DE2165406C3

DE2165406C3 - Verfahren zur Isolierung vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen

Info

Publication number: DE2165406C3
Application number: DE19712165406
Authority: DE
Inventors: Katsumi Suita Fujii; Takekazu Takatsuki Horio; Yasuo Suita Suzuki; Isamu Takatsuki Takagahara
Original assignee: ORIENTAL YEAST CO Ltd TOKIO
Current assignee: ORIENTAL YEAST CO Ltd TOKIO
Priority date: 1971-12-29
Filing date: 1971-12-29
Publication date: 1975-08-14
Also published as: DE2165406A1; DE2165406B2

Description

— O — P — O Gruppen

in Berührung bringt, wobei die vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzyme und die basischen Proteine auf dem Träger adsorbiert werden, daß man sodann die vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzyme dadurch vom Träger mit den adsorbierten vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen und den basischen Proteinen selektiv eluiert, daß man den Träger mit einem wäßrigen Eluierungsmittel in Berührung bringt, welches mindestens ein Substrat, Koenzym, einen Inhibitor und/oder einen Aktivator, wobei diese Substanzen in bezug auf die jeweiligen zu isolierenden, vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzyme mit dem anorganischen Phosphat in Konkurrenz stehen und gegenüber den jeweiligen zu isolierenden vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen spezifisch sind, enthält, und daß man das Eluat mit den vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine rohe Enzymlösung verwendet, aus der die basischen Proteine zuvor entfernt worden sind.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von Enzymen, die vom anorganischen Phosphat abhängig sind, durch Affinitätschromatographie.

Unter dem Begriff »von anorganischem Phosphat abhängigen Enzymen« nachstehend auch als »Pi-abhängige Enzyme« bezeichnet, sollen hier allgemein Enzyme verstanden werden, die anorganisches Phosphat (als Pi bezeichnet) als Substrat verwerten, die anorganisches Phosphat als Reaktionsprodukt ergeben oder Enzyme, bei denen die durch sie katalysierten Reaktionen durch anorganisches Phosphat inhibiert oder aktiviert werden.

Beispiele für Enzyme, die Pi als Substrat verwerten oder die Pi als Reaktionsprodukte ergeben, sind Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und anorganische Pyrophosphatase. Beispiele für Enzyme, deren Reaktion durch Pi inhibiert wird, sind Glucise-6-phosphat-Dehydrogenase, 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, Ribulose-l,6-diphosphat-Dehydrogenase und Pyruvatkinase. Beispiele für Enzyme, deren Reaktion durch Pi aktiviert wird, sind Fumarase und Urease. Diese Pi-abhängigen Enzyme sind wichtige Enzyme, die direkt an vitalen Erscheinungen in den Zellen teilnehmen. Man erwartet von ihnen einen breiten Anwendungsbereich als Laborreagenzien für biochemische Zwecke und weiterhin als klinische und pathologische

ίο Reagenzien für medizinische und pharmazeuüsche Zwecke.

Einige dieser Enzyme sind schon aus Tiergeweben und Mikroorganismen extrahiert und vor der Anwendung gereinigt worden. Die technischen Enzympro-

dukte sind jedoch entweder sehr teuer oder die Produkte sind nicht erhältlich, da bislang noch keine durchführbaren Reinigungsmethoden aufgefunden worden sind. Aus diesem Grund ist die Verwendung der Enzyme bislang beschränkt gewesen, obgleich diese Enzyme sehr geeignet sind.

Die herkömmlichen Enzymisolierungsmethoden ordnen sich in folgende Gruppen ein:

1. Ausfällungsmethoden beim isoelektrischen Punkt. Bei diesen Methoden nützt man die Eigenschaften von amphoteren Elektrolyten aus, daß die Löslichkeit je nach der Wasserstoifionenkonzentration variiert und beim isoelektrischen Punkt den geringsten Wert einnimmt.

2. Aussalzmethoden. Dabei nützt man die Löslichkeitsunterschiede zwischen den Enzymen in Lösung eines neutralen Salzes, wie Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat, aus.

3. Ausfällungsmethoden mit organischen Lösungsmitteln. Dabei fällt man die Enzyme fraktioniert

aus, indem man die Löslichkeit durch Zugabe von Alkohol, Aceton, Dioxan usw. zu der Enzymlösung allmählich verringert.

4. Wärmebehandlungsmethoden, bei welchem mar die Temperatur der Enzymlösung erhöht, um die ungewünschten Proteine zu denaturieren und zu verfestigen. Bei diesen Verfahren nützt man die unterschiedliche Wärmestabilität der Enzyme aus, Sodann wird das Protein entfernt.

5. Selektive Ausfällungsmethoden, bei welchem mar *⁵ ein spezielles Fällungsreagens, wie Protaminsulfal oder Bleiacetat, verwendet.

6. Selektive Adsorptionsmethoden, bei welchen mar spezielle Adsorbentien, wie Aluminiumhydroxid oder Calciumphosphat-Gel, verwendet.

7. Ionenaustauscher-Chromatographie und Elektro phorese, bei welchen man hauptsächlich di« Differenz der elektrischen Ladungen zwischen der einzelnen Proteinen ausnützt.
8. Kristallisationsmethoden.
55

Die obengenannten, bekannten, allgemein üblicher Reinigungsmethoden beruhen auf den quantitativer Unterschieden der physikalischen Eigenschaften zwi sehen den Enzymen oder Proteinen. Qualitative Un terschiede der biologischen Eigenschaften werden da bei jedoch nicht ausgenutzt. Daher ist die Isolierunf der einzelnen Enzyme mit genügender Reinheit sehi schwierig, obgleich Enzyme und Proteine mit nah< aneinanderliegenden physikalisch-chemischen Eigen schäften als Gruppe erfolgreich hergestellt werder konnten. Zur Reinigung der jeweiligen Enzyme warer jedoch sehr aufwendige und teure Arbeitsweisen, bei spielsweise die Kombination verschiedener Reini

3 4

gungsmethoden oder die Wiederholung der Methoden, zur Isolierung von vom anorganischen Phosphat ab-

erforderlicn. hängigen Enzymen durch Affinitätschromatographie,

Zur Reinigung von Glucose-o-phosphat-Dehydro- das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine rohe

genäse, die ein Pi-abhangiges Enzym ist, wurde bei- Enzymlösung, welche keine der im folgenden definier-

spielsweise folgende Methode beschrieben (Journal of 5 ten Eluierungsmittel und zusätzlich zu den vom anorga-

Biological Chemistry, Vol. 236, Nr. 5, S. 1225 bis nischen Phosphat abhängigen Enzymen undverschiede-

1230,1961). Eine Ghicose-ö-phosphat-Dehydrogenase- nen anderen Enzymen verschiedene saure, neutrale und

Probe mit einer 38UOfacnen Reinheit wurde mit einer basische Proteine enthält, mit einem Träger aus einer

schlechten Ausbeute von nur 13% (I.E./I.E. de- wasserunlöslichen organischen oder anorganischen

Enzyme: Die gleiche Bezeichnung soll nachfolgend io Verbindung mit

ebenfalls verwendet werden) aus einem Autolyse- O

Extrakt von getrockneter Brauhefe durch 15 Reini- Il

gungsstufen erhalten. Diese Reinigungsstufen schlos- _ r> — P — O — Grurjnen

sen die fraktionierte Ausfällung mit Silbernitrat, das I

fraktionierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die 15 1

Ausfüllung mit Alkohol als organisches Lösungsniitt»!, - 9

die fraktionierte Adsorption an Betonit, das fraktio- '

nierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die fraktio- in Berührung bringt, wobei die vom anorganischen

nierte Ausfällung mit Manganionne, die Ausfällung Phosphat abhängigen Enzyme und die basischen Pro-

mit Aceton als organisches Lösungsmittel, das fraktio- 20 teine auf dem Träger adsorbiert werden, daß man so-

nierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die Ionenaus- dann die vom anorganischen Phosphat abhängigen

tauscher-Chromatographie mit einem schwachbasi- Enzyme dadurch vom Träger mit den adsorbierten

sehen Ionenaustauscher, das fraktionierte Aussalzen vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen

mit Ammoniumsulfat und eine Kristallisation (zwei- und den basischen Proteinen selektiv eluiert, daß man

mal) ein. 25 den Träger mit einem wäßrigen Eluierungsmittel in

Zur Reinigung von Pyruvat-Kinase, die ein weiteres Berührung bringt, welches mindestens ein Substrat, Pi-abhängiges Enzym ist, wurde folgendes Verfahren Koenzym, einen Inhibität und/oder einen Aktivator, beschrieben (Journal of Biological Chemistry, Vol. 244, wobei diese Substanzen in bezug auf die jeweiligen zu Nr. 18, S. 4815 bis 4818, 1969). Eine Pyruvat-Kinase- isolierenden, vom anorganischen Phosphat abhängigen Probe mit einer etwa 50fachen Reinheit (bezogen auf 30 Enzyme mit dem anorganischen Phosphat in Konkurden rohen Extrakt) wurde mit einer schlechten Aus- renz stehen und gegenüber den jeweiligen zu isolierenbeute von 44,9% aus dem Autolyse-Extrakt von den vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzy-Bäckerhefe durch ein Reinigungsverfahren erhalten. men spezifisch sind, enthält, und daß man das Eluat Das Reinigungsverfahren schloß das fraktionierte mit den vom anorganischen Phosphat abhängigen Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die Ionenaustauscher- 35 Enzymen gewinnt.

Chromatographie mit DÄÄ-Cellulose, die Ionenaus- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die

tauscher-Chromatographie mit Cellulosephosphat und von anorganischem Phosphat abhängigen Enzyme auf

das fraktionierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat ein. Grund ihrer enzymatischen Aktivität gegenüber Phos-

Gemäß der Erfindung soll eine Isolationsmethode phat adsorbiert, während die basischen Proteine, die

für Enzyme zur Verfügung gestellt werden, durch 40 keine Enzyme darstellen, auf den Träger auf Grund

welche in einfacher und billiger Weise Pi-abhängige ihrer statischen elektrischen Kräfte adsorbiert werden.

Enzyme mit hoher Reinheit hergestellt werden kön- Die basischen Proteine werden jedoch schließlich von

nen. den von anorganischem Phosphat abhängigen Enzy-

Es wurde nun gefunden, faß Pi-abhängige Enzyme men abgetrennt, da diese basischen Proteine in der

auf wasserunlöslichen Trägern, wie Cellulosephosphat, 45 nachfolgenden Elutionsstufe nicht aus dem Träger

die eluiert werden.

O Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des er-

'! findungsgemäßen Verfahrens wird als Ausgangsmate-

_ O — P — O Gruppen rial dem Verfahren eine rohe Enzymlösung unterwor-

I 50 fen, aus der die basischen Proteine zuvor entfernt

Q wurden.

Die bei dem Verfahren der Erfindung verwendeten

enthalten, entsprechend ihrer jeweiligen enzymatischen rohen Enzymlösungen sind Extrakte von mechanischen

Affinität für Pi adsorbiert werden und daß die durch Zerkleinerungsprodukten oder Autolysaten von Mikro-

die enzymatische Affinität adsorbierten Enzyme aus 55 Organismen, wie Hefe oder Bakterien, sowie Extrakte

den Trägern eluiert werden, wenn ein mit Pi in Kon- von Homogenaten verschiedener animalischer Ge-

kurrenz stehendes Substrat zugegeben wird. Die vor- webe und Pflanzen. Wenn die rohen Enzymlösungen

liegende Erfindung baut sich auf diesen Erkenntnissen ein Eluierungsmittel enthalten sollten, dann sollte die-

auf. ses Eluierungsmittel zuvor entfernt werden.

Erfindungsgemäß wird von dem qualitativen Unter- 60 Die rohen Enzymlösungen können saure, neutrale

schied der biologischen Eigenschaften der Enzyme, und basische von anorganischem Phosphat abhängige

d. h. der Spezifitäten der Enzyme, nicht jedoch von den Enzyme, andere saure, neutrale und basische Enzyme,

quantitativen Unterschieden der physikalisch-chemi- die keine Pi-abhängigen Enzyme darstellen, und

sehen Eigenschaften Gebrauch gemacht. Das erfin- andere saure, neutrale und basische Proteine, die keine

dungsgemäße Verfahren unterscheidet sich daher be- 65 Enzyme darstellen, enthalten. Es ist nicht notwendig,

reits von der Theorie her von den herkömmlichen diese anderen Proteine vor dem Reinigungsverfahren

Reinigungsmethoden. zu entfernen, und die rohen Enzymlösungen können

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren ohne jede Vorbehandlung eingesetzt werden.

if

Die rohe Enzymlösung wird mit einem Träger in dann werden die Pi-abhängigen Enzyme aus dem Trä-

Berührung gebracht, der eine wasserunlösliche orga- ger nicht eluiert.

nische oder anorganische Verbinduiig mit So kann man z. B. Glucose-6-phosphat-Dehydro-

O genäse in reiner Form isolieren, indem man den mit

π 5 dem Enzym beladenen Träger mit einer wäßrigen

_n I _{n n} Lösung von Nikotinamid-adenindinucleotidphosphat

KJ r KJ -uruppen (NADP), welches das Koenzym dieses Enzyms ist,

' auswäscht bzw. in Berührung bringt

O o-Phosphogluconat-Dehydrogenase kann beispiels-

enthält Dies geschieht dazu, um die Pi-abhängigen io weise in reiner Form isoliert werden, indem man den

Enzyme und die in diesen Enzymen nicht eingeschlos- mit dem Enzym beladenen Träger mit einer wäßrigen

senen basischen Proteine auf dem Träger zur Adsorp- Lösung von 6-Phosphorgluconat, welches ein Sub-

tion zu bringen. strat dieses Enzyms ist, als Eluierungsmittel in Be-

AIs Träger auf der Basis wasserunlöslicher orga- running bringt bzw. auswäscht

nischer Verbindungen mit 15 In der gleichen Weise können Pyruvat-Kinase, an-

O organische Pyrophosphatase und Ribulose-diphos-

Il phatcarboxylase selektiv isoliert werden, indem man

_ Q _ ρ _ _o _ _GruoDen den mit dem Enzym beladenen Träger mit wäßrigen

I " ^pp Lösungen von Substraten, d. h. Adenosintriphosphat

' ao (ATP), eines Pyrophosphats bzw. von Ribulosedi-

^ phosphat, als Eluierungsmittel, in Berührung bringt

können beispielsweise Cellulosephosphat (P-Cellulose), bzw. auswäscht.

Phosphorylmethylcellulose (PPM-Cellulose) und ein Wenn die gereinigte Enzymlösung durch Ultra-Kationenaustauscherharz mittlerer Säurestärke, das filtration od. dgl. konzentriert und langsam beispielsfunktiondle Phosphonsäuregruppen auf einer ver- 25 weise mit Ammoniumsulfat-Lösung versetzt wird, dann netzten Polystyrolmatrix enthält, verwendet werden. kann das Enzym in kristalliner Form erhalten werden. Das vorstehend genannte Kationenaustauscherharz ist Wenn das Eluierungsmittel entfernt werden soll, dann bekannt aus der Veröffentlichung der Diamond'Sham- kann eine Gelfiltration und Dialyse vorgenommen werrock Chemical Company vom Mai 1970 (25 M 5/70 den.

DA-193-itE) und der Veröffentlichung der gleichen 30 Gemäß einer speziellen Ausführungsform des erFirma DUOLITE Data Leaflet Nr. 2, 1971, 6. Als findungsgemäßen Verfahrens werden die basischen Träger auf der Basis wasserunlöslicher anorganischer Proteine zuvor aus den als Ausgangsmaterialien verVerbindungen, die diese Gruppe enthalten, können wendeten rohen Enzymlösungen entfernt. Diese Entz. B. Calciumphosphat-Gel und Magnesiumphosphat fernung der basischen Proteine aus den rohen Enzymverwendet werden. 35 lösungen kann in einfacher Weise erfolgen, indem die

Die Berührung der rohen Enzymlösung mit dem Lösung durch einen sauren anionischen Ionenaus-Träger wird dadurch bewirkt, daß man die rohe Enzym- tauscher geleitet wird, wie Carboxymethylcellulose. In lösung durch eine mit dem Träger gefüllte Säule leitet diesem Fall werden auf dem Träger nur die von anoder daß man den Träger in der rohen Enzymlösung organischem Phosphat abhängigen Enzyme adsorbiert, suspendiert. 40 Die Kapazität des Trägers für die Adsorption der

Auf diese Weise werden durch Berührung der rohen von anorganischem phosphatabhängigen Enzyme ist

Enzymlösung mit dem Träger die Pi-abhängigen En- daher in diesem Fall erheblich erhöht. Bei dem erfin-

zyme und die basischen Proteine auf dem Träger ad- dungsgemäßen Verfahren können daher geringe

sorbiert. Mengen der Träger und der Eluierungsmittel verwendet

Die Adsorption der Pi-abhängigen Enzyme erfolgt 45 werden. Die Reinigungsmaßnahmen sind einfach und

auf Grund der enzymatischen Affinität mit dem Träger leicht durchzuführen.

während die Adsorption der basischen Proteine, die Ein weiterer charakteristischer Vorteil des erfin-

keine Enzyme sind, auf Grund der statischen elektri- dungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß Enzym-

schen Kräfte zwischen der elektrischen Ladung der lösungen mit hoher Konzentration erhalten werden, da

basischen Proteine und derjenigen des Trägers erfolgt. 50 nur mit kleinen Mengen von Eluierungsmitteln gearbei-

Andererseits werden saure und neutrale Enzyme, die tet werden kann.

keine von anorganischem Phosphat abhängige Enzyme Weiterhin können viele Enzymarten nacheinander in

darstellen, und saure und neutrale Proteine, die keine einer einstufigen Reinigung erhalten werden, indem

Enzyme sind, nicht an dem erfindungsgemäß verwen- man nacheinander die Eluierungsmittel verändert, da

deten Träger adsorbiert und laufen bei dem Adsorp- 55 die Reinigung bei ziemlich milden Bedingungen er-

tionsverfahren durch die Säule. folgt.

Danach wird der Träger mit einer wäßrigen Lösung Das Verfahren der Erfindung ist vom industriellen

in Berührung gebracht, die als Eluierungsmittel minde- Standpunkt aus gesehen sehr vorteilhaft, da die Reini-

stens ein Substrat, Koenzym, einen Inhibitor und/oder gung in einfacher Weis«; und innerhalb eines kurzen

einen Aktivator enthält, welches bzw. welcher dem 60 Zeitraums erfolgen kann. Schwierigkeiten auf Grund

einzelnen Enzym gegenüber spezifisch (selektiv) ist von Verschmutzungen u. dgl. treten kaum auf.

und mit dem Pi in Konkurrenz steht (d. h. antagoni- Das Verfahren kann in iiiner einfachen Anlage durch-

stisch wirkt), umd die jeweiligen Pi-abhängigen Enzyme geführt werden,

selektiv in die wäßrige Lösung zu eluieren. Die Ionenaustauscher-Chromatographie ist die am

Wenn eine wäßrige Lösung verwendet wird, die ein 65 meisten bevorzugte Methode bei den herkömmlichen

Substrat, ein Koenzym, einen Inhibitor oder einen Isolationsmethoden für Enzyme, da sie relativ einfach

Aktivator enthält, der mit dem Pi nicht in Konkurrenz vonstatten geht und man bei milden Bedingungen einen

steht (bzw. diesem gegenüber nicht antagonisch wirkt), ziemlich hohen Isolationseffekt erzielt. Bei diesem be-

kannten Verfahren ist aber selbst bei ausgewählten Reinigungsbedingungen eine Verunreinigung durch Substanzen mit quantitativ ähnlichen Eigenschaften nicht vermeidbar, da dieses bekannte Verfahren sich auf den quantitativen Unterschieden der elektrischen Eigenschaften, wie des isoelektrischen Punktes der Enzyme, aufbaut. Demgegenüber besitzt das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren die Vorteile der herkömmlichen Ionenaustauscher-Chromatographie-Verfahren und den weiteren Vorteil, daß eine »Klarschnitte-Eluierung vorgenommen werden kann da das Verfahren der Erfindung die inhärenten, genauen Spezifizitäten von Enzymen für Substrate ausnutzt und da die Eluierung durch ein spezielles Eluierungsmittel, welches für das spezielle Enzym spezifisch ist, vorgenommen wird. Das Verfahren der Erfindung stellt somit ein ideales Isolierungsverfahren dar.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Darin sind sämtliche Prozentangaben auf das Volumen bezogen, falls keine anderen Angaben gemacht werdeia.

Beispiel 1

IsoUerung von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
(hierin als G-6-PDH bezeichnet)

21 Äthylacetat wurden zu 20 kg von nassen Zellen der Hefeart Candida utilis gegeben. Das Ganze wurde gründlich gerührt, um eine Autolyse zu bewirken. Die löslichen Komponenten wurden mit 201 einer ungesättigten Ammoniumsulfatlösung bei Raumtemperatur 24 Stunden extrahiert. Durch Zentrifugierung wurden unlösliche Stoffe entfernt. Auf diese Weise wurde ein roher Extrakt erhalten, der 336 · M)⁴ I.E. G-6-PDH enthielt.

Das Lösungsmittel im Extrakt wurde mit 50 mM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) ersetzt, indem durch eine Säule mit 201 eines als Gel-Filtrationsmedium geeigneten vernetzten Dextrans im Fraktionsbereich 100 bis 5000 geleitet wurde. Das verwendete vernetzte Dextran ist aus der Veröffentlichung der Pharmacia Fine Chemicals, Division of AB Pharmacia »Sephadex and other separation products«, Januar 1970, S. 4, Typ G-25, bekannt. Der Extrakt wurde durch eine Säule mit 201 DÄÄ-Cellulose geleitet, um G-6-PDG zu adsorbieren (gleichzeitig Hefen die ba.sisehen Proteine durch und wurden auf diese Weise entfernt). Sodann wurde das Produkt mit 401 50 mM Triäthanolamin HCl-Pufferlösung (pH 7,5) gewaschen. Hierauf wurden 401 150 mM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) durch die Säule geleitet. Etwa so 201 der eluierten Fraktion, die G-6-PDH enthielt (NADP, d. h. das Eluierungsmittel für das Enz>m, wenn es überhaupt vorhanden war, wurde zu diesem Zeitpunkt nicht eluiert), wurden durch eine Säule mit 201 des vorstehend angegebenen vernetzten Dextruns geleitet, um das Lösungsmittel durch 10 mM Makinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 6,0) zu ersetzen. Die rohe Enzymlösung von G-6-PDH, die kein Eluierungsmittel, nämlich NADP, enthielt, wurde durch eine Säule mit 5 1 P-Cellulose geleitet, um das G-6-PDH auf dem Träger durch enzymatische Affinität mit den Phosphorsäuregruppen der P-Cellulose zu adsorbieren. Darauf wurden 151 1OmM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 6,0, Waschlösung), 51 eines Gemisches (Eluierungslösung) aus dem gleichen Puffer und von NADP in einer Konzentration von 10' M, welches ein Koenzym für das G-6-PDH ist, und 101 10 mM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (Herausdrücklösung) durch die Säule nacheinander geleitet. Das NADP begann vom Boden der Säule aus zu fließen. Zur gleichen Zeit begann hochgereinigte G-6-PDH, die auf ein Volumen von etwa 11 konzentriert war, zu fließen.

Die spezifische Aktivität betrug etwa 55001. E. je mg Protein. Der Reinigungsgrad, bezogen auf den rohen Extrakt, betrug etwa das 50O0fache. Die Ausbeute betrug etwa 70%,

Die G-6-PDH kann durch Konzentrierung der gereinigten G-6-PDH-Lösung durch Ultrafiltration und Erhöhen der Amraoniuimulfatkonzentration allmählich zu einer Sättigung von etwa 0,7 kristallisiert werden.

Die hierin enthaltene NADP hatte die Wirkung, daß die Inaktivierung des Enzyms verhindert wurde. Es lagen jedoch keine schädlichen Einflüsse auf die quantitative Bestimmung der NADP vor, da das NADP in extrem geringer Menge vorlag. NADP kann aber leicht durch Gel-Filtration mit dem vorstehend genannten vernetzten Dextran entfernt werden.

Beispiel 2

Isolierung von Pyruvat-Kinase (nachstehend als
PK bezeichnet)

21 Äthylacetat wurden zu 20 kg der nassen Zellen der Hefeart Candida utilis gegeben. Das Ganze wurde gründlich gerührt, um eine Autolyse zu bewirken. Die löslichen Komponenten wurden mit 201 einer Ungesättigten Ammoniumsulfat-Lösung bei Raumtemperatur 24 Standen extrahiert. Die unlöslichen Komponenten wurden durch Zentrifugierung entfernt, wodurch ei 1 roher Extrakt erhalten wurde, der 95 · 10"⁵ I.E. von PK enthielt. Zu dem rohen Extrakt wurde die viertelte Menge an Glycerin gegeben. Das Lösungsmittel in dem rohen Extrakt wurde durch 50 mM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 7,5), die 20% Glycerin enthielt, in einer Säule mit 20 1 eines quervernetzten Dextrans ersetzt. Der Extrakt wurde sodann durch eire Säule mit 201 DÄÄ-Cellulose geleitet, um das PK zu adsorbieren (zu diesem Zeitpunkt Hefen die basischen Proteine durch und wurden auf diese Weise entfernt). Es wurde mit 401 50-mM-Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung, die 20% Glycerin enthielt, gewaschen. Sodann wurden 401 einer 200-mM-Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung, die 20% Glycerin enthielt, durch die Säule geleitet. Etwa 201 der eluierten Fraktion, dit; PK enthielt (zu diesem Zeitpunkt wird ATP, d. h. tdas Eluierungsmittel für das Enzym, nicht eluiert) durch die Säule mit 20 1 des in Beispiel 1 verwendeten vernetzten Dextrans geleitet, um das Lösungsmittel durch 10 mM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 6,0), die 20% Glycerin enthielt, auszutauschen. Die rohe Enzymlösung von PK wurde durch eine Säule mit 5 1 P-Cellulose geleitet, um PK durch enzymatische Affinität mit der Phosphorsäuregruppe zu adsorbieren.

Hierauf wurden 15 1 einer 10-mM-Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 6,0; Waschlösung), 5 1 eines Gemisches (Eluierungslösung) aus dem gleichen Puffer und ATP, das ein Substrat von PK ist, in einer Konzentration von 10~³ M, und 101 einer 10-mM-Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (Herausdrück-Lösung), die 20% Glycerin enthielt, nacheinander durch die Säule geleitet. ATP begann vom Boden der Säule auszuströmen. Zur gleichen Zeit begann hochgereinigte PK zu fließen.

509633/181

\.βΜ

Die spezifische Aktivität betrug etwa 700 I. E. je tigter Ammoniumsulfat-Lösung bei Raumtemperatur mg Protein. Der Reinigungsgrad des rohen Extraktes 24 Stunden extrahiert. Die unlöslichen Komponenten betrug das 14Ofache. Die Ausbeute betrug etwa 60%. wurden durch Zentrifugierung entfernt, wodurch ein

roher Extrakt erhalten wurde, der RuDPC enthielt.

B e i s ρ i e 1 3 5 Das Lösungsmittel in dem rohen Extrakt wurde

Isolierung von O-Phosphogluconat-Dehydrogenase J""* ISO-mM-Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH

(nachstehend als 6-PGDH bezeichnet) J.⁵ .^erset2t· '"dem der Extrakt durch e.ne Säule mit

20 1 des in Beispiel 1 zur Gelfiltration verwendeten ver-

Wie im Beispiel 2 wurde ein roher Extrakt mit netzten Dextrans geleitet wurde. Der Extrakt wurde 119 · 10⁴I.E. von 6-PGDH erhalten. 6-PGDH wurde io durch eine Säule mit 21 DÄÄ-Cellulose geleitet. Soauf einer P-Cellulose-Säule durch enzymatische Affini- dann wurden durch die Säule 2 1 einer 150-mM-Trität mit der Phosphorsäuregruppe adsorbiert. äthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) geleitet, um

Sodann wurden 15 1 einer 10-mM-Maleinsäure- eine Fraktion zu sammeln, die RuDPC enthielt. Das NaOH-Pufferlösung (pH 6,0; Waschlösung), 5 1 eines Lösungsmittel in der Fraktion wurde durch 10-mM-Gemisches (Eluierungslösung) aus dem gleichen Puffer 15 Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 6,0) ersetzt, wound 6-Phosphogluconat, das ein Substrat von 6-PGDH bei 201 des vorstehend angegebenen vernetzten Dexist, in einer Konzentration von 5 · 10"⁴ M und 101 trans verwendet wurden.

10-mM-Maleat-Pufferlösung (Herausdrück-Lösung), Die auf diese Weise erhaltene rohe Enzymlösung

die 20% Glycerin enthielt) nacheinander durch die von RuDPC wurde durch eine Säule mit 5 1 PPM-CeI-Säule geleitet. Als 6-Phosphogluconat vom Boden der 20 lulose geleitet, um die RuDPC entsprechend ihrer Säule zu strömen begann, begann hochgereinigte enzymatischen Affinität mit der Phosphorsäuregruppe 6-PGDH zu fließen. zu adsorbieren.

Die spezifische Aktivität betrug etwa 200 I.E. je Sodann wurden 151 einer 10-mM-Maleinsäure-

mg Protein. Der Reinigungsgrad des rohen Extrakts NaOH-Pufferlösung (pH 6,0; Waschlösung), 51 eines betrug etwa das600fache. Die Ausbeute betrug 50%. 25 Gemisches (Eluierungslösung) aus der gleichen Pufferlösung und Ribulosediphosphat in einer Konzen-

Beispiel 4 tration von 5 · 10~^s M und 10 1 einer 10-mM-Malein-

Isolierung von Ribulosediphosphat-Carboxylase säure-NaOH-Pufferlösung (Herausdrück-Lösung)

(nachstehend als RuDPC bezeichnet) nacheinander durch die Säule geleitet. Als Ribulose-

30 o-pnosphat vom Boden der Säule zu strömen begann,

500 ml Äthylacetat wurden zu 5 kg von nassen Zellen begann hochgereinigte RuDPC zu fließen. Die spezider Hefeart Candida utilis gegeben. Das Ganze wurde fische Aktivität betrug etwa 1100 I. E. je mg Protein, gründlich gerührt, um eine Autolyse vorzunehmen. Der Reinigungsgrad des rohen Extrakts betrug etwa Die löslichen Komponenten wurden mit 201 O,lgesät- das 380Ofache. Die Ausbeute betrug etwa 70%.

Claims

Paten tansp: üche:

1. Verfahren zur Isolierung von vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen durch Affinitätschromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß man eine rohe Enzymlösung, welche keine der im folgenden definierten Eluierungsmittel und zusätzlich zu den vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen und verschiedenen anderen Enzymen verschiedene saure, neutrale und basische Proteine enthält, mit einem Träger aus einer wasserunlöslichen organischen oder anorganischen Verbindung mit
O