发明内容
本发明提供一种能够显著改善核酸分子分布密度和稳定性的固相基底、其处理方法和用途。
根据第一方面,一种实施例中提供一种固相基底,该固相基底具有至少一个硅烷化的表面,上述表面为暴露于特定环境中一定时长的表面,上述特定环境为惰性气体环境,上述特定环境的温度选自37℃至60℃,上述一定时长为不小于2小时。
进一步地,上述一定时长满足预设关系,上述预设关系为上述表面暴露于上述特定环境的时长和该表面能够固定上的核酸分子的量之间的关系,上述表面能够实现固定到其上的核酸分子的量达到期望值。
进一步地,上述特定环境的温度选自37℃至57℃。
进一步地,上述特定环境的温度为37℃、47℃或57℃。
进一步地,上述一定时长为1天以上、2个月以下。
进一步地,上述一定时长为2天以上、1个月以下。
进一步地,上述一定时长为4天。
进一步地,上述特定环境的相对湿度为30-70%。
进一步地,上述特定环境的相对湿度为45-55%。
进一步地,上述特定环境的相对湿度为55%。
进一步地,上述固相基底为玻璃和/或石英。
进一步地,上述固相基底通过化合物修饰获得上述硅烷化的表面,上述化合物包含能够与氨基化核酸分子中的氨基或者巯基化核酸分子中的巯基发生共价连接的基团。
进一步地,上述基团选自环氧基、醛基、羧基、马来酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺和马来酰亚胺基团中的一种或多种。
进一步地,上述化合物选自3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、5,6-环氧己基三乙氧基硅烷、5,6-环氧己基三甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)、环氧丙基三甲氧基硅烷、环氧丙基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己烷基)乙基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己烷基)乙基三甲氧基硅烷中的一种或多种。
进一步地,上述预设关系为线性关系。
进一步地,上述预设关系的确定包括:连接核酸分子于第一表面并检测固定到该第一表面的核酸分子的量Q1,上述第一表面为暴露于恒定温度的特定环境达时长P1的固相基底的表面,上述第一表面为硅烷化的表面;连接核酸分子于第二表面并检测固定到该第二表面的核酸分子的量Q2,上述第二表面为暴露于上述恒定温度的特定环境达时长P2的固相基底的表面,上述第二表面为硅烷化的表面,其中P1不等于P2;以及利用P1、Q1、P2、Q2确定对应于上述温度的预设关系。
根据第二方面,一种实施例中提供一种芯片,该芯片包括第一方面的固相基底。
进一步地,上述芯片还包括固定在上述固相基底的表面上的核酸分子。
根据第三方面,一种实施例中提供一种第一方面的固相基底和/或第二方面的芯片在核酸捕获和/或核酸检测分析中的用途。
根据第四方面,一种实施例中提供一种处理固相基底的方法,上述固相基底具有至少一个硅烷化的表面,上述方法包括将上述表面暴露于特定环境中一定时长,上述特定环境为惰性气体环境,上述特定环境的温度选自37℃至60℃,上述一定时长为不小于2小时。
进一步地,上述一定时长满足预设关系,上述预设关系为上述表面暴露于上述特定环境的时长和该表面能够固定上的核酸分子的量之间的关系,上述表面能够实现固定到其上的核酸分子的量达到期望值。
进一步地,上述特定环境的温度选自37℃至57℃。
进一步地,上述特定环境的温度为37℃、47℃或57℃。
进一步地,上述一定时长为1天以上、2个月以下。
进一步地,上述一定时长为2天以上、1个月以下。
进一步地,上述一定时长为4天。
进一步地,上述特定环境的相对湿度为30-70%。
进一步地,上述特定环境的相对湿度为45-55%。
进一步地,上述特定环境的相对湿度为55%。
进一步地,上述固相基底为玻璃和/或石英。
进一步地,上述固相基底通过化合物修饰获得上述硅烷化的表面,上述化合物包含能够与氨基化核酸分子中的氨基或者巯基化核酸分子中的巯基发生共价连接的基团。
进一步地,上述基团选自环氧基、醛基、羧基、马来酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺和马来酰亚胺基团中的一种或多种。
进一步地,上述化合物选自3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、5,6-环氧己基三乙氧基硅烷、5,6-环氧己基三甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)、环氧丙基三甲氧基硅烷、环氧丙基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己烷基)乙基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己烷基)乙基三甲氧基硅烷中的一种或多种。
进一步地,上述预设关系为线性关系。
进一步地,上述预设关系的确定包括:连接核酸分子于第一表面并检测固定到该第一表面的核酸分子的量Q1,上述第一表面为暴露于恒定温度的特定环境达时长P1的固相基底的表面,上述第一表面为硅烷化的表面;连接核酸分子于第二表面并检测固定到该第二表面的核酸分子的量Q2,上述第二表面为暴露于上述恒定温度的特定环境达时长P2的固相基底的表面,上述第二表面为硅烷化的表面,其中P1不等于P2;以及利用P1、Q1、P2、Q2确定对应于上述温度的预设关系。
本发明将表面硅烷化的固相基底暴露于惰性气体环境中,于37℃至60℃的温度范围内进行处理,改善了固相基底的性能,从而改善固定到该固相基底的表面上的核酸分子分布密度以及稳定性,具体而言,增加了表面活性基团镀层的密度及稳定性,进而提高了芯片质量,用于核酸捕获或核酸检测分析中能够改善结果,尤其是用于测序中能够改善测序质量。同时,相较于高温处理固相基底,采用本发明中的方法处理固相基底,使得非特性吸附降低,从而改善测序过程中非特异性吸附的干扰。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中,很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而,本领域技术人员可以毫不费力的认识到,其中部分特征在不同情况下是可以省略的,或者可以由其他元件、材料、方法所替代。
另外,说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时,方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此,说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例,并不意味着是必须的顺序,除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本发明中为某些特征所编序号本身,例如“第一”、“第二”等,仅用于区分所描述的对象,不具有任何顺序或技术含义。
本发明中,所谓芯片/固相基底的“老化”一般是指,将芯片/固相基底的表面“暴露于特定环境中一定时长”,由于该表面是硅烷化的表面,表面的硅烷化处理在前进行,硅烷化处理使用特定化合物,这些化合物包含能够与核酸分子发生共价连接的官能基团。硅烷化处理虽然是在容器内进行,但是硅烷化处理之后硅烷化反应仍然持续、缓慢地进行,使得结合不牢的官能基团逐渐结合加强,形成更稳定的基底。从微观机理而言,在“老化”过程中,硅烷化修饰后的基底表面的各种表征参数,如非特异性吸附、游离基团活性等逐渐趋于相对不变或在特定范围内,使得表面各个参数的变化范围处于适合进行下一步处理如探针固定反应的状态。因此,该“老化”过程的控制对于获得高质量的基底至关重要,尤其是老化温度的控制直接影响基底质量。本发明通过将固相基底在选自37℃至60℃的温度下暴露于一定时长实现固相基底的老化。
本发明的芯片/固相基底适用于任何核酸分子——包括但不限于DNA、RNA等核酸分子在其表面上的固定。这种“固定”,可以是核酸分子在基底表面上的特异性吸附(例如,共价键连接)或非特异性吸附(例如,通过范德华力等方式的非共价键连接)。本发明优选适用于DNA分子在芯片基底上的固定,特别是基因测序芯片,包括第二代基因测序芯片和第三代基因测序芯片,特别是第三代单分子测序芯片。同样适用于其它以硅烷-玻璃/石英等为基底的核酸芯片或生物芯片。
本发明中,凡涉及到数值或者数值范围均包括允许在指定数值或者数值范围左右存在一定范围的波动,例如,对于温度37℃,既包括37℃本身,也包括±1℃变化的温度;对于相对湿度55%,既包括55%本身,也包括±5%变化的相对湿度值,即50%和60%的相对湿度值。其他任何温度和相对湿度的数值或者数值范围均以此类推。
本发明中,使用相对湿度来表征环境湿度,相对湿度按照常用的一般概念理解,例如相对湿度表示环境中实际所含水蒸气密度与同温度下饱和水蒸气密度的百分比值。与相对湿度对应的是绝对湿度,其表示单位环境中所含水蒸气的质量,它是大气干湿程度一种物理表达方式,通常用1立方米内所有的水蒸气的克数来表示。在特定温度下,相对湿度与绝对湿度可以互相转换,任何用绝对湿度表示的环境湿度都可以转换为以相对湿度表示。无论是相对湿度、绝对湿度的测量方式还是其转换方法都是本领域技术人员按照其掌握的知识获得的。
本发明的一种实施例中提供一种固相基底,该固相基底具有至少一个硅烷化的表面,上述表面为暴露于特定环境中一定时长的表面,上述特定环境为惰性气体环境,上述特定环境的温度选自37℃至60℃,上述一定时长为不小于2小时。
需要说明的是,常温(25℃)条件短时间(不超过1年)放置后的固相基底对其后续采取的在特定环境中暴露一定时长的处理影响不大,所以可根据固相基底使用时间安排确定采取的处理温度和时间。
本发明实施例中,固相基底的硅烷化可以按照本领域公知的方法进行,其中硅烷化使用的硅烷分子和固相基底都有非常广泛的选择。
硅烷分子中包含能够与核酸分子上的对应基团发生连接反应的活性基团。作为典型但非限定性的实例,核酸分子一般是氨基化核酸分子或巯基化核酸分子,其中氨基或巯基是能够与硅烷分子上的活性基团反应的对应基团。硅烷分子中的活性基团一般位于硅烷分子一端,而硅烷分子的另一端与芯片基底表面发生硅烷化反应将其固定在芯片基底表面上。活性基团的典型但非限定性的实例包括环氧基、醛基、羧基、马来酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺基团等,这些基团可以单独或组合的形式出现在硅烷分子中。作为典型但非限定性的实例,硅烷分子可以选自3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、5,6-环氧己基三乙氧基硅烷、5,6-环氧己基三甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)、环氧丙基三甲氧基硅烷、环氧丙基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己烷基)乙基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己烷基)乙基三甲氧基硅烷中的一种或多种。
固相基底可以是玻璃或石英,术语“玻璃”和“石英”均按其最宽泛的概念理解,包括任何方法制得的适合用于核酸固定的玻璃或石英,另外,“石英玻璃”作为一种只含二氧化硅单一成份的特种玻璃,也归于本发明的玻璃概念中。在本发明一个实施例中,采用玻璃基底(例如,德国肖特nexterion-coverslip 1620415芯片,也称为“5003芯片”),但是基于含有共同的有SiO2等成分,石英或其他基底也是显然可用的。此外,也可以是镀有Al、Al2O3涂层的玻璃基底等,或者镀有SiO2涂层的金属或塑料基底等。
本发明中,硅烷分子在固相基底表面的硅烷化反应可以按照本领域常用的方法进行,例如溶液法或化学气相沉积法(CVD)等。在本发明实施例中,采用溶液法进行硅烷化反应,而化学气相沉积法是利用CVD设备进行硅烷化反应的一种方法,与本发明实施例中的溶液法作用相似。
在进行硅烷化反应之前,固相基底可能需要一些清洗和/活化处理,这些处理按照本领域的公知做法进行即可,例如用盐酸清洗固相基底表面,然后用食人鱼溶液浸泡,再依次用超纯水和乙醇清洗。在本发明实施例中,首先用5%盐酸清洗表面3小时,然后用食人鱼溶液浸泡30分钟,超纯水清洗5次,乙醇清洗1次(表面羟基化),能取得良好的效果。
本发明实施例中,固相基底的表面暴露于特定环境中一定时长。在本发明一个实施例中,通过将固相基底在惰性气体环境中保存一定时长来实现上述固相基底的表面的处理。本发明中“惰性气体环境”包括任何惰性气体,包括但不限于氮气、氩气等,本发明实施例中优选氮气环境。一般而言,通过抽真空再充惰性气体的方式获得惰性气体环境,压强允许在较大的范围内变化,但是优选的气体压力是10000Pa。在没有特别说明的情况下,本发明任何步骤中“惰性气体环境”均按此处定义理解。
发明人已经证实,在本发明实施例中,特定环境的温度选自37℃至60℃能取得更好的效果,即相比现有技术核酸分子分布密度更稳定、更均匀,例如37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、37℃至57℃、37℃至55℃、37℃至52℃、37℃至50℃、37℃至47℃、37℃至45℃、37℃至42℃、40℃至60℃、40℃至57℃、40℃至55℃、40℃至50℃、40℃至45℃、42℃至57℃、42℃至55℃、42℃至52℃、42℃至50℃、42℃至46℃、45℃至60℃、45℃至57℃、45℃至55℃、45℃至50℃、45℃至48℃、47℃至57℃、47℃至55℃、47℃至52℃、50℃至55℃等,优选的37℃至57℃,更优选37℃、47℃或57℃。
在本发明的优选实施例中,特定环境的相对湿度控制在30-70%的范围内,能取得较好的效果,优选45-55%的范围,更优选55%。
在本发明的优选实施例中,固相基底的表面在特定环境中暴露的时间范围是1天以上、2个月以下;优选2天以上、1个月以下;更优选4天。其中1天按24小时计,1个月按30天计。作为一般的原则,表面在特定环境中暴露的时间与温度成反比,即温度越高暴露的时间越短,温度越低暴露的时间越长。例如,37℃放置2个月,47℃放置22天,57℃放置4天等。
发明人还惊奇地发现,固相基底的表面在特定环境中暴露的时间按照预设关系设定,能够取得预想不到的效果,即能够使固相基底的表面实现固定到其上的核酸分子的量达到期望值。这种预设关系为上述表面暴露于上述特定环境的时长和该表面能够固定上的核酸分子的量之间的关系。发明人已经证实,对于给定的固相基底,在一定温度下将基底置于惰性气体环境中一定时长后,将核酸分子固定到基底表面,发现固定到表面的核酸分子的量与基底在一定温度下放置的时长之间呈线性关系。其中核酸分子的量可以是绝对量或相对量,绝对量如核酸分子的个数,相对量如核酸分子的密度或归一化密度等。在本发明一个实施例中,核酸分子的量可以表示为Q,放置时长可以表示为P,相应地,放置时长和该表面能够固定上的核酸分子的量之间的关系可以表示为:Q=a+b*P。在一个具体实施例中,核酸分子的量用密度表示,相应地,上述预设关系体现为密度-时间曲线公式,例如y=a+b*x,其中y表示核酸分子的密度,x表示时间,a表示常数,b表示斜率,即特定温度下的反应速率。
由放置时长和固定上的核酸分子的量之间的关系公式Q=a+b*P可以看出,若要实现表面固定到其上的核酸分子的量达到期望值Q,根据公式即可确定放置时长P。
在本发明一个实施例中,通过如下方法确定预设关系:连接核酸分子于第一表面并检测固定到该第一表面的核酸分子的量Q1,上述第一表面为暴露于恒定温度的特定环境达时长P1的固相基底的表面,上述第一表面为硅烷化的表面;连接核酸分子于第二表面并检测固定到该第二表面的核酸分子的量Q2,上述第二表面为暴露于上述恒定温度的特定环境达时长P2的固相基底的表面,上述第二表面为硅烷化的表面,其中P1不等于P2;以及利用P1、Q1、P2、Q2确定对应于上述温度的预设关系。
本发明实施例中,第一表面和第二表面除在特定环境中暴露的时长不同以外,其他条件控制相同,例如提供第一表面和第二表面的固相基底的材质、制备方法和生产批次等相同,表面处理如硅烷化处理条件相同。第一表面和第二表面可以由独自的固相基底提供,也可以由共同的固相基底的不同区域来提供。
本发明的实施例还提供一种芯片,该芯片包括上述固相基底;或者,该芯片包括上述固相基底以及固定在上述固相基底的表面上的核酸分子。需要说明的是,本发明实施例中“芯片”取广义含义,即带有核酸分子的芯片,或没有核酸分子但能够用于固定核酸分子的芯片。这样的芯片,例如可以是基因测序芯片,包括第二代基因测序芯片和第三代基因测序芯片,特别是第三代单分子测序芯片。同样也适用于其它以硅烷-玻璃/石英等为基底的核酸芯片或生物芯片。
本发明得到的芯片进一步固定氨基或巯基修饰的核酸(如DNA)分子,形成稳定的核酸芯片,可用于测序尤其是单分子测序。
本发明的实施例还提供上述固相基底和/或芯片在核酸捕获和/或核酸检测分析中的用途,尤其是在测序中的用途。
本发明的一种实施例中提供一种处理固相基底的方法,上述固相基底具有至少一个硅烷化的表面,上述方法包括将上述表面暴露于特定环境中一定时长,上述特定环境为惰性气体环境,上述特定环境的温度选自37℃至60℃,上述一定时长为不小于2小时。
需要说明的是,常温(25℃)条件短时间(不超过1年)放置后的固相基底对其后续采取的在特定环境中暴露一定时长的处理影响不大,所以可根据固相基底使用时间安排确定采取的处理温度和时间。
本发明实施例中,固相基底的硅烷化可以按照本领域公知的方法进行,其中硅烷化使用的硅烷分子和固相基底都有非常广泛的选择。
硅烷分子中包含能够与核酸分子上的对应基团发生连接反应的活性基团。作为典型但非限定性的实例,核酸分子一般是氨基化核酸分子或巯基化核酸分子,其中氨基或巯基是能够与硅烷分子上的活性基团反应的对应基团。硅烷分子中的活性基团一般位于硅烷分子一端,而硅烷分子的另一端与芯片基底表面发生硅烷化反应将其固定在芯片基底表面上。活性基团的典型但非限定性的实例包括环氧基、醛基、羧基、马来酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺、马来酰亚胺基团等,这些基团可以单独或组合的形式出现在硅烷分子中。作为典型但非限定性的实例,硅烷分子可以选自3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、5,6-环氧己基三乙氧基硅烷、5,6-环氧己基三甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GOPTS)、环氧丙基三甲氧基硅烷、环氧丙基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己烷基)乙基三乙氧基硅烷、2-(3,4-环氧环己烷基)乙基三甲氧基硅烷中的一种或多种。
固相基底可以是玻璃或石英,术语“玻璃”和“石英”均按其最宽泛的概念理解,包括任何方法制得的适合用于核酸固定的玻璃或石英,另外,“石英玻璃”作为一种只含二氧化硅单一成份的特种玻璃,也归于本发明的玻璃概念中。在本发明一个实施例中,采用玻璃基底(例如,德国肖特nexterion-coverslip 1620415芯片,也称为“5003芯片”),但是基于含有共同的有SiO2等成分,石英或其他基底也是显然可用的。此外,也可以是镀有Al、Al2O3涂层的玻璃基底等,或者镀有SiO2涂层的金属或塑料基底等。
本发明中,硅烷分子在固相基底表面的硅烷化反应可以按照本领域常用的方法进行,例如溶液法或化学气相沉积法(CVD)等。在本发明实施例中,采用溶液法进行硅烷化反应,而化学气相沉积法是利用CVD设备进行硅烷化反应的一种方法,与本发明实施例中的溶液法作用相似。
在进行硅烷化反应之前,固相基底可能需要一些清洗和/活化处理,这些处理按照本领域的公知做法进行即可,例如用盐酸清洗固相基底表面,然后用食人鱼溶液浸泡,再依次用超纯水和乙醇清洗。在本发明实施例中,首先用5%盐酸清洗表面3小时,然后用食人鱼溶液浸泡30分钟,超纯水清洗5次,乙醇清洗1次(表面羟基化),能取得良好的效果。
本发明实施例中,固相基底的表面暴露于特定环境中一定时长。在本发明一个实施例中,通过将固相基底在惰性气体环境中保存一定时长来实现上述固相基底的表面的处理。本发明中“惰性气体环境”包括任何惰性气体,包括但不限于氮气、氩气等,本发明实施例中优选氮气环境。一般而言,通过抽真空再充惰性气体的方式获得惰性气体环境,压强允许在较大的范围内变化,但是优选的气体压力是10000Pa。在没有特别说明的情况下,本发明任何步骤中“惰性气体环境”均按此处定义理解。
发明人已经证实,在本发明实施例中,特定环境的温度选自37℃至60℃能取得更好的效果,即相比现有技术核酸分子分布密度更稳定、更均匀,例如37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、37℃至57℃、37℃至55℃、37℃至52℃、37℃至50℃、37℃至47℃、37℃至45℃、37℃至42℃、40℃至60℃、40℃至57℃、40℃至55℃、40℃至50℃、40℃至45℃、42℃至57℃、42℃至55℃、42℃至52℃、42℃至50℃、42℃至46℃、45℃至60℃、45℃至57℃、45℃至55℃、45℃至50℃、45℃至48℃、47℃至57℃、47℃至55℃、47℃至52℃、50℃至55℃等,优选的37℃至57℃,更优选37℃、47℃或57℃。
在本发明的优选实施例中,特定环境的相对湿度控制在30-70%的范围内,能取得较好的效果,优选45-55%的范围,更优选55%。
在本发明的优选实施例中,固相基底的表面在特定环境中暴露的时间范围是1天以上、2个月以下;优选2天以上、1个月以下;更优选4天。其中1天按24小时计,1个月按30天计。作为一般的原则,表面在特定环境中暴露的时间与温度成反比,即温度越高暴露的时间越短,温度越低暴露的时间越长。例如,37℃放置2个月,47℃放置22天,57℃放置4天等。
发明人还惊奇地发现,固相基底的表面在特定环境中暴露的时间按照预设关系设定,能够取得预想不到的效果,即能够使固相基底的表面实现固定到其上的核酸分子的量达到期望值。这种预设关系为上述表面暴露于上述特定环境的时长和该表面能够固定上的核酸分子的量之间的关系。发明人已经证实,对于给定的固相基底,在一定温度下将基底置于惰性气体环境中一定时长后,将核酸分子固定到基底表面,发现固定到表面的核酸分子的量与基底在一定温度下放置的时长之间呈线性关系。其中核酸分子的量可以是绝对量或相对量,绝对量如核酸分子的个数,相对量如核酸分子的密度或归一化密度等。在本发明一个实施例中,核酸分子的量可以表示为Q,放置时长可以表示为P,相应地,放置时长和该表面能够固定上的核酸分子的量之间的关系可以表示为:Q=a+b*P。在一个具体实施例中,核酸分子的量用密度表示,相应地,上述预设关系体现为密度-时间曲线公式,例如y=a+b*x,其中y表示核酸分子的密度,x表示时间,a表示常数,b表示斜率,即特定温度下的反应速率。
由放置时长和固定上的核酸分子的量之间的关系公式Q=a+b*P可以看出,若要实现表面固定到其上的核酸分子的量达到期望值Q,根据公式即可确定放置时长P。
在本发明一个实施例中,通过如下方法确定预设关系:连接核酸分子于第一表面并检测固定到该第一表面的核酸分子的量Q1,上述第一表面为暴露于恒定温度的特定环境达时长P1的固相基底的表面,上述第一表面为硅烷化的表面;连接核酸分子于第二表面并检测固定到该第二表面的核酸分子的量Q2,上述第二表面为暴露于上述恒定温度的特定环境达时长P2的固相基底的表面,上述第二表面为硅烷化的表面,其中P1不等于P2;以及利用P1、Q1、P2、Q2确定对应于上述温度的预设关系。
本发明实施例中,第一表面和第二表面除在特定环境中暴露的时长不同以外,其他条件控制相同,例如提供第一表面和第二表面的固相基底的材质、制备方法和生产批次等相同,表面处理如硅烷化处理条件相同。第一表面和第二表面可以由独自的固相基底提供,也可以由共同的固相基底的不同区域来提供。
以下通过实施例和比较例详细说明本发明的技术方案和效果,应当理解,实施例仅是示例性的,不能理解为对本发明保护范围的限制,本发明保护范围以所附权利要求为准。
以下实施例和比较例中使用的核酸分子是氨基-DNA-CY3(NH2-T50-Cy3,其中T50表示50个胸腺嘧啶脱氧核苷酸,Cy3表示染料分子,NH2修饰在T50的3’或5’末端的核苷酸上);芯片基底是玻璃基底,即5003芯片(德国肖特nexterion-coverslip 1620415)。
实施例1硅烷化后57℃放置
(1)清洗玻璃基底:用5%(质量浓度)盐酸清洗表面3小时;
(2)活化玻璃基底:用食人鱼溶液(piranha solution)浸泡30分钟,超纯水清洗5次,乙醇清洗1次(表面羟基化);
(3)表面硅烷衍生化反应:配制2%(质量浓度)GOPTS(3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷)乙醇溶液,37℃反应5小时,然后5次纯水、5次乙醇、1次丙酮清洗,氮气吹干,备用;
(4)低温放置处理:将制备好的芯片放置在氮气干燥柜中,放置条件:温度57℃,相对湿度55%,放置时间4天;
(5)氨基-DNA-CY3分子固定:配制含有氨基-DNA-CY3分子的0.25M磷酸缓冲液,涂布在表面,37℃反应10小时,然后用1XPBS(pH=7.4)与纯水交叉清洗2次;
(6)荧光检测:在全内反射荧光成像(Tirf)显微镜上检测芯片表面不同区域荧光点数,检测波长530纳米。
实施例2硅烷化后47℃放置
(1)清洗玻璃基底:用5%(质量浓度)盐酸清洗表面3小时;
(2)活化玻璃基底:用食人鱼溶液浸泡30分钟,超纯水清洗5次,乙醇清洗1次;
(3)表面硅烷衍生化反应:配制2%(质量浓度)GOPTS乙醇溶液,37℃反应5小时,然后5次纯水、5次乙醇、1次丙酮清洗,氮气吹干,备用;
(4)低温放置处理:将制备好的芯片放置在氮气干燥柜中,放置条件:温度47℃,相对湿度55%,放置时间4天;
(5)氨基-DNA-CY3分子固定:配制含有氨基-DNA-CY3分子的0.25M磷酸缓冲液,涂布在表面,37℃反应10小时,然后用1XPBS(pH=7.4)与纯水交叉清洗2次;
(6)荧光检测:在Tirf显微镜上检测芯片表面不同区域荧光点数,检测波长530纳米。
实施例3硅烷化后37℃放置
(1)清洗玻璃基底:用5%(质量浓度)盐酸清洗表面3小时;
(2)活化玻璃基底:用食人鱼溶液浸泡30分钟,超纯水清洗5次,乙醇清洗1次;
(3)表面硅烷衍生化反应:配制2%(质量浓度)GOPTS乙醇溶液,37℃反应5小时,然后5次纯水、5次乙醇、1次丙酮清洗,氮气吹干,备用;
(4)低温放置处理:将制备好的芯片放置在氮气干燥柜中,放置条件:温度37℃,相对湿度55%,放置时间4天;
(5)氨基-DNA-CY3分子固定:配制含有氨基-DNA-CY3分子的0.25M磷酸缓冲液,涂布在表面,37℃反应10小时,然后用1XPBS(pH=7.4)与纯水交叉清洗2次;
(6)荧光检测:在Tirf显微镜上检测芯片表面不同区域荧光点数,检测波长530纳米。
比较例1常规不加热的芯片
(1)清洗玻璃基底:用5%(质量浓度)盐酸清洗表面3小时;
(2)活化玻璃基底:用食人鱼溶液浸泡30分钟,超纯水清洗5次,乙醇清洗1次;
(3)表面硅烷衍生化反应:配制2%(质量浓度)GOPTS乙醇溶液,37℃反应5小时,然后5次纯水、5次乙醇、1次丙酮清洗,氮气吹干,常温(25℃)下放置在氮气干燥柜中;
(4)氨基-DNA-CY3分子固定:配制含有氨基-DNA-CY3分子的0.25M磷酸缓冲液,涂布在表面,37℃反应10小时,然后用1XPBS(pH=7.4)与纯水交叉清洗2次;
(5)荧光检测:在Tirf显微镜上检测芯片表面不同区域荧光点数,检测波长530纳米。
比较例2高温加热芯片
(1)清洗玻璃基底:用5%(质量浓度)盐酸清洗表面3小时;
(2)活化玻璃基底:用食人鱼溶液浸泡30分钟,超纯水清洗5次,乙醇清洗1次;
(3)表面硅烷衍生化反应:配制2%(质量浓度)GOPTS乙醇溶液,37℃反应5小时,然后5次纯水、5次乙醇、1次丙酮清洗,氮气吹干,备用;
(4)高温固化:在真空条件下,加热芯片到90℃,反应15分钟;
(5)氨基-DNA-CY3分子固定:配制含有氨基-DNA-CY3分子的0.25M磷酸缓冲液,涂布在表面,37℃反应10小时,然后用1XPBS与纯水交叉清洗2次;
(6)荧光检测:在Tirf显微镜上检测芯片表面不同区域荧光点数,检测波长530纳米。
试验例非特异吸附实验
测试完上述实施例1-3和比较例1-2共5种不同条件的芯片密度后,用纯水清洗干净芯片表面,将芯片浸泡在带CY5荧光基团的核苷酸溶液中,3分钟后取出,用0.1M磷酸缓冲液和纯水交替清洗两次,再次在Tirf显微镜上检测芯片表面不同区域荧光点数,检测波动为640纳米。表面并无化学反应可以进行,因此此时检测到的点数基本上可以认定为表面的非特异吸附。
以上实施例、比较例和试验例均使用图像处理软件(ImageJ)进行数点。
结果如表1和图1、图2和图3所示。表1中,dot/1024*1024pix表示1024*1024pix像素点的区域中的亮点数目,即密度。
表1
如图1所示,并结合表1数据:(1)相同时间内,温度越高,最终表面硅烷密度越高,越利于提高最终测序通量;(2)温度越高,密度波动大小越小,说明芯片越稳定,同样有利于提高最终检测结果的稳定性。考虑到密度极限值为30000点和正常波动,37℃至57℃温度范围作为放置温度均能取得良好效果,尤其是57℃放置结果是当前最稳定的条件。
如图2所示,并结合表1数据:(1)相同时间内,温度越高,密度越高,加热对芯片密度有明显作用。但是,90℃温度下密度严重超过图像处理软件(ImageJ)正常可数点范围,接近点数极限30000点,点数严重失真,导致波动几乎为0,结果异常。而常温下同样时间放置的芯片密度过低,无法使用。综合考虑密度及波动因素,37℃至57℃温度范围作为放置温度均能取得良好效果,尤其是47℃至57℃温度范围内,芯片密度介于大约13000至25000,密度刚好适中,并且密度波动范围小于10%(分别是6.63%和2.40%),且非特异吸附及其波动相对于常温条件没有明显提高。
如图3所示,并结合表1数据:在常温、37℃、47℃、57℃温度下的非特异吸附均不高,且差异在2个百分点内,而且单个芯片非特异吸附的波动大约10个百分点,因此可以认为基本一致,57℃处理没有影响表面非特异吸附性能。值得注意的是,90℃加热条件下芯片的非特异吸附异常大,达到2000点,且波动50%,无论是绝对值还是波动都是所有芯片中最大,因此,90℃加热条件对芯片非特异吸附影响太大,严重影响了芯片的稳定性,此方法不能用于处理本发明中芯片。
综上所述,90℃处理硅烷芯片会导致密度和吸附异常。37℃至57℃温度范围作为放置温度均能取得良好效果,尤其是57℃放置,无论是在密度还是稳定性上都表现出色。此外,更低温度虽然也可以达到57℃的效果,但需要几个月或半年时间。
以下实施例表明,固相基底的表面暴露于特定环境的时长和该表面能够固定上的核酸分子的量之间呈线性关系。因此,固相基底的表面在特定环境中暴露的时间按照这种线性关系设定,能够使固相基底的表面实现固定到其上的核酸分子的量达到期望值。
实验例4 25℃下保存芯片
取同一批次芯片若干(12个以上,例如15个)进行如下处理:
(1)清洗玻璃基底:用5%盐酸清洗表面3小时;
(2)活化玻璃基底:用食人鱼溶液(piranha solution)浸泡30分钟,超纯水清洗5次,乙醇清洗1次;
(3)表面硅烷衍生化反应:配制2%GOPTS(3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷)乙醇溶液,37℃反应5小时,然后5次纯水、5次乙醇、1次丙酮清洗,氮气吹干,备用;
(4)低温保存处理:将制备好的芯片保存在氮气柜中,在温度25℃,相对湿度55%,保存不同时间(0天、60天、180天、360天、720天);
(5)氨基-DNA-CY3分子固定:分别在0天、60天、180天、360天、720天取出若干芯片(例如3个);配制含有氨基DNA-CY3分子的0.25M磷酸缓冲液,涂布在芯片表面,37℃反应10小时,然后用1XPBS(pH=7.4)与纯水交叉清洗2次;
(6)荧光检测:在Tirf显微镜上检测芯片表面不同区域荧光点数,检测波长530纳米,根据3个芯片检测结果取平均值,得到核酸分子固定密度(dot/1024*1024pix);
(7)根据所获得的60天、180天、360天、720天时核酸分子固定密度,制作25℃下的密度-时间曲线,结果如图4所示,曲线斜率为32.632,即25℃下相对反应速率k1为32.632。
实验例5 57℃下保存芯片
取同一批次芯片若干(12个以上)进行如下处理:
(1)清洗玻璃基底:用5%盐酸清洗表面3小时;
(2)活化玻璃基底:用食人鱼溶液浸泡30分钟,超纯水清洗5次,乙醇清洗1次;
(3)表面硅烷衍生化反应:配制2%GOPTS乙醇溶液,37℃反应5小时,然后5次纯水、5次乙醇、1次丙酮清洗,氮气吹干,备用;
(4)低温保存处理:将制备好的芯片保存在氮气柜中,在温度57℃,相对湿度55%,保存不同时间(0天、2天、4天、7天);
(5)氨基-DNA-CY3分子固定:分别在0天、2天、4天、7天取出若干芯片(例如3个);配制含有氨基-DNA-CY3分子的0.25M磷酸缓冲液,涂布在芯片表面,37℃反应10小时,然后用1XPBS(pH=7.4)与纯水交叉清洗2次;
(6)荧光检测:在Tirf显微镜上检测芯片表面不同区域荧光点数,检测波长530纳米,根据3个芯片检测结果取平均值,得到核酸分子固定密度(dot/1024*1024pix);
(7)根据所获得的0天、2天、4天、7天时核酸分子固定密度,制作57℃下的密度-时间曲线,结果如图5所示,曲线斜率为1877.448,即57℃下相对反应速率k2为1877.448。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述,只是用于帮助理解本发明,并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员,依据本发明的思想,还可以做出若干简单推演、变形或替换。