DE3840160A1 - 2',3'-didesoxyribofuranoside und ein verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
2',3'-didesoxyribofuranoside und ein verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft neue 2′,3′-Didesoxyribofuranoside, ein
Verfahren zur Herstellung von 2′,3′-Didesoxyribofuranosiden
und die damit verbundene Verwendung einer speziellen Nukleosid-
Desoxyribosyltransferase.
Aus der EP-A 2 06 497 ist ein Verfahren zur Synthese von
therapeutisch wirksamen 2′,3′-Didesoxyribosiden bekannt, bei
dem eine Cytosin- oder Purinbase unter Katalyse durch Thymidin-Phosphorylase
und Purin-Nukleosid-Phosphorylase in Gegenwart
von 2′,3′-Didesoxythymidin zum entsprechenden 2′,3′-
Didesoxyribosid umgesetzt wird. In Verbindung mit pyrimidinhaltigen
Basen wird auf die Möglichkeit zur Verwendung einer
geeigneten Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus
hingewiesen. Die große und heterogene Bakterienfamilie
Lactobacillus wird hinsichtlich bestimmter Mitglieder jedoch
nicht näher spezifiziert.
Weiterhin wurde vor kurzem auf die Möglichkeit zur Synthese
von 2′,3′-Didesoxyribosiden mittels Nukleosid-Desoxyribosyltransferase
(EC 2.4.2.6) aus Lactobacillus helveticus hingewiesen
(Carson, D. A. und Wasson, D. B. (1988) Biochem. Biophys.
Res. Commun. 155, 829-834). Nachteilig zeigt das Enzym
aus L. helveticus ein begrenztes Substratspektrum. So kann
im Falle der Akzeptorbasen 5-Amino-v-triazolo[4,5-d]pyrimidin-
7-on (8-Azaguanin) und 7-Amino-v-triazolo[4,5-d]pyrimidin
(8-Azaadenin) ein 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer nicht
bewerkstelligt werden. Dies trifft auch auf Benzimidazol
sowie die purinsubstituierten Basen 6-Amino-2-hydroxypurin
(Isoguanin) und 6-Amino-8-brompurin (8-Bromadenin) zu.
Weiterhin nachteilig bei Synthesen von 2′,3′-Didesoxyribosiden
im präparativen Maßstab ist die geringe spezifische Syntheseleistung
des Enzyms aus Lactobacillus helveticus, die
bei Verwendung von 2′,3′-Didesoxycytidin als 2,3-Didesoxyriboruranosyldonor
bezogen auf die Bildung von 2′,3′-Didesoxyadenosin
15 nmol/min/mg Transferase beträgt (bei 37°C).
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue 2′,3′-
Didesoxyriboside zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird
erfindungsgemäß gelöst durch die Darstellung von 2′,3′-Didesoxyribofuranosiden
gemäß Anspruch 1. Vorteilhafte Ausführungsformen
ergeben sich aus den Ansprüchen 2 bis 5. Durch
die erfindungsgemäßen 2′,3′-Didesoxyriboside wird die Palette
der bisher verfügbaren Nukleoside in sehr vorteilhafter Weise
erweitert.
Die Erfindung betrifft auch die erfindungsgemäßen 2′,3′-
Didesoxyriboside als Pharmazeutika. Dies bezieht sich vor
allem auf deren chemotherapeutische Anwendung als antivirale
Agenzien. Besonders vielversprechend für therapeutische
Zwecke ist die Kombination eines gegenüber Purin modifizierten
(und zusätzlich substituierten) heterozyklischen Ringsystems
mit einem 2,3-Didesoxyribofuranosylrest, der nach Einbau
des Didesoxyribosids in Nukleinsäuren eine anschließende
Kettenverlängerung unmöglich macht.
Bezüglich des Verfahrens zur Herstellung der 2′,3′-
Didesoxyriboside liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde,
ein breites Substratspektrum von Basen umsetzen zu können.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch die Verwendung
von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus
leichmannii bisher nicht umsetzbare Substrate zur Reaktion
gebracht und somit vorher nicht zugängliche 2′,3′-Didesoxyriboside
hergestellt werden können. Gegenstand der Erfindung
ist daher auch ein Verfahren gemäß Anspruch 7.
Gegenüber der bekannten Verwendung des Enzyms aus Lactobacillus
helveticus ist im Falle der Akzeptorbasen 5-Amino-v-
triazolo[4,5-d]pyrimidin-7-on (8-Azaguanin) und 7-Amino-v-
triazolo[4,5-d]pyrimidin (8-Azaadenin) ein 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer
durch Nukleosid-Desoxyribosyltransferase
aus L. leichmannii gut möglich. Bei diesem Enzym kann selbst
im Falle der Akzeptorbase Benzimidazol eine, wenn auch schwache,
Reaktion beobachtet werden. Ein enzymatischer Transfer
eines Didesoxyribofuranosylrestes auf eine Base mit einem
heterozyklischen Grundgerüst, das nicht Purin oder Pyrimidin
darstellt, konnte bisher auch anderweitig nicht demonstriert
werden.
Auch hinsichtlich der purinsubstituierten Substrate ergibt
sich eine Überlegenheit des Enzyms aus L. leichmannii, verglichen
mit demjenigen aus L. helveticus. Es ermöglicht z. B.
die Synthese der Verbindung 6-Amino-9-(1-β-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)-
2-hydroxypurin (2′,3′-Didesoxy-iso-guanosin),
was bei Verwendung des Enzyms aus L. helveticus nicht erreichbar
ist. Weiterhin kann bei dem Enzym aus L. leichmannii
auch das methylierte Isoguanin-Derivat 2-Hydroxy-6-methylaminopurin
als Akzeptor fungieren. Selbst 6-Amino-8-brompurin
(8-Bromadenin) stellt hier im Gegensatz zu dem Enzym aus L.
helveticus ein, wenn auch schwaches, Substrat dar.
Darüber hinaus bewirkt Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus
Lactobacillus leichmannii die Herstellung zusätzlicher, bisher
anderweitig nicht dargestellter purinsubstituierter 2′,3′-
Didesoxyriboside mit signifikantem chemotherapeutischem
Potential.
Auch in enzymtechnologischer Hinsicht erweist sich Nukleosid-
Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus leichmannii als
besonders vorteilhaft. Im Vergleich zu dem Enzym aus L.
helveticus ergibt sich bei Nukleosid-Desoxyribosyltransferase
aus L. leichmannii eine ca. 50fach höhere spezifische Aktivität
bezüglich des 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfers.
Im Vergleich zu Nukleosid-Desoxyribosyltransferasen aus anderen
Lactobacillus-Stämmen, z. B. derjenigen aus L. helveticus,
zeichnet sich Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus L.
leichmannii weiterhin durch eine außergewöhnliche Stabilität
aus, u. a. gegenüber erhöhter Temperatur und denaturierenden
Reagenzien. So kann z. B. die Aktivität des Enzyms nach
zweistündiger Inkubation in 2 M Guanidinhydrochlorid oder
nach achtstündiger Inkubation in 8 M Harnstoff bei Raumtemperatur
und anschließender Dialyse nahezu vollständig zurückgewonnen
werden. Weiterhin hatte eine 15minütige Inkubation des
Enzyms bei 65°C lediglich einen Aktivitätsverlust von 3,5%
zur Folge. Auch führte eine kurzzeitige Erhitzung auf 100°C
nur zu geringen Aktivitätsverlusten.
Die hohe Stabilität von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase
aus L. leichmannii bedingt eine außerordentlich hohe Langzeitaktivität
des Enzyms und läßt es für eine enzymtechnologische
Verwendung geradezu prädestiniert erscheinen. Ermöglicht
wird so die Durchführung der Didesoxyribosidsynthesen
im Batch-Verfahren. Bei den hier praktizierten Synthesen
war der Aktivitätsverlust des Enzyms nach 48stündiger
Reaktion in Lösung bei 37°C durchweg geringer als 8%.
Vorteilhaft ist auch, daß sich das Enzym nach erfolgter
Synthese einfach wiedergewinnen läßt und so mehrfach eingesetzt
werden kann.
Das Verfahren wird vorteilhaft so ausgeführt, daß 2′,3′-
Didesoxyriboside durch Übertragung eines 2,3-Didesoxyribofuranosylrestes
von einem geeigneten 2,3-Didesoxyribofuranosyldonor
auf eine Akzeptorbase unter Ausnutzung der katalytischen
Aktivität derjenigen Nukleosid-Desoxyribosyltransferase
aus L. leichmannii hergestellt werden, die neben purinsubstituierten
auch pyrimidinsubstituierte Basen bzw. Nukleoside
zu erkennen vermag.
Es wurde gefunden, daß in diesem Organismus zwei verschiedene
Nukleosid-Desoxyribosyltransferasen existieren, die durch
Anionenaustauschchromatographie voneinander getrennt werden
können. Die zelluläre Aktivität des einen Enzyms, hier als
Nukleosid-Desoxyribosyltransferase I bezeichnet, beschränkt
sich auf die Übertragung der Desoxyribosylreste von purinhaltigen
Desoxyribonukleosiden auf die 9-Position von Purin-
Akzeptorbasen. Das andere Enzym, im folgenden als Nukleosid-
Desoxyribosyltransferase II bezeichnet, vermag ebenfalls den
Desoxyribosyltransfer zwischen Purinen zu katalysieren, darüber
hinaus aber auch ausschließlich zwischen Pyrimidinen sowie
zwischen Purinen und Pyrimidinen. Beide Transferasen, vor
allem aber Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II, zeichnen
sich durch ein sehr breites Substratspektrum hinsichtlich der
Nukleobasenanteile aus.
Obwohl Nukleosid-Desoxyribosyltransferase bezüglich des zu
transferierenden Zuckers (2-Desoxyribofuranose) ansonsten
sehr spezifisch ist, wurde überraschenderweise gefunden, daß
beide Nukleosid-Desoxyribosyltransferasen aus L. leichmannii
unter geeigneten Bedingungen auch einen Austausch von 2,3-
Didesoxyribosylresten effizient zu katalysieren vermögen.
Zwar ist die Geschwindigkeit (Vmax) des 2,3-Didesoxyribosyltransfers
um ca. eine Größenordnung geringer ist als die
des natürlichen 2-Desoxyribosylaustauschs, dennoch lassen
sich mit Hilfe der Enzyme aufgrund ihrer hohen spezifischen
Syntheseleistung und Langzeitaktivität 2′,3′-Didesoxyriboside
in signifikanten Mengen synthetisieren.
Für die Synthese von 2′,3′-Didesoxyribosiden empfiehlt sich
jedoch der Einsatz von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II
aufgrund der größeren Enzymmenge in Lactobacillus leichmannii
und des breiteren Substratspektrums im Vergleich zu Nukleosid-
Desoxyribosyltransferase I. Bei Verwendung von Nukleosid-
Desoxyribosyltransferase II ist auch die Möglichkeit gegeben,
ein pyrimidinsubstituiertes 2′,3′-Didesoxyribosid als Didesoxyribosyldonor
einzusetzen.
Als besonders günstig hat es sich erwiesen, das Verfahren so
auszuführen, daß 2′,3′-Didesoxyriboside durch Transfer eines
2,3-Didesoxyribofuranosylrestes von 2′,3′-Didesoxycytidin auf
eine gegebenenfalls substituierte Purin-, Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-
oder Triazolo[4,5-d]pyrimidin-Base unter Katalyse
von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II aus Lactobacillus
leichmannii hergestellt werden.
Es wurde gefunden, daß mit Nukleosid-Desoxyribosyltransferase
II aus Lactobacillus leichmannii neben einer Vielzahl von
purinsubstituierten 2′,3′-Didesoxyribosiden auch solche
2′,3′-Didesoxyriboside synthetisiert werden können, deren
heterozyklisches Grundgerüst sich von Purin (bzw. Pyrimidin)
unterscheidet. Hierbei handelt es sich um Derivate von Pyrazolo
[3,4-d]pyrimidin und Triazolo[4,5-d]pyrimidin.
Obwohl prinzipiell der Einsatz verschiedener 2,3-
Didesoxyribofuranosyldonoren (z. B. 2′,3′-Didesoxyguanosin,
2′,3′-Didesoxyadenosin, 2′,3′-Didesoxyuridin) möglich ist,
empfiehlt sich die Verwendung von 2′,3′-Didesoxycytidin bei
präparativen Synthesen. 2′,3′-Didesoxycytidin stellt das zur
Zeit kommerziell günstigste Didesoxyribosid dar. Überdies ist
die Geschwindigkeit des 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfers
ausgehend von 2′,3′-Didesoxycytidin im Vergleich zu 2′,3′-
Didesoxythymidin und 2′,3′-Didesoxyuridin signifikant erhöht.
Bei Verwendung von 2′,3′-Didesoxycytidin ergeben sich auch
Vorteile mit Bezug auf die anschließende Aufreinigung der
synthetisierten 2′,3′-Didesoxyriboside.
Vorteilhaft wird nach der enzymatischen Synthese eine
Aufreinigung der hergestellten 2′,3′-Didesoxyriboside mittels
Reversed-phase-Chromatographie (Chromatographie mit
Phasenumkehr), vorzugsweise über eine stationäre Phase mit
Octadecylsilan, durchgeführt. Diese Chromatographie beinhaltet
die Benutzung eines Laufmittels, das neben Wasser lediglich
eine oder mehrere organische Komponenten (vorzugsweise
handelt es sich um ein reines Wasser/Methanol-Gemisch), aber
keine puffernden Substanzen oder Ionen enthält. Es wurde
gefunden, daß sich der Verzicht darauf nicht signifikant
negativ auf die Trennung auswirkt und neben der Aufreinigung
der Nukleosidkomponenten gleichzeitig ihr Entsalzen ermöglicht.
Das Verfahren kann generell zur Isolierung der hier
synthetisierten purin-, pyrazolo[3,4-d]pyrimidin- und triazolo
[4,5-d]pyrimidin-haltigen 2′,3′-Didesoxyriboside angewendet
werden.
Zur Erhöhung der Reaktionsausbeute sollte der Didesoxyribofuranosyldonor,
hier 2′,3′-Didesoxycytidin, im molaren Überschuß
gegenüber der Akzeptorbase eingesetzt werden. Bei den
durchgeführten präparativen Synthesen lagen die Ausgangskonzentrationen
des 2′,3′-Didesoxycytidin 2- bis 6fach höher
als die der jeweiligen Akzeptorbasen, die in Abhängigkeit von
ihrem Löslichkeitsverhalten zwischen 0,7 und 12 mM variierten.
Die Umsatzraten, die nach analytischer HPLC-Trennung der
jeweiligen Verbindungen durch Integration der zugehörigen
Peaks quantitativ bestimmt wurden, betrugen bei den einzelnen
Reaktionen zwischen 28 und 97% mit Bezug auf die Akzeptorbase.
Die Durchführung der Synthese erfolgte jeweils in
leicht saurem Milieu in einem pH-Bereich von 6,0-6,5. Die
gewählte Synthesetemperatur von 37°C ermöglicht sowohl eine
hohe Syntheseleistung als auch eine sehr gute Langzeitaktivität
des Enzyms.
Nach erfolgter Synthese des jeweiligen 2′,3′-Didesoxyribosids
kann Nukleosid-Desoxyribosyltransferase von den Nukleosiden
und Basen getrennt und somit für weitere Synthesen erneut
verwendet werden. Ermöglicht wird dies auf sehr einfache
Weise durch Ultrafiltration des Syntheseansatzes, gefolgt von
einer Dialyse des enzymhaltigen Retentats zur vollständigen
Entfernung von Restmengen an Nukleosiden bzw. Basen. Zwischen
den Synthesen kann das Enzym in gefriergetrocknetem Zustand
gelagert werden. Das Lyophilisieren selbst hat keinen signifikanten
Aktivitätsverlust des Enzyms zur Folge.
Das im Filtrat befindliche purinhaltige Didesoxyribosid wird
jeweils durch Reversed-phase-Chromatographie über eine
stationäre Phase mit Octadecylsilan bei Verwendung eines
reinen Methanol/Wasser-Gemischs als Laufmittel aufgereinigt.
Dies ermöglicht gleichzeitig ein Entsalzen der Nukleosid-
Verbindungen, so daß ein zusätzlicher Reinigungsschritt nicht
mehr vonnöten ist.
Die Elution der matrixgebundenen Verbindungen erfolgt durch
eine Erhöhung der Methanolkonzentration des Laufmittelgemischs.
Bei den durchgeführten präparativen Chromatographien
wurde jeweils mit einem linearen Gradienten zunehmender Methanolkonzentration
eluiert. Hierbei erfolgte in allen Fällen
zuerst die Elution von Cytosin, während das synthetisierte
2′,3′-Didesoxyribosid als letzte der vier Verbindungen
vollständig homogen von der Matrix gewaschen wurde. Variabel
ist lediglich die Reihenfolge der Elution des Didesoxyribofuranosyldonors,
2′,3′-Didesoxycytidin, sowie der restlichen,
nicht umgesetzten Akzeptorbase. In den meisten Fällen
verläuft die Trennung von 2′,3′-Didesoxycytidin und Akzeptorbase
so effizient, daß Didesoxycytidin, durchweg die teuerste
eingesetzte Verbindung, dabei vollständig homogen und
entsalzt zurückgewonnen werden kann.
Nukleosid-Desoxyribosyltransferase (EC 2.4.2.6) wurde aus
Zellen von Lactobacillus leichmannii aufgereinigt, die im
MRS-Medium gezüchtet worden waren. Nach Aufschluß der Zellen
mittels Glasperlenhomogenisator (Desintegrator-S der Fa. IMA
GmbH, Zeppelinheim, BRD) können beide Nukleosid-Desoxyribosyltransferasen
durch insgesamt lediglich drei Säulenchromatographien
isoliert werden. Dabei erfolgt zunächst die
Trennung beider Transferasen sowie die Entfernung des größten
Teils des Fremdproteins durch Anionenaustauschchromatographie,
während die anschließende Aufreinigung von Nukleosid-
Desoxyribosyltransferase I und II zur Homogenität jeweils
durch Affinitätschromatographie erreicht wird.
Der von den Zelltrümmern befreite und durch Ultrafiltration
eingeengte Rohextrakt wird auf eine Säule mit DEAE-Sephacel
(Fa. Sigma, Deisenhofen, BRD) gegeben. Die Chromatographiebedingungen
werden so gewählt, daß der größte Teil des
Fremdproteins bereits mit dem Startpuffer (50 mM KH₂PO₄ pH
6,5, 150 mM NaCl) von der Säule gewaschen wird, während beide
Transferasen gebunden bleiben. Ihre anschließende Elution
wird durch einen linearen Gradienten steigender Salzkonzentration
bewirkt (150-450 mM). Dabei erfolgt zunächst die
Elution von Nukleosid-Desoxyribosyltransferase I, gefolgt von
Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II. Bezüglich der spezifischen
Aktivität dieses Enzyms ergibt sich gegenüber dem
Rohextrakt ein Aufreinigungsfaktor von ungefähr 10, während
er für Nukleosid-Desoxyribosyltransferase I aufgrund der
geringeren Proteinkonzentration in den entsprechenden Fraktionen
sogar noch wesentlich größer ist. Durch diese
Anionenaustauschchromatographie werden beide Enzyme vollständig
getrennt. Nach Vereinigung der Transferase enthaltenden
Fraktionen erfolgt deren Konzentrierung durch Ultrafiltration.
Die Aufreinigung beider Transferasen zur Homogenität kann
anschließend durch Affinitätschromatographie über N⁶-(6-
Aminohexyl)adenin-Sepharose erreicht werden. Die Affinitätsmatrix
wird durch standardmäßige Reaktion von N⁶-(6-
Aminohexyl)adenin mit Cyanbromid-aktivierter Sepharose 4B
(Fa. Pharmacia LKB, Freiburg) hergestellt. N⁶-(6-Aminohexyl)adenin
kann von der Fa. IMA GmbH (Zeppelinheim, BRD)
bezogen werden.
Während verunreinigendes Protein aus den entsprechenden Fraktionen
der DEAE-Sephacel-Chromatographie nicht an N⁶-(6-
Aminohexyl)adenin-Sepharose bindet, zeigen beide Transferasen
sehr starke Wechselwirkung mit dieser Matrix. Ihre Elution
kann nach Entfernung des Fremdproteins jeweils durch das
denaturierende Reagenz Guanidinhydrochlorid bewirkt werden,
wenn es dem Bindungspuffer (50 mM Natriumcitrat pH 6,5, 25 mM
NaCl) in einer Konzentration von 1,5 M hinzugesetzt wird. Das
Guanidinhydrochlorid muß anschließend durch Dialyse entfernt
werden. Als nicht effizient erweist sich die Elution der
gebundenen Transferasen in Gegenwart gelöster Nukleobasen,
selbst nach Zusatz von Harnstoff in 2molarer Konzentration
zum Bindungspuffer erfolgt keine signifikante Elution von
Nukleosid-Desoxyribosyltransferase I oder II.
Als vorteilhaft erweisen sich die kurze Chromatographiedauer,
die einfache Durchführung der Trennungen, die enorme Kapazität
der Affinitätsmatrix sowie die hohe Wiedergewinnungsrate
der Transferaseaktivität.
Der Reaktionsansatz zur Synthese von 6-Dimethylaminopurin-
2′,3′-didesoxyribosid (6-Dimethylaminopurin-9-b-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid)
enthielt: 210 mg 2′,3′-Didesoxycytidin
(Fa. Fluka, Neu-Ulm, BRD), 55 mg 6-Dimethylaminopurin (Fa.
Sigma, Deisenhofen, BRD) und 8,5 Einheiten Nukleosid-Desoxyribosyltransferase
II aus Lactobacillus leichmannii in 60 ml
50 mM Natriumcitrat pH 6,2 (1 Einheit ist definiert als
diejenige Menge an Enzym, die ausgehend von Thymidin die
Synthese von 1 µmol 2′-Desoxyadenosin pro Minute bei 37°C
und pH 6,0 zu katalysieren vermag).
Aliquots wurden zu verschiedenen Zeiten aus dem Reaktionsansatz
entfernt und hinsichtlich der Bildung von 6-Dimethylaminopurin-
2′,3′-didesoxyribosid mittels Hochleistungsflüssigchromatographie
untersucht. Die analytische Trennung der
Nukleobasen bzw. Nukleoside des Reaktionsansatzes erfolgte
dabei durch Revered-phase-Chromatographie über eine Säule (4
× 250 mm) mit Octadecylsilan (Nucleosil 300-5 C₁₈, Fa. Macherey
u. Nagel, Düren, BRD) als stationärer Phase. Elutionsbedingungen:
0-10 min linearer Gradient von 2,5%-25% Methanol
in 50 mM KH₂PO₄, anschl. Waschen mit 25% MeOH in 50 mM
KH₂PO₄; Fließgeschwindigkeit 1 ml/min; UV-Detektion bei 260
nm. Der Reaktionsverlauf wurde durch Integration der jeweiligen
Peaks quantitativ bestimmt, wobei ein gleicher Extinktionskoeffizient
von Base und entsprechendem 2′,3′-Didesoxyribosid
vorausgesetzt wurde.
Nach 48stündiger Reaktion bei 37°C ergab sich eine Ausbeute
von 78% mit Bezug auf die Umwandlung von 6-Dimethylaminopurin
in das 2′,3′-Didesoxyribosid.
Anschließend wurde Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II von
den Nukleobasen bzw. Nukleosiden des Syntheseansatzes mittels
Ultrafiltration über eine Polyethersulfon-Membran (Ausschlußgrenze
10 Kilodalton; Typ Novasette, Fa. Filtron, Karlstein,
BRD) bei einem Druck von 2,5 bar abgetrennt.
Die Isolierung von 6-Dimethylaminopurin-2′,3′-didesoxyribosid
erfolgte daraufhin durch Mitteldruckflüssigchromatographie
(MPLC-System der Fa. IMA GmbH, Zeppelinheim, BRD) über Reversed-
phase-Material (Octadecylsilan, Korngröße 25-40 µm, Fa.
IMA GmbH, Zeppelinheim, BRD), wobei mit einem reinen Methanol/
Wasser-Gemisch eluiert wurde (Abb. 1).
Die Zuordnung der Peaks zu den jeweiligen Verbindungen erfolgte
wiederum durch HPLC. Bezüglich des Produkts 6-Dimethylaminopurin-2′,3′-didesoxyribosid
ergab sich nach Lyophilisation
ein Substanzmenge von 65,8 mg (Elementaranalyse:
C₁₂H₁₇N₅ für 6-Dimethylaminopurin-2′,3′-didesoxyribosid; gefunden:
C 53,32%, H 6,40%, N 25,89%; erwartet (+ H₂O): C
53,38%, H 6,35%, N 25,94%).
Das breite Substratspektrum des Enzyms Nukleosid-Desoxyribosyltransferase
II aus L. leichmannii hinsichtlich des
Nukleobasenanteils ermöglicht die Synthese einer breiten
Platte von 2′,3′-Didesoxyribosiden. Bei dem heterozyklischen
Grundgerüst des Basenanteils kann es sich um Purin (1),
Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin (2) oder Triazolo[4,5-d]pyrimidin
(3) handeln.
Analytische Untersuchungen mittels Hochleistungsflüssigchromatographie
demonstrierten, daß neben den Standardbasen 6-
Aminopurin (Adenin) und 2-Amino-6-hydroxypurin (Guanin) folgende
purinsubstituierte Basen weiterhin gute Substrate für
den durch das Enzym bewirkten 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer
darstellen:
6-Amino-2-Chlorpurin (2-Chloradenin); 2-Amino-6-chlorpurin (6-Chlorguanin); 6-(6-Aminohexylamino)purin (N⁶-(6-Ainohexyl)adenin); 6-Amino-2-hydroxypurin (Isoguanin); 2-Amino-6- methoxypurin (O⁶-Methylguanin); 6-Amino-2-methylpurin (2- Methyladenin); 2-Amino-6-methylthiopurin; 2-Aminopurin; 6- Benzylaminopurin (N⁶-Benzyladenin); 6-Chlorpurin; 2,6-Diaminopurin; 2,6-Dihydroxypurin (Xanthin); 6-Dimethylaminopurin; 2-Hydroxy-6-methylaminopurin; 6-Hydroxypurin (Hypoxanthin); 6-Hydroxy-2-thiolpurin (2-Thioxanthin); 6-Methoxypurin; 6- Methylaminopurin (6-Methyladenin); 6-Methylpurin; 6-Methylthiopurin; Purin; 6-Thiolpurin.
6-Amino-2-Chlorpurin (2-Chloradenin); 2-Amino-6-chlorpurin (6-Chlorguanin); 6-(6-Aminohexylamino)purin (N⁶-(6-Ainohexyl)adenin); 6-Amino-2-hydroxypurin (Isoguanin); 2-Amino-6- methoxypurin (O⁶-Methylguanin); 6-Amino-2-methylpurin (2- Methyladenin); 2-Amino-6-methylthiopurin; 2-Aminopurin; 6- Benzylaminopurin (N⁶-Benzyladenin); 6-Chlorpurin; 2,6-Diaminopurin; 2,6-Dihydroxypurin (Xanthin); 6-Dimethylaminopurin; 2-Hydroxy-6-methylaminopurin; 6-Hydroxypurin (Hypoxanthin); 6-Hydroxy-2-thiolpurin (2-Thioxanthin); 6-Methoxypurin; 6- Methylaminopurin (6-Methyladenin); 6-Methylpurin; 6-Methylthiopurin; Purin; 6-Thiolpurin.
Signifikant schlechtere Substrate, deren präparative Synthese
zum betreffenden Didesoxyribosid bei hinreichender Enzymmenge
dennoch praktikabel ist, sind folgende Verbindungen:
2-Acetylamino-6-hydroxypurin (N²-Acetylguanin); 6-Amino-8- brompurin (8-Bromadenin); 2-Amino-6-hydroxy-8-brompurin (8- Bromguanin); 2-Amino-6-thiolpurin (6-Thioguanin); 2,6-Dithiolpurin; 6-Hydroxy-2-methylaminopurin (N²-Methylguanin); 2-Hydroxy-6-thiolpurin (6-Thioxanthin); 2-Thiolpurin.
2-Acetylamino-6-hydroxypurin (N²-Acetylguanin); 6-Amino-8- brompurin (8-Bromadenin); 2-Amino-6-hydroxy-8-brompurin (8- Bromguanin); 2-Amino-6-thiolpurin (6-Thioguanin); 2,6-Dithiolpurin; 6-Hydroxy-2-methylaminopurin (N²-Methylguanin); 2-Hydroxy-6-thiolpurin (6-Thioxanthin); 2-Thiolpurin.
Folgende purinsubstituierte Basen sind hingegen keine
Substrate für den durch Nukleosid-Desoxyribosyltransferase
aus L. leichmannii katalysierten 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer:
2-Amino-6-hydroxy-9-methylpurin (9-Methylguanin); 2-Amino-3- methyl-6-hydroxypurin (3-Methylguanin); 6-Amino-3-methylpurin (3-Methyladenin); 2,6-Dihydroxy-3-methylpurin (3-Methylxanthin).
2-Amino-6-hydroxy-9-methylpurin (9-Methylguanin); 2-Amino-3- methyl-6-hydroxypurin (3-Methylguanin); 6-Amino-3-methylpurin (3-Methyladenin); 2,6-Dihydroxy-3-methylpurin (3-Methylxanthin).
Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus L. leichmannii ermöglicht
den 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer auf 4-Aminopyrazolo
[3,4-d]pyrimidin. Weniger gut, aber immer noch praktikabel
ist die Verwendung von 4-Amino-6-hydroxypyrazolo[3,4-
d]pyrimidin als Akzeptorbase, während im Falle von 4-Hydroxypyrazolo
[3,4-d]pyrimidin (Allopurinol) zwar noch geringfügige
Produktbildung nachgewiesen werden kann, eine Transferase-
bewirkte Synthese in präparativen Mengen aber nicht sinnvoll
erscheint.
Aus der Substanzklasse der Triazolo[4,5-d]pyrimidine sind 5-
Amino-v-triazolo[4,5-d]pyrimidin-7-on (8-Azaguanin) und 7-
Amino-v-triazolo[4,5-d]pyrimidin (8-Azaadenin) als Akzeptoren
für den 2,3-Didesoxyribofuranosyltransfer gut geeignet. Weiterhin
kann der Didesoxyribosyltransfer mittels Nukleosid-
Desoxyribosyltransferase aus L. leichmannii auch auf 5,7-
Diamino-v-triazolo[4,5-d]pyrimidin (8-Aza-2,6-diaminopurin)
bewerkstelligt werden. Als Substrate, wenn auch weniger effizient,
fungieren weiterhin Triazolo[4,5-d]pyrimidin-7-on (8-Azahypoxanthin) und Triazolo[4,5-d]pyrimidin-5,7-dion (8-
Azaxantin).
Die im folgenden aufgeführten purin-, pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-
und triazolo[4,5-d]pyrimidin-substituierten Basen wurden
durch Nukleosid-Desoxyribosyltransferase II aus Lactobacillus
leichmannii in Gegenwart eines geeigneten Didesoxyribosyldonors
zum entsprechenden 2′,3′-Didesoxyribosid in 50-100-mg-
Mengen umgesetzt und anschließend durch Reversed-phase-
Chromatographie zur Homogenität aufgereinigt:
2-Amino-6-chlorpurin (6-Chlorguanin); 6-(6-Aminohexylamino)- purin (N⁶-(6-Aminohexyl)adenin); 6-Amino-2-hydroxypurin (Isoguanin); 2-Amino-6-methoxypurin (O⁶-Methylguanin); 6-Amino-2- methylpurin (2-Methyladenin); 2-Amino-6-methylthiopurin; 2- Aminopurin; 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin; 7-Amino-v-triazolo [4,5-d]pyrimidin (8-Azaadenin); 5-Amino-v-triazolo[4,5- d]pyrimidin-7-on (8-Azaguanin); 6-Chlorpurin; 2,6-Diaminopurin; 6-Dimethylaminopurin; 6-Hydroxy-2-thiolpurin (2-Tioxanthin); 6-Methoxypurin; 6-Methylaminopurin (6-Methyladenin); 6-Methylpurin, 6-Methylthiopurin, Purin, 6-Thiolpurin.
2-Amino-6-chlorpurin (6-Chlorguanin); 6-(6-Aminohexylamino)- purin (N⁶-(6-Aminohexyl)adenin); 6-Amino-2-hydroxypurin (Isoguanin); 2-Amino-6-methoxypurin (O⁶-Methylguanin); 6-Amino-2- methylpurin (2-Methyladenin); 2-Amino-6-methylthiopurin; 2- Aminopurin; 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin; 7-Amino-v-triazolo [4,5-d]pyrimidin (8-Azaadenin); 5-Amino-v-triazolo[4,5- d]pyrimidin-7-on (8-Azaguanin); 6-Chlorpurin; 2,6-Diaminopurin; 6-Dimethylaminopurin; 6-Hydroxy-2-thiolpurin (2-Tioxanthin); 6-Methoxypurin; 6-Methylaminopurin (6-Methyladenin); 6-Methylpurin, 6-Methylthiopurin, Purin, 6-Thiolpurin.
Alle eingesetzten Basen sind kommerziell verfügbar und
können von den Firmen Sigma (Deisenhofen, BRD) und IMA
(Zeppelinheim) bezogen werden.
Claims (10)
1. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside, erhältlich durch Übertragung
eines 2,3-Didesoxyribofuranosylrestes von einem 2′,3′-
Didesoxyribofuranosid auf eine Akzeptorbase unter Katalyse
durch Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus,
dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Ausnutzung der katalytischen
Aktivität der Transferase aus Lactobacillus
leichmannii darstellbar sind.
2. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß ein 2,3-Didesoxyribofuranosylrest glykosidisch
mit einem gegebenenfalls substituierten Pyrazolo[3,4-
d]pyrimidin oder Triazolo[4,5-d]pyrimidin verknüpft ist.
3. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside nach Anspruch 2, gekennzeichnet
durch folgende Strukturen:
4-Amino-1-(1-b-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin
(kann auch als 4-Aminopyrazolo[3,4- d]pyrimidin-1-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 5-Amino-3-(1-β-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)- v-triazolo[4,5-d]pyrimidin-7-on
(kann auch als 5-Amino-v-triazolo[4,5- d]pyrimidin-7-on-3-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 8-Azaguanin-9-β-D- 2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 7-Amino-3-(1-β-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)- v-triazolo[4,5-d]pyrimidin
(kann auch als 7-Amino-v-triazolo[4,5- d]pyrimidin-3-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 8-Azaadenin-9-β-D- 2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden).
(kann auch als 4-Aminopyrazolo[3,4- d]pyrimidin-1-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 5-Amino-3-(1-β-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)- v-triazolo[4,5-d]pyrimidin-7-on
(kann auch als 5-Amino-v-triazolo[4,5- d]pyrimidin-7-on-3-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 8-Azaguanin-9-β-D- 2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 7-Amino-3-(1-β-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)- v-triazolo[4,5-d]pyrimidin
(kann auch als 7-Amino-v-triazolo[4,5- d]pyrimidin-3-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 8-Azaadenin-9-β-D- 2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden).
4. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß ein 2,3-Didesoxyribofuranosylrest glykosidisch
mit Purin oder einem substituierten Purin verknüpft
ist.
5. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside nach Anspruch 4,
gekennzeichnet durch folgende Strukturen:
6-(6-Aminohexylamino)-9-(1-β-D-2,3-
didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-(6-Aminohexylamino)- purin-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder N⁶-(6-Aminohexyl)-2′,3′-didesoxyadenosin bezeichnet werden) 6-Amino-2-hydroxy-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Amino-2-hydroxypurin- 9-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 2′,3′-Didesoxy-iso-guanosin bezeichnet werden) 2-Amino-6-methoxy-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 2-Amino-6-methoxypurin- 9-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder O⁶-Methyl-2′,3′-didesoxyguanosin bezeichnet werden) 2-Amino-6-methylthio-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 2-Amino-6-methylthiopurin-9- b-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 6-Dimethylamino-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Dimethylaminopurin-9- β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 9-(1-β-D-2,3-Didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als Purin-9-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 6-Hydroxy-2-thiol-9-(1-β-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Hydroxy-2-tiolpurin- 9-b-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 2-Thio-2′,3′-didesoxyxanthosin bezeichnet werden) 6-Thiol-9-(1-b-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Thiolpurin-9-β-D- 2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 6- Mercaptopurin-9-b-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden).
(kann auch als 6-(6-Aminohexylamino)- purin-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder N⁶-(6-Aminohexyl)-2′,3′-didesoxyadenosin bezeichnet werden) 6-Amino-2-hydroxy-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Amino-2-hydroxypurin- 9-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 2′,3′-Didesoxy-iso-guanosin bezeichnet werden) 2-Amino-6-methoxy-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 2-Amino-6-methoxypurin- 9-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder O⁶-Methyl-2′,3′-didesoxyguanosin bezeichnet werden) 2-Amino-6-methylthio-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 2-Amino-6-methylthiopurin-9- b-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 6-Dimethylamino-9-(1-β-D-2,3- didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Dimethylaminopurin-9- β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 9-(1-β-D-2,3-Didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als Purin-9-β-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden) 6-Hydroxy-2-thiol-9-(1-β-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Hydroxy-2-tiolpurin- 9-b-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 2-Thio-2′,3′-didesoxyxanthosin bezeichnet werden) 6-Thiol-9-(1-b-D-2,3-didesoxyribofuranosyl)purin
(kann auch als 6-Thiolpurin-9-β-D- 2′,3′-didesoxyribofuranosid oder 6- Mercaptopurin-9-b-D-2′,3′-didesoxyribofuranosid bezeichnet werden).
6. 2′,3′-Didesoxyribofuranoside nach den Ansprüchen 1 bis 5
als Pharmazeutika.
7. Verfahren zur Herstellung von 2′,3′-
Didesoxyribofuranosiden durch Übertragung eines
2,3-Didesoxyribofuranosylrestes auf eine Akzeptorbase unter
Katalyse durch Nukleosid-Desoxyribosyltransferase aus
Lactobacillus, dadurch gekennzeichnet, daß Nukleosid-
Desoxyribosyltransferase aus Lactobacillus leichmannii
verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
diejenige Nukleosid-Desoxyribosyltransferase verwendet wird,
die bei anionenchromatographischer Trennung der Nukleosid-
Desoxyribosyltransferasen aus Lactobacillus leichmannii als
zweite Transferase-Spezies anfällt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
2′,3′-Didesoxyribofuranoside durch Übertragung eines 2,3-
Didesoxyribofuranosylrestes von 2′,3′-Didesoxycytidin auf
eine gegebenenfalls substituierte Purin-, Pyrazolo[3,4-
d]pyrimidin- oder Triazolo[4,5-d]-pyrimidin-Base hergestellt
werden.
10. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß nach der enzymatischen Reaktion eine
Reinigung der Produkte durch Reversed-phase-Chromatographie,
vorzugsweise über Octadecylsilan, durchgeführt wird.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19883840160 DE3840160A1 (de) | 1988-11-29 | 1988-11-29 | 2',3'-didesoxyribofuranoside und ein verfahren zu ihrer herstellung |
PCT/EP1989/001447 WO1990006312A1 (de) | 1988-11-29 | 1989-11-29 | 2', 3'-didesoxyribofuranoside und ein verfahren zu ihrer herstellung |
AU48174/90A AU4817490A (en) | 1988-11-29 | 1989-11-29 | 2',3'-dideoxyribofuranosides and process for producing them |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3840160A1 true DE3840160A1 (de) | 1990-05-31 |
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ID=6368063
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19883840160 Withdrawn DE3840160A1 (de) | 1988-11-29 | 1988-11-29 | 2',3'-didesoxyribofuranoside und ein verfahren zu ihrer herstellung |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3840160A1 (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4004558A1 (de) * | 1989-02-27 | 1990-09-27 | Sanyo Kokusaku Pulp Co | 2',3'-didesoxypurinnucleoside und verfahren zu ihrer herstellung |
EP2177606A2 (de) | 2001-09-14 | 2010-04-21 | Institut Pasteur | N-Desoxyribosyltransferasen von Laktobazillen, entsprechende Nukleotidsequenzen und ihre Anwendungen |
CN105754899A (zh) * | 2016-04-08 | 2016-07-13 | 南京工业大学 | 一种n-脱氧核糖转移酶、编码基因及其高产菌株和应用 |
-
1988
- 1988-11-29 DE DE19883840160 patent/DE3840160A1/de not_active Withdrawn
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4004558A1 (de) * | 1989-02-27 | 1990-09-27 | Sanyo Kokusaku Pulp Co | 2',3'-didesoxypurinnucleoside und verfahren zu ihrer herstellung |
DE4004558C2 (de) * | 1989-02-27 | 1998-02-12 | Jujo Paper Co Ltd | 6-Mercaptopurin- und 2-Amino-6-mercaptopurin-9-ß-D-2',3'-didesoxyribofuranosid, diese enthaltende Mittel, Medikamente und Reagenzien sowie Verfahren zur Herstellung von 2',3'-Didesoxypurinnucleosiden |
EP2177606A2 (de) | 2001-09-14 | 2010-04-21 | Institut Pasteur | N-Desoxyribosyltransferasen von Laktobazillen, entsprechende Nukleotidsequenzen und ihre Anwendungen |
CN105754899A (zh) * | 2016-04-08 | 2016-07-13 | 南京工业大学 | 一种n-脱氧核糖转移酶、编码基因及其高产菌株和应用 |
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