DE2165406B2 - Verfahren zur Isolierung vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen - Google Patents

Description

«
— O — P — O —Gruppen

i O

in Berührung bringt, wobei die vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzyme und die basischen Proteine auf dem Träger adsorbiert werden, daß man sodann die vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzyme dadurch vom Träger mit den adsorbietten vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen und den basischen Proteinen selektiv eluiert, daß man den Träger mit einem wäßrigen Eluierungsmiltel in Berührungbringt, welches mindestens ein Substrat, Koenzym, einen Inhibitor und/oder einen Aktivator, wobei diese Substanzen in bezug auf die jeweiligen zu isolierenden, vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzyme mit dem anorganischen Phosphat in Konkurrenz stehen und gegenüber d*".n jeweiligen zu isolierenden vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen spezifisch sind, enthält, und daß man das Eluat mit den vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen gewinnt.

2. Verfahren «ach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine rohe Enzymlösung verwendet, aus der die basischen Proteine zuvor entfernt worden sind.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum isolieren von Enzymen, die vom anorganischen Phosphat abhängig sind, durch Affinitätschromatographie.

Unter dem Begriff »von anorganischem Phosphat abhängigen Enzymen« nachstehend auch a!« »Pi-abhängige Enzyme« bezeichnet, sollen hier allgemein Enzyme verstanden werden, die anorganisches Phosphat (als Pi bezeichnet) als Substrat verwerten, die anorganisches Phosphat als Reaktionsprodukt ergeben oder Enzyme, bei denen die durch sie katalysierten Reaktionen durch anorganisches Phosphat inhibiert oder aktiviert werden.

Beispiele für Enzyme, die Pi als Substrat verwerten oder die Pi als Reaktionsprodukte ergeben, sind Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und anorganische Pyrophosphatase. Beispiele für Enzyme, deren Reaktion durch Pi inhibiert wird, sind Glucise-6-phosphat-Dehydrogenase, 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase^ Rihulose-lifisdiphospnai-Dehydrpgenase «od Pyravatkinase. Beispiele für Enzyme, deren Reaktion durch Pi aktiviert wird, sind Fumarase und Urease.
Diese Pi-abhängigen Enzyme sind wichtige Enzyme, die direkt an vitalen Erscheinungen in den Zellen teilnehmen. Man erwartet von ihnen eiae·? breiten Anwendungsbereich als Laborreagenzien Kk ■ ^chemische Zwecke und weiterhin als klinische und , ,uhologische

ίο Reagenzien für medizinische und pharmazeutische Zwecke.

Einige dieser Enzyme sind schon aus Tiergeweben und Mikroorganismen extrahiert und vor der Anwendung gereinigt worden. Die technischen Enzympro-

IS dukte sind jedoch entweder sehr teuer oder die Produkte sind nicht erhältlich, da bislang noch keine durchführbaren Reinigungsmethoden aufgefunden worden sind. Aus diesem Grund ist die Verwendung der Enzyme bislang beschränkt gewesen, obgleich diese

ao Enzyme sehr geeignet sind.

Die herkömmlichen Enzymisolierungsmethoden ordnen sich in folgende Gruppen ein:

1. Ausfällungsmethoden beim isoelektrischen Punkt. Bei diesen Methoden nützt man die Eigenschaften

^as von amphoteren Elektrolyten aus, daß die Löslichkeit je nach der Wasserstoffionenkonzentration variiert und beim isoelektrischen Punkt den geringsten Wert einnimmt.

2. Aussalzmethoden. Dabei nützt man die Löslichkeitsunterschiede zwischen den Enzymen in Lösung eines neutrale- Salzes, wie Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat, aus.

3. Ausfällungsmethoden mit organischen Lösungsmitteln. Dabei fällt man die Enzyme fraktioniert

aus, indem man die Löslichkeit durch Zugabe von Alkohol. Aceton, Dioxan usw. zu der Enzymlösung allmählich verringert.

4. Wärmebehandlungsmethoden, bei welchem man die Temperatur der Enzymlösung erhöht, um die

*° ungewünschten Proteine zu denaturieren und zu verfestigen. Bei diesen Verfahren nützt man die unterschiedliche Wärmestabilität der Enzyme aus. Sodann wird das Protein entfernt.

5. Selektive Ausfällungsmethoden, bei welchem man ein spezielles Fällungsreagens, wie Protaminsulfat oder Bleiacetat, verwendet.

6. Selektive Adsorptionsmethoden, bei welchen man spezielle Adsorbentien, wie Aluminiumhydroxid oder Calciumphosphat-Gel, verwendet.

7. Ionenaustauscher-Chromatographie und Elektrophorese, bei welchen man hauptsächlich die Differenz der elektrischen Ladungen zwischen den einzelnen Proteinen ausnützt.

8. Kristallisationsmethoden.

Die obengenannten, bekannten, allgemein üblicher Reinigungsmethoden beruhen auf den quantitativer Unterschieden der physikalischen Eigenschaften zwi sehen den Enzymen oder Proteinen. Qualitative Un terschiede der biologischen Eigenschaften werden da bei jedoch nicht ausgenutzt. Daher ist die Isolierunf der einzelnen Enzyme mit genügender Reinheit sehi schwierig, obgleich Enzyme und Proteine mit nahi aneinanderliegenden physikalisch-chemischen Eigen schäften als Gruppe erfolgreich hergestellt werdei konnten. Zur Reinigung der jeweiligen Enzyme warei jedoch sehr aufwendige und teure Arbeitsweisen, bei spielsweise die Kombination verschiedener Reini

gungsmethüden oder die Wiederholung der Methoden, zur Isolierung von vom anorganischen Phosphat äb-

erforderüch. hängigen Enzymen durch AffinKäischromatographie,

Zur Reinigung von Glucose-o-phosphat-Dehydro- das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eise rohe

genäse, die ein Pi-abimngiges Enzym ist, wurde bei- Enzyralösung, welche keine der im folgenden definier-

spielsweise folgende Methode beschrieben (Journal of 5 ten Eluierungsmittel und zusätzlich zu den vom anorga-

Biological Chemistry, VoL 236, Nr. 5, S. 1225 bis nischen Phosphat abhängigen Enzymen undverschiede-

1230,1961). Eine Glucose-ö-phosphat-Dehydrogenase- nen anderen Enzymen verschiedene saure, neutrale und

Probe mit einer 38Q0fachen Reinheit wurde mit einer basischer Proteine enthält, mit einem Träger aus einer

schlechten Ausbeute von nur 13% (LE./I.E. der wasserunlöslichen organischen oder anorganischen

Enzyme: Die gleiche Bezeichnung soll nachfolgend u> Verbindung mit

ebenfalls verwendet werden) aus einem Autolyse- O

Extrakt von getrockneter Brauhefe durch IS Reini- ||

gungsstufen erhalten. Diese Reinigungsstufen schlos- O P O Gruppen

sen die fraktionierte Ausfällung mit Silbernitrat, dm |

fraktionierte Aussalzen mit Ammnniumsulfat, die 15 q

Ausfüllung mit Alkohol als organisches Lösungsmittel, 1

die fraktionierte Adsorption an Betonit, das fraktio- '

nierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die fraktio- in Berührung bringt, wobei die vom anorganischen

nierte Ausfällung mit Manganionne, die Ausfällung Phosphat abhängigen Enzyme und die basischen Pro-

mit Aceton als organisches Lösungsmittel, das fraktio- ao teine auf dem Träger adsorbiert werden, daß man so-

nierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die Ionenaus- dann die vom anorganischen Phosphat abhängigen

tauscher-Chromatographie mit einem schwachbasi- Enzyme dadurch vom Träger mit den adsorbierten

sehen Ionenaustauscher, das fraktionierte Aussalzen vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen

mit Ammoniumsulfat und eine Kristallisation (zwei- und den basischen Proteinen selektiv eluieit, daß man

mal) ein. 35 den Träger mit einem wäßrigen Eluierungsmittel in

Zur Reinigung von Pyruvat-Kinase, die ein weiteres Berührung bringt, welches mindestens ein Substrat, Pi-abhängiges Enzym ist, wurde folgendes Verfahren Koenzym, einen Inhibität und/oder einen Aktivator, beschrieben (Journal of Biological Chemistry, Vol. 244. wobei diese Substanzen in bezug auf die jeweiligen zu Nr. 18, S. 4815 bis 4818, 1969). Eine Pyruvat-Kinase- isolierenden, vom anorganischen Phosphat abhängigen Probe mit einer etwa 50fachen Reinheit (bezogen auf 30 Enzyme mit dem anorganischen Phosphat in Konkurdsn rohen Extrakt) wurde mit einer schlechten Aus- renz stehen und gegenüber den jeweiligen zu isolierenbeute von 44,9% aus dem Autolyse-Extrakt von den vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzy-Bäckerhefe durch ein Reinigungsverfahren erhalten. men spezifisch sind, enthält, und daß man das Eluat Das Reinigungsverfahren schloß das fraktionierte mit den vom anorganischen Phosphat abhängigen Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die Ionenaustauscher- 35 Enzymengewinnt.

Chromatographie mit DÄÄ-Cellulose, die Ionenaus- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die

tauscher-Chromatographie mit Cellulosephosphat und von anorganischem Phosphat abhängigen Enzyme auf

das fraktionierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat ein. Grund ihrer enzymatischen Aktivität gegenüber Phos-

Gemäß der Erfindung soll eine Isolationsmethode phat adsorbiert, während die basischen Proteine, die

für Enzyme zur Verfugung gestellt werden, durch 4° keine Enzyme darstellen, auf den Träger auf Grund

welche in einfacher und billiger Weise Pi-abhängige ihrer statischen elektrischen Kräfte adsorbiert werden.

Enzyme mit hoher Reinheit hergestellt werden kön- Die basischen Proteine werden jedoch schließlich von

nen. den von anorganischem Phosphat abhängigen Enzy-

Es wurde nun gefunden, faß Pi-abhängige Enzyme men abgetrennt, da diese basischen Proteine in der

auf wasserunlöslichen Trägern, wie Cellulosephosphat, 45 nachfolgenden Elutionsstufe nicht aus dem Träger

die eluiert werden.

O Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des er-

!I findungsgemäßen Verfahrens wird als Ausgangsmate-

O — P O -Gruppen "al dem Verfahren eine rohe Enzymlösung unterwor- I 50 fen, aus der die basischen Proteine zuvor entfernt

Q _ wurden.

Die bei dem Verfahren der Erfindung verwendeten

enthalten, entsprechend ihrer jeweiligen enzymatischen rohen Enzymlösungen sind Extrakte von mechanischen

Affinität für Pi adsorbiert werden und daß die durch Zerkleinerungsprodukten oder Autolysaten von Mikro-

die enzymatische Affinität adsorbierten Enzyme aus 55 Organismen, wie Hefe oder Bakterien, sowie Extrakte

den Trägern eluiert werden, wenn ein mit Pi in Kon- von Homogenaten verschiedener animalischer Ge-

kurrenz stehendes Substrat zugegeben wird. Die vor- webe und Pflanzen. Wenn die rohen Enzymlösungen

liegende Erfindung baut sich auf diesen Erkenntnissen ein Eluierungsmittel enthalten sollten, dann sollte die-

auf. ses Eluierungsmittel zuvor entfernt werden.

Erfindungsgemäß wird von dem qualitativen Unter- 60 Die rohen Enzymlösungen können saure, neutrale

schied der biologischen Eigenschaften der Enzyme, und basische von anorganischem Phosphat abhängige

d. h. der Spezifitäten der Enzyme, nicht jedoch von den Enzyme, andere saure, neutra'e und basische Enzyme,

quantitativen Unterschieden der physikalisch-chemi- die keine Pi-abhängigen Enzyme darstellen, und

sehen Eigenschaften Gebrauch gemacht. Das erfin- andere saure, neutrale und basische Proteine, die keine

dungsgemäße Verfahren unterscheidet sich daher be- 65 Enzyme darstellen, enthalten. Es ist nicht notwendig,

reits von der Theorie her von den herkömmlichen diese anderen Proteine vor dem Reinigungsverfahren

Reinigungsmethoden. zu entfernen, und die rohen Enzymlösungen können Gegenstand der Erfindung ist daher ein Vetfahren ohne jede Vorbehandlung eingesetzt werden.

5 6

Die rphe .Enzymlösung wird mit einem Träger in dann werden die Pi-abhängigen Enzyme aus dem Trä- Berülirppg gebracht, der eine wassefunlösliche orga- ger nicht eluiert

nische oder anorganische Verbindung mit So kann man z.B. Glucose-6-phosphafc-Dehydro-

O .·...·.·: genäse in reiner Form isolieren, indem man den mit

β ..,.-· 5 dem Enzym beladenen Träger mit einer wäßrigen

, o—P O —-GruDDen Lösung von Nikotinamid-adenindinucleotidphosphat

ι ' ΡΡ° (NADP), welches das Keeozym dieses Enzyms ist,

' auswascht bzw. in Berührung bringt

^u o-Phosphogluconat-Dehydrogenase kann beispiels-

enthält Dies geschieht dazu, um die Pi-abhängigen io weise in reiner Form isoliert werden, indem man den

Enzyme und die in diesen Enzymen nicht eingeschlos- mit dem Enzym beladenen Träger mit einer wäßrigen

senen basischen Proteine auf dem Träger zur Adsorp- Lösung von 6-Ph.osphorgluconat, welches ein Sub-

tion zu bringen. strat dieses Enzyms ist, als Eiuierungsmittel in Be-

AIs Träger auf der Basis wasserunlöslicher orga- rührung bringt bzw. auswäscht

nischer Verbindungen mit 15 In der gleichen Weise können Pyruvat-Kinase, an-

O organische Pyrophosphatase und Ribulose-diphos- Il phatcarboxylase selektiv isoliert werden, indem man O — P O GruDoen ^^en ™* ^^em Enzym beladenen Träger mit wäßrigen

1 " ^pp^ Lösungen von Substraten, d. h. Adenosintriphosphat

' ao (ATP), eines Pyrophosphats bzw. von Ribulosedi-

^υ phosphat, als Eiuierungsmittel, in Berührung bringt

können beispielsweise Cellulosephosphat (P-Cellulose), bzw. auswäscht.

Phosphorylmethylcellulose (PPM-Cellulose) und ein Wenn die gereinigte Enzymlösung durch Ultra-Kationenaustauscherharz mittlerer Säurestärke, das filtration od. dgl. konzentriert und langsam beispielsfunktioneüe Phosphonsäuregruppen auf einer ver- 25 weise mit Ammo"iumsulfat-Losung versetzt wird, dann netzten Polystyrolmatrix enthält, verwendet werden. kann das Enzym in kristalliner Form erhalten werden. Das vorstehend genannte Kationenaustauscherharz ist Wenn das Eiuierungsmittel entfernt werden soll, dann bekannt aus der Veröffentlichung der Diamond'Sham- kann eine Gelfiltration und Dialyse vorgenommen werrock Chemical Company vom Mai 1970 (25 M S/70 den.

DA-193-IE) und der Veröffentlichung der gleichen 30 Gemäß einer speziellen Ausführungsform des erFirma DUOLITE Data Leaflet Nr. 2, 1971, 6. Als findungsgemäßen Verfahrens werden die basischen Träger auf der Basis wasserunlöslicher anorganischer Proteine zuvor aus den als Ausgangsmaterialien verVerbindungen, die diese Gruppe enthalten, können wendeten rohen Enzymlösungen entfernt. Diese Entz. B. Calciumphosphat-Gel und Magnesiumphosphat fernung der basischen Proteine aus den rohen Enzymverwendet werden. 35 lösungen kann in einfacher Weise erfolgen, indem die

Die Berührung der rohen Enzymlösung mit dem Lösung durch einen sauren anionischen Ionenaus-Träger wird dadurch bewirkt, daß man die rohe Enzym- tauscher geleitet wird, wie Carboxymethylcellulose. In lösung durch eine mit dem Träger gefüllte Säule leitet diesem Fall werden auf dem Träger nur die von anoder daß man den Träger in der rohen Enzymlösung organischem Phosphat abhängigen Enzyme adsorbiert, suspendiert. 40 Die Kapazität des Trägers für die Adsorption der

Auf diese Weise werden durch Berührung der rohen von anorganischem phosphatabhängigen Enzyme ist Enzymlösung mit dem Träger die Pi-abhängigen En- daher in diesem Fall erheblich erhöht. Bei dem erfin-

zyme und die basischen Proteine auf dem Träger ad- dungsgemäßen Verfahren können daher geringe

sorbiert. Mengen der Träger und der Eiuierungsmittel verwendet

Die Adsorption der Pi-abhängigon Enzyme erfolgt 45 werden. Die Reinigungsmaßnahmen sind einfach und

auf Grund der enzymatischen Affinität mit dem Träger leicht durchzuführen.

während die Adsorption der basischen Proteine, die Ein weiterer charakteristischer Vorteil des erfin-

keine Enzyme sind, auf Grund der statischen elektri- dungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß Enzym-

schen Kräfte zwischen der elektrischen Ladung der lösungen mit hoher Konzentration erhalten werden, da

basischen Proteine und derjenigen des Trägers erfolgt. 5« nur mit kleinen Mengen von Eiuierungsmitteln gearbei-

Andererseits werden saure und neutrale Enzyme, die tet werden kann.

keine von anorganischem Phosphat abhängige Enzyme Weiterhin können viele Enzymarten nacheinander in

darstellen, und saure und neutrale Proteine, die keine einer einstufigen Reinigung erhalten werden, indem

Enzyme sind, nicht an dem erfindungsgemäß verwen- man nacheinander die Eiuierungsmittel verändert, da

deten Träger adsorbiert und laufen bei dem Adsorp· 55 die Reinigung bei ziemlich milden Bedingungen er-

tionsverfahren durch die Säule. folgt.

Danach wird der Träger mit einer wäßrigen Lösung Das Verfahren der Erfindung ist vom industriellen

in Berührung gebracht, die als Eiuierungsmittel minde- Standpunkt aus gesehen sehr vorteilhaft, da die Reini-

stens ein Substrat, Koenzym, einen Inhibitor und/oder gung in einfacher Weise und innerhalb eines kurzen

einen Aktivator enthält, welches bzw. welcher dem 60 Zeitraums erfolgen kann. Schwierigkeiten auf Grund

einzelnen Enzym gegenüber spezifisch (selektiv) ist von Verschmutzungen u. dgl. treten kaum auf.

und mit dem Pi in Konkurrenz steht (d. h. antagoni- Das Verfahren kann in einer einfachen Anlage durch-

stisch wirkt), umd die jeweiligen Pi-abhängigen Enzyme geführt werden,

selektiv in die wäßrige Lösung zu eluieren. Die Ionenaustauscher-Chromatographie ist die am

Wenn eine wäßrige Lösung verwendet wird, die ein 65 meisten bevorzugte Methode bei den herkömmlichen Substrat, ein Koenzym, einen Inhibitor oder einen Isolationsmethoden für Enzyme, da sie relativ einfach Aktivator enthält, der mit dem Pi nicht in Konkurrenz vonstatten geht und man bei milden Bedingungen einen

steht (bzw. diesem gegenüber nicht antagonisch wirkt), ziemlieh hohen Isolationseffekt erzielt. Bei diesem be-

kannten Verfahren ist aber selbst bei ausgewählten drücklösung) durch die Säule nacheinander geleitet.

Reinigungsbedingungen eine Verunreinigung durch Das NADP begann vom Boden der Säule aus zu Substanzen mit quantitativ ähnlichen Eigenschaften fließen. Zur gleichen Zeit begann hochgereinigte

nicht vermeidbar, da dieses bekannte Verfahren sich G-6-PDH, die auf ein Volumen von etwa 11 konzen-

auf den quantitativen Unterschieden der elektrischen 5 triert war, zu fließen.

Eigenschaften, wie des isoelektrischen Punktes der Die spezifische Aktivität betrug etwa 55001. E. je mg Enzyme, aufbaut. Demgegenüber besitzt das er- Protein. Der Reinigungsgrad, bezogen auf den rohen

findungsgemäße Reinigungsverfahren die Vorteile Extrakt, betrug etwa das 5000fache. Die Ausbeute be-

der herkömmlichen Ionenaustauscher-Chromato- trug etwa 70%.

graphie-Verfahren und den weiteren Vorteil, daß eine io Die G-6-PDH kann durch Konzentrierung der ge-

»KlarschnitU-Eluierung vorgenommen werden kann reinigten G-6-PDH-Lösung durch Ultrafiltration und

da das Verfahren der Erfindung die inhärenten, genauen Erhöhen der Ammoniumsulfaikonzentration allmäh-

Spezifizitäten von Enzymen für Substrate ausnutzt und lieh zu einer Sättigung von etwa 0,7 kristallisiert wer-

da die Eluierung durch ein spezielles Eluierungsmittel, den.

weiches für das spezielle Enzym spezifisch ist, vorge- 15 Die hierin enthaltene NADP hatte die Wirkung, daß

nommen wird. Das Verfahren der Erfindung stellt so- die Inaktivierung des Enzyms verhindert wurde. Es

mit ein ideales Isolierungsverfahren dar. lagen jedoai keine schädlichen Einflüsse auf die

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Darin quantitative Bestimmung der NADP vor, da das

sind sämtliche Prozentangaben auf das Volumen be- NADP in extrem geringer Menge vorlag. NADP kann

zogen, falls keine anderen Angaben gemacht werden, so aber leicht durch Gel-Filtration mit dem vorstehend

genannten vernetzten Dextran ertfernt werden. Beispiel 1

Isolierung von Glucose-ö-phosphat-Dehydrogenase Beispiel 2

(hierin als G-6-PDH bezeichnet) Isolierung von Pyruvat-Kinase (nachstehend als

λ ι χ 1. 1 j -.λ 1 . „ ^iS PK bezeichnet) 21 Athylacetat wurden zu 20 kg von nassen Zellen

der Hefeart Candida utilis gegeben. Das Ganze wurde 21 Äthylacetat wurden zu 20 kg der nassen Zellen

gründlich gerührt, um eine Autolyse zu bewirken. der Hefeart Candida utilis gegeben. Das Ganze wurde

Die löslichen Komponenten wurden mit 201 einer gründlich gerührt, um eine Autolyse zu bewirken,

ungesättigten Ammoniumsulfatlösung bei Raum- 30 Die löslichen Komponenten wurden mit 201 einer

temperatur 24 Stunden extrahiert. Durch Zentrifugie- ungesättigten Ammoniumsulfat-Lösung bei Raum-

rung wurden unlösliche Stoffe entfernt. Auf diese temperatur 24 Stunden extrahiert. Die unlöslichen

Weise wurde ein roher Extrakt erhalten, der 336 · 10* Komponenten wurden durch Zentrifugierung ent- I. E. G-6-PDH enthielt fernt, wodurch ein roher Extrakt erhalten wurde, der Das Lösungsmittel im Extrakt wurde mit 50 mM 35 95 · 10~⁵ I. E. von PK enthielt Zu dem rohen Extrakt Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) ersetzt, in- wurde die viertelte Menge an Glycerin gegeben. Das

dem durch eine Säule mit 201 eines als Gel-Filtrations- Lösungsmittel in dem rohen Extrakt wurde durch

medium geeigneten vernetzten Dextrans im Fraktions- 50 mM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 7,5),

bereich 100 bis 5000 geleitet wurde. Das verwendete die 20% Glycerin enthielt, in einer Säule mit 201 eines

vernetzte Dextran ist aus der Veröffentlichung der 40 quervernetzten Dextrans ersetzt. Der Extrakt wurde

Pharmacia Fine Chemicals, Division of AB Pharmacia sodann durch eine Säule mit 201 DÄÄ-Cellulose ge-

»Sephadex and other separation products«, Januar leitet, um das PK zu adsorbieren (zu diesem Zeitpunkt

1970, S. 4, Typ G-25, bekannt. Der Extrakt wurde liefen die basischen Proteine durch und wurden auf

durch eine Säule mit 201 DÄÄ-Cellulose geleitet, um diese Weise entfernt). Es wurde mit 40 1 50-mM-Tri-

G-6-PDG zu adsorbieren (gleichzeitig Hefen die basi- « äthanolamin-HCl-Pufferlösung, die 20% Glycerin ent-

schen Proteine durch und wurden auf diese Weise ent- hielt, gewaschen. Sodann wurden 401 einer 200-mM-

fernt). Sodann wurde das Produkt mit 401 50 mM Tri- Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung, die 20% Glycerin

ethanolamin HCl-Pufferlösung (pH 7,5) gewaschen. enthielt, durch die Säule geleitet Etwa 201 der eluier-

Hierauf wurden 401 15OmM Triäthanolamin-HCl- ten Fraktion, die PK enthielt (zu diesem Zeitpunkt Pufferlösung (pH 7,5) durch die Säule geleitet. Etwa 50 wird ATP, d. h. das Eluierungsmittel für das Enzym,

201 der eluierten Fraktion, die G-6-PDH enthielt nicht eluiert) durch die Säule mit 201 des in Beispiel 1

(NADP, d. h. das Eluierungsmittel für das Enzym, verwendeten vernetzten Dextrans geleitet um das

wenn es überhaupt vorhanden war, wurde zu diesem Lösungsmittel durch 10 mM Maleinsäure-NaOH-Puf-

Zeitpunkt nicht eluiert), wurden durch eine Säule mit ferlösung (pH 6,0), die 20% Glycerin enthielt, auszu-

201 des vorstehend angegebenen vernetzten Dextrans 55 tauschen. Die rohe Enzymlösung von PK wurde durch

geleitet, um das Lösungsmittel durch 10 mM Malein- eine Säule mit 51 P-Cellulose geleitet, um PK durch

säure-NaOH-Pufferlösung (pH 6,0) zu ersetzen. Die enzymatische Affinität mit der Phosphorsäuregruppe

rohe Enzymlösung von G-6-PDH, die kein Eluierungs- zu adsorbieren.

mittel, nämlich NADP, enthielt, wurde durch eine Hierauf wurden 15 1 einer 10-mM-Maleinsäure-

Säule mit 51 P-Cellulose geleitet, um das G-6-PDH 60 NaOH-Pufferlösung (pH 6,0; Waschlösung), 51 eines

auf dem Träger durch enzymatische Affinität mit der Gemisches (Eluierungslcsung) aus dem gleichen Puf-

Phosphorsäuregruppen der P-Cellulose zu adsorbieren. fer und ATP, das ein Substrat von PK ist, in einet Darauf wurden 151 10 mM Maleinsäure-NaOH- Konzentration von 10"» M, und 101 einer 10-mM- Pufferlösung (pH 6,0; Waschlösung), 51 eines Ge- Malemsäure-NaOH-Pufferlösung (Herausdrück-Lö-

misches (Eluierungslösung) aus dem gleichen Puffer 65 sung), die 20% Glycerin enthielt, nacheinander durch

und von NADP in einer Konzentration von 10"⁴M, die Säule geleitet ATP begann vom Boden der Säule

welches ein Koenzyis fur das G-6-PDH ist, und 101 auszuströmen. Zur gleichen Zeit begann hochgereinigtt

1OmM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (Heraus- PK zu fließen.

Die spezifische Aktivität betrug etwa 7001. E. je mg Protein. Der Reinigungsgrad des rohen Extraktes betrug das 14Ofache. Die Ausbeute betrug etwa 60%.

Beispiel 3

Isolierung von o-Phosphogiuconat-Dehydrogenase
(nachstehend als 6-PGDH bezeichnet)

Wie im Beispiel 2 wurde ein roher Extrakt mit 119 · 10* I.E. von 6-PGDH erhalten. 6-PGDH wurde auf einer P-Cellulose-Säule durch enzymatische Affinität mit der Phosphorsäuregruppe adsorbiert.

Sodann wurden 151 einer 10-mM-Maleinsäure-NaOH-Pufferiösung (pH 6,0; Waschlösung), 5 1 eines Gemisches (Eluierungslösung) aus dem gleichen Puffer und 6-Phosphogluconat, das ein Substrat von 6-PGDH ist, in einer Konzentration von 5 · 10~⁴ M und 101 10-mM-Maleat-Pufferlösung (Herausdrück-Lösung), die 20% Glycerin enthielt) nacheinander durch die Säule geleitet. Als 6-Phosphogluconat vom Boden der Säule zu strömen begann, begann hochgereinigte 6-PGDH zu fließen.

Die spezifische Aktivität betrug etwa 2001. E. je mg Protein. Der Reinigungsgrad des rohen Extrakts betrug etwa das 600fache. Die Ausbeute betrug 50 %.

Beispiel 4

Isolierung von Ribulosediphosphat-Carboxylase
(nachstehend als RuDPC bezeichnet)

500 ml Äthylacetat wurden zu 5 kg von nassen Zellen der Hefeart Candida utilis gegeben. Das Ganze wurde gründlich gerührt, um eine Autolyse vorzunehmen. Die löslichen Komponenten wurden mit 2010.lgesättigter Ammoniumsulfat-Lösung bei Raumtemperatur 24 Stunden extrahiert. Die unlöslichen Komponenten wurden durch Zentrifugierung entfernt, wodurch ein roher Extrakt erhalten wurde, der RuDPC enthielt. S Das Lösungsmittel in dem rohen Extrakt wurde durch 150-mM-Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) ersetzt, indem der Extrakt durch eine Säule mit 201 des in Beispiel 1 zur Gelfiltration verwendeten vernetzten Dextrans geleitet wurde. Der Extrakt wurde

ίο durch eine Säule mit 21 DÄÄ-Cellulose geleitet. Sodann wurden durch die Säule 21 einer 150-mM-Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) geleitet, um eine Fraktion zu sammeln, die RuDPC enthielt. Das Lösungsmittel in der Fraktion wurde durch 10-mM-Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 6,0) ersetzt, wobei 201 des vorstehend angegebenen vernetzten Dextrans verwendet wurden.

Die auf diese Weise erhaltene rohe Enzymlösung von RuDPC wurde durch eine Säule mit 51 PPM-CeI-

ao lulose geleitet, um die RuDPC entsprechend ihrei enzymatischen Affinität mit der Phosphorsäuregruppe zu adsorbieren.

Sodann wurden 151 einer 10-mM-Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 6,0; Waschlösung), 51 eines Gemisches (Eluierungslösung) aus der gleichen Pufferlösung und Ribulosediphosphat in einer Konzentration von 5 · 10~⁵ M und 101 einer 10-mM-Maleinsäure - NaOH - Pufferlösung (Herausdrück - Lösung] nacheinander durch die Säule geleitet Als Ribulose-6-phosphat vom Boden der Säule zu strömen begann, begann hochgereinigte RuDPC zu fließen. Die spezifische Aktivität betrug etwa 11001. E. je mg Protein. Der Reinigungsgrad des rohen Extrakts betrug etwa das 38OOfache. Die Ausbeute betrug etwa 70%.

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   Ii Verfahren zur Isolierung von vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen dissfc Affinitätschronmtograpaie, dadurch gekennzeichnet, daß man eine rohe Enzymlosung, weiche keine der im folgenden definierten Eluierungsmittel und zusätzlich zu den vom anorganischen Phosphat abhängigen Enzymen und verschiedenen anderen Enzymen verschiedene saure, neutrale und basische Proteine enthält, mit einem Träger aus einer wasserunlöslichen organischen oder anorganischen Verbindung mit