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Beschreibung zu der Patentanmeldung Verfahren zur Isolierung von Enzymen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Enzymen, insbesondere ein
Verfahren zur Isolierung von Enzymen, die von anorganischen Phosphaten abhängig
sind. Diese sollen nachstehend als Pl-abhängige Enzyme bezeichnet erden.
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Unter dem Begriff 1,Pi-abhängige Enzyme" sollen hierin im allgemeinen
Enzyme verstanden werden, die anorganisches Phosphat (nachstehend als Pi bezeichnet)
als Substrat verwerten oder die Pi als Reaktionsprodukte ergeben oder schließlich
solche Enzyme, bei denen die durch sie katalysierten Reaktionen durch Pi inhibiert
oder aktiviert werden.
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Beispiele für Enzyme, die Pi als Substrat verwerten oder die Pi als
Reaktionsprodukte ergeben, sind Clycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und anorganische
Pyrophosphatase. Beispiele für Enzyme deren Reaktion durch Pi inhibiert wird, sind
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase, Ribulose-1,6-diphosphat-Dehydrogenase
und Pyruvat kinase. Beispiele für Enzyme, deren Reaktion durch Pi aktiviert wird,
sind Fumarase und Urease.
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Diese Pi-abhängigen Enzyme sind wichtige Enzyme, die direkt an vitalen
Erscheinungen in den Zellen teilnehmen. Man erwartet von ihnen einen breiten Anwendungsbereich
als Laborreagentien für biochemische Zwecke und weiterhin als klinische und pathologische
Reagentien für medizinische und pharmazeutische Zwecke.
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Einige dieser Enzyme sind schon aus Tiergeweben und Mikroorganismen
extrahiert und vor der Anwendung gereinigt worden. Die technischen Enzymprodukte
sind jedoch entweder sehr teuer oder die Produkte sind nicht erhältlich, da bislang
noch keine durchführbaren Reinigungsmethoden aufgefunden worden sind. Aus diesem
Grund ist die Verwendung der En7yme bislang beschränkt gewesen, obgleich diese Enzyme
sehr geeignet sind.
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Die herkömmlichen Enzymisolierungsmetheden ordnen sich. in folgende
Gruppen ein: 1. Ausfällungsmethoden beim isoelektrischen Punkt. Bei diesen Methoden
nützt man die Eigenschaften von amphoteren Elektroden aus, daß die Löslichkeit je
nach der Wasserstoffionenkonzentration variiert und beim isoelektrischen Punkt den
geringsten Wert einnimmt.
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2. Aussalzme thoden. Dabei nütz t man die Löslichkeitsunterschiede
zwischen den Enzymen in Lösung eines neutrale Salzes, wie Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat,
aus
3. Ausfällungsmethoden mit organischen Lösungsmitteln. Dabei
fällt man die Enzyme fraktioniert aus, indem man die Löslichkeit durch Zugabe von
Alkohol, Aceton, Dioxan etc. zu der Enzymlösung allmählich verringert.
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4. Wärmebehandlungsmethoden, bei welchen man die Temperatur der Enzymlosung
erhöht, um die ungewünsehten Proteine zu denaturisieren und zu verfestigen. Bei
diesen Verfahren nützt man die unterschiedliche Wärmestabilität der Enzyme aus.
Sodann wird das Protein entfernt.
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5, Selektive Ausfällungsmethoden, bei welchen man ein spezielles Fällungsreagens,
wie Promitansulfat oder Bleiacetat, verwendet.
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6. Selektive Adsorptionsmethoden, bei welchen man spezielle Adsorbentien,
wie Aluminiumhydroxid oder Calciumphosphat-Gel, verwendet.
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7. Ionenaustauscher-Chromatographie und Elektrophorese 3 bei welchem
man die Differenz der elektrischen Ladungen zwischen den einzelnen Proteinen hauptsächlich
ausnützt.
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8. $Kristallisationsmethoden.
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Die obengenannten, bekannten, allgemein üblichen Reinigungsmethoden
bauen sich auf den quantitativen Unterschieden der physikalischen Eigenschaften
zwischen den Enzymen oder Proteinen auf.
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Unterschiecle der biologischen Eigenschaften werden dabei jedoch nicht
verwendet, Daher ist die Isolierung der einzelnen Enzyme mit genügender Reinheit
sehr schwierig, obgleich Enzyme und Proteine mit nahe aneinanderliegenden physikalisch-chemischen
Eigenschaften als Gruppe erfolgreich hergestellt werden konnten. Zur Reinigung der
jeweiligen Enzyme waren jedoch sehr aufwendige und teure Arbeitsweisen, beispielsweise
die Kombination versehiedener Reinigungsmethoden oder die Wiederholung der IJIethoden,
erforderlich.
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Zur Reinigung von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, die ein Pi-abhängiges
Enzym ist, wurde beispielsweise folgende Methode beschrieben (Journal of Biological
Chemistry, Vol. 256 Nr. 5 Seiten 1225 bis 1230, 1961). Eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Probe
mit einer 3800-fachen Reinheit wurde mit einer schlechten Ausbeute von nur 13% (I.E./I.E.
der Enzyme: Die gleiche Bezeichnung soll nachfolgend ebenfalls verwendet werden)
aus einem Autolyse-Extrakt von getrockneter Brauhefe durch 15 Reinigungsstufen erhalten.
Diese Reinigungsstufen schlossen die fraktionierte Ausfällung mit Silbernitrat,
das fraktionierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die Ausfällung mit Alkohol als organisches
Lösungsmittel, die fraktionierte Adsorption an Bentonit, das fraktionierte Aussalzen
mit Ammoniumsulfat, die fraktionierte Ausfällung mit Manganionen, die Ausfällung
mit Aceton als organisches Lösungsmittel, das fraktionierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat,
die Ionenaustauscher-Chromatographie mit DEAE-SF (Handelsnamen für einen schwachbasischen
Ionenaustauscher), das fraktionierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat und eine Kristallisation
irweimal) ein, Zur Reinigung von Pyruvat-Kinase, die ein weiteres Pi-abhängiges
Enzym ist, wurde folgendes Verfahren beschrieben (Journal of Biological Chemistry,
Vol 244 Nr. 1.8, Seiten 4815 bis 4818, 1969). Eine Pyruvat-Kinase-Probe mit einer
etwa 50-fachen Reinheit (bezogen auf den rohen Extrakt) wurde mit einer schlechten
Ausbeute von 44,9% aus dem Autolyse-Extrakt von Bäckerhefe durch ein Reinigungsverfahren
erhalten. Das Reinigungsverfahren schloß das fraktionierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat,
die Ionenaustauscher-Chromatographie mit DEAE-Cellulose, die Ionenaustauscher-Chromatographie
mit P-Cellulose und das fraktionierte Aussalzen mit Ammoniumsulfat ein.
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Gemäß der Erfindung soll eine Isolationsmethode für Enzyme zur Verfügung
gestellt werden, durch welche in einfacher und billiger Weise Enzyme, insbesondere
Pi-abhängige Enzyme, mit hohler Reinheit hergestellt werden können.
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Es wurde nun gefunden, daß Pi-abhängige Enzyme auf wasserunlöslichen
Trägern, wie Cellulosephosphat, das
-Gruppen enthält, entsprechend ihrer jeweiligen enzymatischen Affinität für Pi adsorbiert
werden und daß die durch die enzymatische Affinität adsorbierten Enzyme aus den
Trägern eluiert werden, wenn ein mit Pi in Konkurrenz stehendes Substrat zugegeben
wird. Die vorliegende Erfindung baut sich auf diesen Erkenntnissen auf.
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Bei der Erfindung macht man vom Unterschied der biologischen Eigenschaften
der Enzyme (d.h. der Spezifizitäten der Enzyme), nicht aber von quantitativen Unterschieden
der physikalisch-chemischen Eigenschaften Gebrauch. Somit unterscheidet sich die
Erfindung von der Theorie her von den herkömmlichen Reinigungsmethoden.
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Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Isolierung von
Enzymen, bei welchem man eine rohe Enzymlösung, die das unten angegebene Eluierungsmittel
nicht enthält, mit einem Träger aus einer wasserunlöslichen organischen oder anorganischen
Verbindung, die
-Gruppen enthält, in Berührung bringt, um die Pi-abhängigen Enzyme und-die in den
Enzymen nicht eingeschlossenen basischen Proteine auf den Träger zu adsorbieren,
und bei welchem man den Träger mit einer wäßrigen Lösung in Berührung bringt, die
als Eluierungsmittel wenigstens ein Substrat, ein Koenzym,-einen Inhibitor und/oder
einen Extivator enthält, welches mit dem Pi in bezug auf die jeweiligen Enzyme in
Konkurrenz steht und das den jeweiligen Enzymen gegenüber spezifisch ist, wodurch
die adsorbierten Enzyme selektiv in die wäßrige Löcungeluiert werden.
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Bei dem oben beschriebenen Verfahren werden die Pi-abhängigen Enzyme
auf dem Träger aufgrund ihrer enzymatischen Affinität gegenüber dem Pi adsorbiert,
während die basischen Proteine, die in den Enzymen nicht eingeschlossen sind, auf
dem Träger aufgrund ihrer statischen elektrischen Kräfte adsorbiert werden. Die
basischen Proteine werden jedoch am Schluß von den Pi-abhängigen Enzymen abgetrennt,
da die Proteine aus dem Träger in der nachfolgenden Eluierungsstufe nicht eluiert
werden.
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Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung
von Enzymen, bei welchen man eine. rohe Enzynilösung, die kein Eluierungsmittel
enthält und aus welcher die basischen Proteine zuvor entfernt worden sind, mit dem
Träger in Berührung bringt, um die anorganischen, phosphatabhängigen Enzyme auf
dem Träger aufgrund ihrer enzymatischen Affinität zu adsorbierenXund und sodann
die adsorbierten Enzyme in gleicher Weise, wie oben beschrieben, selektiv eluiert,
Die bei dem Verfahren der Erfindung verwendeten rohen Enzymlösungen sind Extrakte
von mechanischen Ferkleinerungsprodukten oder Autolysaten von Mikroorganismena wie
Kefe oder BSrterien, sowie Extrakte von Homogenaten verschiedener animalischer Gewebe
und Pflanzen. Wenn die rohen EnBymlösungen ein Eluierungsmittel enthalten sollten,
dann sollte dieses Eluierungsmittel zuvor entfernt werden.
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Die rohen Enzymlösungen enthalten zusätzlich zu den Pi-abhängigen
Enzymen und verschiedenen anderen Enzymen verschiedene saures neutrale und basische
Proteine, die nicht mit den Enzymen identisch sind. Es ist nicht notwendig, solche
Proteine vor dem Reinigungsverfahren zu entfernen.
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Die rohe Enzymlösung wird mit einem Träger in Berührung gebracht,
der eine wasserunlösliche organische oder anorganische
Verbindung
mit
-Gruppen enthält. Dies geschieht dazu, um die Pi-abhängigen Enzyme und die in diesen
Enzymen nicht eingeschlossenen basischen Proteine auf dem Träger zur hdsorption
zu bringen.
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Als Träger auf der Basis wasserunlöslicher organischer Verbindungen
mit
-Gruppen können beispielsweise P-Cellulose (Cellulosephosphat), PPM-Cellulose (Phosphorylmethylcellulose)
und Duolite ES-63 (Warenzeichen der Diamond Alkali Company, USA) verwendet werden.
Als Träger auf der Basis vzasserunlöslicher anorganischer Verbindungen mit wasserunlöslichen
anorganischen Verbindungen, die diese Gruppe enthalten, können z.B.
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Calciumphosphat-Gel und Magnesiumphosphat verwendet werden.
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Die Berührung der rohen Enzymlösung auf dem Träger wird in der Weise
bewirkt, daß man die rohe Enzymlösung durch eine mit dem Träger gepackte Säule leitet
oder daß man den Träger in der rohen Enzymlösung suspendiert.
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Auf diese Weise werden durch Berührung der rohen Enzymlösung mit dem
Träger die Pi-abhängigen Enzyme und die in den Enzymen nicht eingeschlossenen Proteine
auf dem Träger adsorbiert.
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Die Adsorption der Pi-abhängigen Enzyme erfolgt aufgrund der enzymatischen
Affinität mit dem Träger, während die Adsorption der basischen Proteine, die von
den Enzymen nicht eingeschlossen sind, aufgrund der statischen elektrischen Kräfte
zwischen der elektrischen Ladlmg der basischen Proteine und derjenigen des Trägers
erfolgt.
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Danach wird der Träger mit einer wäßrigen Lösung in Berührung gebracht,
die als Eluierungsmittel mindestens ein Substrat, Koenzym, einen Inhibitor und/oder
einen Aktivator enthält, welches dem einzelnen Enzym gegenüber spezifisch (selektiv)
ist und mit dem Pi in Konkurrenz steht (d.h. antagonistisch wirkt), um die jeweiligen
Pi-abhängigen Enzyme selektiv in die wäßrige Lösung zu eluieren.
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Wenn eine wäßrige Lösung verwendet wird, die ein Substrat, ein Koenzym,
einen Inhibitor oder einen Aktivator enthält, der mit dem Pi nicht in Konkurrenz
steht (bzw diesem gegenüber nicht antagonistisch wirkt), dann werden die Pi-abhängigen
Enzyme aus dem Träger nicht eluiert.
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So kann man z.B. Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase in reiner Form isolieren,
indem man den mit dem Enzym beladenen Träger mit einer wäßrigen Lösung von Nikotinamid-adenindinucleotidphosphat
(NADP), welches das Koenzym dieses Enzyms ist, auswäscht bzw. in Berührung bringt.
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6-Phosphogluconat-Dehydrogenase kann beispielsweise in reiner Form
isoliert werden, indem man den mit dem Enzym beladenen Träger mit einer wäßrigen
Lösung von 6-Phosphogluconat, welches ein Substrat dieses Enzyms ist,als Eluierungsmittel
in Berührung bringt bzw, auswäscht.
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In der gleichen Weise können Pyruvat-Kinase, anorganische Pyrophosphatase
und Ribulose-diphosphatcarboxylase selektiv isoliert werden, indem man den mit dem
Enzym beladenen Träger mit wäßrigen Lösungen von Substraten, d.h. Adenosintriphosphat
(ATP), eines Pyrophosphats bzw. von Ribulosediphosphat als Eluierungsmittel in Berührung
bringt bzw. auswäscht.
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Wenn die gereinigte Enzymlösung durch Ultrafiltration oder dergleichen
konzentriert und langsam beispielsweise mit konzentrierter
Amrzoniumsulfat-Lösung
versetzt wird; dann kann das Enzym in kristalliner Form erhalten werden. Wenn dasEluierungsmittel
entfernt werden soll, dann kann eine Gelfiltration und Dialyse vorgenommen werden.
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Im Falle, daß die basischen Proteine zuvor aus den als Ausgangsmaterialien
verwendeten rohen Enzymlösungen entfernt worden sind, werden auf dem Träger nur
die Pi-abhängigen Enzyme adsorbiert. In diesem Fall ist daher die Kapazität des
Trägers für die Adsorption der Pi-abhängigen Enzyme erheblich erhöht.
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Bei dem Verfahren der Erfindung können daher die Mengen der Träger
und der Eluierungsmittel gering sein. Die ReinigungsmaßnSlraen werden einfach und
leicht durchzuführen sein. Ein weiterer charakteristischer Vorteil des Verfahrens
der Erfindung besteht darin, daß man Enzymlösungen mit hoher Konzentrcation erhalten
kann, da man nur mit kleinen Mengen von Eluierungsmitteln arbeitet.
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tiachdem das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung der Enzyme
von der spezifischen Affinität der Enzyme mit Trägern und den Eluierungsmitteln
Gebrauch macht, unterscheidet sich das Verfahren der Erfindung von der Theorie her
von den herkömmlichen Reinigungsverfahren Somit können auch Enzyme, die bislang
aufgrund ihrer analogen physilvalisch-chemischen Eigenschaften nicht leicht gereinigt
werden konnten, mit extrem hoher Reinheit hergestellt rSerdene Weiterhin können
viele Enzymarten nacheinander in einer einstufigen Reinigung erhalten werden5 indem
man nacheinander die Eluierungsmittel verändert da die Reinigung bei ziemlich milden
Bedingungen erfolgt.
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Das Verfahren der Erfindung ist vom industriellen Standpunkt aus gesehen
sehr vorteilhaft, da die Reinigung in einfacher Wei se und innerhalb eines kurzen
Zeitraums erfolgen kann. Schwierigkeiten aufgrund von Verschmutzungen und dergleichen
treten
kaum auf. Das Verfahren kann in einer einfachen Anlage durchgeführt
werden.
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Die Ionenaustauscher-chromatographie, ist die am meisten bevorzugte
Methode bei den herkömmlichen Isolationsmcthoden für Enzyme, da sie relativ einfach
vonstatten geht und man bei milden Bedingungen einen ziemlich hohen Isolationseffekt
erzielt.
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Bei diesem bekannten Verfahren ist aber selbst beiausgewählten Reinigungsbedingungen
eine Verunreinigung durch Substanzen mit quantitativ ähnlichen Eigenschaften nicht
vermeidbar, da dieses bekannte Verfahren sich auf den quantitativen Unterschieden
der elektrischen Eigenschaften, wie des isoelektrischen Punktes der Enzyme, aufbaut.
Demgegenüber besitzt das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren die Vorteile der herkömmlichen
Ionenaustauscher-Chromatographie-Verfahren und den weiteren Vorteil, daß eine "Klarschnitt"-:luierung
vorgenommen werden kann da das Verfahren der Erfindung die inhärenten, genauen Spezitlzitäten
von Enzymen für Substrate ausnutzt und da die Eluierung durch ein spezielles Eluierungsmittel,
welches für das spezielle Enzym spezifisch ist, vorgenommen wird. Das Verfahren
der Erfindung stellt somit ein ideales Isolierungsverfahren dar.
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Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Darin'sind sämtliche
Prozentangaben auf das Volumen bezogen, falls keine anderen Angaben gemacht werden.
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Beispiel 1 Isolierung von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (hierin
als G-6-PDH bezeichnet).
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2 1 Athylacetat wurden zu 20 kg von nassen Zellen.der IIefeart Candida
utilis gegeben, Das Ganze wurde gründlich gerührt, um eine Autolyse zu bewirken.
Die löslichen Komponenten wurden mit 20 1 einer 0,1-gesättigten Ammoniumsulfatlösung
bei Raumtemperatur
24 Stunden extrahiert. Durch Zentrifugierung
wurden unlösliche Stoffe entfernt. Auf diese Weise wurde ein roher Extralr-t; erhalten,
der 336 x 104 I.E. G-6-PDH enthielt.
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Das Lösungsmittel im Extrakt wurde mit 50 mM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5) ersetzt, indem durch eine Säule mit 20 1 Sephadex G-25 geleitet wurde.
Der Extrakt wurde durch eine Säule mit 20 1 DEAE-Cellulose geleitet, um G-6-PDH
zu adsorbieren (gleichzeitig liefen die basischen Proteine durch und wurden auf
diese Weise entfernt) Sodann wurde das Produkt mit 40 1 50 mM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5) gew-aschen, Hierauf wurden 40 1 150 mM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung
(pH 7,-5) durch die Säule geleitet. Etwa 20 1 der abgenommenen Fraltion, die G-6-PDH
enthielt (NADP, d .h. das Eluierungsmittel für das Enzym, wenn es überhaupt vorhanden
war, wurde zu diesem Zeitpunkt nicht eluiert), wurden durch eine Säule mit 20 1
Sephadex G-25 geleitet, um das Lösungsmittel durch 10 mM Maleinsäure-STaOII-Pufferlösung
(pH 6,0) zu ersetzen. Die rohe Enzyme lösung von G-6-PDH, die kein Eluierungsmittel,
nämlich NADP, enthielt, wurde durch eine Säule mit 5 1 P-Cellulose geleitet, um
das G-6-PDH auf dem Träger durch enzymatische Affinität mit den Phosphorsäuregruppen
der P-Cellulose zu adsorbieren. Darauf wurden 15 1 10 mM Maleinsäure-NaOII-Pufferlösung
(pH 6,0; Waschlösung), 5 1 eines Gemisches tEluierungslösung) aus dem gleichen Puffer
und von NADP in einer Konzentration von 10-4 welches ein Koenzym für das G-6-PDH
ist, und 10 1 10 mM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (Herausdrücklösung) durch die
Säule nacheinander geleitet. Das NADP begann vom Boden der Säule aus zu fließen.
Zur gleichen Zeit begann hochgereinigte G-6-PDH, die auf ein Volumen von etwa 1
1 konzentriert war, zu fließen.
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Die spezifische Aktivität betrug etwa 5500 I.E. je mg Protein.
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Der Reinigungsgrad, bezogen auf den rohen Extrakt, betrug etwa das
5000-fache. Die Ausbeute betrug etwa 70%.
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Die G-6-PDH kann durch Konzentrierung der gereinigten G-6-PDH-Lösung
durch Ultrafiltrierung mit einem Dia-Filter (Produkt von Nihon Shinku-Gijutsu Co.)
allmählich zu einer Sättigung von etwa 0,7 kristallisiert werden.
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Die hierin enthaltene NADP hatte die Wirkung, daß die Inaktivierung
des Enzyms verhindert wurde.' Es lagen jedoch keine schädlichen Einflüsse auf die
quantitative Bestimmung der NADP vor, da das NADP in extrem geringer Menge vorlag.
NADP kann aber leicht durch Gelfitration mit Sephadex G-25 entfernt werden.
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Beispiel 2 Isolierung von Pyruvat-Kinase (nachstehend als PK bezeichnet).
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2 1 Äthylacetat wurden zu 20 kg der nassen Zellen der Hefeart Candida
utilis gegeben. Das Ganze wurde gründlich gerührt, um eine Autolyse zu bewirken.
Die löslichen Komponenten wurden mit 20 1 einer 0,1-gesättigten Ammoniumsulfat-Lösung
bei Raumtemperatur 24 Stunden extrahiert. Die unlöslihen Komponenten wurden durch
Zentrifugierung entfernt, wodurch ein roher Extrakt erhalten wurde, der 95 X 10-5
5 I.E. von PK enthielt. Zu dem rohen Extrakt wurde die viertelte Menge an Glycerin
gegeben. Das Lösungsmittel in dem rohen Extrakt wurde durch 50 rnM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5), die 20% Glycerin enthielt, in einer Säule mit 20 1 Sephadex ersetzt. Der
Extrakt wurde sodann durch eine Säule mit 20 1 DEAE-Cellulose geleitet, um das PK
zu adsorbieren (zu diesem Zeitpunkt liefen die basischen Proteine durch und wurden
auf diese Weise entfernt). Es wurde mit 40 1 50 it Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung,
die 20% Glycerin enthielt, gewaschen. Sodann wurden 40 1 einer 200 m Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung,
die 20% Glycerin enthielt, durch die Säule geleitet. Etwa 20 1 der eluierten Fraktion,
die PK enthielt (zu diesem Zeitpunkt wird ATP, d.h. das Eluierungsmittel für das
Enzym, nicht eluiert) durch die Säule mit 20 1 Sephadex G-25 geleitet, um das Lösungsmittel
durch 10 mM Maleinsäure-NaOII-Pufferlösung (pH 6,0), die 20% Glycerin enthielt,
auszutauschen.
Die rohe-Enzymlösung von PK wurde durch eine Säule
mit 5 1 P-Cellulose geleitet, um PK durch enzymatische Affinität mit der Phosphorsäuregruppe
zu adsorbieren.
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Hierauf wurden 15 1 einer 10 mM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH
6,0; Waschlösung), 5 1 eines Gemisches (Eluierungslösung) aus dem gleichen Puffer
und ATP, das ein Substrat von PK ist, in einer Konzentration von 10 3 M, und 10
1 einer 10 mM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (Horausdrück-Lösung), die 20% Glycerin
enthielt, nacheinander durch die Säule geleitet. ATP begann, vorn Boden der Säule
auszuströmen. Zur gleichen Zeit begann, hochgereinigte PK zu fließen.
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Die spezifische Aktivität betrug etwa 700 I.E. je mg Protein.
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Der Reinigungsgrad des rohen Extraktes betrug das 140-fache.
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Die Ausbeute betrug etwa 60%.
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Beispiel 3 Isolierung von 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (nachstehend
als 6-PGDH bezeichnet).
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Wie im Beispiel 2 wurde ein roher Extrakt mit 119 x 104 I.E. von 6-PGDH
erhalten. 6-PGDH wurde auf einer P-Cellulose-Säule durch enzymatische Affinität
mit der Phosphorsäuregruppe adsorbiert.
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Sodann wurden 15 1 einer 10 mM Maleinsäure-NaOlI-Pufferlösung (pH
6,0; Waschlösung), 5 1 eines Gemisches(Eluierungslösung) aus dem gleichen Puffer
und 6-Phosphogluconat, das ein Substrat von 6-PGDH ist, in einer Konzentration von
5 x x 10-4 4 mM und 10 1 10 mM Maleat-Pufferlösung (lierausdrück-Lösung), die 20%
Glycerin enthielt) nacheinander durch die Säule geleitet. Als ó-Phosphogluconat
vom Boden der Säule zu strömen begann, begann hochgereinigte 6-PGDH zu fließen.
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Die spezifische Aktivität betrug etwa 200 I.E. je mg Protein.
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Der Reinigungsgrad des rohen Extrakts betrug etwa das 600-tach.
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Die Ausbeute betrug 52%.
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Beispiel 4 Isolierung von Ribulosediphosphat-Carboxylase (nachstehend
als RuDPC bezeichnet).
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500 ml Äthylacetat wurden zu 5 kg von nassen Zellen der Hefeart Candida
utilis gegeben. Das Ganze wurde gründlich gerührt, um eine Autolyse vorzunehmen.
Die löslichen Komponenten wurden mit 20 1 0,1-gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung
bei Raumtemperatur 24 Stunden extrahiert. Die unlöslichen Komponenten wurden durch
Zentrifugierung entfernt, wodurch ein roher Extrakt erhalten wurde, der RuDPC enthielt.
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Das Lösungsmittel in dem rohen Extrakt wurde durch 150 mN Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung
(pH 7,5) ersetzt, indem der Extrat durch eine Säule mit 20 1 Sephadex-G-25 geleitet
wurde.
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Der Extrakt wurde durch eine Säule mit 2 1 DEAE-Cellulose P'eleitet.
Sodann wurden durch die Säule 2 1 einer 150 mM Triäthanolamin-HCl-Pufferlösung (pH
7s5) geleitet, um eine Fraktion zu sauneln, die RuDPC enthielt. Das Lösungsmittel
in der Fraktion wurde durch 10 mM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 6,0) ersetzt,
wobei 20 1 Sephadex G-25 verwendet wurden.
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Die auf diese Weise erhaltene rohe Enzymlösung von RuDPC wurde durch
eine-Säule mit 5 1 PPM-Cellulose geleitet, um die RuDPC entsprechend ihrer enzymatischen
Affinität mit der Phosphorsäuregruppe zu adsorbieren.
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Sodann wurden 15 1 einer 10 mM Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (pH 6s0;
Waschlösung), 5 1 eines Gemisches (Eluierungslösung) aus der gleichen Pufferlösung
und Ribulosediphosphat in einer Konzentration von 5 x 10-5 M und 10 1 einer 10 mM
Maleinsäure-NaOH-Pufferlösung (Herausdrück-Lösung) nacheinander durch die Säule
gleitet. Als Ribulose-6-phosphat vom Boden der Säule zu strömen begann, begann hochgereinigte
RuDPC zw fließen. Die spezifische Aktivität betrug etwa 1100 I.E. je mg Protein.
Der Reinigungsgrad des rohen Extrakts ' trug etwa das 3800-fache. Die Ausbeute betrug
etwa 7Q/o.