JPS6093354A - オ−トラジオグラフイ−によるｄνａもしくはｄνａ断片物の塩基配列決定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オーｉ・ラジオグラフィーを利用するＤＮＡ
もしくはＤＮＡ断片物の塩基配列決定方法に関するもの
である。

近年、急激に発達して来た分子生物学においては、生物
体の機能や複製のメカニズムを解明するために、生物体
のもつ遺伝情報を明らかにすることが必須のこととなっ
ている。とりわけ、４〜定の遺伝情報を１１１うＤＮＡ
　（もしくはＤＮＡ断片物、以下同様）なとの核酸の１
！！基配列を決定することは必要不可欠なこととなって
いる。

ＤＮＡの塩基配列を決定するための代表的な方法の一つ
として、サンカー拳クールンン（Ｓａｎｇｅｒ−Ｃｏｕ
ｌｓｏｎ）法が知られている。この方法は、ＤＮＡが二
本の鎖状分子からなる二重ラセン構造を有し、かつその
二本の鎖状分子は、各々四種類の塩基、すなわちアデニ
ン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（
Ｔ）なる塩基を有する構成単位から構成されていること
、そしてこの二本の鎖状分子の間はこれらの四種類の塩
基間の水素結合によって架橋されており、しかも各構成
単位間の水素結合はＧ−ＣおよびΔ−Ｔの二種類の組合
わせのみにおいて実現しているというＤＮＡの特徴的な
構造に着１１シ、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ断片の合
成、ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーの１段
を巧みに利用してＤＮＡの塩ノ、（配列を決定する方法
である。

サンガー・クールラン法において、塩基配列を決定しよ
うとしているＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物（これらを以
後、検体ＤＮＡという）と相補的なりＮＡ断片を合成す
るためには幾つかの方法があるか、基本的には・末鎖の
検体ＤＮＡを鋳型（テンプレート）とし、」、記の四種
類の塩基を含むモノヌクレオシｌ’　ｌリフオスフェー
トの存在下でＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）を
作用させることにより、検体ＤＮＡと相補的な種々の長
さのＤＮＡ断片を合成する。このとき、一部のモノヌク
レオシドＩ・リフォスフェ−１・に放ＱＪ性！　識が伺
与されたものを用いることにより、放射性標識された合
成りＮＡ断片（ＤＮＡ合成物）が得られる。

次に、この操作により得られる多数の合成りＮＡ断片か
らなる混合物をゲル電気泳動法により支持媒体上に分離
展開する。この支持媒体についてオートラジオグラフィ
ー操作を行なうことにより、合成りＮＡ断片が分＃展開
されてなる分＃１ｊり凹刻のオートラジオグラフを１１
）る。そして、このｕ）視化されたオートラジオグラフ
に基づいて、鎖状分子の末端から順にそのＪＪ４ノ、（
配列を決定することができ、このようにして検体ＤＮＡ
のすべてのｊＪ１基の配列を決定することかできる。

なお、上記に要約したサンカー・クールノン法の特徴お
よび操作についての筒中な記述は次の文献に見られる。

１′漬伝情報を原に６で読む・意表を衝いたＤＮＡの塩
基配列解析法」三浦謹一部、現代化学、１９７７年９月
号４６〜５４頁（−東京化学同人刊）］二述のサンガー
・クールノン法は、検体り、　Ｎ　Ａと相補的なりＮＡ
断片を合成するに際し、まずテンブレー１−　Ｄ　Ｎ　
Ａにプライマーと呼ばれる短い鎖のＤＮＡ断片を対合さ
せ、このプライマー部分からＤＮＡを伸長させて合成す
る。そのため、支持媒体１；に分離展開されたＤＮＡ断
片のオーＩ・ラジオグラフを解析する際に、プライマ一
部分の蹟１基配列は決定する必要がない。すなわち、比
較的短いＤＮＡ断片については解析する必要がなく、分
７、　Ｉｊｌの小さな、従って泳動速度の大きいＤＮＡ
断片が流出してしまうような泳動速度で分＃展開を行な
ってもよい。このため、゛心気泳動による分離ＩｊＧ開
速度を速めて分＃展開の時間を短縮化できるという利点
がある。

さらに、ＤＮＡの合成過程で放射性物質を導入すること
ができるため、比放射能の高いＤＮＡ断片を得ることが
でき、オートラジオグラフィーにおける露光時間を短縮
化することができる。また比放射能の高いＤ　Ｎ　Ａ断
片が得られるために、用いるテンプｌ、−）　Ｄ　Ｎ　
Ａの最が少量で済むきいう利点もある。

このようなＪ！Ｆ山から、サンガー・クールノン法は、
検体ＤＮＡの塩基特異的切断分解を利用するマキサム拳
ギルバート法とともに、ＤＮＡの塩基配列決定において
非常に注［１されている方法である。

従来において、上記のＤＮＡの塩基配列決定に利用され
るオートラジオグラフィーは、放射性検品が伺与された
ＤＮＡ断片が分＃展開された支持媒体と高感度Ｘ線フィ
ルムなとの放射線フィルムとを一定時間重ね合わせて、
該フィルムを感光（あるいは、露光）させることによっ
て行なわれている。また、オートラジオグラフィーの検
出感度を高めるために増感紙を用いることも１１なわれ
ている。このようなオートラジオグラフィーについては
、たとえば、次に示すような文献に記載されている。

生化学実験講座６　トレーサー実験法（上）２７１〜２
８９頁、「８．　オートラジオグラフィーｊ末吉徹、重
松閉則（１９７７年、−東京化学同人ｒ４Ｊ　） 」二連のように、オートラジオグラフィーはＤＮＡなど
の核酸の塩基配列を決定する上で、支持媒体−■二に分
＃展開されたＤＮＡ断片の位置情報を得るための重要な
手段となっている。しかしながら、このように有用なオ
ートラジオグラフィーをＤＮＡの塩基配列決定に適用す
るにあたっては、いくつかの問題がある。

その第一は、放射性標識物質を含む支持媒体上の放射性
物質の位置をｎｆ視化するために、その支＋ｙ奴体と高
感度Ｘ線フィルＪ、などの放射線フィルトとを一定時間
重ね合わせて、該フィルムを感光（露光）させることが
行なわれているが、この露光操作が長時間を必要とする
点である。すなわち従来より、ＤＮＡの塩基配列決定に
おけるオートラジオグツイーの露光操作は通常、数十時
間かけて実施されている。これは、支Ｊ、’＋奴体七に
展開されたＤＮＡ断片などの試料の量が少ないこと、お
よび放射性標識物質が一般に３２ｐ等で部分的に標識さ
れた核酸であるため、高い放射性が伺＋７．されていな
いことによる。

第二には、この露光操作は適冷、低温（たとえば、Ｏ℃
〜−８０°Ｃ）で行なわなければならない点である。そ
の理由は、室温などの比較的高い温度では、放射線また
は蛍光による感光によって形成されたフィルムＪ−の銀
塩中の潜像が退行して現像できない像となりやすく、ま
た、Ｌ記の試料が分＃展開された支持媒体から、銀１ス
嘉に対して有害な成分が移動するなどして化学カブリを
形成しゃすいからである。さらに、蛍光増感紙を用いて
増感露光を行なう場合には、増感紙からの発光の輝度が
低いため、室温のような比較的高い温度では潜像を形成
しにくいという銀塩の特性にも依っている。

第三には、化学カブリなどによる画質の低下を防ぐため
に、放射性標識物質を含む支持媒体を乾燥した状態で放
射線フィルムと重ね合わせて露光させなければならない
点である。このため、通常は支持媒体の乾燥もしくは合
成樹脂フィルム等による支持媒体の包装が行なわれてい
る。

オー１ラジオグラフイーによってイ１すられた画像にこ
のようなカブリが発生ずると、支持媒体上に分Ｋ　Ｉｊ
ｘ開されたＤＮＡ断片の位置情報を高精度で得ることが
むずかしく、決定されるＤＮＡの塩基配列の精度を著し
く低１・゛させることになる。

以１．の理由により、オートラシオクフィーの操１′１
が煩雑なものとなっており、このことによりＤＮＡの１
；１Ｘ基配列を決定するための操作全体が煩雑になって
いる。

また、放射線フィルムの感光成分である銀塩は物理的な
刺激にも影響されやすく、露光操作時における操作１１
」当店の手あるいは機器との接触などに起因する物理的
圧力などによって物理的カブリ現象を起こす傾向がある
。この点も得られるＤＮＡの塩基配列の精度を低ドさせ
る原因となり、そのような放射線フィルムの物理カブリ
の発生を回避するためには、その取扱い作業において高
度の熟練と注意とを必要とし、塩基配列決定のための操
作をさらに複雑にする結果となる。

また、従来のオートラジオグラフィーでは」；記のよう
に長時間の露光操作が行なわれるため、放射性標識物質
以外に支持媒体に混入した不純物による放射能または自
然放射能もまた放射線フィルムの露光に関与し、得られ
る放射性標識物質の（，７置情報の精度を低ドさせると
の問題がある。そのような妨害を排除して適切な露光条
性を設定するためには、たとえば、対照試料を用いた並
行実験の実施、露光時間の適１に化なとか図られている
か、並行実験の実施による実験回数の増大、好適な露光
時間の決定を行なうためのＹ’　＃ｉｉ実験の必要に１
なとにより、その操作全体が煩雑になるとの欠点がある
。

さらに、従来のオートラジオグラフィーによるＤＮＡの
ｌｉｉ　）人配列決定においては、画像化されたオーＩ
・ラジオグラフから必要な位置情報を得るために、分１
１１１展開された放射性標識化されているＤＮＡ断片の
泳動距離を目視によって読み取るというｒｌｉ純な作業
を長時間に渡って行なうことが必要であった・ 本発明者は、従来のオートラジオグラフィーを利用する
ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の墳墓配列決定方法におい
て附随するに記のような問題点の解決を目的として鋭意
研究を行なった結果、感光材料として放射線フィルムの
代りに、輝尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍光体シートを
用いることにより、前記の問題点の解決あるいは欠点の
低減が実現することを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、 （１）塩基配列を決定しようとしているＤＮＡもしくは
ＤＮＡ断片物と相補的な塩基配列を有し、かつ放射性標
識が（Ｊ！７’されているＤＮＡ合成物からなる混合物
を調製する１稈； （２）該ＤＮＡ合成物からなる混合物を支持媒体）、で
分離１ｉ　１）１させる工程；（３）該支持媒体と、輝
尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍光体シートとを一定時間
重ね合わせることにより、該支持媒体りの放射性標識物
質から放出される放射線エネルギーの少なくとも一部を
該蓄積性蛍光体シートに吸収させたのち、該シートを電
磁波により励起して該シートに蓄積されてしする放射線
エネルギーを輝尽光として放出させ、そしてその輝尽光
を検出することにより、放射性標識が旧年されたＤＮＡ
合成物の位置情報を得るに程；および、 （４）得られた位置情報に基づいて、１」的のＤＮＡも
しくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定する工程； を含むことを特徴とするオートラジオグラフィーによる
ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配夕１決定方法を提
供するものである。

なお、本発明において支持媒体１−の放射性標識物質の
「位置情報」とは、支持媒体１−における放射性標識物
質もしくはその集合体の位置を中心とする各種の情報、
たとえば、支持媒体−１ニに存在する放射性物質の集合
体の存在位置と形状、その位置における放射性物質の濃
度、分布などからなる情報の一つもしくは任意の組合わ
せとしてＶｔ＋られる各種の情報を意味する。

木発明において使用する蓄積性蛍光体シート・は放射線
像変換パネルとも呼ばれるものであり、その例は、たと
えば特開昭５５−１２１４５号公報などに記載されてお
り、−１ｉｔ）的な構成としては既に公知である。

すなわち、蓄積性蛍光体シートは輝尽性蛍光体からなる
ものであり、被写体を透過した放射線エネルギー、ある
いは被検体から発せられた放射線エネルギーを該シート
の輝尽性蛍光体に吸収させ、そののちに該シートをＯｆ
視乃至赤外領域の電磁波（励起光）を用いて励起するこ
とにより、該シートの輝尽性蛍光体中に蓄積されている
放射線エネルギーを張光として放出させることができる
ものである。従って、被写体あるいは被検体の放射線像
は、この蛍光を光電的に読み取って電気信号に変換し、
得られた電気信号を写真フィルムなどの記録材料、ＣＲ
Ｔなどの表示装置上に可視画像として再生するか、ある
いは数値化もしくは記号化した位置情報などとして表わ
すことができる。

木発明の方法によれば、ＤＮＡの塩基配列を決定するた
めのオートラジオグラフィーにおいて、従来のオートラ
ジオグラフィーで用いられている放射線フィルム、ある
いはそれと増感紙との組合わせの代りに、輝尽性蛍光体
を含有してなる蓄積性蛍光体シートを用いることにより
、露光時間の大幅な短縮化が実現されるのみでなく、露
光が環境温度あるいはその付近の温度という温度条件で
行なわれても、得られる位置情報の精度は低ドすること
がない。従って、従来においては冷却Ｆで長時間かけて
実施されていた露光操作が著しく簡便なものとなり、オ
ートラジオグラフィー操作が簡略化されるものである。

また、感光材料として蓄積性蛍光体シートを使用した場
合には、蓄積性蛍光体シーＩ・に蓄積記録された放射性
標識物質の位置情報を得るために特に画像化する必要は
なく、蓄積性蛍光体シーＩ・をレーザーなどの電磁波で
走査することにより上記の位置情報を読み出し、その位
置情報を画像、記号および／または数値、あるいはそれ
らの組合わせなどの任意な形態に変えて取り出すことが
可能となる。さらに、上記の位置情報を電気的手段など
を利用して更に処理することにより、所望の各種の形態
で、すなわち必ずしも画像の形で位置情報を得るのでは
なく、その画像情報についてデータ処理して得られる他
の情報として得ることも可能である。本発明においては
、蓄積性蛍光体シートを読み出して得られる放射性標識
物質の位置情報を有する電気信号あるいはデジタル信号
を、電気泳動などにより分１１ｍ展開された分離パター
ンとして画像情報の形で１１１るのみではなく、それを
コンピュータなどを利用して解析し、［−１的のＤＮＡ
の」ス１基配列情報として（１１ることもＩ＋７能であ
る。

さらに、オートラジオグラフィーの感光材料として１−
記の蓄積性蛍光体シートを利用することにより、従来よ
り放射線フィルムの使用において大きな問題となってい
た化学カブリおよび物理カブリが実質的に発生しなくな
る点も、ＤＮＡの塩基配列決定の精度の向」二および作
業性において非常に右利に作用する。また、支持媒体中
に含まれていた不純物の放射能または自然放射能などに
起因する精度の低下は、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録
されている位置情報を電気的に処理することにより容易
に低減あるいは解消することがＯｆ能となる。

従って、支持媒体１；に分＃展開された放射性標識物質
の位置情報に基づ＜ＤＮＡの塩〕、（配列決定のための
解析操作は著しく容易になり、同時に決定されるＤＮＡ
の塩基配列の精度を高めてその解析効率を向」−させる
ことが０■能となる。

以下に、本発明のオートラジオグラフィーによるＤＮＡ
もしくはＤＮＡ断片物の塩基配列決定方法ニツイテ、ジ
デオキシ法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｍ
ｅｔｈｏｄまたは、鎖停止法ともいう）を例にとり、１
；を細に説明する。この方法は、前述のサンカー・クー
ルシン法のうち最もＩｌｉ便かつ精度の高い方法として
汎用されている方法である。

まず、検体ＤＮＡを含む−・末鎖のＤＮＡを用意する。

これをテンプレートＤＮＡと呼ぶ。このＤＮＡの一部に
対して相補的な短いＤＮＡ断片（プライづ−と呼ばれる
）を用意し、テンブレー１−　ＤＮＡとハイブリダイズ
させたのち、テンプレートＤＮＡと相補的なりＮＡの合
成を行なう。

ＤＮＡの合成は、プライマーを有するテンプレートＤＮ
Ａに、四種類の塩基をそれぞれ含むデオキシヌクレオシ
ドトリフオスフェート（ｄ　ＮＴＰ）四種と特定の塩基
を含むジデオキシヌクレオシドトリフォスフェ−１，（
ｄｄＮＴＰ）一種とを加え、ＤＮＡポリメラーゼを作用
させることにより、テンプレートＤＮＡのプライマ一部
分からＤＮＡ鎖を伸長させて行なわれる。この合成過程
において、テンブレー１−　Ｄ　Ｎ　Ａにジデオキシヌ
クレオシドトリフォスフニーＩ・が組み込まれるとＤＮ
Ａの合成反応はそこで停止するため、プライマーから特
定の塩基の位置まで伸長された検体ＤＮＡと相補的なり
ＮＡ断片が得られる。たとえば、ジデオキシアデノシン
トリフォスフニー１．（ｄｄＡＴＰ）を用いた場合には
、末端がアデニン（Ａ）で終わる種々の長さのＤＮＡ断
片の混合物が得られる。

上記ＤＮＡの合成において、四種のデオキシヌクレオシ
ドトリフオスフェートのうちの少なくとも一種のヌクレ
オチドとして３２Ｐなどの放射性元素で標識化されたも
のを用いることにより、放射性標識が付与された合成り
ＮＡ断片を得ることができる。

Ｌ記の合成工程を異なる四種のジデオキシヌクレオシド
トリフオスフェートを用いて四回繰り返えし、四種類の
塩基特異的ＤＮＡ合成物を得る。

なお、以」二に記述したジデオキシヌクレオシＩ−トリ
フォスフェ−１・を用いるＤＮＡ断ノ１の合成７Ｊｉ、
および得られたＤＮＡ合成物によるＤＮＡの１！！ノ１
（配列決定法の詳細については、たとえば次の文献に詳
細に記載されている。

Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　＆
　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、　Ｒ，。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ、　７４．　ｐｐ、　５４Ｈ−５４８１（１９７７） また、テンプレートＤＮＡを得る方法としては種々のも
のが考案されているが、バクテリオファージＭ１３を用
いたクローニング方法が最も簡便であり、この方法につ
いてはたとえば、次の文献に詳細に記載されている。

５ｃｈｒｅｉｅｒ、　Ｐ、　Ｈ，、＆　Ｃｏｒｔｅｓｅ
、　Ｒ，、Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、胆もｐｐ、　ＩＨ−１７２（１９７９）次
に、得られた四種類の合成りＮＡ断片混合物についてゲ
ル電気泳動操作を行ない、各々の混合物が分ＩＩＩｙＣ
開されてなる支持媒体を得る。

この放射性標識化された合成りＮＡ断片が分離力く開ご
れた支持媒体について、オートラジオグラフ測定を行な
うことにより、検体ＤＮＡの塩基配列を決定する。

本発明の特徴的な要件である支持媒体上に分離Ｉｊ４関
されてなる放射性標識物質の位置情報を得るためのオー
トラジオグラフィーは、まず、」：記支持媒体と蓄積性
蛍光体シートとを一定時間重ね合わせて露光操作を行な
うことにより、支持媒体１の放射性標識物質から放出さ
れる放射線の少なくとも一部を該シートに吸収させる。

露光操作において、上記の支持媒体と蓄積性蛍光体シー
トとを重ね合わせた状態は、通常は′１＃積性蛍光体シ
ートと密着させることにより実現するが、必ずしも支持
媒体と蓄積性蛍光体シートとを密着させる必要はなく、
それらが近接した状態で配置されていてもよい。また、
支持媒体は必ずしも乾燥状態とする必要はなく、湿って
いてもよいし、あるいは所望により放射性標識されたＤ
ＮＡ断片からの放射線を妨げない程度の厚みのポリエチ
レンシート等で包まれていてもよい。

また、いわゆる露光時間は、支持媒体に含まれる放射性
標識物質の放射線強度、該物質の早、蓄積性蛍光体シー
トの感度、および支持媒体と蓄積性蛍光体シートとの位
置関係などにより変動するが、露光操作は一定時間、た
とえば数秒程度具１−は必要とする。ただし、本発明に
従って感光材料として蓄積性蛍光体シートを用いた場合
には、従来の放射線フィルムを使用する場合に必要な露
光時間に比較して、その露光時間は大幅に短縮される。

また、露光により支持媒体から蓄積性蛍光体シートに蓄
積記録された支持媒体中の放射性標識物質の位置情報を
読み出す操作において、該シ−１・に蓄積されているエ
ネルギーの強さ、分布、所望とする情報などに応じて各
種の電気的処理を施すことにより、たとえば得られる電
気信号の増幅率を任意の値に設定できるなど、得られる
位置情報を好適に処理することが可能となるため、露光
操作時における露光時間の厳密な制御は特に必要とはし
ない。

また、露光操作を実施する温度は特に制限はないが、本
発明における蓄積性ｆｉ？光体シートを利用したオート
ラジオグラフィーは、約１０〜３５℃などの環境温度に
て実施することがｉｉ）能である。

ただし、従来のオーｉ・ラジオグラフィーにおいて利用
されている低温（たとえば５°Ｃ伺近、あるいはそれ以
下の温度）において露光操作を行なうことも差しつかえ
ない。

１、記オートラジオグラフィーにおいて好適に使用され
る蓄積性蛍光体シートは、一般に基本構造として、支持
体と、この支持体上に設けられた輝尽性蛍光体を分散状
態で含有支持する結合剤からなる蛍光体層とから構成さ
れる。ただし、蛍光体層が自己支持性である場合には、
必ずしも支持体を設ける必要はない。

上記の構成を有する蓄積性蛍光体シートは、たとえば、
次に述べるような方法により製造することができる。

まず、輝尽性蛍光体粒子と結合剤とを適当な溶剤（たと
えば、低級アルコール、塩素原子含有炭化水素、ケトン
、エステル、エーテル）に加え、これを充分に混合して
、結合剤溶液中に輝尽性蛍光体が均一に分散した塗布液
を調製する。

結合剤の例としては、ゼラチン等の蛋白質、ポリ酢酸ビ
ニル、ニトロセルロース、ポリウレタン、ポリビニルア
ルコール、線状ポリエステルなどような合成高分子物質
などにより代表される結合剤を挙げることができる。

塗布液における結合剤と輝尽性ｉｉｇ光体との混合比は
、通常１：８乃至１：４０（屯＾１１ｔ）の範囲から選
ばれる。

次に、この塗布液を支持体の表面に均一に塗１（ｉする
ことにより塗布液の塗膜を形成する。この塗膜を徐々に
加熱することにより乾燥して、支持体」−へのイ１ｆ光
体層の形成を完ｒする。蛍光体層の層厚は、一般に５０
乃至５００ｇｍである。

支持体としては、従来の放射線写真法における増感紙（
または増感スクリーン）の支持体として用いられている
各種の材料から任意に選ぶことができる。そのような材
料の例としては、セルロースアセテート、ポリエチレン
テレフタレートなどのプラスチック物質のフィルム、ア
ルミニウム箔などの金属シート、通常の紙、バライタ紙
、レジンコ−１・紙などを挙げることができる。

なお、支持体の蛍光体層が設けられる側の表面には、接
着性付与層、光反躬層、光吸収層などが設けられていて
もよい。

以下全白 さらに、蛍光体層の支持体に接する側とは反対側の表面
に、蛍光体層を物理的および化学的に保護するための透
明な保護膜が設けられていてもよい。透明保護膜に用い
られる材料の例としては。

酢酸セルロース、ポリメチルメタクリレート、ポリエチ
レンテレフタレート、ポリエチレンを挙げることができ
る。透明保護膜の膜厚は、通常は約０．１乃至２０ルｍ
である。

また、蓄積性蛍光体シートの表面は必要に応じて、親水
化処理などの表面処理が施されていてもよい。

本発明において利用される′＃ｒ積性蛍光体シートに用
いられる輝尽性蛍光体は、先に述べたように放射線を照
射した後、励起光を照射すると輝尽発光を示す蛍光体で
あるが、実用的な面からは４゜Ｏ〜８５０ｎｍの波長範
囲の励起光によって３００〜５００ｎｍの波長範囲の輝
尽発光を示す蛍光体であることが望ましい。そのような
師尽性弗光体の例としては、 米国特許第３，８５９，５２７号明細書に記載されてい
るＳｒＳ：Ｃｅ、Ｓｍ、ＳｒＳ：Ｅｕ。

Ｓｍ、Ｔ’ｈＯｚ　：　Ｅ　ｒ、およびＬａ２Ｏ２Ｓ：
Ｅｕ、Ｓｍなどの組成式で表わされる蛍光体、特開昭５
５−１２１４２号公報に記載されているＺｎＳ　：Ｃｕ
　、Ｐｂ、ＢａＯ＠ｘＡｌ２Ｏ３：Ｅｕ［ただし、０．
８≦Ｘ≦１０］、および。

Ｍ２＋０・ｘｓｉ０２　：Ａ　［ただし、Ｍ２＋はＭｇ
、Ｃａ、Ｓｒ、Ｚｎ、Ｃｄ、またはＢａであり、ＡはＣ
ｅ、Ｔｂ、Ｅｕ、Ｔｍ、Ｐｂ、Ｔ文、Ｂｉ、またはＭｎ
であり、Ｘは、０．５≦Ｘ≦２．５である］などの組成
式で表わされる蛍光体、特開＋１ｆｌ　５５−１２１４
３　’−′Ｊ公報に記載されている　（Ｂ　ａ　１−ｚ
−ｙ　、Ｍｇｘ　、Ｃａｙ）　ＦＸ　：ａＥｕ２＋　（
ただし、ＸはＣｆｌおよびＢｒのうちの少なくとも一つ
であり、Ｘおよびｙは、０くＸ十ｙ≦０．６、かツｘ　
ｙ　＃　０−１１’あり、ａは、１０−”≦ａ≦５　Ｘ
　１０−”である］の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭５５−１２１４４吋公報に記載されているＬｎＯ
Ｘ：ＸＡ［ただし、ＬｎはＬａ、Ｙ、Ｇｄ、およびＬｕ
のうちの少なくとも一つ、ＸｊｉＣ文およびＢｒのうち
の少なくとも一つ、Ａ　１ｔＣｅおよびＴｂのうちの少
なくとも−・つ、そして、Ｘは、Ｏ＜ｘ＜Ｏ、ｌである
］の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭５５−１２１４５号公報に記載されてｌ、）る（
　Ｂ　ａ　１−　Ｘ　、　Ｍ　”　ｘ　）　Ｆ　Ｘ　：
　ｙ　Ａ　［ただし、ＭｌｌはＭｇ、Ｃａ、Ｓ　ｒ、Ｚ
ｎ、およびＣｄのうちの少なくとも一つ、ＸはＣ１、Ｂ
ｒ、およびＩのうちの少なくとも一つ、ＡはＥｕ、Ｔｂ
、Ｃｅ、Ｔｍ、　Ｄｙ、Ｐｒ、Ｈｏ、Ｎｄ、Ｙｂ、およ
びＥｒのうちの少なくとも一つ、そしてＸは、０≦Ｘ≦
０．６、ｙは、０≦ｙ≦０．２である］のＭ１或式で表
わされる蛍光体、 特開＋１？Ｊ　５５−１６００７８号公報に記載されて
いるＭ”ＦＸｅ　ｘＡ　：　ｙＬｎ　（ただし、Ｍｌは
Ｂａ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｍｇ、Ｚｎ、およびＣｄ（７）うチ
ノ少なくとも一種、ＡはＢｅ０１Ｍｇ０．ＣａＯ，５ｒ
Ｏ１ＢａＯ１ＺｎＯ，Ａｕ２０３、Ｙ２Ｏ３、Ｌ　ａ　
２０３、Ｉｎ２Ｏ２，５ＩＯｚ、１文０　。、　Ｚ　ｒ
０２　、　Ｇｅ０２　、　Ｓ　ｎ０２　、　Ｎ　ｂ　２
０５、Ｔａ２０５、およびＴｈＯ□のうちの少なくとも
〜・種、ＬｎはＥｕ、Ｔｂ、Ｃｅ、Ｔｍ、Ｄｙ、　Ｐｒ
、　Ｈｏ、　Ｎｄ、　Ｙｂ、　Ｅｒ、　Ｓｍ、およびＧ
ｄのうちの少なくとも一種、ＸはＣ又、Ｂｒ、およびＩ
のうちの少なくとも−・種であり、Ｘおよびｙはそれぞ
れ５Ｘ１０”−’≦ｘ≦０．５、およびＯくｙ≦０．２
である］の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭５６−１１６７７７号公報に記載されている（Ｂ
ａｔ−ｘ　、Ｍ”Ｘ）Ｆ２　ａ　ａＢａＸ２　：ｙＥｕ
、ｚＡ［ただし、Ｍ璽はベリリウム、マグネシウＪ＼、
カルシウム、ストロンチウム、　、ｒｎ＜鉛、およびカ
ドミウムのうちの少なくとも一種、Ｘは１１４素、臭素
、および沃素のうりの少なくとも一種、Ａはジルコニウ
ムおよびスカンジウムのうちの少な、くとも一種であり
、ａ、ｘ、ｙ、および２はそれぞれ０．５≦ａ≦１．２
５．０≦Ｘ≦１．１０−６≦ｙ≦２　Ｘ　ｌ　Ｏ−’、
およびＯ＜ｚ≦ｌＯ″′２であるコの組成式で表わされ
る蛍光体、特開昭５７−２３６７３号公報に記載されて
いる　（Ｂ　１ｉＬ１−Ｘ　、Ｍ”　Ｘ）　Ｆ　２　Ｉ
Ｉ　ａＢ　ａＸｚ　：ｙＥｕ、ｚＢ［ただし、Ｍｌはベ
リリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム
、亜鉛。

およびカドミウムのうちの少なくとも−・種、Ｘは塩素
、臭素、および沃素のうちの少なくとも一種であり、ａ
、ｘ、ｙ、およびＺはそれぞれ０．５≦ａ≦１．２５、
Ｏ≦Ｘ≦１．１０−”≦ｙ≦２×１０−１、およびＯ＜
ｚ≦２Ｘ１０−’である］の組成式で表わされる蛍光体
、 特開昭５７−２３６７５号公報に記載されている　（Ｂ
ａ　ｌ−ｘ　、Ｍ”ｘ）　Ｆ２　ｅ　ａＢａＸ　２　：
ｙＥｕ、ｚＡ［ただし１Ｍ１±ベリリウム、マグオ／つ
１．、カル／つ／、、　、　ＩＩ　ＩＩ　／Ｊ−２）　
１ｌＩＩ鉛およびカドミウムのうちの少なくとも一種、
Ｘは塩素、臭素、および沃素のうちの少なくとも一種、
Ａは砒素および硅素のうちの少なくとも一種であり、ａ
、ｘ、ｙ、およびＺはそれぞれ０．５≦ａ≦１．２５．
０≦Ｘ≦１、ｉｏ−’≦Ｖ≦２×１０−′、およびＯ＜
ｚ≦５ＸＩＯ−”である］の組威武で表わされる蛍光体
、 本出願人による特願昭５６−１６７４９８号明細書に記
載されているＭ”ＯＸ　：　ｘＣｅ　［ただしＭｌｌは
Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅ
ｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、およびＢｉからなる群より選ばれる少
なくとも一種の三価金属であり、ＸはＣ９，およびＢｒ
のうちのいずれか一方あるいはその両方であり、Ｘは０
＜ｘ＜０．１である］の組成式で表わされるイ１を光体
、本出願人による特願昭５７−８９８７５号明細−１に
記載されているＢ　ａ　１−　Ｘ　Ｍ　Ｘ　１２　Ｌ　
Ｘ　、ｔ２　Ｆ　Ｘ　：ｙＥｕ２＋［ただし、Ｍは、Ｌ
ｉ、Ｎａ、に、Ｒｂ、およびＣｓからなる群より選ばれ
る少なくとも一種のアルカリ金属を表わし；Ｌは、Ｓｃ
、Ｙ、Ｌａ、Ｃｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｇｄ、Ｔ
ｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙ　ｂ、Ｌｕ、Ａ文、Ｇ
ａ、Ｉｎ、およびＴｌからなる群より選ばれる少なくと
も一種の三価金属を表わし；Ｘは、ｃｘ、Ｂｒ、および
Ｉからなる群より選ばれる少なくとも一種のハロゲンを
表わし；そして、Ｘはｔｏ−”≦Ｘ≦０．５、ｙはｏ＜
ｙ≦０．１である］の組成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特願昭５７−１３７３７４号明細書に記
載されているＢａＦＸｓｘＡ：　ｙＥｕ”［ただし、Ｘ
は、Ｃ１、Ｂｒ、およびＩからなる群より選ばれる少な
くとも一種のハロゲンであり；Ａは、テトラフルオロホ
ウ酸化合物の焼成物であり；ソシテ、ｘ　ハ１０−”　
≦ｘ　≦Ｏ’、　１　、　’ｌ　ハ０くｙ≦０．１であ
る］の組成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特願昭５７−１５８０４８号明細書に記
載されているＢａＦＸ拳ｘＡ：　ｙＥｕ２＋［ただし、
Ｘは、Ｃ！１．Ｂｒ、および工からなる群より選ばれる
少なくとも一種のハロゲンであり；Ａは、ヘキサフルオ
ロケイ酸、ヘキサフルオロチタン酸およびヘキサフルオ
ロシルコニウド酸）−価もしくは二価金属の塩からなる
ヘキサフルオロ化合物群より選ばれる少なくとも−・種
の化合物の焼成物であり；そして、Ｘは１０−≦Ｘ≦０
゜１、ｙはｏ＜ｙ≦０．１である］の組成式で表わされ
る蛍光体、 本出願人による特願昭５７−１６６３２０号明細書に記
載されているＢａＦＸ＠ｘＮａＸ’：ａ　Ｅｕ　２＋　
［ただし、ＸおよびＸ”は、それぞれ０文、Ｂｒ、およ
びＩのうちの少なくとも一種であり、Ｘおよびａはそれ
ぞれ０　＜　ｘ≦２、および０＜ａ≦０．２である］の
組成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特願昭５７−１６６６９６号明細書に記
載されているＭ　”　Ｆ　Ｘ　ｅ　ｘ　Ｎ　ａ　Ｘ　’
　：ｙＥｕ２＋：ｚＡ［ただし、ＭＷは、Ｂａ、Ｓｒ、
およびＣａからなる群より選ばれる少なくとも一種のア
ルカリ−に類金）民であり；ＸおよびＸｏは、それぞれ
Ｃ１、Ｂｒ、および■からなる群より選ばれる少なくと
も一種のハロゲンであり；Ａは、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ
、Ｃｏ、およびＮｉより選ばれる少なくとも一種の遷移
金属であり；そして、Ｘは０＜ｘ≦２、ｙはｏ＜ｙ≦０
．２、および２は０　＜　ｚ≦１０−２である］の組成
式で表わされる蛍光体、 本出願人による特願昭５７−１８４４５５号明細書に記
載されているＭ　”　Ｆ　Ｘ　＊　ａ　Ｍ　”　Ｘ”・
ｂＭ’　”Ｘ”　２４　ＣＭ”Ｘ″’　３．　Ｘ　Ａ　
：　ｙ　Ｅ　ｕ　２＋［ただし、ＭｌｌはＢａ、Ｓｒ、
およびＣａからなる群より選ばれる少なくとも一種のア
ルカリ土類金属であり、　Ｍ　ＩはＬｉ、Ｎａ、に、Ｒ
ｂ、およびＣ８からなる群より選ばれる少なくとも−・
種のアルカリ金属であり；Ｍ′１はＢｅおよびＭｇから
なる群より選ばれる少なくとも−・種の二価金属であり
；　Ｍ　”はＡＪｌｊ、Ｇａ、Ｉｎ、およびＴｌかもな
る群より選ばれる少なくとも−・種の三価金属であり；
Ａは金属酸化物であり：ＸはＣ１、Ｂｒ、および工から
なる群より選ばれる少なくとも種のハロゲンであり；Ｘ
ｏ、Ｘ゛°、およびＸｏ゛は、Ｆ、Ｃ１、Ｂｒ、および
Ｉからなる群より選ばれる少なくとも一種のハロゲンで
あり；そして、ａはＯ≦ａ≦２、ｂは０≦ｂ≦１ｏ−２
、ＣはＯ≦Ｃ≦１０−２、かつａ＋ｂ＋ｃ≧１０−６で
あり；Ｘは０＜Ｘ≦０．５、ｙはＯ＜　ｙ　＜　０　、
２　テある］の組成式で表わされる蛍光体。

などを挙げることができる。

ただし、本発明の方法に用いられる蓄積性蛍光体シート
に含まれる輝尽性蛍光体は上述の蛍光体に限られるもの
ではなく、放射線の照射を受けたのち励起光の照射を受
けた場合に輝尽発光を示す蛍光体であればいかなるもの
であってもよい。

本発明に従うオートラジオグラフィーに利用される蓄積
性蛍光体シートの詳細については、たとえば本出願人に
よる特願昭５７−１９３４１８号明細書に記載されてい
る。

次に、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録された支持媒体に
の放射性標識物質の位置情報の読み出しが行なわれる。

この読み出し方法について、添伺図面の第１図に示した
読出’ＡＵｉＣあるいは読取装置ν１）の例を参照しな
がら略述する。

第１図は、蓄積性蛍光体シート（以下においては、シー
トと略記することもある）ｌにＰ？積記録されている放
射性標識物質の一次元的な位置情報を仮に読み出すため
の先読み用続出部２と、放射性標識物質の位置情報を出
力するためにシート１に蓄積記録されている放射線画像
を読み出す機能を有する本読み用読出部３から構成され
る装置置の例の概略図を示している。

先読み用読出部２においては次のような先読み操作が行
なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５は支持媒体６
を通過することにより、このレーザー光５による励起に
応じて蓄積性蛍光体シー｝１かも発生する輝尽発光の波
長領域に該当する波長領域の部分がカットされる。次い
でレーザー光は、カルへノミラー等の光偏向器７により
偏向処理され、平面反射鏡８により反射されたのちシー
｝　１　−Ｌに一次元的に偏向して入射する。ここで用
いるレーザー光源４は、そのレーザー光５の波長領域が
、シートｌから発する輝尽発光の主要波長領域と重複し
ないように選釈される。

蓄積性蛍光体シートｌは、上記の偏向レーザー光の照射
下において矢印９の方向に移送される６従って、シート
１の全面にわたって偏向レーサー光が照射されるように
なる。なお、レーザー光源４の出力、レーザー光５のビ
ー／．％ｌＹ、レーザー光５の走査速度、シー１−　１
の移送速度については、先読み操作のレーザー光５のエ
ネルギーが本読み操作に用いられるエネルギーよりも小
さくなるように調整される。

蓄積性蛍光体シート１は、」一記のようなレーザー光の
ＩＫ１射を受けると，蓄積記録されている放射線エネル
ギーに比例する光量の輝尽発光を示し。

この光は先読み用導光性シー｝１０に入射する。

この導光性シート１０はその入射面が直線状で。

蓄積性蛍光体シー１・１上の走査線に対向するように近
接して配置されており、その射出面は円環を形成し、フ
ォトマルなどの光検出器１１の受光面に連絡している。

この導光性シートｌＯは、たとえばアクリル系合成樹脂
などの透明な熱可塑性樹脂シートを加」二し一Ｃつくら
れたもので、入射面より入射した光がその内部において
全反射しながら射出面へ伝達されるように構成されてい
る。蓄積性ｉｉｒ光体シートｌからの輝尽発光はこの導
光性シー｝　１０内を導かれて射出面に到達し，その射
出面から射出されて光検出器１ｌに受光される。

光検出器１１の受光面には、輝尽発光の波長領域の光の
みを透過し、励起光（レーザー光）の波長領域の光をカ
ットする支持媒体が貼着され、輝尽発光のみを検出しう
るよラにされている。光検出器ｌｌにより検出された輝
尽発光は電気信号に変換され，さらに増幅器ｌ２により
増幅され出力される。増幅器ｌ２から出力された蓄積記
録情報は、本読み用続出部３の制御回路１３に入力され
る。制８回路１３は、得られた蓄積記録情報に応じて、
濃度およびコントラス１・が最も均一でかつ観察読影性
能の優れた画像が得られるように、増幅率設定値ａ、収
録スケールファクターｂ、および、再生画像処理条件設
定値Ｃを出力する。

以」二のようにして先読み操作が終了した蓄積性蛍光体
シートｌは、本読み用読出部３へ移送される。本読み用
読出部３においては次のような本読み操作が行なわれる
。

本読み用レーザー光源ｌ４から発せられたレーザー光ｌ
５は、前述の支持媒体６と同様な機能を有する支持媒体
１６を通過したのちビーム・エクスパンダ−１７により
ビーム径の大きさが厳密に調整される。次いでレーザー
光は、ガルバノミラ−等の光偏向器１８により偏向処理
され、平面反射鏡１９により反射されたのら蓄積性蛍光
体シート１　、、ｈに一次元的に偏向して入射する。な
お、光偏向器１８と平面反射鏡１９との間にはｆＯレン
ズ２０等が配置され、シート１の上を偏向レーザー光で
走査した場合に、常に均一なビーム速度を維持するよう
にされている・ 蓄積性蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー光の照射
「において、矢印２１の方向に移送される。従って、先
読み操作におけると同様にシートｌの全面にわたって偏
向レーザー光が照射されるようになる。

蓄積性蛍光体シート１は、上記のようにしてレーザー光
の照射を受けると、先読み操作におけると同様に、蓄積
記録されている放射線エネルギーに比例する光量の輝尽
発光を発し、この光は本読み用導光性シート２２に入Ｑ
１する。この本読み用導光性シート２２は先読み用導光
性シートｌＯと同様の材質、構造を有しており、本読み
用導光性シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれ
た輝尽発光はその射出面から射出されて、光検出器２３
に受光される。なお、光検出器２３の受光面には輝尽発
光の波長領域のみを選択的に透過する支持媒体が貼着さ
れ、光検出器２３が輝尽発光のみを検出するようにされ
ている。

光検出器２３により検出された師Ｍ発光は電気信号に変
換され、前記の増幅率設定値ａに従って感度設定された
増幅器２４において適正レベルの電気信号に増幅された
のち、Ａ／Ｄ変換器２５に入力される。Ａ／Ｄ変換器２
５は、収録スケールファクター設定値すに従い信号変動
幅に適したスケールファクターでデジタル信５Ｊ−に変
換され、信す処理回路２６に入力される。信号処理回路
２６では、再生画像処理条件設定値Ｃに基づいて、濃度
およびコントラストが適止で観察読影性能の優れた可視
画像が得られるように信号処理が行なわれ、処理された
情報は磁気テープなどの保存手段に蓄えられる。次いで
、必要に応じて所望の記録装置（図示なし）に伝送され
る。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレーザー光
等で走査して光学的に記録するもの、ＣＲＴ等に電子的
に表示するもの、ＣＲＴ等に表示された放射線画像をビ
デオ・プリンター等に記録するもの、熱線を用いて感熱
記録材料上に記録するものなど種々の原理に基づいた記
録装置を用いることができる。

ただし、記録装置は上記のように可視画像化するものに
限られるものではなく、前述したように放射性標識物質
の二次元的な位置情報を、たとえば数値化もしくは記号
化するなどして記録することもできる。

なお１本発明における蓄積性イ１？光体シートに蓄積記
録された支持媒体」二の放射性標識物質の位置情報を読
み出すための方法について、上記においては先読み操作
と本読み操作とからなる読出し操作を説明したが、本発
明において利用することができる読出し操作は、上記の
例に限られるものではない。たとえば、支持媒体上の放
射性物質の放射線°強度および、その支持媒体について
の蓄積性蛍光体シートの露光時間が予めわかっていれば
、上記の例において先読み操作を省略することもできる
。

また、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄積記録さ
れた放射性標識物質の位置情報を読み出すだめの方法は
、」；記に例示した方法に限られるものではない。

このようにして得られた支持媒体−４−の放射性標識物
質の二次元的な位置情報に基づいて、ＤＮＡの塩基配列
を決定することができる。すなわち、末端がそれぞれＡ
、Ｇ、Ｔ、Ｃのうちのいずれかの特定の塩基のみからな
る合成りＮＡ断片混合物（塩基特異的ＤＮＡ合成物）の
各分ａ　ｊｊ％開列間で放射性標識物質の位置（泳動距
＃）を相互に比較することにより、泳動距離の長い順に
末端の１Ｍ基を帰属させていくことにより、その塩基配
列を決定することができる。

なお、このようにしてＤＮＡ合成物に対して１真１基配
列を決定することは、に記の一本鎖のＤＮＡ合成物が目
的とする検体ＤＮＡの片方のＤＮＡ鎖と相補的であると
ころから、二本鎖の検体ＤＮＡのうちの一本鎖の塩基配
列を決定することに等しい。そして、この塩基配列の決
められた片方のＤＮＡ鎖から、二本鎖の検体ＤＮＡ全て
についてその塩基配列を決定することができる。あるい
は、検体ＤＮＡが一本鎖のものである場合には、ＤＮＡ
合成物に対して塩基配列を決定することによってこれに
相補的なりＮＡの塩基配列が決定されることになり、得
られた塩基配列から一本鎖の検体ＤＮＡの塩基配列を決
定することができる。

本発明において、オートラジオグラフィーを利用して支
持奴体上の放射性標識物質の二次元的な位４情報を得る
ことによりＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、上記の
ような放ｒＡＪ線フィルム等にオートラジオグラフを可
視画像化する方法に限られるものではなく、たとえば、
その位置情報を数値化もしくは記号化することにより、
得られた数値・記号等のデジタル値に基づいてＤＮＡの
塩基配列を決定することも可能である。

さらには、得られたデジタル信吟にＤＮＡの塩基配列決
定のための好適な信号処理を行なうことにより、直接に
検体ＤＮＡの塩基配列を得ることも可能である。このよ
うな信号処理方法については、たとえば本出願人による
下記の特許出願の明細書に記載されている。

特願昭５８−１３２６号、特願昭５８−１３２７号、特
願昭５８−１３２８号および４．￥即閉５８−１３２９
号。

Ｌ記においては、サンカー・クールシン法のうちジデオ
キシ法を利用するＤＮＡの塩基配列決定方法について説
明したが、本発明の方法は、−に記のジデオキシ法に限
定ｙれるものではなく、プラス中マイナス法などの別の
サンガーΦクールソン法に適用することもできる。さら
に、本発明の方法はサンガー・クールシン法に限られる
ものではなく、オートラジオグラフィーによりＤＮＡ合
成物を利用してその塩基配列を決定することができる方
法であればいかなる方法にも適用することが１丁能であ
る。

また、合成りＮＡ断片に放射性標識を付与するするため
に、ヌクレオチドに用いられる放射性核種の例としては
、３２Ｐ、３　ＩＩ、１４　Ｃ、３５Ｓを挙げることが
できる。

次に本発明の実施態様を、前述のジデオキシ法を利用し
たサンカーφクールソン法を例にして記載する。なお、
以下の実施例および比較例において用いた検体ＤＮＡ　
（プラスミドｐＢＲ３２２）は既にその塩基配列が解明
されており、得られた塩基配列の結果を、それらの既知
データと比較して評価した。

また、以下の実施例において使用した蓄積性蛍光体シー
トは下記の方法により製造されたものである。

輝尽性の二価のユーロピウム賦活弗化臭化バリウム蛍光
体（ＢａＦＢ’ｒ　：　Ｅｕ２））ｃｒ）粒子と線廿ポ
リエステル樹脂との混合物にメチルエチルケトンを添加
し、さらに硝化度１１．５％のニトロセルロースを添加
して蛍光体粒子を分散状態で含有する分散液を調製する
。次に、この分散液に燐酸トリクレジル、ｎ−ブタノー
ル、そしてメチルエチルケトンを添加したのち、プロペ
ラミキサーを用いて充分に攪拌混合して、蛍光体粒子が
均一に分散し、結合剤と蛍光体との混合比が１＝２５（
重亀比）かつ粘度が２５〜３５ＰＳ　（２５°Ｃ）の塗
布液を調製する。

次に、ガラス板上に水平に置いたカーボンブラック練り
込みポリエチレンテレフタレートシート（支持体、厚み
：２５０ルｍ）のにに塗布液をドクターブレードを用い
て均一に塗布する。そして塗布後に、塗膜が形成された
支持体を乾燥器内に入れ、この乾燥器内部の温度を２５
℃から１００°Ｃに徐々に」二昇させて、塗膜の乾燥を
行なった。

このようにして、支持体−１；に層がか３００ルｍの蛍
光体層を形成する。

そして、この蛍光体層の上に、透明なポリエチレンテレ
フタレートフィルム（厚み：１２μｍ）の片面にポリエ
ステル系接着剤を付与、したのち、接着剤層側を下に向
けて置いて接着することによリ、保護膜を形成し、支持
体、蛍光体層および保ａ膜から構成された蓄積性蛍光体
シートを製造する。

［実施例１］ （１）検体ＤＮＡを含むテンブレー）ＤＮＡの調製 常法により、大腸菌プラスミドＤＮＡ　（ＰＢＲ３２２
）を制限酵素Ｂｉｎｄ−ＩＩにより切断してＤＮＡ断片
１１００ｎを得た。これに、バクテリオファージＭ１３
ｍｐＢ株（アマジャム社製、Ｎ４５０１）を上記と同じ
制限酵素Ｈｉｎｄ−Ｍで処理したちの２０　ｎｇをベク
ターＤＮＡとして加え、Ｔ４Ｄ　ＮＡリガーゼを用いて
常法により接合させた。その後、対数成長期にあるＥ、
Ｃｏ１１Ｋ　ｌ　２株にこの組換えＤＮＡを感染させて
、−夜培養した。

得られた組換えＤＮＡ（Ｍｌ：Ｓ）を含むＥ、Ｃｏ１１
培養閑（無色のプラーク）１ｍＭを、２ＸＴＹ培ｔｅｌ
（１ｉ当り、バクトドリプＩ・ン１６ｇ、イースト抽出
物１０ｇ、および塩化すトリウム５ｇを含む）１００ｍ
ｆＬ上に木製のカスチルスティックを用いて植え付けた
。これを培養管に移して３７°Ｃの温度で５時間振とう
したのち、遠心分離を行なってその上澄み液を採取する
ことにより、大腸菌を注意深く除去した。

この上澄み液を２０％ＰＥＧ　（ポリエチレングリコー
ル８０００）と２．５Ｍ塩化ナトリウムとを含む液に加
え、よく攪拌したのち、遠心分離によりＰＥＧ層を取り
除いた。底部に残ったペレット状の固形物にＴＥ緩衝液
（１０ｍＭトリス・塩酸溶液および１ｍＭのＥＤＴＡを
含む、ｐＨ８，０）１００ＪＬｕを加え、次いでＴＥ＃
ｌｆ＃１液で飽和されたフェノール５０終りを加えて攪
拌したのち、室温で１５分間放置した。得られた懸濁液
に遠心分離を行ない、その上澄み液を３Ｍ酢酸ナトリウ
ム溶液１ｏａｎ中に移し、さらにエタノール２５０ｐＬ
交を加えて一２０°Ｃの温度で一夜放置した。これを遠
心分離にかけて、その沈澱物を冷メタノールで洗浄し、
乾燥したのち、乾燥物をＴＥ緩衝液５０．９．に溶解し
て検体ＤＮＡを含むテンブレー）ＤＮＡ溶液を得た。

（２）テンブレー１・ＤＮＡ上へのプライマーのハイブ
リダイゼーション 蒸留水２．５ｇＭに、上記のテンプレートＤＮＡ５ｐ−
１、Ｍ１３プライマー（アマジャム社製、Ｎ４５０２）
　１　ｇｌおよび旧ｅｎｏｗ反応緩衝液（１０ｍ　Ｍ　
ｌ・リス、ｐＨ８，５および１０ｍＭ塩化マグネシウム
を含む）１．５ＩＬＪｌｊを加えた後、５５〜６０°Ｃ
の温度で２時間培養して、プライマーがハイブリダイズ
したテンブレー）ＤＮＡを得た。

（３）合成反応 り記のプライマーがハイブリダイズしたテンプレートＤ
ＮＡに、［α−３２ＰｇｌｄＡＴＰ（比放射能：　８０
０　Ｃｉ／　ｍｍｏｌｅ、アマジャム社製、Ｐ８１０３
８４）２μ文およびＫｌｅｎｏ賛フラグメント（ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ）　ｌ　ＩＬ！Ｊ、　（ｌｕｎｉｔ）を
加えた。四本の試験管にこの混合物を２．５ｐＬ文ずつ
取り、さらに下記の第１表に示される成分からなる反応
用モノヌクレオチドの混合液（Ａ＃、Ｃ＃、Ｇ＃または
Ｔ＃）２１１．文を添加して混合し、四種類の混合液を
得た。これらの混合液を室温にて１５分間反応させた後
、それぞれにチェイス反応溶液（０，５ｍＭの四種のモ
ノデオキシヌクレオシドトリフオスフェートの混合液）
２μ文を加えて、さらに１５分間反応させた。次いで。

イオン交換処理したホルムアミド４舊文を加えて反応を
停止させた。

第１表 Ａ＃　Ｃ＃　Ｇ＃　Ｔ＃ １ＸＴＥ緩衝液　２０　２０　２０　２００．５ｍＭｄ
ＣＴＰ　２０　１　２０　２００．５ｍＭｄＧＴＰ　２
０　２０　１　２００．５ｍＭｄＴＴＰ　２０　２０　
２０　１０．１ｍＭｄｄＡＴＰ　８０　−　−　−０．
１＋ａＭｄｄＣＴＰ　−６０−− ０，３ｍＭｄｄＧＴＰ　６０　− ０．５ｍＭｄｄＴＴＰ　−−−６０ このようにしてＡ＃〜Ｔ＃の四種類の溶液を用いて合成
することにより、アデニン（Ａ）特異的ＤＮＡ合成物、
シトシンＣＣ＞特異的ＤＮＡ合成物、グアニン（Ｇ）特
異的ＤＮＡ合成物、およびチミン（Ｔ）特異的ＤＮＡ合
成物を得た。

（４）電気泳動用ゲルの調製 アクリルアミド５．７ｇ、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアク
リルアミド０．３ｇ、尿素４２ｇおよび２０ｍＭのＥＤ
ＴＡを含む１．０Ｍ）リス・ホウ酸緩衝液（ｐＨ５３，
３）１０ｍ文を蒸留水に溶解して全綴を１００ｍ１とし
たゲル液を得た。このゲル液に窒素ガスを吹込んで酸素
を除いた後、これに１０％過硫酸アンモニウム水溶液６
００μ文と触媒のＴＥＭＥＤ　（テトラメチルエチレン
ジアミン）２５．文を加えた。このようにして処理した
ゲル液を、充分に洗浄した二枚の厚さ３ｍｍのカラス板
から形成したモールド（０，５ｍｍＸ２００ｍｍＸ４０
０ｍｍ）の中に注入し、さらに」二記のゲル液の上端部
に、四個のスロット（各、０．５ｍｍＸ１５ｍｍＸ２０
ｍｍ）形成用のスロｙ）フォーマ−を挿入したのち、−
夜装置してゲル化させて目的の四個のスロットを有する
電気泳動用ゲルを調製した。

（５）電気泳動操作 ト述のようにして調製されたゲルを電気泳動装置に装着
したのち、 第１スロツトに（−Ａ）特異的ＤＮＡ合成物、第２スロ
ツトに（Ｃ）＃異的ＤＮＡ合成物、第３スロツトに（Ｇ
）特異的ＤＮＡ合成物、第４スロツトに（Ｔ）＃異的Ｄ
ＮＡ合成物、各々２ル見を、ミクロピペットを用いて注
入した。この際に、スロットに電極液を吹き付けること
により、ゲル中から溶出する尿素を除去してスロットを
洗浄したのち、上記ＤＮＡ合成物の注入を行なった。

このゲルに２０００Ｖ／４０ｃｍの直流電圧を印加して
試料の電気泳動を行なった。電気泳動は、ＤＮＡ試料中
に予め添加しておいたマーカー色素ＢＰＢ　（ブロムフ
ェノールブルー）がゲルの下端から約３ｃｍの位置に達
するまで継続したのち電源を切り、ゲルを泳動装置から
取り外した。

次いで一方のガラス板を除去したのち、ゲルを１０％酢
酸中に１５分間ずつ液を換えて数回浸漬してＤＮＡを固
定し、さらにゲルを濾紙上に移し、減圧下にて加熱乾燥
した。

（６）オートラジオグラフ測定操作 １−記において得られた乾燥ゲルと蓄積性蛍光体シート
とを重ね合わせてカセット内に収納し、室温（約２０°
Ｃ）にて、４０分間露光したのち、第１図に示した読出
装置に装填して、蓄積性蛍光体シートに転写蓄積された
ゲル支持媒体上の放射性標識物質の位置を示す凹刻のオ
ートラジオグラフを読み出し、次いでその位置情報をデ
ジタル信号として記憶装置に保存させた６ １、記のデジタル情報に基づいてオートラジオグラフの
Ｏｊ視両画像得たところ、鮮明な画像が得られた。そし
て、この可視化されたオートラジオグラフを既知の大腸
菌プラスミドＩ）ＮＡ（ｐＢＲ３２２）のオートラジオ
グラフと１１＜１合したところ、充分な一致が見られた
。

（７）ＤＮＡの塩基配列の決定 得られたオートラジオグラフ上の各々のスロットの泳動
列において、スロットの底から各泳動帯（分子量の相違
によって分離された放射性標識ＤＮＡ断片に対応してい
る）までの距離を測定し、最も泳動距離の大きいものか
ら順に並べることにより数列（ｘ　’＋　１を得た。こ
こで、Ｘは泳動［離、ｙは各塩基別のスロットに対応す
る記号（この場合は、第１スロツトがＡ、第２スロット
がＣ１第３スロツトがＧ、そして第４スロツトがＴであ
る）、ｉは上記のようにして並べたときの順位を意味す
る。

次に、全てのｘｙＩについてそのスロットに対応する記
号（ｙ）を順に並べることにより、ＤＮＡの塩基配列を
得た。

以上のようにして得られた塩基配列は、調査対象とした
大腸菌プラスミドＤＮＡ　（ｐＢＲ３２２）の既知の塩
基配列に一致した。

上記の結果から、蓄積性蛍光体シートを用いて室温で短
時間のオートラジオグラフィー操作を行なうことにより
、バクテリオファージＭ１３を用い−Ｃクローニングし
たｐＢＲ３２２の塩基配列をジデオキシ法によって決定
できることが明らかである。

［比較例１］ 実施例１の（６）オートラジオグラフ測定操作において
、乾燥ゲルによる蓄積性蛍光体シートの露光操作を、蓄
積性ｆｉｔ光休シ体トの代りにＸ線フィルム（ＲＸタイ
プ：富１−写ｒｔフィルム■製）と蛍光増感紙（ライト
ニングプラス：米国デュポンン１製）とを組合わせて使
用し、通常のＸ線フィルム用カセツテに収納して実施例
１と同一の条件（室温、４０分間露光）にて露光操作を
行なった。

次いでｘ！ｌａフィルムを現像したが、判読Ｈｆ能なオ
ートラジオグラフを得ることができなかった。

次に−１，記の露光操作を、通常のジデオキシ法に準じ
て一８０℃にて１０００分間実施したのち。

同様にＸ線フィルムを現像したところ、実施例１にてＩ
ｉｆ視画像画像て得られたオートラジオグラフと同程度
の鮮明度を有するオートラジオグラフを得ることができ
た。ここで得られたオートラジオグラフは、実施例１に
おいて可視画像として得られたオートラジオグラフと一
致した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において蓄積性蛍光体シートに転写蓄
積された試料中の放射性標識物質の位置情報を読み出す
ための読出装置（あるいは読取装置）の例を示すもので
ある。 ■＝蓄積性蛍光体シート、２：先読み用続出部、３：本
読み用続出部、４：レーザー光源、５：レーザー光、６
：フィルター、７：光偏向器、８：平面反射鏡、９：移
送方向、ｌＯ：先読み用導光性シート、ｌｌ：光検出器
、１２：増幅器、１３：制御回路、１４：レーザー光源
、１５：レーザー光、１６：フィルター、１７：ビーム
・エクスパングー、１８：光偏向器、１９　：　ｔ１ｚ
面反射鏡、２０：ｆθレンズ、２１：移送方向、２２：
本読み用導光性シート、２３：光検出器、２４：増幅器
、２５　：　Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処理回路 手続補正書 昭和５９年１月２５日 昭和５８年　特　楢　Ｍ１第２０１２３１号３、　補正
をする者 ′１１１４１１との関係　＠詐出願人 ４代理人 （ｉ、ｈｌｉ正により増加する発明の数　な　し７　補
正の対象 明細書の１発明の；１ＹＪｉＵな説明」の欄明細書の「
発明の詳細な説明」の欄を下記の如く補＋Ｅ致します。 記 −」組ＥｆＬ−−辿止栽一 （＋）　４８頁１行目　カステルスティ、り　→　カク
テルステインク（２）　５１頁１５行目　２５ル父　→
　圭旦且去席（３）　５３頁８行目　４０分　→　−Ｌ
Ｊ分−を組合わせて （５）５５頁１１行目使用シ、　→　１ｕｌｌ。 （ｅ）　５５Ｌｔ１３行目　４０分　→　工旦分（７）
　５５頁１７行目　１０００分　→　↓Ａ立９分以　１
−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ｏ　（１）塩基配列を決定しようとしているＤＮＡも
   しくはＤＮＡ断片物と相補的な塩基配列を４３し、かつ
   放射性標識が４−Ｊｌｊ＝されているＤＮＡ合成物から
   なる１９合物を調製する１程；（２）該ＤＮＡ合成物か
   らなる混合物を支持媒体１−で分Ｉ１１展開させる工程
   ； （３）該支持媒体と、輝尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍
   光体シー１・とを・定時間重ね合わせることにより、該
   支持媒体上の放射性標識物質から放出される放０１線エ
   ネルギーの少なくとも一部を該蓄Ｊ＋−性蛍光体シート
   に吸収させたのち、該シートを電磁波により励起しＣ＋
   ＋にシートに蓄積されて１戸る成用線エネルギーを師Ｊ
   、＜光として放出させ、そしてその輝尽光を検出するこ
   とにより、放射性標識が伺！ｊ、されたＤＮＡ合成物の
   位置情報を得る工程：および、 （４）得られた位置情報に基づいて、１」的のＤＮＡも
   しくはＤＮＡ断片物の塩基配列を決定する工程； を含むことを特徴とするオートラジオグラフィーによる
   ＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物の塩基配列決定方法。 ２゜−に記（１）の工程において、ＤＮＡ合成物をサン
   ガー・クールンンＪノ；により合成することを４．９徴
   とする特許請求の範囲第１項記載のオートラジオグラフ
   ィーによるＤＮＡもしくはＤＮＡ断ノ断物１物基配列決
   定方法。 ３゜上記（１）の１程において、ＤＮＡ合成物をジデオ
   キシ法により合成することを！ＩＨ２Ｊとする特、１１
   請求の範囲第２項記載のオートラジオグラフィーによる
   ＤＮＡもしくはＤＮＡ断ノ断物１物Ｊ、Ｂノ、（配列法
   定力〃、。 ４゜上記（２）の工程において、ＤＮＡ合成物の混合物
   をゲル電気泳動により分１！１１：　ＩＮ開させること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれ
   かの項記載のオーＩ・ラジオグラフィーによるＤＮＡも
   しくはＤＮＡ断片物の塩基配列決定方法。 ５、に記（３）の］二程において、蓄積性蛍光体シート
   を電磁波で時系列的に走査することにより励起すること
   を特徴とする特、ｉｌ−請求の範囲第１項乃至第３項の
   いずれかの項記載のオートラジオグラフィーによるＤＮ
   Ａもしく　ｌ；ｌ：　Ｄ　Ｎ　Ａ断片物の塩基配列決定
   方法。 ６゜−１−記（３）の１程において、放射性標識物質の
   位置情報を画像として得ることを特徴とする特１ｉ１請
   求の範囲第１ｑ４乃至ｆ５３項のいずれかの項記載のオ
   ーｉ・ラジオグラフィーによるＤＮＡもしくはＤＮＡ断
   片物の塩基配列決定方法。 ７゜上記（３）の１程において、放射性標識物質の位置
   情報を記号および／または数値として得ることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項乃至第３ダ１のいずれかの項
   記載のオー；・ラジオグラフィーによるＤＮＡもしくは
   ＤＮＡ断」１物の塩基配列決定方法。 ８゜上記蓄積性蛍光体シートが、支持体、輝尽性蛍光体
   を結合剤中に分散してなる蛍光体層および保護膜を含む
   ものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至
   第３項のいずれかの項記載のオートラジオグラフィーに
   よるＤＮＡもしくはＤＮＡ断片物のｌｉ基配列決定方法
   。