EP0904409A1 - Verfahren zur dns-analytik von blut und mittel zur durchführung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur dns-analytik von blut und mittel zur durchführung des verfahrens

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EP0904409A1
EP0904409A1 EP97924874A EP97924874A EP0904409A1 EP 0904409 A1 EP0904409 A1 EP 0904409A1 EP 97924874 A EP97924874 A EP 97924874A EP 97924874 A EP97924874 A EP 97924874A EP 0904409 A1 EP0904409 A1 EP 0904409A1
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EP97924874A
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Richard Grosse
Eva Spitzer
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Institut fur Medizinische Molekulardiagnostik Gbrmbh
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Institut fur Medizinische Molekulardiagnostik Gbrmbh
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Abstract

Das erfindungsgemäße Verfahren zur DNS-Analytik im Blut ist dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Blut zum Transport bzw. zur Lagerung auf einen saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebracht wird, der vorzugsweise eine Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm2 aufweist. Dieser Flächenträger wird anschließend mit Wasser inkubiert, die erhaltene Blutzellsuspension wird konzentriert, mit einem chelierenden Agens versetzt und auf exakt 100 °C erhitzt, danach zentrifugiert, und die als Überstand erhaltene DNS-Lösung, ggf. nach weiterer Lagerung bei -20 °C, wird in an sich üblicher Weise analysiert.

Description

Verfahren zur DNS-Analytik von Blut und Mittel zur Durchführung des Verfahrens
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur DNS-Analytik von Blut und ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.
Es gilt heute als gesichert, daß mindestens 5000 Krankheiten genetisch bedingt, das heißt erblich übertragbar, sind. Etwa 450 Erbkrankheiten sind aufgrund der Entschlüsselung der zugrunde liegenden Gene und ihrer krankheitsauslösenden Defekte (Genmutationen) einer Diagnostik zugänglich (JAMA: Statement on use of DNA testing for presymptomatic identification of cancer risk 271, 785 (1994)). Die meisten dieser Erbkrankheiten sind monogen ( gleichbedeutend mit der Zuordnung nur eines einzelnen Gens zu einer bestimmten Krankheit) und umfassen relativ seltene Krankheiten, die im frühen Kindesalter auftreten und als unheilbar gelten. Dazu gehören beispielsweise Mukoviszidose, Muskeldystrophie oder das Fragile(X) Syndrom (BioEssays: Trinucleotide repeat expansion and human genetic diseases 16, 277 (1994)). In den letzten 5 Jahren hat sich überraschend herausgestellt, daß auch eine Vielzahl von sogenannten Volkserkrankungen vererbt werden können. Dazu gehören solche häufig vorkommenden Krankheiten wie Hypertonie und Arteriosklerose, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Diabetes, Alzheimer u.a. Die meisten dieser Krankheiten können bei rechtzeitiger Diagnose erfolgreich therapiert werden. Damit haben sich die Anwendungsmöglichkeiten der Gendiagnostik dramatisch erweitert. Familiäre Hyper¬ cholesterinämie (FH) zum Beispiel ist eine der am häufigsten auftretenden autosomal dominanten Erbkrankheiten (etwa 1 von 500 Menschen, Arterosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology: Vol. 15, 12 (1995)) mit einem starken Risiko für Herzinfarkt. Ein Gentest für FH würde Hochrisikopatienten 2 frühzeitig erfassen und einer gezielten medikamentösen Therapie mit Cholesterinsenkern zuführen, die das Infarktrisiko deutlich senkt. Davon wären in Deutschland mehrere 100.000 Menschen betroffen. Ähnliche Betrachtungen gelten für die Früherkennung von Krebsrisikopatienten. Der Gentest ist die genaueste
Vorsorgemaßnahme, da er die Ursache, nicht das Symptom, der
Krankheit bestimmt. Wir sprechen in diesem Zusammenhang von der präsymptomatischen, also vorbeugenden genetischen Diagnostik.
In den USA belaufen sich wirtschaftliche Betrachtungen zum Gen- testmarkt auf etwa 7 Milliarden Dollar für die kommenden 5-10
Jahre.
Die molekulargenetische Gendiagnostik wird in folgenden Schritten durchgeführt (Nature Medicine: Analysis of mismatch repair genes in hereditary non-polyposis colorectal cancer patients 2, 169 (1996)):
1. Aus einer Blutprobe wird DNS isoliert;
2. Mittels Polymerasen-Ketten-Reaktion (PCR) wird ein die Mutation enthaltender DNS-Abschnitt amplifiziert;
3. Der mutierte und der normale DNS-Abschnitt werden durch gelelektrophoretische Trennverfahren und/oder Southern Blots miteinander verglichen.
4. In besonderen Fällen muß der DNS-Abschnitt zur Identifizierung einer unbekannten Mutation sequenziert werden.
Als Ausgangsmaterial zur Präparation reiner DNS in der molekularbiologischen Forschung ist Vollblut üblich. Zur Reinigung derartiger DNS ist eine Mindestmenge an Blut von 5-10 ml notwendig.
Üblicherweise wird die DNS nach folgendem Schema (Proc.Natl.Acad.Sc. : Analysis of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants 74, 1245 (1977)) gereinigt, das von den Laboren noch unterschiedlich verifiziert wird: - ca. 10 ml EDTA Blut werden im Puffer lysiert, der 1% Triton x-100 enthält;
- 10 min Zentrifugation;
- Aufnahme des Pellets in 1 ml 0,9% NaCl; - Lyse in 10% SDS plus EDTA;
- Zugabe von Na-perchlorat;
- Zugabe von Chloroform/Octanol zur Herausbildung von 2 Phasen;
- 20 min Zentrifugation;
- obere Phase plus 5ml Chloroform; - 5 min Zentrifugation;
- obere Phase abnehmen;
- mit Isopropanol die DNS fällen und mit Glasstab aufwickeln;
- in kaltem Alkohol waschen;
- in NaCl/Na-citrat über Nacht lösen; - Umfallen mit Alkohol, zentrifugieren, trocknen und bei -20°C aufbewahren.
Der Nachteil dieses bisher in der klinischen Diagnostik angewandten Verfahrens besteht darin, daß generell 5-10 ml EDTA-Blut des Patienten (immer Venenblut!) innerhalb von 48 Std. kühl gelagert in das genetische Labor transportiert werden müssen.
Das erfordert gewöhnlich einen Express-Probentransport bevorzugt auf Eis, dem sich die 2 tägige DNS-Isolierung anschließt. Der eigentliche Gentest mit der PCR beginnt also erst etwa 4 Tage nach Blutabnahme in der Arztpraxis. Das bedeutet, daß beispielsweise die Diagnose für den Gentest Mukoviszidose frühestens nach 14 Arbeitstagen gestellt werden kann. Schickt der Arzt das Blut nicht sofort nach Entnahme per Express ein, so gerinnt das Blut häufig, wodurch eine ordentliche DNS-Isolierung unmöglich wird.
Von der Firma Fitzco, Inc., Maple Piain, MN, USA ist ein FTA®
Gene Guard System für Blutproben zur DNA-Analyse mittels PCR bekannt, das ein komplexes System für die Kollektion, den Transport, die Lagerung und Reinigung von DNA darstellt. Es umfaßt ein Reinigungsreagenz, einen Kollektions- und
Reinigungskit sowie eine Stanze. Dieses System ist jedoch relativ teuer, da es für jeden Patienten dieses speziell kostenaufwendig vorbehandelten Trägers bedarf.
Die Erfindung hat deshalb das Ziel, den Gentest für die medizinische Diagnostik zu verbessern. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, ein schnelles, unkompliziertes und kostensparendes Verfahren zur Erfassung von Blutproben durch den Hausarzt und selbstversorgenden Patienten und ihrer Weiterverarbeitung zu entwickeln. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Mittel zum Transport und zur Lagerung von Blutproben bereitzustellen.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Das Verfahren zur DNS-Analytik im Blut beruht auf der überaschenden Erkenntnis, daß eine vorhandene Blutraenge 0,05 ml Blut pro cm3 eines Flächenträgers nicht übersteigen darf, da ansonsten die PCR gehemmt wird. Dies ist darauf zurückzuführen, daß Blutproteine, wie z.B. Hämoglobin, Metallionen wie Fe oder Zn tragen, welche die PCR hemmen.
Erfindungsgemäß wird das zu untersuchende Blut zum Transport bzw. zur Lagerung auf einen saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebracht, dieser Flächenträger wird zur Analyse mit Wasser inkubiert und die erhaltene Blutzellsuspension wird konzentriert. Das geschieht vorzugsweise durch schnelle Zentrifugation, besonders bevorzugt für 3 Minuten bei 14.000 x g. Man erhält einen festen Pellet, der weiter verarbeitet wird; der Überstand wird zu über 90 % verworfen.
Anschließend versetzt man den Pellet mit einem chelierenden Agens und erhitzt bis zu 100 °C. In einer bevorzugten
Ausführungsvariante erfolgt dieses Erhitzen in zwei Etappen; in einem ersten Schritt auf 50 bis 60 °C und anschließend auf 100 °C. Erfindungsgemäß kann das Erhitzen auch sofort auf 100 °C erfolgen. Überraschend bewirkt erst dieses Erhitzen auf 100 °C nach der Chelexchromatographie eine optimale DNS-Ausbeute für die nachfolgende PCR.
Danach wird wiederum zentrifugiert und die als Überstand erhaltene DNS-Lösung wird, ggf. nach weiterer Lagerung bei -20° C, in an sich üblicher Weise analysiert. Die wesentliche Funktion des chelierenden Agens besteht darin, daß polyvalente Metallionen gebunden werden und die DNS bei der Temperaturbehandlung geschützt wird. Die spätere PCR-Behandlung wird dadurch optimiert. Gemäß der Erfindung kann jedes handelsübliche chelierende Agens eingesetzt werden.
Als Flächenträger werden Papier, Zellulose, Kunststoffolien, Baumwolle oder Leinen verwendet. Bevorzugt ist der Einsatz von Filterpapier, speziell von Filterpapier, wie es in der klinischen Routinediagnostik, z. B. als Guthriepapier, Verwendung findet. Ebenfalls bevorzugt ist Whatman-Blotting- Papier, wie es bei Southern, Northern und analogen Techniken gebraucht wird.
Dieses Papier ist zweckmäßigerweise in Form einer Karte ausgebildet, welche mehrere kreisförmige Felder zur Aufnahme der Blutproben aufweist, eine Anweisung zum Gebrauch der Karte sowie Felder für Angaben zum Patienten, zum behandelnden Arzt und zum Datum enthält (Abb. 1).
Das als Flächenträger eingesetzte Filterpapier weist bevorzugt eine Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm2 auf.
Gegenstand der Erfindung ist auch das Mittel zum Transport bzw. zur Lagerung von Blut für die DNS-Analyse, umfassend saugfähige, poröse Flächenträger wie Papier, Zellulose, Kunststoffolie, Baumwolle oder Leinen. Das bevorzugte Mittel ist Filterpapier, speziell Filterpapier mit einer Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cma.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung von auf einem saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebrachtem Blut zur DNS-Analytik, bevorzugt von papiergetrocknetem Blut.
Das neue erfindungsgemäße Verfahren bietet folgende Vorteile gegenüber dem üblichen Verfahren zur DNS-Gewinnung aus frischem Vollblut:
1. Die Patientenproben können per Normalpost im Briefumschlag als papiergetrocknete Blutspots für den Gentest eingesandt werden. Expresszustellung und Probenkühlung entfallen. Der Gentest kann also überregional angeboten werden
2. Venenblut ist nicht mehr erforderlich. Der Patient kann selbst Fingerblut einsenden.
3. Die nicht verwendeten Blutspots auf den vorgezeichneten Papierkreisen können für archivarische Zwecke aufbewahrt werden.
4. Der DNS-Extrakt kann innerhalb von 2 Stunden gewonnen werden und ist direkt einsetzbar für die PCR.
5. Die Erstellung einer Gentestdiagnose (Mutations-und Deletionsscreening) verkürzt sich von ca. 14 Tagen mit Beginn der Blutabnahme in der Arztpraxis bei konventionellem Vollblut auf ca. 7 Tage bei papiergetrocknetem Blut, d.h. um fast die Hälfte.
Im Vergleich zu anderen Trägern (Firma Fitzco) ist eine kostenaufwendige Vorbehandlung des erfindungsgemäßen Trägers nicht erforderlich. überraschend ist das Verfahren ohne spezielle und teure Reagenzien (Puffersysteme) für die Papierbehandlung bzw. Blutextraktion durchführbar. Desweiteren sind keine speziellen Stanzen zur Entfernung der Blutspots und auch keine speziellen PCR-Röhrchen vonnöten, wodurch der Preis einer DNS-Isolierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren um mehr als das 10-fache gesenkt werden kann (DNS-Isolierung nach
Fitzco, Inc.: pro Patient ca. 3 Dollar, DNS-Isolierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ca. 0,20 DM/Patient). Das bedeutet darüber hinaus, daß das erfindungsgemäße Verfahren in jedem
Labor für die jeweilige PCR eingesetzt werden kann.
Mit der Erfindung wird also ein einfaches, schnelles und sicheres Verfahren zur Herstellung eines DNS-Extraktes aus papiergetrocknetem Blut für die Durchführung von Gentests zur Verfügung gestellt. Auch kritische Mengen DNA können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen werden. Da kein spezieller Probentransport erforderlich ist und die Diagnose in ca. 7 Tagen nach Blutentnahme in der Arztpraxis gestellt werden kann, ist eine wesentliche Voraussetzung gegeben, um den erfindungsgemäßen Gentest insbesondere der niedergelassenen Ärzteschaft anbieten zu können, in deren Händen die Verantwortung für Früherkennung und Vorsorge liegt. Der erste Schritt, die Blutprobenbereitstellung für den Gentest durch den "Hausarzt", ist unkompliziert, sicher, schnell und preiswert, und kann selbst vom Patienten zu Hause durchgeführt werden.
Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Ausführunσsbeispie1
Einfaches Filterpapier wird mit Kreisen eines Durchmessers von 1 cm versehen. Die Kreise werden mit je ca. 0,04 ml Blut, das beliebig aus Finger, Vene, Ferse oder Ohr entnommen werden kann, benetzt. Venenblut ist nicht erforderlich. Das Papier muß so beschaffen sein, daß es etwa 0,03-0,05 ml Blut per cm2 aufsaugen kann. Aus dem Blutspot werden 3-4 mm Papierstreifen ausgeschnitten und in ein kleines Eppendorfröhrchen gelegt (für Vergleichszwecke können 3-10 Mikroliter frisches Vollblut direkt in ein Eppendorfröhrchen pipettiert werden). Dann wird l ml Wasser zugegeben und bei leichtem Schwenken des Röhrchens auf einer Wippe 20 min inkubiert. Anschließend werden die
Blutzellen für 3 min bei 14.000 x g zentrifugiert. Der
Überstand wird bis auf 20-30 Mikroliter verworfen. Zum Niederschlag werden 0,18 ml 5% Chelex 100 der Firma Bio-Rad,
Richmond,USA, (BioTechniques: Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR based typing from forensic material
513, 506 (1991)) bis auf ein Gesamtvolumen von 0,2 ml unter
Schütteln zugegeben. Anschließend wird bei 56° C für 20 min auf einem Vortex-Schüttler, danach bei 100° C für 8 min geschüttelt. Die Suspension wird dann bei 14.000 x g für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig abgenommen und bei -20° C aufbewahrt. Direkt aus dieser Lösung werden in den PCR Ansatz 1-15 Mikroliter per 25 Mikroliter Ansatzvolumen pipettiert. Zum Vergleich wurde das Verfahren, wie oben ausgeführt, mit 3-10 Mikroliter Vollblut durchgeführt. Für Vergleichszwecke wurden ein Mutationssreening für Mukoviszidose, ein Deletionsscreening für Muskeldystrophie Typ Duchenne/Becker und ein Mutationsscreening für Familiäre Hypercholesterinämie parallel mit papiergetrocknetem bzw. mit Vollblut aus Probanden durchgeführt. Die Ergebnisse sind identisch.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur DNS-Analytik im Blut, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Blut zum Transport bzw. zur Lagerung auf einen saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebracht wird, dieser Flächenträger mit Wasser inkubiert wird, die erhaltene Blutzellsuspension konzentriert, mit einem Chelator versetzt und erhitzt wird, zentrifugiert wird und die als Überstand erhaltene DNS-Lösung, ggf. nach weiterer Lagerung, in an sich üblicher Weise analysiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Blutzellsuspension durch schnelle Zentrifugation für 3 Minuten bei 14.000 x g erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß daß nach dem Chelatschritt das Erhitzen auf exakt 100 °c erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß in zwei Etappen erhitzt wird, in einem ersten Schritt auf 50-60 °C und in einem zweiten Schritt auf 100 °c.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Flächenträger mit einer Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm2 verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Flächenträger Papier, Zellulose, Kunststoffolie, Baumwolle oder Leinen verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
Filterpapier verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Blottingpapier verwendet wird.
9. Mittel zum Transport bzw. zur Lagerung von Blut für die DNS- Analyse, dadurch gekennzeichnet, daß es saugfähige, poröse Flächenträger wie Papier, Zellulose, Kunststoffolie, Baumwolle oder Leinen umfaßt.
10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm2 aufweist.
11. Verwendung von auf einem saugfähigen, porösen Flächenträger aufgebrachtem Blut zur DNS-Analytik.
12. Verwendung von papiergetrocknetem Blut mit einer Aufnahmefähigkeit von 0,03-0,05 ml Blut/cm2 zur DNS-Analytik.
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