DE2165406C3 - Verfahren zur Isolierung vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen - Google Patents
Verfahren zur Isolierung vom anorganischen Phosphat abhängigen EnzymenInfo
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Description
— O — P — O Gruppen
in Berührung bringt, wobei die vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzyme und die basischen
Proteine auf dem Träger adsorbiert werden, daß man sodann die vom anorganischen Phosphat
abhängigen Enzyme dadurch vom Träger mit den adsorbierten vom anorganischen Phosphat abhängigen
Enzymen und den basischen Proteinen selektiv eluiert, daß man den Träger mit einem
wäßrigen Eluierungsmittel in Berührung bringt, welches mindestens ein Substrat, Koenzym, einen
Inhibitor und/oder einen Aktivator, wobei diese Substanzen in bezug auf die jeweiligen zu isolierenden,
vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzyme mit dem anorganischen Phosphat in Konkurrenz stehen und gegenüber den jeweiligen
zu isolierenden vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen spezifisch sind, enthält, und
daß man das Eluat mit den vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine rohe Enzymlösung verwendet,
aus der die basischen Proteine zuvor entfernt worden sind.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von Enzymen, die vom anorganischen Phosphat abhängig
sind, durch Affinitätschromatographie.
Unter dem Begriff »von anorganischem Phosphat abhängigen Enzymen« nachstehend auch als »Pi-abhängige
Enzyme« bezeichnet, sollen hier allgemein Enzyme verstanden werden, die anorganisches Phosphat
(als Pi bezeichnet) als Substrat verwerten, die anorganisches Phosphat als Reaktionsprodukt ergeben
oder Enzyme, bei denen die durch sie katalysierten Reaktionen durch anorganisches Phosphat inhibiert
oder aktiviert werden.
Beispiele für Enzyme, die Pi als Substrat verwerten oder die Pi als Reaktionsprodukte ergeben, sind Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
und anorganische Pyrophosphatase. Beispiele für Enzyme, deren Reaktion durch Pi inhibiert wird, sind Glucise-6-phosphat-Dehydrogenase,
6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, Ribulose-l,6-diphosphat-Dehydrogenase und
Pyruvatkinase. Beispiele für Enzyme, deren Reaktion durch Pi aktiviert wird, sind Fumarase und Urease.
Diese Pi-abhängigen Enzyme sind wichtige Enzyme, die direkt an vitalen Erscheinungen in den Zellen teilnehmen.
Man erwartet von ihnen einen breiten Anwendungsbereich als Laborreagenzien für biochemische
Zwecke und weiterhin als klinische und pathologische
ίο Reagenzien für medizinische und pharmazeuüsche
Zwecke.
Einige dieser Enzyme sind schon aus Tiergeweben und Mikroorganismen extrahiert und vor der Anwendung
gereinigt worden. Die technischen Enzympro-
dukte sind jedoch entweder sehr teuer oder die Produkte sind nicht erhältlich, da bislang noch keine
durchführbaren Reinigungsmethoden aufgefunden worden sind. Aus diesem Grund ist die Verwendung
der Enzyme bislang beschränkt gewesen, obgleich diese Enzyme sehr geeignet sind.
Die herkömmlichen Enzymisolierungsmethoden ordnen sich in folgende Gruppen ein:
1. Ausfällungsmethoden beim isoelektrischen Punkt. Bei diesen Methoden nützt man die Eigenschaften
von amphoteren Elektrolyten aus, daß die Löslichkeit je nach der Wasserstoifionenkonzentration
variiert und beim isoelektrischen Punkt den geringsten Wert einnimmt.
2. Aussalzmethoden. Dabei nützt man die Löslichkeitsunterschiede zwischen den Enzymen in Lösung
eines neutralen Salzes, wie Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat, aus.
3. Ausfällungsmethoden mit organischen Lösungsmitteln. Dabei fällt man die Enzyme fraktioniert
aus, indem man die Löslichkeit durch Zugabe von Alkohol, Aceton, Dioxan usw. zu der Enzymlösung
allmählich verringert.
4. Wärmebehandlungsmethoden, bei welchem mar die Temperatur der Enzymlösung erhöht, um die
ungewünschten Proteine zu denaturieren und zu verfestigen. Bei diesen Verfahren nützt man die
unterschiedliche Wärmestabilität der Enzyme aus, Sodann wird das Protein entfernt.
5. Selektive Ausfällungsmethoden, bei welchem mar *5 ein spezielles Fällungsreagens, wie Protaminsulfal
oder Bleiacetat, verwendet.
6. Selektive Adsorptionsmethoden, bei welchen mar spezielle Adsorbentien, wie Aluminiumhydroxid
oder Calciumphosphat-Gel, verwendet.
7. Ionenaustauscher-Chromatographie und Elektro
phorese, bei welchen man hauptsächlich di« Differenz der elektrischen Ladungen zwischen der
einzelnen Proteinen ausnützt.
8. Kristallisationsmethoden.
55
8. Kristallisationsmethoden.
55
Die obengenannten, bekannten, allgemein üblicher Reinigungsmethoden beruhen auf den quantitativer
Unterschieden der physikalischen Eigenschaften zwi sehen den Enzymen oder Proteinen. Qualitative Un
terschiede der biologischen Eigenschaften werden da bei jedoch nicht ausgenutzt. Daher ist die Isolierunf
der einzelnen Enzyme mit genügender Reinheit sehi schwierig, obgleich Enzyme und Proteine mit nah<
aneinanderliegenden physikalisch-chemischen Eigen schäften als Gruppe erfolgreich hergestellt werder
konnten. Zur Reinigung der jeweiligen Enzyme warer jedoch sehr aufwendige und teure Arbeitsweisen, bei
spielsweise die Kombination verschiedener Reini
3 4
gungsmethoden oder die Wiederholung der Methoden, zur Isolierung von vom anorganischen Phosphat ab-
erforderlicn. hängigen Enzymen durch Affinitätschromatographie,
Zur Reinigung von Glucose-o-phosphat-Dehydro- das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine rohe
genäse, die ein Pi-abhangiges Enzym ist, wurde bei- Enzymlösung, welche keine der im folgenden definier-
spielsweise folgende Methode beschrieben (Journal of 5 ten Eluierungsmittel und zusätzlich zu den vom anorga-
Biological Chemistry, Vol. 236, Nr. 5, S. 1225 bis nischen Phosphat abhängigen Enzymen undverschiede-
1230,1961). Eine Ghicose-ö-phosphat-Dehydrogenase- nen anderen Enzymen verschiedene saure, neutrale und
Probe mit einer 38UOfacnen Reinheit wurde mit einer basische Proteine enthält, mit einem Träger aus einer
schlechten Ausbeute von nur 13% (I.E./I.E. de- wasserunlöslichen organischen oder anorganischen
Enzyme: Die gleiche Bezeichnung soll nachfolgend io Verbindung mit
ebenfalls verwendet werden) aus einem Autolyse- O
Extrakt von getrockneter Brauhefe durch 15 Reini- Il
gungsstufen erhalten. Diese Reinigungsstufen schlos- _ r>
— P — O — Grurjnen
sen die fraktionierte Ausfällung mit Silbernitrat, das I
fraktionierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die 15 1
Ausfüllung mit Alkohol als organisches Lösungsniitt»!, - 9
die fraktionierte Adsorption an Betonit, das fraktio- '
nierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die fraktio- in Berührung bringt, wobei die vom anorganischen
nierte Ausfällung mit Manganionne, die Ausfällung Phosphat abhängigen Enzyme und die basischen Pro-
mit Aceton als organisches Lösungsmittel, das fraktio- 20 teine auf dem Träger adsorbiert werden, daß man so-
nierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die Ionenaus- dann die vom anorganischen Phosphat abhängigen
tauscher-Chromatographie mit einem schwachbasi- Enzyme dadurch vom Träger mit den adsorbierten
sehen Ionenaustauscher, das fraktionierte Aussalzen vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen
mit Ammoniumsulfat und eine Kristallisation (zwei- und den basischen Proteinen selektiv eluiert, daß man
mal) ein. 25 den Träger mit einem wäßrigen Eluierungsmittel in
Zur Reinigung von Pyruvat-Kinase, die ein weiteres Berührung bringt, welches mindestens ein Substrat,
Pi-abhängiges Enzym ist, wurde folgendes Verfahren Koenzym, einen Inhibität und/oder einen Aktivator,
beschrieben (Journal of Biological Chemistry, Vol. 244, wobei diese Substanzen in bezug auf die jeweiligen zu
Nr. 18, S. 4815 bis 4818, 1969). Eine Pyruvat-Kinase- isolierenden, vom anorganischen Phosphat abhängigen
Probe mit einer etwa 50fachen Reinheit (bezogen auf 30 Enzyme mit dem anorganischen Phosphat in Konkurden
rohen Extrakt) wurde mit einer schlechten Aus- renz stehen und gegenüber den jeweiligen zu isolierenbeute
von 44,9% aus dem Autolyse-Extrakt von den vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzy-Bäckerhefe
durch ein Reinigungsverfahren erhalten. men spezifisch sind, enthält, und daß man das Eluat
Das Reinigungsverfahren schloß das fraktionierte mit den vom anorganischen Phosphat abhängigen
Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die Ionenaustauscher- 35 Enzymen gewinnt.
Chromatographie mit DÄÄ-Cellulose, die Ionenaus- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die
tauscher-Chromatographie mit Cellulosephosphat und von anorganischem Phosphat abhängigen Enzyme auf
das fraktionierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat ein. Grund ihrer enzymatischen Aktivität gegenüber Phos-
Gemäß der Erfindung soll eine Isolationsmethode phat adsorbiert, während die basischen Proteine, die
für Enzyme zur Verfügung gestellt werden, durch 40 keine Enzyme darstellen, auf den Träger auf Grund
welche in einfacher und billiger Weise Pi-abhängige ihrer statischen elektrischen Kräfte adsorbiert werden.
Enzyme mit hoher Reinheit hergestellt werden kön- Die basischen Proteine werden jedoch schließlich von
nen. den von anorganischem Phosphat abhängigen Enzy-
Es wurde nun gefunden, faß Pi-abhängige Enzyme men abgetrennt, da diese basischen Proteine in der
auf wasserunlöslichen Trägern, wie Cellulosephosphat, 45 nachfolgenden Elutionsstufe nicht aus dem Träger
die eluiert werden.
O Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des er-
'! findungsgemäßen Verfahrens wird als Ausgangsmate-
_ O — P — O Gruppen rial dem Verfahren eine rohe Enzymlösung unterwor-
I 50 fen, aus der die basischen Proteine zuvor entfernt
Q wurden.
Die bei dem Verfahren der Erfindung verwendeten
enthalten, entsprechend ihrer jeweiligen enzymatischen rohen Enzymlösungen sind Extrakte von mechanischen
Affinität für Pi adsorbiert werden und daß die durch Zerkleinerungsprodukten oder Autolysaten von Mikro-
die enzymatische Affinität adsorbierten Enzyme aus 55 Organismen, wie Hefe oder Bakterien, sowie Extrakte
den Trägern eluiert werden, wenn ein mit Pi in Kon- von Homogenaten verschiedener animalischer Ge-
kurrenz stehendes Substrat zugegeben wird. Die vor- webe und Pflanzen. Wenn die rohen Enzymlösungen
liegende Erfindung baut sich auf diesen Erkenntnissen ein Eluierungsmittel enthalten sollten, dann sollte die-
auf. ses Eluierungsmittel zuvor entfernt werden.
Erfindungsgemäß wird von dem qualitativen Unter- 60 Die rohen Enzymlösungen können saure, neutrale
schied der biologischen Eigenschaften der Enzyme, und basische von anorganischem Phosphat abhängige
d. h. der Spezifitäten der Enzyme, nicht jedoch von den Enzyme, andere saure, neutrale und basische Enzyme,
quantitativen Unterschieden der physikalisch-chemi- die keine Pi-abhängigen Enzyme darstellen, und
sehen Eigenschaften Gebrauch gemacht. Das erfin- andere saure, neutrale und basische Proteine, die keine
dungsgemäße Verfahren unterscheidet sich daher be- 65 Enzyme darstellen, enthalten. Es ist nicht notwendig,
reits von der Theorie her von den herkömmlichen diese anderen Proteine vor dem Reinigungsverfahren
Reinigungsmethoden. zu entfernen, und die rohen Enzymlösungen können
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren ohne jede Vorbehandlung eingesetzt werden.
if
Die rohe Enzymlösung wird mit einem Träger in dann werden die Pi-abhängigen Enzyme aus dem Trä-
Berührung gebracht, der eine wasserunlösliche orga- ger nicht eluiert.
nische oder anorganische Verbinduiig mit So kann man z. B. Glucose-6-phosphat-Dehydro-
O genäse in reiner Form isolieren, indem man den mit
π 5 dem Enzym beladenen Träger mit einer wäßrigen
n I n n Lösung von Nikotinamid-adenindinucleotidphosphat
KJ r KJ -uruppen (NADP), welches das Koenzym dieses Enzyms ist,
' auswäscht bzw. in Berührung bringt
O o-Phosphogluconat-Dehydrogenase kann beispiels-
enthält Dies geschieht dazu, um die Pi-abhängigen io weise in reiner Form isoliert werden, indem man den
Enzyme und die in diesen Enzymen nicht eingeschlos- mit dem Enzym beladenen Träger mit einer wäßrigen
senen basischen Proteine auf dem Träger zur Adsorp- Lösung von 6-Phosphorgluconat, welches ein Sub-
tion zu bringen. strat dieses Enzyms ist, als Eluierungsmittel in Be-
AIs Träger auf der Basis wasserunlöslicher orga- running bringt bzw. auswäscht
nischer Verbindungen mit 15 In der gleichen Weise können Pyruvat-Kinase, an-
O organische Pyrophosphatase und Ribulose-diphos-
Il phatcarboxylase selektiv isoliert werden, indem man
_ Q _ ρ _ o _ GruoDen den mit dem Enzym beladenen Träger mit wäßrigen
I " pp Lösungen von Substraten, d. h. Adenosintriphosphat
' ao (ATP), eines Pyrophosphats bzw. von Ribulosedi-
^ phosphat, als Eluierungsmittel, in Berührung bringt
können beispielsweise Cellulosephosphat (P-Cellulose), bzw. auswäscht.
Phosphorylmethylcellulose (PPM-Cellulose) und ein Wenn die gereinigte Enzymlösung durch Ultra-Kationenaustauscherharz
mittlerer Säurestärke, das filtration od. dgl. konzentriert und langsam beispielsfunktiondle
Phosphonsäuregruppen auf einer ver- 25 weise mit Ammoniumsulfat-Lösung versetzt wird, dann
netzten Polystyrolmatrix enthält, verwendet werden. kann das Enzym in kristalliner Form erhalten werden.
Das vorstehend genannte Kationenaustauscherharz ist Wenn das Eluierungsmittel entfernt werden soll, dann
bekannt aus der Veröffentlichung der Diamond'Sham- kann eine Gelfiltration und Dialyse vorgenommen werrock
Chemical Company vom Mai 1970 (25 M 5/70 den.
DA-193-itE) und der Veröffentlichung der gleichen 30 Gemäß einer speziellen Ausführungsform des erFirma
DUOLITE Data Leaflet Nr. 2, 1971, 6. Als findungsgemäßen Verfahrens werden die basischen
Träger auf der Basis wasserunlöslicher anorganischer Proteine zuvor aus den als Ausgangsmaterialien verVerbindungen,
die diese Gruppe enthalten, können wendeten rohen Enzymlösungen entfernt. Diese Entz.
B. Calciumphosphat-Gel und Magnesiumphosphat fernung der basischen Proteine aus den rohen Enzymverwendet
werden. 35 lösungen kann in einfacher Weise erfolgen, indem die
Die Berührung der rohen Enzymlösung mit dem Lösung durch einen sauren anionischen Ionenaus-Träger
wird dadurch bewirkt, daß man die rohe Enzym- tauscher geleitet wird, wie Carboxymethylcellulose. In
lösung durch eine mit dem Träger gefüllte Säule leitet diesem Fall werden auf dem Träger nur die von anoder
daß man den Träger in der rohen Enzymlösung organischem Phosphat abhängigen Enzyme adsorbiert,
suspendiert. 40 Die Kapazität des Trägers für die Adsorption der
Auf diese Weise werden durch Berührung der rohen von anorganischem phosphatabhängigen Enzyme ist
Enzymlösung mit dem Träger die Pi-abhängigen En- daher in diesem Fall erheblich erhöht. Bei dem erfin-
zyme und die basischen Proteine auf dem Träger ad- dungsgemäßen Verfahren können daher geringe
sorbiert. Mengen der Träger und der Eluierungsmittel verwendet
Die Adsorption der Pi-abhängigen Enzyme erfolgt 45 werden. Die Reinigungsmaßnahmen sind einfach und
auf Grund der enzymatischen Affinität mit dem Träger leicht durchzuführen.
während die Adsorption der basischen Proteine, die Ein weiterer charakteristischer Vorteil des erfin-
keine Enzyme sind, auf Grund der statischen elektri- dungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß Enzym-
schen Kräfte zwischen der elektrischen Ladung der lösungen mit hoher Konzentration erhalten werden, da
basischen Proteine und derjenigen des Trägers erfolgt. 50 nur mit kleinen Mengen von Eluierungsmitteln gearbei-
Andererseits werden saure und neutrale Enzyme, die tet werden kann.
keine von anorganischem Phosphat abhängige Enzyme Weiterhin können viele Enzymarten nacheinander in
darstellen, und saure und neutrale Proteine, die keine einer einstufigen Reinigung erhalten werden, indem
Enzyme sind, nicht an dem erfindungsgemäß verwen- man nacheinander die Eluierungsmittel verändert, da
deten Träger adsorbiert und laufen bei dem Adsorp- 55 die Reinigung bei ziemlich milden Bedingungen er-
tionsverfahren durch die Säule. folgt.
Danach wird der Träger mit einer wäßrigen Lösung Das Verfahren der Erfindung ist vom industriellen
in Berührung gebracht, die als Eluierungsmittel minde- Standpunkt aus gesehen sehr vorteilhaft, da die Reini-
stens ein Substrat, Koenzym, einen Inhibitor und/oder gung in einfacher Weis«; und innerhalb eines kurzen
einen Aktivator enthält, welches bzw. welcher dem 60 Zeitraums erfolgen kann. Schwierigkeiten auf Grund
einzelnen Enzym gegenüber spezifisch (selektiv) ist von Verschmutzungen u. dgl. treten kaum auf.
und mit dem Pi in Konkurrenz steht (d. h. antagoni- Das Verfahren kann in iiiner einfachen Anlage durch-
stisch wirkt), umd die jeweiligen Pi-abhängigen Enzyme geführt werden,
selektiv in die wäßrige Lösung zu eluieren. Die Ionenaustauscher-Chromatographie ist die am
Wenn eine wäßrige Lösung verwendet wird, die ein 65 meisten bevorzugte Methode bei den herkömmlichen
Substrat, ein Koenzym, einen Inhibitor oder einen Isolationsmethoden für Enzyme, da sie relativ einfach
Aktivator enthält, der mit dem Pi nicht in Konkurrenz vonstatten geht und man bei milden Bedingungen einen
steht (bzw. diesem gegenüber nicht antagonisch wirkt), ziemlich hohen Isolationseffekt erzielt. Bei diesem be-
kannten Verfahren ist aber selbst bei ausgewählten Reinigungsbedingungen eine Verunreinigung durch
Substanzen mit quantitativ ähnlichen Eigenschaften nicht vermeidbar, da dieses bekannte Verfahren sich
auf den quantitativen Unterschieden der elektrischen Eigenschaften, wie des isoelektrischen Punktes der
Enzyme, aufbaut. Demgegenüber besitzt das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren die Vorteile
der herkömmlichen Ionenaustauscher-Chromatographie-Verfahren und den weiteren Vorteil, daß eine
»Klarschnitte-Eluierung vorgenommen werden kann da das Verfahren der Erfindung die inhärenten, genauen
Spezifizitäten von Enzymen für Substrate ausnutzt und da die Eluierung durch ein spezielles Eluierungsmittel,
welches für das spezielle Enzym spezifisch ist, vorgenommen
wird. Das Verfahren der Erfindung stellt somit ein ideales Isolierungsverfahren dar.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Darin
sind sämtliche Prozentangaben auf das Volumen bezogen, falls keine anderen Angaben gemacht werdeia.
IsoUerung von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
(hierin als G-6-PDH bezeichnet)
(hierin als G-6-PDH bezeichnet)
21 Äthylacetat wurden zu 20 kg von nassen Zellen der Hefeart Candida utilis gegeben. Das Ganze wurde
gründlich gerührt, um eine Autolyse zu bewirken. Die löslichen Komponenten wurden mit 201 einer
ungesättigten Ammoniumsulfatlösung bei Raumtemperatur
24 Stunden extrahiert. Durch Zentrifugierung wurden unlösliche Stoffe entfernt. Auf diese
Weise wurde ein roher Extrakt erhalten, der 336 · M)4 I.E. G-6-PDH enthielt.
Das Lösungsmittel im Extrakt wurde mit 50 mM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) ersetzt, indem
durch eine Säule mit 201 eines als Gel-Filtrationsmedium geeigneten vernetzten Dextrans im Fraktionsbereich 100 bis 5000 geleitet wurde. Das verwendete
vernetzte Dextran ist aus der Veröffentlichung der Pharmacia Fine Chemicals, Division of AB Pharmacia
»Sephadex and other separation products«, Januar 1970, S. 4, Typ G-25, bekannt. Der Extrakt wurde
durch eine Säule mit 201 DÄÄ-Cellulose geleitet, um G-6-PDG zu adsorbieren (gleichzeitig Hefen die ba.sisehen
Proteine durch und wurden auf diese Weise entfernt). Sodann wurde das Produkt mit 401 50 mM Triäthanolamin
HCl-Pufferlösung (pH 7,5) gewaschen. Hierauf wurden 401 150 mM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5) durch die Säule geleitet. Etwa so 201 der eluierten Fraktion, die G-6-PDH enthielt
(NADP, d. h. das Eluierungsmittel für das Enz>m, wenn es überhaupt vorhanden war, wurde zu diesem
Zeitpunkt nicht eluiert), wurden durch eine Säule mit 201 des vorstehend angegebenen vernetzten Dextruns
geleitet, um das Lösungsmittel durch 10 mM Makinsäure-NaOH-Pufferlösung
(pH 6,0) zu ersetzen. Die rohe Enzymlösung von G-6-PDH, die kein Eluierungsmittel,
nämlich NADP, enthielt, wurde durch eine Säule mit 5 1 P-Cellulose geleitet, um das G-6-PDH
auf dem Träger durch enzymatische Affinität mit den Phosphorsäuregruppen der P-Cellulose zu adsorbieren.
Darauf wurden 151 1OmM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung
(pH 6,0, Waschlösung), 51 eines Gemisches (Eluierungslösung) aus dem gleichen Puffer
und von NADP in einer Konzentration von 10' M, welches ein Koenzym für das G-6-PDH ist, und 101
10 mM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (Herausdrücklösung)
durch die Säule nacheinander geleitet. Das NADP begann vom Boden der Säule aus zu
fließen. Zur gleichen Zeit begann hochgereinigte G-6-PDH, die auf ein Volumen von etwa 11 konzentriert
war, zu fließen.
Die spezifische Aktivität betrug etwa 55001. E. je mg
Protein. Der Reinigungsgrad, bezogen auf den rohen Extrakt, betrug etwa das 50O0fache. Die Ausbeute betrug
etwa 70%,
Die G-6-PDH kann durch Konzentrierung der gereinigten G-6-PDH-Lösung durch Ultrafiltration und
Erhöhen der Amraoniuimulfatkonzentration allmählich
zu einer Sättigung von etwa 0,7 kristallisiert werden.
Die hierin enthaltene NADP hatte die Wirkung, daß die Inaktivierung des Enzyms verhindert wurde. Es
lagen jedoch keine schädlichen Einflüsse auf die quantitative Bestimmung der NADP vor, da das
NADP in extrem geringer Menge vorlag. NADP kann aber leicht durch Gel-Filtration mit dem vorstehend
genannten vernetzten Dextran entfernt werden.
Isolierung von Pyruvat-Kinase (nachstehend als
PK bezeichnet)
PK bezeichnet)
21 Äthylacetat wurden zu 20 kg der nassen Zellen
der Hefeart Candida utilis gegeben. Das Ganze wurde gründlich gerührt, um eine Autolyse zu bewirken.
Die löslichen Komponenten wurden mit 201 einer Ungesättigten Ammoniumsulfat-Lösung bei Raumtemperatur
24 Standen extrahiert. Die unlöslichen Komponenten wurden durch Zentrifugierung entfernt,
wodurch ei 1 roher Extrakt erhalten wurde, der 95 · 10"5 I.E. von PK enthielt. Zu dem rohen Extrakt
wurde die viertelte Menge an Glycerin gegeben. Das Lösungsmittel in dem rohen Extrakt wurde durch
50 mM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 7,5),
die 20% Glycerin enthielt, in einer Säule mit 20 1 eines quervernetzten Dextrans ersetzt. Der Extrakt wurde
sodann durch eire Säule mit 201 DÄÄ-Cellulose geleitet, um das PK zu adsorbieren (zu diesem Zeitpunkt
Hefen die basischen Proteine durch und wurden auf diese Weise entfernt). Es wurde mit 401 50-mM-Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung,
die 20% Glycerin enthielt, gewaschen. Sodann wurden 401 einer 200-mM-Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung,
die 20% Glycerin enthielt, durch die Säule geleitet. Etwa 201 der eluierten
Fraktion, dit; PK enthielt (zu diesem Zeitpunkt wird ATP, d. h. tdas Eluierungsmittel für das Enzym,
nicht eluiert) durch die Säule mit 20 1 des in Beispiel 1 verwendeten vernetzten Dextrans geleitet, um das
Lösungsmittel durch 10 mM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 6,0), die 20% Glycerin enthielt, auszutauschen.
Die rohe Enzymlösung von PK wurde durch eine Säule mit 5 1 P-Cellulose geleitet, um PK durch
enzymatische Affinität mit der Phosphorsäuregruppe zu adsorbieren.
Hierauf wurden 15 1 einer 10-mM-Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung
(pH 6,0; Waschlösung), 5 1 eines Gemisches (Eluierungslösung) aus dem gleichen Puffer
und ATP, das ein Substrat von PK ist, in einer Konzentration von 10~3 M, und 101 einer 10-mM-Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung
(Herausdrück-Lösung), die 20% Glycerin enthielt, nacheinander durch
die Säule geleitet. ATP begann vom Boden der Säule auszuströmen. Zur gleichen Zeit begann hochgereinigte
PK zu fließen.
509633/181
\.βΜ
Die spezifische Aktivität betrug etwa 700 I. E. je tigter Ammoniumsulfat-Lösung bei Raumtemperatur
mg Protein. Der Reinigungsgrad des rohen Extraktes 24 Stunden extrahiert. Die unlöslichen Komponenten
betrug das 14Ofache. Die Ausbeute betrug etwa 60%. wurden durch Zentrifugierung entfernt, wodurch ein
roher Extrakt erhalten wurde, der RuDPC enthielt.
B e i s ρ i e 1 3 5 Das Lösungsmittel in dem rohen Extrakt wurde
Isolierung von O-Phosphogluconat-Dehydrogenase J""* ISO-mM-Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH
(nachstehend als 6-PGDH bezeichnet) J.5 .erset2t· '"dem der Extrakt durch e.ne Säule mit
20 1 des in Beispiel 1 zur Gelfiltration verwendeten ver-
Wie im Beispiel 2 wurde ein roher Extrakt mit netzten Dextrans geleitet wurde. Der Extrakt wurde
119 · 104I.E. von 6-PGDH erhalten. 6-PGDH wurde io durch eine Säule mit 21 DÄÄ-Cellulose geleitet. Soauf
einer P-Cellulose-Säule durch enzymatische Affini- dann wurden durch die Säule 2 1 einer 150-mM-Trität
mit der Phosphorsäuregruppe adsorbiert. äthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) geleitet, um
Sodann wurden 15 1 einer 10-mM-Maleinsäure- eine Fraktion zu sammeln, die RuDPC enthielt. Das
NaOH-Pufferlösung (pH 6,0; Waschlösung), 5 1 eines Lösungsmittel in der Fraktion wurde durch 10-mM-Gemisches
(Eluierungslösung) aus dem gleichen Puffer 15 Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 6,0) ersetzt, wound
6-Phosphogluconat, das ein Substrat von 6-PGDH bei 201 des vorstehend angegebenen vernetzten Dexist,
in einer Konzentration von 5 · 10"4 M und 101 trans verwendet wurden.
10-mM-Maleat-Pufferlösung (Herausdrück-Lösung), Die auf diese Weise erhaltene rohe Enzymlösung
die 20% Glycerin enthielt) nacheinander durch die von RuDPC wurde durch eine Säule mit 5 1 PPM-CeI-Säule
geleitet. Als 6-Phosphogluconat vom Boden der 20 lulose geleitet, um die RuDPC entsprechend ihrer
Säule zu strömen begann, begann hochgereinigte enzymatischen Affinität mit der Phosphorsäuregruppe
6-PGDH zu fließen. zu adsorbieren.
Die spezifische Aktivität betrug etwa 200 I.E. je Sodann wurden 151 einer 10-mM-Maleinsäure-
mg Protein. Der Reinigungsgrad des rohen Extrakts NaOH-Pufferlösung (pH 6,0; Waschlösung), 51 eines
betrug etwa das600fache. Die Ausbeute betrug 50%. 25 Gemisches (Eluierungslösung) aus der gleichen Pufferlösung
und Ribulosediphosphat in einer Konzen-
Beispiel 4 tration von 5 · 10~s M und 10 1 einer 10-mM-Malein-
Isolierung von Ribulosediphosphat-Carboxylase säure-NaOH-Pufferlösung (Herausdrück-Lösung)
(nachstehend als RuDPC bezeichnet) nacheinander durch die Säule geleitet. Als Ribulose-
30 o-pnosphat vom Boden der Säule zu strömen begann,
500 ml Äthylacetat wurden zu 5 kg von nassen Zellen begann hochgereinigte RuDPC zu fließen. Die spezider
Hefeart Candida utilis gegeben. Das Ganze wurde fische Aktivität betrug etwa 1100 I. E. je mg Protein,
gründlich gerührt, um eine Autolyse vorzunehmen. Der Reinigungsgrad des rohen Extrakts betrug etwa
Die löslichen Komponenten wurden mit 201 O,lgesät- das 380Ofache. Die Ausbeute betrug etwa 70%.
Claims (1)
1. Verfahren zur Isolierung von vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen durch Affinitätschromatographie,
dadurch gekennzeichnet,
daß man eine rohe Enzymlösung, welche keine der im folgenden definierten Eluierungsmittel
und zusätzlich zu den vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen und verschiedenen
anderen Enzymen verschiedene saure, neutrale und basische Proteine enthält, mit einem
Träger aus einer wasserunlöslichen organischen oder anorganischen Verbindung mit
O
O
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE19712165406 DE2165406C3 (de) | 1971-12-29 | 1971-12-29 | Verfahren zur Isolierung vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE19712165406 DE2165406C3 (de) | 1971-12-29 | 1971-12-29 | Verfahren zur Isolierung vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen |
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Family
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Family Applications (1)
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DE19712165406 Expired DE2165406C3 (de) | 1971-12-29 | 1971-12-29 | Verfahren zur Isolierung vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen |
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1971
- 1971-12-29 DE DE19712165406 patent/DE2165406C3/de not_active Expired
Also Published As
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DE2165406A1 (de) | 1973-07-19 |
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