ、遺伝子分析、核酸またはタンパク質を含むコンビナトリアル分析、およびタンパク質−ＤＮＡ結合アッセイなどの他のスクリーニング応用に有用である。コーティング表面の特性は、シラン表面コーティング上への独特のオリゴヌクレオチドの標準化パターン化を可能にする。本発明はさらに、高密度および様々なアレイフォーマットでの複数のＤＮＡプローブの同時パターン化に関する。発明の詳細な記載：１．核酸分子の固定化本発明は核酸分子の固相上への固定化方法に関する。最近、幾つかの方法がオリゴヌクレオチドを固相支持体に固定化するのに適しているものとして提案されている。たとえば、Holmstrom,K.らは、アビジンおよびストレプトアビジンに対するビオチンの親和性を利用し、ビオチン化核酸分子をアビジン／ストレプトアビジンコーティング支持体に固定化している（Holmstrom,K.ら、Anal.Biochem. 209 :278〜283(1993)）。他の方法は、ポリスチレンまたはガラス固相をポリ−Ｌ −Ｌｙｓまたはポリ−Ｌ−Ｌｙｓ,Ｐｈｅでプレコーティングした後、アミノ− またはスルフヒドリル−のいずれかで修飾したオリゴヌクレオチドを２官能性架橋試薬を用いて共有結合させることを必要とする。本発明とは異なって、両方法ともに修飾オリゴヌクレオチドの使用および固相の前処理を必要とするが、本発明は、「非修飾の」５'−または３'−ＯＨを有するオリゴヌクレオチドを固相表面に共有結合させる方法を開示するものである。本明細書において「非修飾」とは、特別の反応性基の必要性の不在をいう。そのような基を有する、またはビオチン化した、フルオレセイン化した等のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを排除することを意図するものではない。 Kawai,S.らは、短いオリゴヌクレオチドプローブをいっしよにライゲートさせて多量体を生成させ、ついでこれらをファージミドベクター中にライゲートする別法を記載している（Kawai,S.ら、Anal.Biochem. 209:63〜69(1993)）。これらオリゴヌクレオチドをポリスチレンプレート上に固定化し、２５４ｎｍのＵＶ照射により固定する。短い５'−リン酸化プライマーを化学的に修飾したポリスチレンプレート（「Covalink」プレート、Nunc）に直接共有結合させる方法もまたRasmussen,S.R.らにより提唱されている（Anal.Biochem. 198:138〜142(1991) ）。修飾オリゴヌクレオチドと固相表面との間の共有結合は、水溶性カルボジイミドを用いた縮合反応により行う。Rasmussenの方法はオリゴヌクレオチドの５' −リン酸により５'−付着が優先的に起こることを主張しているが、該方法は特別に調製した高価なプレートを必要とする。本発明の方法は、不安定で取り扱いの難しい架橋試薬を必要としないという点でかかる方法とは区別されるものである。 Maskos,U.らは、オリゴヌクレオチドをガラス支持体上に直接合成する方法を記載している(Maskos,U.ら、Nucl.Acids Res. 20:1679〜1684(1992)）。この方法によれば、一次（primary）ヒドロキシル基を有する可撓性リンカーをグリシドキシブロピルシランにより固相支持体に結合させるが、その際、該一次ヒドロキシル基はオリゴヌクレオチド合成の出発点となる。オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を表面上に付着させるための多くの方法が記載されている。前以て調製したオリゴヌクレオチドを修飾ガラス表面に付着させるためのこれまでに報告されている共有結合法では、常に、表面に対するオリゴヌクレオチドの反応性および選択性を高めるために修飾したオリゴヌクレオチドを用いている。典型的な修飾は、エポキシ表面上への３'および／または５' −アミノ修飾オリゴヌクレオチドへのアミノ基またはチオ基の導入が関与する。 Stimpsonら（P.N.A.S.92 6379-6383(1995)）は、自動化ＤＮＡ診断応用に使用するためのＤＮＡチップの生成を開示している。このためにStimpsonの論説は、グリシドキシプロピルシラン処理したガラススライド上の組織化アレイに３'アミノ結合オリゴヌクレオチドを固定化することを開示している。 Lamtureら（Nucleic Acids Res.22 2121-2125(1994)）は、０.１ＭＫＯＨの存在下での３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランコーティングシリコンウエハへの３'アミノ修飾オリゴヌクレオチドの固定化を記載している。オリゴヌクレオチドは、二次的な（secondary）アミン結合により固相支持体に共有結合で固定化される。Beattieら（Clin.Chem.41 700-706(1995)）は、６０℃の温度での３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランコーティングガラススライドへの３'および／または５'アミノ修飾オリゴヌクレオチドの固定化を開示している。さらに、幾つかの他の参照文献が一般に固相支持体へのオリゴヌクレオチドの固定化に関している。Chriseyら（Nucleic Acids Res.24 3031-3039(1996 )）、Guoら（Nucleic Acids Res.22 45456-5465(1994)）、Fahyら(Nucleic Acid s Res.21 1819-1826(1993)）、Sliwkowskiら（Biochem.J.209 731-739(1983)）はすべて、固相支持体への５'または３'修飾オリゴヌクレオチドの固定化を開示している。本発明は、オリゴヌクレオチドアレイ調製のための他の共有結合化学に対して３つの別個の利点をもたらすものである。第一に、上記先行技術文献ではオリゴヌクレオチドをアミノかまたはチオールのいずれかで修飾する必要があるが、本発明は、「非修飾の」５'または３'−ＯＨを有するオリゴヌクレオチドを固相表面に共有結合させる方法を開示するものである。それゆえ、本発明は、「非修飾の」オリゴヌクレオチドの共有結合を可能とする点で固相へのオリゴヌクレオチドの共有結合のための従来法とは異なる。従って、本発明は、従来技術に対して幾つかの有意の改良点を提供する。とりわけ、本発明は、シラン化固相への「非修飾」オリゴヌクレオチドの共有結合のための低コストで安定な方法を提供するものであり、かくして共有結合したオリゴヌクレオチドは核酸またはタンパク質が関与する遺伝子分析やコンビナトリアル分析において広範囲の用途を有する。それゆえ、固相表面へのオリゴヌクレオチドの共有結合はオリゴヌクレオチドの修飾なしに達成され、それによってコストを大きく低減させるとともに修飾オリゴヌクレオチドの品質の変動をなくすことができる。第二に、本発明の方法のシラン化表面は非常に疎水性の表面を提供し、固相表面上の特定の局在した位置にオリゴヌクレオチドプローブの小滴が生成することを可能する。それゆえ、たとえば、ロボットの液体デリバリーシステムやインクジェットプリンティング技術を用い、高いプローブ密度（１０,０００プローブ／ｃｍ²）でもプローブ間で交差汚染することなく表面上に複数のプローブを同時にパターン化することができる。従って、このプロセスは既製のロボットまたはインクジェットプリンティング装置を用いて容易に自動化およびスケールアップすることができる。標準的な共有結合化学は、高密度のＤＮＡアレイ調製のために複数のマスキングおよびリフティング工程を必要とする、写真平板およびレーザーパターン化技術の使用を必要とする。第三に、伝統的な技術とは異なり、本発明の方法では高価な架橋試薬の使用を必要としない。これら架橋試薬は、空気や湿度に敏感なために使用するのが難しい。それゆえ、本発明は、ＤＮＡアレイの調製、とりわけ大スケールのＤＮＡアレイ調製のための新規、効率的で安価な方法を提供するものである。好ましい態様において、本発明は、シランコーティング固相表面への核酸の固定化法を記載するものであり、該方法は遺伝子分析やタンパク質−ＤＮＡ結合アッセイなどの他のスクリーニング応用に有用である。本発明は、シランコーティング固相表面および該シランコーティング固相に共有結合した非修飾または修飾オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドアレイに関するものであり、かかるアレイは遺伝子分析および核酸やタンパク質が関与するコンビナトリアル分析に有用である。コーティング表面の特性は、シラン表面コーティングへの独特のオリゴヌクレオチドの標準的なパターン化を可能にする。最も好ましい態様において、本発明は、メルカプトシラン化表面またはエポキシシラン化表面へ非修飾オリゴヌクレオチドを高密度および高安定性にて共有結合する方法を提供する。安定なエーテル（エポキシ）またはチオエーテル（メルカプト）結合でカップリングした非修飾オリゴヌクレオチドの調製が容易であることから、この方法は最もコストが低減されるものとなり、オリゴヌクレオチドの品質、付着の安定性および大スケールの製造におけるバッチ間の一貫性という観点で変動が全くまたは殆どない。さらに、シラン表面の疎水的な性質はまた、複数のＤＮＡプローブを高密度かつ様々なアレイフォーマットにて同時にパターン化することを可能にする。さらに、高塩条件およびＤＭＡ、尿素および上昇温度などの変性条件に対して安定なＤＮＡアレイは、遺伝子試験、ハイブリダイゼーションによる配列決定およびＤＮＡ結合分子のコンビナトリアル選択などの小型化バイオ技術において広範な用途を有する。本発明の共有付着は、他の付着手段、たとえば、ファンデアワールス相互作用やイオン−イオン相互作用とは区別されうる。それゆえ、他の付着手段とは異なり、共有結合により固定化したオリゴヌクレオチドはその後の洗浄工程の間に固相から遊離されないであろう。一般に、共有付着は非共有付着に比べて上昇温度および他の化学処理下で一層安定な結合を提供し、それゆえ、生化学的なプロセスでの使用が一層柔軟なものとなる。 II．エポキシ化学を用いた核酸分子の固定化本発明の好ましい態様において、核酸分子を固相に末端選択的な仕方で共有付着するためにエポキシベースの付着化学を用いた、選択的で高効率の方法が提供される。オリゴヌクレオチドは５'および３'末端に２つの遊離のヒドロキシル基を有しており、オリゴヌクレオチドが化学的および／または酵素的な伸長、ライゲーションおよび環化を受けることを可能にする。これら２つの末端ヒドロキシル基間での立体障害の違いにより、制御した条件下で５'選択的なエステル化、５'選択的なトリチル化および５'選択的な酸化が可能となる。それゆえ、ある種の制御された条件下で固相へ付着させるための非修飾オリゴヌクレオチドは、５ '−ＯＨの方が３'−ＯＨに比べてエポキシ活性化表面へ反応しやすい可能性を有する。末端選択的な付着は、オリゴヌクレオチドの５'末端と３'末端との立体障害の違いを利用することによりエポキシ化学において達成される。従って、いずれかの末端を（リン酸化等によって）ブロックすることによってブロックしていない末端と固相との間で直接、方向性の定まった付着を得ることができる。本発明のエポキシベースの好ましい態様において記載する共有結合は、共有エーテル結合である。末端選択的な付着は、固定化したオリゴヌクレオチドの全配列を所望の生化学反応に利用することを確実にする。この方法はオリゴヌクレオチドの修飾を必要としないので、コストならびにオリゴヌクレオチドの品質の観点での変動が大きく低減される。エポキシベースの付着化学は、ＰＣＲ産物またはゲノムＤＮＡを含む全ての形態のＤＮＡをシラン化表面に付着することを可能にする。さらに、エポキシベースの付着化学の場合は、シラン層とオリゴヌクレオチドとの間の化学結合は共有エーテル結合であり、これは熱、高塩、および上昇温度に対して安定である。 III．メルカプト化学を用いた核酸分子の固定化本発明は、他の好ましい態様において、核酸分子を非特異的な仕方で固相に共有結合するためにメルカプトベースの付着化学を用いた、ランダムで高効率の方法を記載する。本発明のこの第二の好ましい態様において記載する共有結合は、共有チオエーテル結合である。この態様は非特異的な結合に拠っているため、固定化したオリゴヌクレオチドの全配列が全ての所望の生化学反応に利用できるわけではない。メルカプト基はラジカル反応において非常に反応性が高く、低ｐＨ（ｐＨ９）下で容易に脱イオン化されるため、様々の反応を核酸に起こさせることが可能である。オリゴヌクレオチド中のヘテロ環プリン（ラジカルを安定化させる電子に富む系、とりわけプリンの７位）およびピリミジン（電子不足、求核アクセプター）は、求核攻撃またはラジカル反応の好適なアクセプターである。メルカプト化学では、高度に反応性のメルカプト基は付着のための穏やかな条件を可能とする。得られたアレイは、様々な生化学反応を受けることができ、高効率でのハイブリダイゼーションが可能である。メルカプトベースの付着化学は、ＰＣＲ産物またはゲノムＤＮＡを含む全ての形態のＤＮＡをシラン化表面に付着することを可能にする。さらに、メルカプトベースの付着化学の場合は、シラン層とオリゴヌクレオチドとの間の化学結合は共有チオエーテル結合であり、これは熱、高塩、および上昇温度に対して安定である。本発明において記載する非修飾核酸分子は、ゲノムＤＮＡ（すなわち、非翻訳領域を含むＤＮＡ）、ｃＤＮＡ（すなわち、非翻訳領域を欠くＤＮＡ）またはＲＮＡのいずれであってもよく、核酸分子はまた一本鎖あるいは二本鎖のいずれであってもよい。本発明を用いていかなる非修飾核酸分子をも固定化することができるが、本発明の好ましい核酸分子は非修飾の一本鎖合成オリゴヌクレオチドである。合成オリゴヌクレオチドの製造法は、以前にGait,M.J.（Oligonucleotide Svnthesis,A Practical Approach 、ＩＲＬプレス、オックスフォード（１９８４））およびSinha,N.D.ら（Nucl.Acids Res. 12:4539〜4557(1984)）によって記載されている（両文献とも参照のため本明細書中に引用する）。長さが約１０〜約２５０ヌクレオチドの非修飾オリゴヌクレオチドの合成は、ホスホルアミダイト化学に従ってＡＢ１３９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機で行うことができる。合成後、非修飾オリゴヌクレオチドを精製して（たとえば、ＨＰＬＣカラムを用いて）、混入した成熟前に終止した（すなわち、短くなった）オリゴヌクレオチドから完全長のオリゴヌクレオチドを分離することができる。カップリング反応に使用するに先立ってオリゴヌクレオチドを濃縮し、所望ならオリゴヌクレオチドのモル濃度を決定することができる。本発明の方法に従って様々なガラスやプラスチック固相支持体のいずれをも用いることができるが、ガラスが好ましい支持体である。支持体はビーズ、ディップスティック、試験管、ピンカラム（pin column）などの形態とすることができる。しかしながら、特に好ましい支持体はガラススライドである。別の態様として、固相支持体はポリスチレンプラスチック（たとえば、９６−ウエルマイクロタイタープレートなど）の形態とすることができる。スルフヒドリル基を有する固相支持体をコーティングするため、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメトキシシランおよび（メルカプトメチル）エチルジメトキシシランなどの多くの種々のメルカプトシラン化合物を本発明において用いることができる。本発明において用いることのできるメルカプトシランの一般式は、ＨＳ(ＣＨ₂)_n−ＳｉＸ₃ （式中、Ｘは、アルコキシ、アシルオキシ、アミンまたはハライドなどの加水分解しうる基）である。上記メルカプトシランはすべて、United Chemical,Inc.またはAldrich Chemical Company,Inc.から市販されている。上記シランは固相上に多くの手段のいずれによってもコーティングすることができる。たとえば、メルカプトシランは固相表面上にエアロゾルまたは蒸気として沈積させることができる。別法として、シランは機械的な手段（たとえば、スプレッダーバー、染み込ませた布など）により固相表面上に広げることができる。本発明の重要な特性は、シランの疎水的性質である。この性質のために、メルカプトシランをコーティングした固相支持体の表面上で水溶液が極めてよく定められたビーズを形成することが可能となる。自動化デリバリーシステム、たとえばHamiltonロボットまたはインクジェットプリンティング法を用い、メルカプトシランコーティングガラススライド上でオリゴヌクレオチドプローブの非常に複雑なアレイを形成することが可能である。かかる方法は、ナノないしピコリットルサイズの小滴をミリメートル以下の間隙で送達することが可能である。水性ビーズは極めてよく定められているので、極めて高密度のオリゴヌクレオチドプローブのアレイを生成することが可能である。それゆえ、約１０,０００プローブ小滴／ｃｍ²以上を有するアレイを生成することが可能である。 IV．固定化された核酸分子の使用固定化された核酸分子、より好ましくは固定化されたオリゴヌクレオチドは、理想的な診断用具となる。とりわけ、その用途の広さおよび簡単さのため、感染疾患および遺伝子病の検出、変異分析などのための理想的な診断用具となる。核酸分子を固相支持体に固定化する仕方はいかようであってもよいが、本発明の好ましい態様の一つは核酸分子を規則正しいアレイに整列させることである。本明細書においてアレイとは、行と列とのマトリックスのように規則正しく整列された核酸分子をいう。本発明の化学は、個々のアレイが有限数かまたは無限数の独特の固定化核酸分子を含みうるようなものである。核酸アレイを生成するために２つの好ましい方法がある：一つは特定のオリゴヌクレオチド配列を固相上に所望のパターンで直接合成することであり（Southe rnら、Nucl.Acids Res. 22:1368〜1373(1994);Maskosら、Nucl.Acids Res. 20:1 679〜1684(1992);およびPeaseら、Proc.Natl.Acad.Sci.91:5022〜5026(1994);これら文献をすべて参照のため本明細書中に引用する）、もう一つはオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ３９２など）で前以て合成し、ついで該オリゴヌクレオチドを固相の特定の位置に固定化させることである（Lamtureら、Nuc l.Acids Res. 22:2121〜2125(1994)およびSmithら、Nucl.Acids Res. 22:5456〜 5465(1994);両文献を参照のため本明細書中に引用する）。第一の方法においては、各塩基のカップリング工程の効率が核酸分子アレイの品質および完全さに影響を及ぼすであろう。この方法では、一般に所望でない不完全な（短いままの）配列を大きなパーセントで生じ、このことが分析工程に問題を生じ、分析の完全さに影響を及ぼしうる。それゆえ、第一の方法に従って合成したアレイの完全さは核酸分子の長さに反比例する。とりわけ、より長いオリゴヌクレオチドの合成は、不完全で短いままの配列を一層高いパーセントで生じる結果となる。核酸アレイ合成のための第二のより好ましい方法は、ＤＮＡ合成のために自動ＤＮＡ合成機を用いる。自動ＤＮＡ合成機による制御された化学は、第一の方法に比べて一層長く、一層高品質のＤＮＡ分子の合成を可能とする。また、第二の方法に従って合成した核酸分子はカップリング工程に先立って精製することができる。それゆえ、この核酸分子アレイの品質は第一の方法の核酸アレイの品質に比べてはるかに高いものとなることが期待される。しかしながら、前以て合成したオリゴヌクレオチドの固定化のためには簡単、有効かつ特異的なオリゴヌクレオチドカップリング化学が存在しない。本発明は、エーテルかまたはチオエーテルのいずれかの共有結合により、前以て合成した非修飾オリゴヌクレオチドを固相にカップリングするための簡単、有効かつ効率的な方法を記載するものである。Ａ．ＰＣＲ生成物のハイブリダイゼーション検出それゆえ、たとえば、共有結合により固定化された核酸分子は特定のＰＣＲ生成物をハイブリダイゼーションにより検出するのに用いることができ、その際、捕捉プローブは固相上に固定化されている（Rankiら、Gene 21:77〜85(1983);Ke llerら、J.Clin.Microbiol.29:638〜641(1991);Urdeaら、Gene 61:253〜264(198 7)）。好ましい方法はハイブリダイゼーション前に一本鎖ＰＣＲ生成物を調製することである。ついで、標的分子を含んでいると思われる試料またはその増幅生成物を該固相に暴露し、結合したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。本発明の方法は、標的核酸が天然の二本鎖のうちの一方の鎖のみを含むことを必要としない。それゆえ、本発明の方法は、二本鎖のＤＮＡか、または、たとえば天然のＤＮＡのアルカリ処理により得られた一本鎖ＤＮＡのいずれに対しても行うことができる。使用されていない（非鋳型）鎖の存在は反応に影響を及ぼさない。しかしながら、所望なら標的ＤＮＡ分子の天然の二本鎖の一方の鎖を反応から排除するために種々の方法のいずれをも用いることができる。一本鎖ＤＮＡ分子は一本鎖ＤＮＡバクテリオファージＭ１３を用いて調製することができる（Mess ing,J.ら、Meth.Enzymol. 101:20(1983);Sambrook,J.らのMolecular Cloning.A Laboratory Manual 、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９８９）をも参照）。一本鎖ＤＮＡ分子を生成するために幾つかの別法を用いることができる。Gyll ensten,U.ら(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 85:7652〜7656(1988))およびMihovilov ic,M.ら（BioTechniques 7:14(1989)）は、「非対称ＰＣＲ」と称する方法を記載しており、この方法は異なるモル濃度で存在するプライマーを用いて標準「ＰＣＲ」法を行うものである。Higuchi,R.G.ら（Nucl.Acids Res.17:5865(1985)）は、一本鎖増幅生成物を生成するための別の方法を例示している。この方法は、二本鎖増幅生成物の一方の鎖の５'末端をリン酸化し、ついで５'→３'エキソヌクレアーゼ（Ｔ７遺伝子エキソヌクレアーゼなど）にリン酸化鎖を優先的に分解させることを内容とする。他の方法はまた、一本鎖ＤＮＡ分子を生成させるためにホスホロチオエート誘導体のヌクレアーゼ耐性特性を利用している（Benkovicら、米国特許第4,521,50 9号;Sayers,J.R.ら、Nucl.Acids Res. 16:791〜802(1988);Eckstein,F.ら、Bioc hemistry 15:1685〜1691(1976)、Ott,J.ら、Biochemistry 26:8237〜8241(1987) ）。最も好ましくは、そのような一本鎖分子はNikiforov,T.により記載された方法（米国特許第5,518,900号；参照のため本明細書中に引用する）を用いて製造されるであろう。簡単に説明すると、これら方法はヌクレアーゼ耐性のヌクレオチド誘導体を用い、そのような誘導体を天然に存在するヌクレオチドの代わりに化学合成または酵素的手段によりプライマー分子またはその伸長生成物中に導入する。適当なヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドのリン酸部分の１または２の非架橋酸素分子が硫黄含有基（とりわけホスホロチオエート）、アルキル基（とりわけメチルまたはエチルアルキル基）、窒素含有基（とりわけアミン）、および／またはセレン含有基などで置換された誘導体が挙げられる。ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド誘導体は最も好ましいヌクレオチド誘導体である。そのようなホスホロチオエート誘導体を製造および使用する方法はNikiforov,T.により開示されている（米国特許第5,518,900号）。Ｂ．固相ＤＮＡ配列決定本発明の方法はまた、Khrapko,K.R.らにより記載されているように（DNA Seq. ,1:375〜388(1991)およびDrmanac,R.およびCrkvenjakov,R.、Int.J.Genome Res. , 1:1〜11(1992);ともに参照のため本明細書中に引用する）、固相配列決定を行うために用いることができる。Ｃ．ＧＢＡ^TMジェネティックビット分析本発明の方法はまた、ＧＢＡ^TMジェネティックビット分析（Goelet,P.ら、ＰＣＴ出願第９２／１５７１２号；参照のため本明細書中に引用する）に用いるオリゴヌクレオチドを固定化するためにも用いることができる。ＧＢＡ^TMジェネティックビット分析は、単一ヌクレオチド多型のタイプ分けのための固相法である。それゆえ、多型の可変ヌクレオチドのすぐ近位または遠位に位置する領域に相補的な所定の配列を有するオリゴヌクレオチドがポリスチレンマイクロタイターウエルまたはガラスプレートに提供され、上記方法に従って塩とともにインキュベートする。ついで、固定化プライマーを、単一ヌクレオチド多型（そのすぐ３'遠位配列は固定化プライマーの配列と相補的である）を有するＤＮＡ分子（好ましくはゲノムＤＮＡ分子）の存在下でインキュベートする。好ましくは、そのようなインキュベーションは、ｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＴＴＰ）の完全な不在下だが１または２以上の鎖停止ヌクレオチド誘導体（ジデオキシヌクレオチド誘導体など）の存在下、そしてそのような誘導体のプライマーの３'末端への導入を可能とするに充分な条件下で行う。理解されるであろうように、多型部位が２または３のみのアレルが存在するようなものである（それぞれｄｄＮＴＰの２または３の種のみがプライマー伸長生成物中に取り込まれるようなものである）場合には、使用できないヌクレオチド三リン酸が反応中に存在しても重要ではない。インキュベーションおよび鎖停止ヌクレオチド誘導体のみの使用の結果、単一のジデオキシヌクレオチドがプライマーの３'末端に付加される。この付加されたヌクレオチドは該多型の多型部位のヌクレオチドにより決定され、該ヌクレオチドに相補的である。本件特許出願に記載の方法を用い、オリゴヌクレオチドプライマーをポリスチレンやガラスのような固相上に固定化し、ＰＣＲ由来の一本鎖鋳型にハイブリダイズさせ、単一の標識ｄｄＮＴＰによりその３'末端にて酵素的な伸長に供される。導入されたｄｄＮＴＰの性質は、反対鎖中に位置するヌクレオチド（多型ヌクレオチド）により決定される。このアッセイはポリスチレンＥＬＩＳＡプレートまたはガラススライドの両者で都合よく行うことができる。この態様において、多型部位のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドのセットのいずれがプライマー依存性ポリメラーゼにより結合オリゴヌクレオチドの３'末端に導入されたかをアッセイすることにより決定される。最も好ましくは、複数のジデオキシヌクレオチド誘導体を同時に用いる場合には、導入ジデオキシヌクレオチド誘導体の同定の差異決定が可能となるように異なる標識が用いられるであろう。Ｄ．リガーゼ媒体ＧＢＡ^TM 本発明の方法および試薬はまた、ポリメラーゼ／リガーゼ媒体多型応答（inte rrogation）アッセイとともに用いることができる。このアッセイはリガーゼ媒体ＧＢＡ^TMジェネティックビットアッセイと呼ばれ、ＧＢＡ^TMジェネティックビット分析アッセイの一層特異的な版である。第二のハイブリダイゼーション工程およびライゲーション工程を付加することにより、さらなる特異性が得られる。このアッセイでは２つのオリゴヌクレオチドを用いる。第一のオリゴヌクレオチドは、多型のすぐ３'遠位にある不変配列に相補的なプライマーである。このオリゴヌクレオチドの３'末端はプレートに付着されている。第二のリンカーオリゴヌクレオチドは、分析しようとする多型の５'近位配列に相補的であるが第一のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない。第二のリンカーオリゴヌクレオチドは３'および５'の両末端でリン酸化されている。これらオリゴヌクレオチドを、分析しようとする単一ヌクレオチド多型を含むＤＮＡおよび少なくとも１の２'−デオキシヌクレオチド５'−三リン酸の存在下でインキュベートする。インキュベーション反応にはさらにＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡリガーゼを含む。それゆえ、係留されたオリゴヌクレオチドおよび可溶性オリゴヌクレオチドは分析下の標的分子の同じ鎖にハイブリダイズすることができる。配列を考慮すると、これら２つのオリゴヌクレオチドは、多型の可変ヌクレオチドをフランキングしている単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の近位配列および遠位配列にハイブリダイズし、変異の正確な位置にて単一のヌクレオチドにより隔てられることになる。ポリメラーゼおよび多型の可変部位に存在するヌクレオチドに相補的な２'− デオキシヌクレオチド５'−三リン酸の存在により、伸長プライマーが結合オリゴヌクレオチドにライゲートし、それによってプライマーを固定化することが可能になる。ついで、該単一ヌクレオチドの反対である多型部位の同定は幾つかの手段のいずれかにより決定することができる。好ましい態様において、該反応の２'−デオキシヌクレオチド５'−三リン酸は標識されており、それゆえ、その検出が多型部位の相補的ヌクレオチドの同定を明らかにする。それぞれ異なって標識された幾つかの異なる２'−デオキシヌクレオチド５'−三リン酸が存在していてよい。別法として別々の反応を行い、各反応をそれぞれ異なる２'−デオキシヌクレオチド５'−三リン酸で行うことができる。別の態様としては、２'−デオキシヌクレオチド５'−三リン酸を標識せずに可溶性のオリゴヌクレオチドを標識する。この態様では伸長されたプライマーがポリスチレン上に固定化される。別々の反応を、それぞれ異なる非標識２'−デオキシヌクレオチド５'−三リン酸を用いて行う。本発明をその特定の態様に関連して記載したが、さらに修飾することが可能であり、この出願は、一般に本発明の原理に従って、および本発明が関与する技術分野内では公知で慣例的な実施であるとして、あるいは上記や添付の請求の範囲内の本質的特徴に適用しうるものとして、本発明の開示から逸脱するものを包含して、本発明の変更、使用、または適応を包含することを意図するものであることが理解されるであろう。以上、本発明を一般的に記載したが、同内容は下記実施例を参照して一層容易に理解されるであろう。これら実施例は例示のために提供するのであって、特に断りのない限り本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書中に言及した全ての特許、特許出願および公報は参照のためにその全体が引用される。実施例１エポキシベースの化学シラン処理およびオリゴヌクレオチド結合の２工程プロセスにより付着を得た。ガラススライドを２５％水酸化アンモニウム水溶液中でエッチングし、ミリＱ水中、ついで９５％エタノール中で濯いだ。ガラススライドを３−グリシドキシプロピルエタノール（９５％エタノール、ｐＨ４.５）中で約３０分間処理した。スライドを６５℃にて少なくとも１２時間ねかせておいた。アルカリ溶液（１２.５ｍｍＮａＯＨまたはＫＯＨ）中の２.５〜１０μＭの濃度のオリゴヌクレオチドを、ねかせておいたスライドに所望のアレイフォーマットにて密封チャンバ中で一夜適用し、その後、後の使用のために水中または密封チャンバ中で貯蔵した。ハイブリダイゼーション反応および酵素反応を用いた機能性試験は、ＥＬＦ間接検出読み取りおよび放射性同位体定量により４００＞１のシグナル／ノイズ比にて所望のシグナルを与えた（図１）。図１はエポキシベースの付着化学のＧＢＡ機能アッセイの結果を示す。５'に（Ｔ）１０スペーサーアームを有する２５量体のプライマーを付着に用いた。ヌクレオシド三リン酸濃度および酵素濃度および反応条件の観点から、標準ＧＢＡ条件を用いた。合成鋳型１は「Ａ」シグナルを与えるようにデザインされており、合成鋳型２は「Ｔ」シグナルを与えるようにデザインされている。単一塩基伸長（ＧＢＡシグナル）は、ＥＬＦ間接検出を用いることにより、およびＣＣＤカメラ造影によっても、適当な鋳型でのみ得られた。シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）は４００１以上であった。さらに、５'末端ブロックした、３'末端ブロックした、または両末端をブロックした下記末端ブロックオリゴヌクレオチドを用いて付着実験をデザインした。末端のブロックは、自動ＤＮＡ合成の際に末端ヒドロキシル基をリン酸化することにより行った。各タイプのオリゴヌクレオチドについての付着をリン像分析（phosphor image analysis）により定量し、ついで末端選択性の比を決定した。エポキシシラン化表面への非修飾オリゴヌクレオチドの５'末端選択的な付着は、少なくとも５１の選択性比として示された。ヘテロ環アミノによる付着は、ある種の試験条件下では最小であった（表１）。表１は、エポキシベースの化学による非修飾オリゴヌクレオチドの末端選択的な付着を示す。付着は、エポキシシラン化スライド上で、１２.５ｍＭＮａＯＨ中の種々の濃度のオリゴヌクレオチドを用いて一夜行い、ＴＮＴｗおよび５０ｍＭＮａＯＨで順番に洗浄した。５'付着は３'リン酸化オリゴヌクレオチドの読み取り付着を、３'付着は５'リン酸化オリゴヌクレオチドの読み取り付着を意味する。ミドル付着は、３'末端ブロックおよび５'末端ブロックの両オリゴヌクレオチドのヘテロ環アミノ付着読み取りを意味する。³²Ｐ同位体像は、ホスファーイメージクオンタソフトウエア（phosphor image quanta software）で分析した。１０μＭの濃度での付着は、５'末端付着と３'末端付着との最良の選択性比８７１を与えた。５μＭの濃度での付着は、３'末端プラス５'末端付着とミドル付着との最良の選択性比１９１を与えた。これら結果は一つのスライドのみに基づくものであったが、多くのスライドは５'末端選択的な付着に対して２.５〜５μＭで最適の濃度の傾向を示した。さらに、エポキシシラン化表面は、空気、湿気および熱に対して安定であり、試験した条件下ではタンパク質およびオリゴヌクレオチドへの非特異的な結合を示さなかった。要約するに、オリゴヌクレオチドの５'末端選択的な付着はオリゴヌクレオチドの修飾なしで示された。実施例２メルカプトベースの化学シラン処理およびオリゴヌクレオチド結合の２工程プロセスにより付着を得た。ガラススライドを２５％水酸化アンモニウム水溶液中でエッチングし、ミリＱ水中、ついで９５％エタノール中で濯いだ。ガラススライドを３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＳ）中で約３０分間処理した。スライドを乾燥不活性ガス（ＡｒまたはＮ₂）下で少なくとも２４時間ねかせておいた。アルカリ溶液中の２.５〜１０μＭの濃度のオリゴヌクレオチドを、ねかせておいたスライドに所望のアレイフォーマットにて密封チャンバ中で一夜適用し、その後、後の使用のために水中または密封チャンバ中で貯蔵した。ハイブリダイゼーション反応および酵素反応を用いた機能性試験は、所望のシグナルを与えた（図２）。図２はメルカプトベースの付着化学およびハイブリダイゼーションおよびＧＢＡによる機能アッセイの結果を示す。データはホスファーイメージクオンタソフトウエア分析に基づいた。Ｘ軸は、付着に使用したオリゴヌクレオチドの投入濃度（０.３１２５μＭ〜４０μＭ）を表す。付着したオリゴヌクレオチドは三角形で表し（ピコモル／７ｍｍ²）、菱形はハイブリダイゼーションシグナルを表し、正方形はＧＢＡシグナル（ｄｄＡＴＰ伸長）を表す。付着した密度を決定するために³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドを用いた。ハイブリダイゼーション効率を評価するために³²Ｐ５'鋳型を用いた。ＧＢＡ効率の決定は、エクソクレノウＤＮＡポリメラーゼを用い、他の非標識（cold）ジデオキシヌクレオチドの存在なしで³²Ｐ−ｄｄＡＴＰの取り込みにより行った。ＧＢＡ効率およびハイブリダイゼーションは、１０μＭの付着投入量で飽和に達した。さらに、メルカプトプロピルシラン化スライドへの染料標識ヌクレオチドの付着について実験を行ったところ、ＡおよびＧに対しては一層強いシグナルを、ＣおよびＴに対しては一層弱いシグナルを示し、このことは求核攻撃よりもラジカル機構の方がより関与するとの仮説に都合のよいものである。³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドおよびフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドの付着を決定し、定量した（図２）。付着密度、ハイブリダイゼーションおよびジェネティックビット分析効率に関して達成された付着の結果は、エポキシ化学およびその他によって報告された化学に匹敵するものであった。実施例３プライマー密度とハイブリダイゼーション効率との間の相関関係ハイブリダイゼーション効率は付着したプライマーの表面密度と正の相関を有する。本実施例では、増大量のＢＲＡＣＩプライマ−５'(T)₁₀TCA TTA ATG CTA TGC AGA AAA TCT TAG（配列番号１）を上記方法に従って固相表面に共有付着させる。表２は、エポキシベースの付着とハイブリダイゼーション効率とを対比させた結果を示す。データはホスファーイメージクオンタソフトウエア分析に基づいた。付着には３'リン酸化オリゴヌクレオチドを用い、ハイブリダイゼーションには５'リン酸化鋳型を用いた。低い表面適用範囲（coverage）は、おそらく対応する低いハイブリダイゼーションシグナルを生じるであろう。逆に、高い表面密度は共有結合固定化オリゴヌクレオチド間での立体障害をもたらし、それによって標的ＤＮＡのアクセスを妨害する。その結果は、１.７８ピコモル／７ｍｍ²までの一層高い適用範囲では一層高いハイブリダイゼーション効率が得られることを示した。増大するプライマー密度は増大するハイブリダイゼーション効率と関係している。従って、ハイブリダイゼーション効率はプライマー付着の安定性によって影響される。実施例４ジェネティックビット分析の適合性ポリ−Ｔ₁₀残基の長いスペーサーアームを有するＧＢＡプライマーを、以前に記載したエポキシベースの化学またはメルカプトベースの化学によりガラス表面上に付着させる。標準ＧＢＡ生化学を用いて２つの合成鋳型を分析する。各合成鋳型は上記処理ガラススライドに固定化したＧＢＡプライマーにハイブリダイズし、伸長反応成分のすべて、大腸菌ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ不含クレノウ断片および各４つのフルオレセイン標識ｄｄＮＴＰおよびｃｏ−ｄｄＮＴＰまたは³²Ｐ−ｄｄＡＴＰを含む伸長混合物で処理する。シグナルは、Cytoflou r II蛍光プレートリーダー（図１）またはホスファーイメージクオンタ分析を用いた酵素媒体蛍光により記録した。図１は、エポキシベースの付着化学のＧＢＡ機能アッセイの結果を示す。付着には５'に(Ｔ)１０スペーサーアームを有する２７量体プライマーを用いた（配列番号１）。ヌクレオシド三リン酸濃度および酵素濃度および反応条件に関して標準ＧＢＡ条件を用いた。合成鋳型１５'ACA C TC TAA GAT TTT CTG CAT AGC ATT AAT（配列番号２）を「Ａ」シグナルを与えるためにデザインし、合成鋳型２５'GGA CAC TAA GAT TTT CGT CAT AGC ATT AAT（配列番号３）を「Ｔ」シグナルを与えるためにデザインした。単一塩基伸長（ＧＢＡシグナル）は、ＥＬＦ間接検出を用い、またＣＣＤカメラ造影によっても、適当な鋳型でのみ得られた。シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）は、４００１を超えた。ＤＮＡ試料ゲノムＤＮＡを、ヒトまたはウマの末梢血を３倍容量過剰のＡＣＫ溶解緩衝液（０.１５Ｍ塩化アンモニウム、１ｍＭ重炭酸カリウム、０.１ｍＭＥＤＴＡ）で希釈することにより行う選択的溶解により赤血球から濃縮した末梢血有核細胞から、ＳＤＳ／プロテイナーゼＫ法（Maniatis,T.、Molecular Cloning:A Labor atory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー（１９８９））を用いて単離した。オリゴヌクレオチドの調製を、Applied Biosystems,Inc.（フォスター・シティー、カリフォルニア）Model 391自動ＤＮＡ合成機を用いて固相ホスホルアミダイト化学により行った。ジェネティックビット分析（ＧＢＡ）反応に用いたプライマーの場合には最後の合成サイクルの後に脱トリチル化を行わず、完全長のオリゴヌクレオチドを製造業者の推奨に従ってApplied Biosystemsオリゴヌクレオチド精製カートリッジ（ＯＰＣ）を用いて精製した。たいていのＰＣＲ反応では脱保護反応物を乾燥することによりプライマーを直接用いた。表３は、合成鋳型１５'ACA CTC TAA GAT TTT CTG CAT AGC ATT ATT（配列番号２）（塩基ＡにおいてＧＢＡシグナルを与えるべくデザインしたもの）をおよび合成鋳型２５'GGA CAC TAA GAT TTT CGT CAT AGC ATT AAT（配列番号３）（塩基Ｔにおいてシグナルを与えるべくデザインしたもの）を用いて行った実験の結果を示す。使用したプライマーは、(T)₁₀TCA TTA ATG CTA TGC AGA AAA TCT T AG（配列番号１）であった。両シグナルは予測された塩基で強いシグナルを与え、他の塩基では実質的にノイズが観察されなかった（シグナル／ノイズ比は５２０１〜６００１）。実施例５インクジェットプリンティングによるオリゴヌクレオチドアレイの調製オリゴヌクレオチド溶液の自動送達のための他の方法は、MicroFab（Technolo gies,Inc.、プラノ、テキサス）によって行うインクジェットプリンティング法を用いるものである。一つの実験において、４つの異なるスポット空隙（中心から中心）および８つの異なる小滴サイズを、３'末端をフルオレセインで標識したオリゴヌクレオチドを用いてメルカプトシランコーティング表面上で試験する。表４に示したスライドのフォーマットは以下の通りである。標識オリゴヌクレオチドの検出をMolecular Dynamic Fluorlmager 595を用いて行う。インクジェットプリンティング法は、ミリリットル以下の空隙およびナノリットルからピコリットルの小滴サイズのオリゴヌクレオチドアレイを製造するのに適した方法である。それゆえ、インクジェットプリンティング法はオリゴヌクレオチドアレイの大スケールの製造に適している。実施例６自動ピペットロボットを用いたオリゴヌクレオチドアレイの調製 Hamilton 2200自動ピペットロボットを用い、サイズが約１００ｎｌ〜約２５０ｎｌ、各ドット間の空隙が１ｍｍのオリゴヌクレオチド小滴のアレイを調製する。小容量のオリゴヌクレオチド溶液を自動ピペットロボットに用いることにより、オリゴヌクレオチド小滴の速やかな乾燥が可能となる。インクジェットプリンティング法と同様、Hamiltonロボットはナノリットルからピコリットルのサイズの小滴をミリリットル以下の空隙で送達すべくプログラムしうる。本発明をその特定の態様に関連して記載したが、さらに修飾することが可能であり、この出願は、一般に本発明の原理に従って、および本発明が関与する技術分野内では公知で慣例的な実施であるとして、あるいは上記や添付の請求の範囲内の本質的特徴に適用しうるものとして、本発明の開示から逸脱するものを包含して、本発明の変更、使用、または適応を包含することを意図するものであることが理解されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 37/00 １０３Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．合成核酸分子を固相に固定化する方法であって、（Ａ）該固相をシランでコーティングし、該シランコーティング固相をねかせ、ついで（Ｂ）末端３'ＯＨかまたは末端５'ＯＨのいずれかを有する非修飾の核酸分子を該シランコーティング固相にカップリングする工程を含む方法。２．工程Ａにおいて、該コーティングを、水性エタノールの酸性緩衝液の存在下で少なくとも約３０分間行う、請求項１に記載の方法。３．工程Ａにおいて、該シランが、メルカプト−アルキル−トリメトキシシランおよびグリシドキシ−アルキル−シランよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。４．工程Ａにおいて、該シランが、３−メルカプト−プロピル−トリメトキシである、請求項１に記載の方法。５．工程Ａにおいて、該シランが、３−グリシドキシプロピル−シランである、請求項１に記載の方法。６．工程Ａにおいて、該ねかせを、ＡｒまたはＮ₂よりなる乾燥不活性ガスの存在下で約２４時間行う、請求項４に記載の方法。７．工程Ａにおいて、該ねかせを、約６０℃〜約７０℃の温度にて約１０〜１４時間行う、請求項５に記載の方法。８．工程Ｂにおいて、該カップリングをアルカリ溶液中で行う、請求項１に記載の方法。９．工程Ｂにおいて、該アルカリ溶液が約０.０００１Ｍ〜約５ＭのＮａＯＨを含む、請求項８に記載の方法。１０．工程Ｂにおいて、該アルカリ溶液がＮａＯＨ、ＫＯＨ、およびＬｉＯＨを含む、請求項８に記載の方法。１１．工程Ｂにおいて、該核酸分子がオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。１２．該オリゴヌクレオチドが、約１.０〜約１０μＭの濃度を有する、請求項１１に記載の方法。１３．工程Ｂにおいて、該共有結合が、共有エーテルおよびチオエーテル結合よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。１４．工程Ｂにおいて、該共有結合が共有チオエーテル結合である、請求項４に記載の方法。１５．工程Ｂにおいて、該共有結合が共有エーテル結合である、請求項５に記載の方法。１６．該固相がガラスである、請求項１に記載の方法。１７．該ガラスが顕微鏡スライドである、請求項１６に記載の方法。１８．該固相がプラスチックである、請求項１に記載の方法。１９．該プラスチックがポリスチレンプラスチックである、請求項１８に記載の方法。２０．該固相が、ビーズ、プレート、カラム、ピンおよびディップスティックよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。２１．該カップリング反応が、固定化した核酸分子のアレイを生成する、請求項１に記載の方法。２２．該固定化核酸がポリヌクレオチドであり、該方法がさらに、（Ｃ）該固定化ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより特定のポリヌクレオチド分析対象物の少なくとも一方の鎖を溶液から捕捉し、ついで（Ｄ）該捕捉した分析対象物の存在を検出する工程を任意に含む、請求項１に記載の方法。２３．該工程（Ｃ）がさらに（Ｃ'(１)）ポリメラーゼ連鎖反応を用いて特定のゲノムの特定の領域を増幅させ、その際、該領域は該固定化ポリヌクレオチドに相補的な配列を有しており、ついで（Ｃ'(２)）該固定化ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより該増幅生成物の少なくとも一方の鎖を溶液から捕捉する工程を含み、該工程（Ｄ）がさらに（Ｄ'）該捕捉した増幅生成物の存在を検出する工程を含む、請求項２２に記載の方法。２４．該方法がさらに（Ｅ）単一ヌクレオチド多型を含む標的生物の核酸の試料を該固定化ポリヌクレオチドプライマーおよび少なくとも一つのジデオキシヌクレオチド誘導体の存在下、該プライマーのポリメラーゼ媒体鋳型依存性伸長を可能とするに充分な条件下でインキュベートし、その際、該伸長は該プライマーの３'末端へ単一のジデオキシヌクレオチドを導入させ、該単一のジデオキシヌクレオチドは該多型の多型部位の該単一ヌクレオチドに相補的であり、（Ｆ）該プライマー分子の該鋳型依存性伸長および該単一ジデオキシヌクレオチドの該導入を行わせ、ついで（Ｇ）該多型部位に導入されたヌクレオチドを同定し、その際、該同定されたヌクレオチドは該多型部位の該ヌクレオチドに相補的である工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。２５．該ポリスチレン支持体がマイクロウエルプレートである、請求項１９に記載の方法。２６．該ポリスチレン支持体がマイクロウエルプレートにフィットするようにデザインされているアレイである、請求項１９に記載の方法。２７．該コーティング工程がエアロゾル、蒸発手段または他の機械的手段によるものである、請求項１に記載の方法。２８．固定化非修飾核酸分子を含む組成物であって、該核酸分子が固相に共有結合によりカップリングされている組成物。２９．該非修飾核酸分子がシランコーティング固相に共有付着されている、請求項２８に記載の組成物。３０．該シランが、メルカプト−アルキル−トリメトキシシランおよびグリシドキシアルキルシランよりなる群から選ばれる、請求項２９に記載の方法。３１．該組成物が、遺伝子分析、コンビナトリアル分析、核酸ハイブリダイゼーション分析およびハイブリダイゼーションによる配列決定を含むスクリーニング応用、およびプライマー伸長遺伝子型決定に用いられる、請求項２８に記載の組成物。