DE3840160A1 - 2',3'-didesoxyribofuranoside und ein verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue 2′,3′-Didesoxyribofuranoside, ein Verfahren zur Herstellung von 2′,3′-Didesoxyribofuranosiden und die damit verbundene Verwendung einer speziellen Nukleosid- Desoxyribosyltransferase.

Enzymatische Verfahren zur Synthese von 2′,3′- Didesoxyribofuranosiden

Aus der EP-A 2 06 497 ist ein Verfahren zur Synthese von therapeutisch wirksamen 2′,3′-Didesoxyribosiden bekannt, bei dem eine Cytosin- oder Purinbase unter Katalyse durch Thymidin-Phosphorylase und Purin-Nukleosid-Phosphorylase in Gegenwart von 2′,3′-Didesoxythymidin zum entsprechenden 2′,3′- Didesoxyribosid umgesetzt wird. In Verbindung mit pyrimidinhaltigen Basen wird auf die Möglichkeit zur Verwendung einer geeigneten Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus hingewiesen. Die große und heterogene Bakterienfamilie Lactobacillus wird hinsichtlich bestimmter Mitglieder jedoch nicht näher spezifiziert.

Weiterhin wurde vor kurzem auf die Möglichkeit zur Synthese von 2′,3′-Didesoxyribosiden mittels Nukleosid-Desoxyribosyltransferase (EC 2.4.2.6) aus Lactobacillus helveticus hingewiesen (Carson, D. A. und Wasson, D. B. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 155, 829-834). Nachteilig zeigt das Enzym aus L. helveticus ein begrenztes Substratspektrum. So kann im Falle der Akzeptorbasen 5-Amino-v-triazolo[4,5-d]pyrimidin- 7-on (8-Azaguanin) und 7-Amino-v-triazolo[4,5-d]pyrimidin (8-Azaadenin) ein 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer nicht bewerkstelligt werden. Dies trifft auch auf Benzimidazol sowie die purinsubstituierten Basen 6-Amino-2-hydroxypurin (Isoguanin) und 6-Amino-8-brompurin (8-Bromadenin) zu. Weiterhin nachteilig bei Synthesen von 2′,3′-Didesoxyribosiden im präparativen Maßstab ist die geringe spezifische Syntheseleistung des Enzyms aus Lactobacillus helveticus, die bei Verwendung von 2′,3′-Didesoxycytidin als 2,3-Didesoxyriboruranosyldonor bezogen auf die Bildung von 2′,3′-Didesoxyadenosin 15 nmol/min/mg Transferase beträgt (bei 37°C).

2′,3′-Didesoxyribofuranoside und ihre Synthese durch Nukleosid- Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus leichmannii

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue 2′,3′- Didesoxyriboside zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Darstellung von 2′,3′-Didesoxyribofuranosiden gemäß Anspruch 1. Vorteilhafte Ausführungsformen ergeben sich aus den Ansprüchen 2 bis 5. Durch die erfindungsgemäßen 2′,3′-Didesoxyriboside wird die Palette der bisher verfügbaren Nukleoside in sehr vorteilhafter Weise erweitert.

Die Erfindung betrifft auch die erfindungsgemäßen 2′,3′- Didesoxyriboside als Pharmazeutika. Dies bezieht sich vor allem auf deren chemotherapeutische Anwendung als antivirale Agenzien. Besonders vielversprechend für therapeutische Zwecke ist die Kombination eines gegenüber Purin modifizierten (und zusätzlich substituierten) heterozyklischen Ringsystems mit einem 2,3-Didesoxyribofuranosylrest, der nach Einbau des Didesoxyribosids in Nukleinsäuren eine anschließende Kettenverlängerung unmöglich macht.

Bezüglich des Verfahrens zur Herstellung der 2′,3′- Didesoxyriboside liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein breites Substratspektrum von Basen umsetzen zu können. Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch die Verwendung von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus leichmannii bisher nicht umsetzbare Substrate zur Reaktion gebracht und somit vorher nicht zugängliche 2′,3′-Didesoxyriboside hergestellt werden können. Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren gemäß Anspruch 7.

Gegenüber der bekannten Verwendung des Enzyms aus Lactobacillus helveticus ist im Falle der Akzeptorbasen 5-Amino-v- triazolo[4,5-d]pyrimidin-7-on (8-Azaguanin) und 7-Amino-v- triazolo[4,5-d]pyrimidin (8-Azaadenin) ein 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer durch Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus L. leichmannii gut möglich. Bei diesem Enzym kann selbst im Falle der Akzeptorbase Benzimidazol eine, wenn auch schwache, Reaktion beobachtet werden. Ein enzymatischer Transfer eines Didesoxyribofuranosylrestes auf eine Base mit einem heterozyklischen Grundgerüst, das nicht Purin oder Pyrimidin darstellt, konnte bisher auch anderweitig nicht demonstriert werden.

Auch hinsichtlich der purinsubstituierten Substrate ergibt sich eine Überlegenheit des Enzyms aus L. leichmannii, verglichen mit demjenigen aus L. helveticus. Es ermöglicht z. B. die Synthese der Verbindung 6-Amino-9-(1-β-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)- 2-hydroxypurin (2′,3′-Didesoxy-iso-guanosin), was bei Verwendung des Enzyms aus L. helveticus nicht erreichbar ist. Weiterhin kann bei dem Enzym aus L. leichmannii auch das methylierte Isoguanin-Derivat 2-Hydroxy-6-methylaminopurin als Akzeptor fungieren. Selbst 6-Amino-8-brompurin (8-Bromadenin) stellt hier im Gegensatz zu dem Enzym aus L. helveticus ein, wenn auch schwaches, Substrat dar. Darüber hinaus bewirkt Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus leichmannii die Herstellung zusätzlicher, bisher anderweitig nicht dargestellter purinsubstituierter 2′,3′- Didesoxyriboside mit signifikantem chemotherapeutischem Potential.

Auch in enzymtechnologischer Hinsicht erweist sich Nukleosid- Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus leichmannii als besonders vorteilhaft. Im Vergleich zu dem Enzym aus L. helveticus ergibt sich bei Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus L. leichmannii eine ca. 50fach höhere spezifische Aktivität bezüglich des 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfers. Im Vergleich zu Nukleosid-Desoxyribosyltransferasen aus anderen Lactobacillus-Stämmen, z. B. derjenigen aus L. helveticus, zeichnet sich Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus L. leichmannii weiterhin durch eine außergewöhnliche Stabilität aus, u. a. gegenüber erhöhter Temperatur und denaturierenden Reagenzien. So kann z. B. die Aktivität des Enzyms nach zweistündiger Inkubation in 2 M Guanidinhydrochlorid oder nach achtstündiger Inkubation in 8 M Harnstoff bei Raumtemperatur und anschließender Dialyse nahezu vollständig zurückgewonnen werden. Weiterhin hatte eine 15minütige Inkubation des Enzyms bei 65°C lediglich einen Aktivitätsverlust von 3,5% zur Folge. Auch führte eine kurzzeitige Erhitzung auf 100°C nur zu geringen Aktivitätsverlusten. Die hohe Stabilität von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus L. leichmannii bedingt eine außerordentlich hohe Langzeitaktivität des Enzyms und läßt es für eine enzymtechnologische Verwendung geradezu prädestiniert erscheinen. Ermöglicht wird so die Durchführung der Didesoxyribosidsynthesen im Batch-Verfahren. Bei den hier praktizierten Synthesen war der Aktivitätsverlust des Enzyms nach 48stündiger Reaktion in Lösung bei 37°C durchweg geringer als 8%. Vorteilhaft ist auch, daß sich das Enzym nach erfolgter Synthese einfach wiedergewinnen läßt und so mehrfach eingesetzt werden kann.

Das Verfahren wird vorteilhaft so ausgeführt, daß 2′,3′- Didesoxyriboside durch Übertragung eines 2,3-Didesoxyribofuranosylrestes von einem geeigneten 2,3-Didesoxyribofuranosyldonor auf eine Akzeptorbase unter Ausnutzung der katalytischen Aktivität derjenigen Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus L. leichmannii hergestellt werden, die neben purinsubstituierten auch pyrimidinsubstituierte Basen bzw. Nukleoside zu erkennen vermag.

Es wurde gefunden, daß in diesem Organismus zwei verschiedene Nukleosid-Desoxyribosyltransferasen existieren, die durch Anionenaustauschchromatographie voneinander getrennt werden können. Die zelluläre Aktivität des einen Enzyms, hier als Nukleosid-Desoxyribosyltransferase I bezeichnet, beschränkt sich auf die Übertragung der Desoxyribosylreste von purinhaltigen Desoxyribonukleosiden auf die 9-Position von Purin- Akzeptorbasen. Das andere Enzym, im folgenden als Nukleosid- Desoxyribosyltransferase II bezeichnet, vermag ebenfalls den Desoxyribosyltransfer zwischen Purinen zu katalysieren, darüber hinaus aber auch ausschließlich zwischen Pyrimidinen sowie zwischen Purinen und Pyrimidinen. Beide Transferasen, vor allem aber Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II, zeichnen sich durch ein sehr breites Substratspektrum hinsichtlich der Nukleobasenanteile aus.

Obwohl Nukleosid-Desoxyribosyltransferase bezüglich des zu transferierenden Zuckers (2-Desoxyribofuranose) ansonsten sehr spezifisch ist, wurde überraschenderweise gefunden, daß beide Nukleosid-Desoxyribosyltransferasen aus L. leichmannii unter geeigneten Bedingungen auch einen Austausch von 2,3- Didesoxyribosylresten effizient zu katalysieren vermögen. Zwar ist die Geschwindigkeit (Vmax) des 2,3-Didesoxyribosyltransfers um ca. eine Größenordnung geringer ist als die des natürlichen 2-Desoxyribosylaustauschs, dennoch lassen sich mit Hilfe der Enzyme aufgrund ihrer hohen spezifischen Syntheseleistung und Langzeitaktivität 2′,3′-Didesoxyriboside in signifikanten Mengen synthetisieren.

Für die Synthese von 2′,3′-Didesoxyribosiden empfiehlt sich jedoch der Einsatz von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II aufgrund der größeren Enzymmenge in Lactobacillus leichmannii und des breiteren Substratspektrums im Vergleich zu Nukleosid- Desoxyribosyltransferase I. Bei Verwendung von Nukleosid- Desoxyribosyltransferase II ist auch die Möglichkeit gegeben, ein pyrimidinsubstituiertes 2′,3′-Didesoxyribosid als Didesoxyribosyldonor einzusetzen.

Als besonders günstig hat es sich erwiesen, das Verfahren so auszuführen, daß 2′,3′-Didesoxyriboside durch Transfer eines 2,3-Didesoxyribofuranosylrestes von 2′,3′-Didesoxycytidin auf eine gegebenenfalls substituierte Purin-, Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin- oder Triazolo[4,5-d]pyrimidin-Base unter Katalyse von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II aus Lactobacillus leichmannii hergestellt werden.

Es wurde gefunden, daß mit Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II aus Lactobacillus leichmannii neben einer Vielzahl von purinsubstituierten 2′,3′-Didesoxyribosiden auch solche 2′,3′-Didesoxyriboside synthetisiert werden können, deren heterozyklisches Grundgerüst sich von Purin (bzw. Pyrimidin) unterscheidet. Hierbei handelt es sich um Derivate von Pyrazolo [3,4-d]pyrimidin und Triazolo[4,5-d]pyrimidin.

Obwohl prinzipiell der Einsatz verschiedener 2,3- Didesoxyribofuranosyldonoren (z. B. 2′,3′-Didesoxyguanosin, 2′,3′-Didesoxyadenosin, 2′,3′-Didesoxyuridin) möglich ist, empfiehlt sich die Verwendung von 2′,3′-Didesoxycytidin bei präparativen Synthesen. 2′,3′-Didesoxycytidin stellt das zur Zeit kommerziell günstigste Didesoxyribosid dar. Überdies ist die Geschwindigkeit des 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfers ausgehend von 2′,3′-Didesoxycytidin im Vergleich zu 2′,3′- Didesoxythymidin und 2′,3′-Didesoxyuridin signifikant erhöht. Bei Verwendung von 2′,3′-Didesoxycytidin ergeben sich auch Vorteile mit Bezug auf die anschließende Aufreinigung der synthetisierten 2′,3′-Didesoxyriboside.

Vorteilhaft wird nach der enzymatischen Synthese eine Aufreinigung der hergestellten 2′,3′-Didesoxyriboside mittels Reversed-phase-Chromatographie (Chromatographie mit Phasenumkehr), vorzugsweise über eine stationäre Phase mit Octadecylsilan, durchgeführt. Diese Chromatographie beinhaltet die Benutzung eines Laufmittels, das neben Wasser lediglich eine oder mehrere organische Komponenten (vorzugsweise handelt es sich um ein reines Wasser/Methanol-Gemisch), aber keine puffernden Substanzen oder Ionen enthält. Es wurde gefunden, daß sich der Verzicht darauf nicht signifikant negativ auf die Trennung auswirkt und neben der Aufreinigung der Nukleosidkomponenten gleichzeitig ihr Entsalzen ermöglicht.

Das Verfahren kann generell zur Isolierung der hier synthetisierten purin-, pyrazolo[3,4-d]pyrimidin- und triazolo [4,5-d]pyrimidin-haltigen 2′,3′-Didesoxyriboside angewendet werden.

Allgemeine Darstellung des Snytheseverfahrens 1. Durchführung der Synthesen der 2′,3′-Didesoxyriboside

Zur Erhöhung der Reaktionsausbeute sollte der Didesoxyribofuranosyldonor, hier 2′,3′-Didesoxycytidin, im molaren Überschuß gegenüber der Akzeptorbase eingesetzt werden. Bei den durchgeführten präparativen Synthesen lagen die Ausgangskonzentrationen des 2′,3′-Didesoxycytidin 2- bis 6fach höher als die der jeweiligen Akzeptorbasen, die in Abhängigkeit von ihrem Löslichkeitsverhalten zwischen 0,7 und 12 mM variierten. Die Umsatzraten, die nach analytischer HPLC-Trennung der jeweiligen Verbindungen durch Integration der zugehörigen Peaks quantitativ bestimmt wurden, betrugen bei den einzelnen Reaktionen zwischen 28 und 97% mit Bezug auf die Akzeptorbase. Die Durchführung der Synthese erfolgte jeweils in leicht saurem Milieu in einem pH-Bereich von 6,0-6,5. Die gewählte Synthesetemperatur von 37°C ermöglicht sowohl eine hohe Syntheseleistung als auch eine sehr gute Langzeitaktivität des Enzyms.

2. Rückgewinnung der eingesetzten Nukleosid-Desoxyribosyltransferase

Nach erfolgter Synthese des jeweiligen 2′,3′-Didesoxyribosids kann Nukleosid-Desoxyribosyltransferase von den Nukleosiden und Basen getrennt und somit für weitere Synthesen erneut verwendet werden. Ermöglicht wird dies auf sehr einfache Weise durch Ultrafiltration des Syntheseansatzes, gefolgt von einer Dialyse des enzymhaltigen Retentats zur vollständigen Entfernung von Restmengen an Nukleosiden bzw. Basen. Zwischen den Synthesen kann das Enzym in gefriergetrocknetem Zustand gelagert werden. Das Lyophilisieren selbst hat keinen signifikanten Aktivitätsverlust des Enzyms zur Folge.

3. Aufreinigung der synthetisierten 2′,3′-Didesoxyriboside

Das im Filtrat befindliche purinhaltige Didesoxyribosid wird jeweils durch Reversed-phase-Chromatographie über eine stationäre Phase mit Octadecylsilan bei Verwendung eines reinen Methanol/Wasser-Gemischs als Laufmittel aufgereinigt. Dies ermöglicht gleichzeitig ein Entsalzen der Nukleosid- Verbindungen, so daß ein zusätzlicher Reinigungsschritt nicht mehr vonnöten ist.

Die Elution der matrixgebundenen Verbindungen erfolgt durch eine Erhöhung der Methanolkonzentration des Laufmittelgemischs. Bei den durchgeführten präparativen Chromatographien wurde jeweils mit einem linearen Gradienten zunehmender Methanolkonzentration eluiert. Hierbei erfolgte in allen Fällen zuerst die Elution von Cytosin, während das synthetisierte 2′,3′-Didesoxyribosid als letzte der vier Verbindungen vollständig homogen von der Matrix gewaschen wurde. Variabel ist lediglich die Reihenfolge der Elution des Didesoxyribofuranosyldonors, 2′,3′-Didesoxycytidin, sowie der restlichen, nicht umgesetzten Akzeptorbase. In den meisten Fällen verläuft die Trennung von 2′,3′-Didesoxycytidin und Akzeptorbase so effizient, daß Didesoxycytidin, durchweg die teuerste eingesetzte Verbindung, dabei vollständig homogen und entsalzt zurückgewonnen werden kann.

Enzymatische Synthese und Isolierung eines Didesoxyribosids am Beispiel von 6-Dimethylaminopurin-2′,3′-didesoxyribosid 1. Herkunft der verwendeten Nukleosid-Desoxyribosyltransferase

Nukleosid-Desoxyribosyltransferase (EC 2.4.2.6) wurde aus Zellen von Lactobacillus leichmannii aufgereinigt, die im MRS-Medium gezüchtet worden waren. Nach Aufschluß der Zellen mittels Glasperlenhomogenisator (Desintegrator-S der Fa. IMA GmbH, Zeppelinheim, BRD) können beide Nukleosid-Desoxyribosyltransferasen durch insgesamt lediglich drei Säulenchromatographien isoliert werden. Dabei erfolgt zunächst die Trennung beider Transferasen sowie die Entfernung des größten Teils des Fremdproteins durch Anionenaustauschchromatographie, während die anschließende Aufreinigung von Nukleosid- Desoxyribosyltransferase I und II zur Homogenität jeweils durch Affinitätschromatographie erreicht wird.

Anionenaustauschchromatographie

Der von den Zelltrümmern befreite und durch Ultrafiltration eingeengte Rohextrakt wird auf eine Säule mit DEAE-Sephacel (Fa. Sigma, Deisenhofen, BRD) gegeben. Die Chromatographiebedingungen werden so gewählt, daß der größte Teil des Fremdproteins bereits mit dem Startpuffer (50 mM KH₂PO₄ pH 6,5, 150 mM NaCl) von der Säule gewaschen wird, während beide Transferasen gebunden bleiben. Ihre anschließende Elution wird durch einen linearen Gradienten steigender Salzkonzentration bewirkt (150-450 mM). Dabei erfolgt zunächst die Elution von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase I, gefolgt von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II. Bezüglich der spezifischen Aktivität dieses Enzyms ergibt sich gegenüber dem Rohextrakt ein Aufreinigungsfaktor von ungefähr 10, während er für Nukleosid-Desoxyribosyltransferase I aufgrund der geringeren Proteinkonzentration in den entsprechenden Fraktionen sogar noch wesentlich größer ist. Durch diese Anionenaustauschchromatographie werden beide Enzyme vollständig getrennt. Nach Vereinigung der Transferase enthaltenden Fraktionen erfolgt deren Konzentrierung durch Ultrafiltration.

Affinitätschromatographie

Die Aufreinigung beider Transferasen zur Homogenität kann anschließend durch Affinitätschromatographie über N⁶-(6- Aminohexyl)adenin-Sepharose erreicht werden. Die Affinitätsmatrix wird durch standardmäßige Reaktion von N⁶-(6- Aminohexyl)adenin mit Cyanbromid-aktivierter Sepharose 4B (Fa. Pharmacia LKB, Freiburg) hergestellt. N⁶-(6-Aminohexyl)adenin kann von der Fa. IMA GmbH (Zeppelinheim, BRD) bezogen werden.

Während verunreinigendes Protein aus den entsprechenden Fraktionen der DEAE-Sephacel-Chromatographie nicht an N⁶-(6- Aminohexyl)adenin-Sepharose bindet, zeigen beide Transferasen sehr starke Wechselwirkung mit dieser Matrix. Ihre Elution kann nach Entfernung des Fremdproteins jeweils durch das denaturierende Reagenz Guanidinhydrochlorid bewirkt werden, wenn es dem Bindungspuffer (50 mM Natriumcitrat pH 6,5, 25 mM NaCl) in einer Konzentration von 1,5 M hinzugesetzt wird. Das Guanidinhydrochlorid muß anschließend durch Dialyse entfernt werden. Als nicht effizient erweist sich die Elution der gebundenen Transferasen in Gegenwart gelöster Nukleobasen, selbst nach Zusatz von Harnstoff in 2molarer Konzentration zum Bindungspuffer erfolgt keine signifikante Elution von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase I oder II.

Als vorteilhaft erweisen sich die kurze Chromatographiedauer, die einfache Durchführung der Trennungen, die enorme Kapazität der Affinitätsmatrix sowie die hohe Wiedergewinnungsrate der Transferaseaktivität.

2. Durchführung der Reaktion

Der Reaktionsansatz zur Synthese von 6-Dimethylaminopurin- 2′,3′-didesoxyribosid (6-Dimethylaminopurin-9-b-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid) enthielt: 210 mg 2′,3′-Didesoxycytidin (Fa. Fluka, Neu-Ulm, BRD), 55 mg 6-Dimethylaminopurin (Fa. Sigma, Deisenhofen, BRD) und 8,5 Einheiten Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II aus Lactobacillus leichmannii in 60 ml 50 mM Natriumcitrat pH 6,2 (1 Einheit ist definiert als diejenige Menge an Enzym, die ausgehend von Thymidin die Synthese von 1 µmol 2′-Desoxyadenosin pro Minute bei 37°C und pH 6,0 zu katalysieren vermag).

3. Analyse des Reaktionsverlaufs

Aliquots wurden zu verschiedenen Zeiten aus dem Reaktionsansatz entfernt und hinsichtlich der Bildung von 6-Dimethylaminopurin- 2′,3′-didesoxyribosid mittels Hochleistungsflüssigchromatographie untersucht. Die analytische Trennung der Nukleobasen bzw. Nukleoside des Reaktionsansatzes erfolgte dabei durch Revered-phase-Chromatographie über eine Säule (4 × 250 mm) mit Octadecylsilan (Nucleosil 300-5 C₁₈, Fa. Macherey u. Nagel, Düren, BRD) als stationärer Phase. Elutionsbedingungen: 0-10 min linearer Gradient von 2,5%-25% Methanol in 50 mM KH₂PO₄, anschl. Waschen mit 25% MeOH in 50 mM KH₂PO₄; Fließgeschwindigkeit 1 ml/min; UV-Detektion bei 260 nm. Der Reaktionsverlauf wurde durch Integration der jeweiligen Peaks quantitativ bestimmt, wobei ein gleicher Extinktionskoeffizient von Base und entsprechendem 2′,3′-Didesoxyribosid vorausgesetzt wurde.

Nach 48stündiger Reaktion bei 37°C ergab sich eine Ausbeute von 78% mit Bezug auf die Umwandlung von 6-Dimethylaminopurin in das 2′,3′-Didesoxyribosid.

4. Isolierung von 6-Dimethylaminopurin-2′,3′-didesoxyribosid

Anschließend wurde Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II von den Nukleobasen bzw. Nukleosiden des Syntheseansatzes mittels Ultrafiltration über eine Polyethersulfon-Membran (Ausschlußgrenze 10 Kilodalton; Typ Novasette, Fa. Filtron, Karlstein, BRD) bei einem Druck von 2,5 bar abgetrennt.

Die Isolierung von 6-Dimethylaminopurin-2′,3′-didesoxyribosid erfolgte daraufhin durch Mitteldruckflüssigchromatographie (MPLC-System der Fa. IMA GmbH, Zeppelinheim, BRD) über Reversed- phase-Material (Octadecylsilan, Korngröße 25-40 µm, Fa. IMA GmbH, Zeppelinheim, BRD), wobei mit einem reinen Methanol/ Wasser-Gemisch eluiert wurde (Abb. 1).

Die Zuordnung der Peaks zu den jeweiligen Verbindungen erfolgte wiederum durch HPLC. Bezüglich des Produkts 6-Dimethylaminopurin-2′,3′-didesoxyribosid ergab sich nach Lyophilisation ein Substanzmenge von 65,8 mg (Elementaranalyse: C₁₂H₁₇N₅ für 6-Dimethylaminopurin-2′,3′-didesoxyribosid; gefunden: C 53,32%, H 6,40%, N 25,89%; erwartet (+ H₂O): C 53,38%, H 6,35%, N 25,94%).

Herstellung verschiedener basenmodifizierter 2′,3′-Didesoxyriboside durch Nukleosid-Desoxyribosyltransferase

Das breite Substratspektrum des Enzyms Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II aus L. leichmannii hinsichtlich des Nukleobasenanteils ermöglicht die Synthese einer breiten Platte von 2′,3′-Didesoxyribosiden. Bei dem heterozyklischen Grundgerüst des Basenanteils kann es sich um Purin (1), Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (2) oder Triazolo[4,5-d]pyrimidin (3) handeln.

Purinsubstituierte 2′,3′-Didesoxyriboside

Analytische Untersuchungen mittels Hochleistungsflüssigchromatographie demonstrierten, daß neben den Standardbasen 6- Aminopurin (Adenin) und 2-Amino-6-hydroxypurin (Guanin) folgende purinsubstituierte Basen weiterhin gute Substrate für den durch das Enzym bewirkten 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer darstellen:
6-Amino-2-Chlorpurin (2-Chloradenin); 2-Amino-6-chlorpurin (6-Chlorguanin); 6-(6-Aminohexylamino)purin (N⁶-(6-Ainohexyl)adenin); 6-Amino-2-hydroxypurin (Isoguanin); 2-Amino-6- methoxypurin (O⁶-Methylguanin); 6-Amino-2-methylpurin (2- Methyladenin); 2-Amino-6-methylthiopurin; 2-Aminopurin; 6- Benzylaminopurin (N⁶-Benzyladenin); 6-Chlorpurin; 2,6-Diaminopurin; 2,6-Dihydroxypurin (Xanthin); 6-Dimethylaminopurin; 2-Hydroxy-6-methylaminopurin; 6-Hydroxypurin (Hypoxanthin); 6-Hydroxy-2-thiolpurin (2-Thioxanthin); 6-Methoxypurin; 6- Methylaminopurin (6-Methyladenin); 6-Methylpurin; 6-Methylthiopurin; Purin; 6-Thiolpurin.

Signifikant schlechtere Substrate, deren präparative Synthese zum betreffenden Didesoxyribosid bei hinreichender Enzymmenge dennoch praktikabel ist, sind folgende Verbindungen:
2-Acetylamino-6-hydroxypurin (N²-Acetylguanin); 6-Amino-8- brompurin (8-Bromadenin); 2-Amino-6-hydroxy-8-brompurin (8- Bromguanin); 2-Amino-6-thiolpurin (6-Thioguanin); 2,6-Dithiolpurin; 6-Hydroxy-2-methylaminopurin (N²-Methylguanin); 2-Hydroxy-6-thiolpurin (6-Thioxanthin); 2-Thiolpurin.

Folgende purinsubstituierte Basen sind hingegen keine Substrate für den durch Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus L. leichmannii katalysierten 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer:
2-Amino-6-hydroxy-9-methylpurin (9-Methylguanin); 2-Amino-3- methyl-6-hydroxypurin (3-Methylguanin); 6-Amino-3-methylpurin (3-Methyladenin); 2,6-Dihydroxy-3-methylpurin (3-Methylxanthin).

Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-substituierte 2′,3′-Didesoxyriboside

Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus L. leichmannii ermöglicht den 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer auf 4-Aminopyrazolo [3,4-d]pyrimidin. Weniger gut, aber immer noch praktikabel ist die Verwendung von 4-Amino-6-hydroxypyrazolo[3,4- d]pyrimidin als Akzeptorbase, während im Falle von 4-Hydroxypyrazolo [3,4-d]pyrimidin (Allopurinol) zwar noch geringfügige Produktbildung nachgewiesen werden kann, eine Transferase- bewirkte Synthese in präparativen Mengen aber nicht sinnvoll erscheint.

Triazolo[4,5-d]pyrimidin-substituierte 2′,3′-Didesoxyriboside

Aus der Substanzklasse der Triazolo[4,5-d]pyrimidine sind 5- Amino-v-triazolo[4,5-d]pyrimidin-7-on (8-Azaguanin) und 7- Amino-v-triazolo[4,5-d]pyrimidin (8-Azaadenin) als Akzeptoren für den 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer gut geeignet. Weiterhin kann der Didesoxyribosyltransfer mittels Nukleosid- Desoxyribosyltransferase aus L. leichmannii auch auf 5,7- Diamino-v-triazolo[4,5-d]pyrimidin (8-Aza-2,6-diaminopurin) bewerkstelligt werden. Als Substrate, wenn auch weniger effizient, fungieren weiterhin Triazolo[4,5-d]pyrimidin-7-on (8-Azahypoxanthin) und Triazolo[4,5-d]pyrimidin-5,7-dion (8- Azaxantin).

Präparative Synthesen von 2′,3′-Didesoxyribosiden

Die im folgenden aufgeführten purin-, pyrazolo[3,4-d]pyrimidin- und triazolo[4,5-d]pyrimidin-substituierten Basen wurden durch Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II aus Lactobacillus leichmannii in Gegenwart eines geeigneten Didesoxyribosyldonors zum entsprechenden 2′,3′-Didesoxyribosid in 50-100-mg- Mengen umgesetzt und anschließend durch Reversed-phase- Chromatographie zur Homogenität aufgereinigt:
2-Amino-6-chlorpurin (6-Chlorguanin); 6-(6-Aminohexylamino)- purin (N⁶-(6-Aminohexyl)adenin); 6-Amino-2-hydroxypurin (Isoguanin); 2-Amino-6-methoxypurin (O⁶-Methylguanin); 6-Amino-2- methylpurin (2-Methyladenin); 2-Amino-6-methylthiopurin; 2- Aminopurin; 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin; 7-Amino-v-triazolo [4,5-d]pyrimidin (8-Azaadenin); 5-Amino-v-triazolo[4,5- d]pyrimidin-7-on (8-Azaguanin); 6-Chlorpurin; 2,6-Diaminopurin; 6-Dimethylaminopurin; 6-Hydroxy-2-thiolpurin (2-Tioxanthin); 6-Methoxypurin; 6-Methylaminopurin (6-Methyladenin); 6-Methylpurin, 6-Methylthiopurin, Purin, 6-Thiolpurin.

Alle eingesetzten Basen sind kommerziell verfügbar und können von den Firmen Sigma (Deisenhofen, BRD) und IMA (Zeppelinheim) bezogen werden.

Claims (10)

1. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside, erhältlich durch Übertragung eines 2,3-Didesoxyribofuranosylrestes von einem 2′,3′- Didesoxyribofuranosid auf eine Akzeptorbase unter Katalyse durch Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Ausnutzung der katalytischen Aktivität der Transferase aus Lactobacillus leichmannii darstellbar sind.

2. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein 2,3-Didesoxyribofuranosylrest glykosidisch mit einem gegebenenfalls substituierten Pyrazolo[3,4- d]pyrimidin oder Triazolo[4,5-d]pyrimidin verknüpft ist.

3. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch folgende Strukturen: 4-Amino-1-(1-b-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin
(kann auch als 4-Aminopyrazolo[3,4- d]pyrimidin-1-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 5-Amino-3-(1-β-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)- v-triazolo[4,5-d]pyrimidin-7-on
(kann auch als 5-Amino-v-triazolo[4,5- d]pyrimidin-7-on-3-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 8-Azaguanin-9-β-D- 2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 7-Amino-3-(1-β-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)- v-triazolo[4,5-d]pyrimidin
(kann auch als 7-Amino-v-triazolo[4,5- d]pyrimidin-3-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 8-Azaadenin-9-β-D- 2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden).

4. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein 2,3-Didesoxyribofuranosylrest glykosidisch mit Purin oder einem substituierten Purin verknüpft ist.

5. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch folgende Strukturen: 6-(6-Aminohexylamino)-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-(6-Aminohexylamino)- purin-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder N⁶-(6-Aminohexyl)-2′,3′-didesoxyadenosin bezeichnet werden) 6-Amino-2-hydroxy-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Amino-2-hydroxypurin- 9-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 2′,3′-Didesoxy-iso-guanosin bezeichnet werden) 2-Amino-6-methoxy-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 2-Amino-6-methoxypurin- 9-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder O⁶-Methyl-2′,3′-didesoxyguanosin bezeichnet werden) 2-Amino-6-methylthio-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 2-Amino-6-methylthiopurin-9- b-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 6-Dimethylamino-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Dimethylaminopurin-9- β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 9-(1-β-D-2,3-Didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als Purin-9-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 6-Hydroxy-2-thiol-9-(1-β-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Hydroxy-2-tiolpurin- 9-b-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 2-Thio-2′,3′-didesoxyxanthosin bezeichnet werden) 6-Thiol-9-(1-b-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Thiolpurin-9-β-D- 2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 6- Mercaptopurin-9-b-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden).

6. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside nach den Ansprüchen 1 bis 5 als Pharmazeutika.

7. Verfahren zur Herstellung von 2′,3′- Didesoxyribofuranosiden durch Übertragung eines 2,3-Didesoxyribofuranosylrestes auf eine Akzeptorbase unter Katalyse durch Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus, dadurch gekennzeichnet, daß Nukleosid- Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus leichmannii verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß diejenige Nukleosid-Desoxyribosyltransferase verwendet wird, die bei anionenchromatographischer Trennung der Nukleosid- Desoxyribosyltransferasen aus Lactobacillus leichmannii als zweite Transferase-Spezies anfällt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß 2′,3′-Didesoxyribofuranoside durch Übertragung eines 2,3- Didesoxyribofuranosylrestes von 2′,3′-Didesoxycytidin auf eine gegebenenfalls substituierte Purin-, Pyrazolo[3,4- d]pyrimidin- oder Triazolo[4,5-d]-pyrimidin-Base hergestellt werden.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß nach der enzymatischen Reaktion eine Reinigung der Produkte durch Reversed-phase-Chromatographie, vorzugsweise über Octadecylsilan, durchgeführt wird.