DE3234332C2

DE3234332C2 - Herstellung immobilisierter Strictosidin-Synthase und deren Verwendung

Info

Publication number: DE3234332C2
Application number: DE3234332A
Authority: DE
Inventors: Ursula Dipl.-Biol. Pfitzner; Meinhart H. Prof. Dr. 8000 München Zenk
Original assignee: A Nattermann & Cie 5000 Koeln De GmbH
Current assignee: A Nattermann & Cie 5000 Koeln De GmbH
Priority date: 1982-09-16
Filing date: 1982-09-16
Publication date: 1984-07-19
Also published as: DE3234332A1

Abstract

An Trägermaterial, insbesondere CNBr-aktivierte Sepharose gebundene, stabilisierte, hochreine Strictosidin-Synthase, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zur stereospezifischen Synthese von 3α(S)-Strictosidin durch Kondensation von Tryptamin mit Secologanin.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Strictosidin-Synthase und die Verwendung derselben zum Herstellen von Strictosidin gemäß den Patentansprüchen 1 und 2.

Strictosidin-Synthase ist ein Enzym, das aus Zellkulturen von catharantus roseus gewonnen werden kann. Die Aufarbeitung und Gewinnung von relativ reinen Lösungen ist in der Literatur wiederholt beschrieben. Das Enzym kann auch aus anderen Pflanzen, beispielsweise denen der Familien der apocynaceae oder rubiaceae, gewonnen werden.

H. Mitsukami et. al. beschreiben in Biochemistry, Vol. 18/Nr. 17, Seite 3760-3763 (1979) die Aufarbeitung und Reinigung mittels vielfacher Fällungs- und Chromatographie-SchriUe. Nach teilweiser Reinigung durch Ammonsuifatfallung und dreimaliger unterschiedlicher Chromatographie wurde eine Stabilität der Enzymlösung von mehr als v:iner Wjche bei 4⁰C erreicht. Nach weiterer Reinigung durch isoelektrische Fokussierung ging die Stabilität wieuer stark zurück. Gefrorene Enzymlösungen verloren innerhalb einer Woche die Hälfte ihrer Aktivität.

J. Stöckigt beschreibt in Phytochemistry 18, 965-970 (1979) die Isolierung und Reinigung des Enzyms, wobei mittlere Proteingehalte von 5 mg pro Milliliter erreicht werden. Dieser Autor beschreibt das Enzym als wirksam bei der Biosynthese von Alkaloiden in zellfreien Systemen bei pH-Werten von 6,0 - 7,0 und nennt eine Stabilität der Lösungen von etwas mehr als 1,5 Monaten bei 4°C.

Strictosidin-Synthase ermöglicht die spezifische Herstellung von 3a-(S)-Strictosidin aus Tryptamin und Secologanin. Strictosidin ist ein Schlüsselprodukt für die Alkaloid-Synthese, so daß seine stereospezifische Herstellung in industriellem Maßstab von Interesse ist.

Voraussetzung dafür sind jedoch ausreichende Mengen an Strictosidin-Synthase als katalytisch wirkendes Enzym. Die in der Literatur beschriebenen Herstellungs- und Reinigungsverfahren sind jedoch außerordentlich aufwendig und die Ausbeute an reinen Enzymlösungen so gering, daß eine Verwertung im industriellen Maßstab nicht möglich war. Ein weiterer wichtiger Nachteil der Lösungen besteht darin, daß sie nicht ausreichend lagerstabil sind und wegen ihrer Instabilität nach der Alkaloid-Synthese nicht mehr zurückgewonnen werden können.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, immobilisierte Strictosidin-Synthase zu schaffen, die bei Ver-Wendung zur Biosynthese von Strictosidin in zelifisien Systemen zurückgewonnen werden kann, ohne daß ihre biologische Aktivität verlorengeht.

Die Aufgabe wird also gelöst durch ein Verfahren zum Herstellen immobilisierter hochreiner Strictosidin- |j Synthase und ihre Verwendung zur Synthese von Strictosidin durch Kondensation von Tryptamin mit

pl Secologanin gemäß den Patentansprüchen 1 und 2.

■ύ 55 Als für die Erfindung geeignetes Trägermaterial hat sich CNBr-aktivierte Sepharose erwiesen. Dabei han-

t» delt es sich um mit Cyanobromid aktivierte Sepharose 4 B, einem Agarosegel mit 4%iger Konzentration von

|| Agarose.

Zur Herstellung des Enzyms wurden Zellkulturen von catharanthus roseus als Suspensionen im Dunkeln bei ?4°C auf Linsmaier- und Skoog-Medium (Physiol. Plant 18,110 (1965) mit einem Gehalt von 60 Mikromol 2,3-Dimethylphenoxyessigsäure als alleinigem Hormon verwendet. Nach einer Entwicklungszeit von 7 Tagen im Dunkeln bei 24⁰C wurden die Zellen abfiltfiert, mit flüssigem Stickstoff gefroren und bei -20⁰C gelagert.

sf Die Enzymisolierung und Reinigung aus den gefrorenen Zellen erfolgte durch Aufnehmen und Rühren in

?i Kaliumphosphat-Pufferlösung mit pH 7, die etwas Mercaptoethanol enthält. Nach Abfiltrieren und Zentri-

% 65 fugieren wird das Enzym aus der überstehenden Lösung mit Ammoniumsulfat ausgefällt und durch Zentri-

r| fugieren abgetrennt. Der gewonnene Rückstand wird in Mercaptoethanol enthaltender Kaliumphosphat-

% Pufferlösung (pH 7) aufgenommen und einer Dialyse gegen 100-fachen Überschuß des Puffers unterworfen,

:* so daß die niedermolekularen Produkte und Salze entfernt sind. Anschließend wird das unlöslich gebliebene

Protein abzentrifugiert und der gewonnenen klaren Enzymlösung Glycerin zugefügt, so daß der Glyceringehalt 5% beträgt. Die Lösung wird dann der Gelfiltration unierzogen und die Strictosidin-Synthase enthaltenden Fraktionen gesammelt und durch Ultrafiltration aufkonzentriert.

Dieses Aufarbeitungs- und Reinigungsverfahren ergibt eine 15-fache Anreicherung bei 80%iger Ausbeute.

Vor dem Fixieren auf einem Trägermaterial wird eine weitere Reinigung durch Dialyse gegen einen 0,1 M NaHCO₃-Puffer (pH 8,5), der 0,5 M Natriumchlorid enthält, durchgeführt.

Die CNBr-aktivierte Sepnarose wird zunächst mit HCl gewaschen und mit Wasser nachgewaschen, ehe sie in der gereinigten Enzyralösung suspendiert wird.

Die Fixierung auf dem Trägermaterial erfolgt durch Rühren der Suspension des Trägermaterials in der Enzymlösung bei Raumtemperatur für eine ausreichend lange Zeit. Für die Adsorption sind etwa 2 Stunden ausreichend.

Das Trägergel wird dann auf einem Filter gesammelt, mit Pufferlösungen gewaschen und anschließend zur besseren Fixierung des Enzyms in 0,1 M Tris-HCl-Lösung mit pH 8,0 suspendiert und bei Raumtemperatur für einige Zeit, vorzugsweise etwa 2 Stunden, gerührt. Danach wird das Trägergel abfiltriert und mit verschiedenen Pufferlösungen gewaschen und eine Matrix des stabilisierten Enzyms gewonnen. Das gebundene Enzym wird bei 4°C gelagert und es kann Natriumazid zugefügt werden zur Vermeidung von Mikrobenwachstum.

Das gebundene Enzym weist eine Aktivität von mindestens 700 pKatal bei pH 6,5 und 37°C auf. Seine relative Aktivität beträgt mindestens 40% zwischen pH 4,3 und 8,5. Der pH-Wert von hoher Aktivität (mindestens 40% relativ) ist breiter als bei in Lösung befindlichem Enzym und die optimale Aktivität ist bei pH 6,4 vorhanden. In Lösung befindliches Enzym weist bei pH 4 nur eine relative Aktivität von 4% auf und bei pH 8 nur eine 2C solche von 15%. Im Gegensatz dazu weist das erfindungsgemäße stabilisierte und gebundene inzym bei pH 4 noch 35% seiner Aktivität auf und bei pH 8 noch 58%.

Die Abhängigkeit der relativen Enzymaktivität vom pH-Wert ist für das erfindungsgemäß gebundene Enzym und Enzymlösungen in Fig. 1 wiedergegeben.

Die Figur läßt deutlich erkennen, daß das gebundene Enzym einen breiteren Aktivitätsbereich hat als das gelöste Produkt.

Die verbesserte thermische Stabilität des gebundenen Enzyms gegenüber dem in Lösung befindlichen Produkt ist beachtlich. Wie in Fig. 2 und 3 wiedergegeben, weist das erfindungsgemäß stabilisierte Enzym eine Halbwertszeit von etwa 68 Tagen bei 37°C auf und 6% seiner Aktivität sind noch nach mehr als einem Jahr bei dieser Temperatur vorhanden. Im Vergleich dazu beträgt die Halbwertzeit einer teilweise gereinigten Enzymlösung nach Wiederaufnahme der Ammoniumsulfatfällung unter gleichen Bedingungen nur 5 Stunden. Die enzymatische Aktivität wurde jeweils bestimmt durch die erhaltene Menge an Strictosidin durch Kondensation von Tryptamin mit Secologanin in Gegenwart des Enzyms.

Bai 4°C fällt die Aktivität des teilweise gereinigten Enzyms in Lösung innerhalb weniger Stunden fast vollständig ab, während das gebundene Enzym nach einer Lagerzeit von mehr als 2 Jahren noch 45% seiner Anfangsaktivität aufweist.

Die Erfindung wird nun anhand der Beispiele noch näher erläutert.

Wie bereits beschrieben, wird eine Suspension von catharantus-roseus-Zellen bei 24°C 7 Tage auf einem Linsmaier-Skoog-Medium, das 60 Mikromol 2,3-Dimethylphenoxyessigsäure als Hormon enthält, belasten, um das Enzym zu bilden. Zur vorübergehenden Lagerung bei -20⁰C werden die Zellen abfiltriert und mit flüssigem Stickstoff gefroren.

635 g der gefrorenen Zellen werden in 1300 ml 100 mM Natriumphosphat-Pufferlösung pH 7, enthaltend 20 mM Mercaptoethanol, unter Rühren eingebracht. Die Suspension wird dann durch Filtertuch filtriert und 20 Minuten bei 27 000 xg zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird mit Ammonsulfat versetzt (35% Sättigung) und 30 Minuten gerührt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert. Zur überstehenden klären Lösung wird nochmals Ammoniumsulfat hinzugefügt bis zur 50%-igen Sättigung und nach 30 Minuten erneut zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird verworfen. Die vereinigten Niederschläge werden in 86 ml 50 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7), enthaltend 20 mM Mercaptoethanol, aufgenommen und gegen 100-fachen Überschuß dieses Puffers dialysiert. Nach der Dialyse werden die unlöslich gebliebenen Proteinbestandteile durch Zentrifugieren entfernt und rter Enzymlösung Glycerin in einer solchen Menge zugesetzt, daß die Konzentration des Glycerins 5 Gew.-% beträgt. Die erhaltene Lösung wird dann der Gelfiltration unterworfen.

Kolonnenmaterial

5 χ 100 cm, Geschwindigkeit 80 ml pro Stunde.

Es wurden 16D Fraktionen von jeweils 16 ml gewonnen. Die Fraktionen 70-92 enthalten Strictosidin-Synthase. Die erhaltenen Fraktionen (355 ml) wurden vereinigt und mittels Ultrafiltration auf 20 ml eingeengt. Dadurch wird eine Anreicherung um das 15-fache erreicht. Die Enzym-Ausbeute beträgt 84,3 mg Protein (80%) mit einer Aktivität von 202,7 nkat.

10 ml der zuvor erhaltenen Enzymlösung wurden während 12 Stunden gegen einen Überschuß von 0,1 M NaHCO₃ PufTer (8,5) dialysiert. Der Puffer enthält noch 0,5 M NaCl.

2 g CNBr-aktivierte Sepharose wurden mit 400 ml 1 mM HCl gewaschen und die Säure abgesaugt, Das Gel wurde mit Wasser nachgewaschen und in der Enzymlösung suspendiert. Für die Absorption sind 2 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren ausreichend. Das Gel wird anschließend auf einem Fiiter gesammelt und mit dem 3-fachen Gelvolumen 0,1 M NaHCO₃-Pufferlösung (pH 8,5), enthaltend 0,5 M NaCl, gewaschen. Anschließend wird das Gel in 16 ml 0,1 M Tris-HCl-Lösung (pH 8,0) suspend^:ert und unter Rühren 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Die überstehende Lösung wird dann entfernt und das Gel gewaschen mit dem 3-fachen Gelvolumen der zuvor angegebenen 0,1 M NaHCO₃-Pufferlösung. Danach wird gewaschen mit0,l M Citrat-PufTer (pH 3,8), ebenfalls 0,5 M NaCl enthaltend. Das Waschen wird vervollständigt mit dem 3-fachen

Gel volumen von 0,1 M Phosphat-PufTer (pH 6,5).

Zur Bestimmung der Aktivität der gebundenen Strictosidin-Synthase wurde ein aliquoter Teil des Gels in den Phosphatpuffer suspendiert und die enzymatische Aktivität bestimmt durch Synthese von Strirtosidin aus Tryptamin und Secologanin. Die mittlere Aktivität der Enzym-Matrix betrug 40%. Das gebundene Enzym wird bei 4⁰C gelagert und erhält einen Zusatz von 0,02% Natriumazid zur Konservierung.

Die Aktivität des gebundenen Enzyms wurde bestimmt durch Einbringen einer bestimmten Menge von Enzym (üblicherweise 10 pkat) der gebundenen Matrix mit ³H-markiertem Tryptamin und Secologanin bei pH 6,5 und Messung der entwickelten Menge von ³HOH. Dieses Verfahren ist von J. Treimer und M. H. Zenk im Eur. Journal of Biochemistry 101, 225 (1979) detailliert beschrieben.

Verwendung des erfindungsgemäß stabilisierten Enzyms zur Herstellung von Strictosidin

Eine Glaskolonne (1 χ 6 cm) wurde mit 2 g Sepharose gefüllt, die etwa 40 nkat gebundene Strictosidin-Synthase enthält. Das Gel wurde mit Wasser durchgewaschen. Wäßrige ungepufferte Lösung von 15 Millimol Tryptamin-Hydrochlorid und Secologanin wurden separat hergestellt. Die Substrate wurden mit Säuren oder !5 Basen auf pH 6,5 eingestellt. Beide Lösungen wurden der Kolonne getrennt zugeführt mit einer Geschwindigkeit von 3 ml pro Stunde. Die Kolonne wurde auf einer Temperatur von 37°C gehalten. Die Lösungen wurden im Kolonnenkopf gemischt und abschließend über den Katalysator geleitet. Eine chemische Reaktion der Einzelkomponenten wurde durch die Maßnahme wie von A. R. Battersby et al. im Journal Chemical Society (C) 1193 (!969) beschrieben, vermieden. Dadurch ist sichergestellt, daß nur das biologisch aktive .Stereoisomer 3a(S)-Strictosidin und nicht das 3jS(R)-Vincosid gewonnen werden kann.

Die Kolonne wurde eluiert und die während 12 Stunden gesammelten Fraktionen chromatographisch auf gebildete Produkte geprüft. Zusätzlich wurde die Kondensationsreaktion überwacht durch Verwendung eines ¹⁴C-markierten Tryptamins. Unter den beschriebenen Bedingungen wurde mehr als 95% Umsatz erreicht. Die Kolonne wurde kontinuierlich bei 37°C für 12 Tage betrieben. Während dieser Zeit wurde keine Veränderung der Umsetzungsgeschwindigkeit und des Umsetzungsgrades festgestellt. Alle 3 Tage wurde die Kolonne gewaschen mit einer Lösung von 0,02% Natriumazid für 8 Stunden, um Bakterienwachstum zu vermeiden. Das aus der Kolonne gewonnene Eluat wurde gefriergetrocknet und es wurden insgesamt 6 g synthetisiertes Strictosidin erhalten.

Das Produkt wurde auf Anteile an 3jS-Epimer-Vincosid geprüft. Es wurde kein Vincosid gefunden. Durch die mit dem erfindungsgemäßen Produkt katalysierte Umsetzung wurde spezifisch nur das 3a(S)-Epimer, Strictosidin gebildet.

Das UV-Spektrum der isolierten Verbindung:

/C?" nm: 289, 280, 272, 225.
Nach Acetylierung wurde ein UV-Spektrum erhalten:

/iJ_a ^e?^Hnm: 289,281,272,225.
Die MS- und IR-Werte sind folgende:

740(M⁺,6), 698(15), 697(32), 409(9), 394(12), 392(6), 377(6), 374(6), 373(6), 349(16), 333(6), 331(6), 323(13), 322(10), 321(10), 320(9), 297(6), 291 (7), 290(6), 279(7), 265(10), 264(10), 252(6), 251(6),
227(15), 226(12), 216(6), 215(6), 214(38), 213(100), 185(10), 184(9), 183(7), 172(7), 171(46), 170(15), 169(49), 168(7), 167(6), 165(10) 157(12), 156(7), 155(6), 154(7), 145(10), 144(10), 143(7), 140(9),

139(7), 137(17), 115(22), 110(6), 109(29).

IR v™ cm"':

3360 (Br, NH), 1755(C = O), 1700(C = C), 1630, 1425, 1370, 1220, 1060, 1035.

Auch die nach Umsetzung in das Lactam-Tetraacetat erhaltenen analytischen Werte stimmen mit denen in der Literatur für dieses Derivat beschriebenen Weiten überein, so daß die Identität des 3e(S)-Strictosidin gesichert ist.

Werte für Lactam-Tetraacetat:

666 (M⁺,7). 335 (6), 331 (7), 319 (9), 289 (6), 271 (5), 267 (4), 266 (7), 265 (11), 264 (4), 236 (4), 235 (7), 211 (7), 171(9), 170(13), 169(100), 149(13), 145(9), 144(15), 143(22), 139(6), 127(26), 109(76).

IR »Si cm"¹:

3360 (br, NH), 1750(C = O), 1655(C = O), 1590(C = C).
CDyCf¹^¹O-If):

201 (-15,5), 238(-5,7), 270(+9,3).

NMR 400 MHz, CDCl₃. TMS = o:

δ 1,23 (3H,s, -OCOMe), 1,87 (3H,s, -OCOMe), 197(3H, s, -OCOMe),2,07 (3H, s, -OCOMe), 7,87(IH, S, -NH),

Das erfindungsgemäße immobilisierte Enzym ist also sehr gut geeignet für die Synthese von Strictosidin aus Tryptamin und Secologanin nach folgendem Reaktionsschema:

MeO₂C

Tryptamin

Secologanin

Strictosidin Synthese

OH

HO

UP™

/1 I CH₂OH

> Ο—J/

+ HOH

MeO₂C

3e(S)-Strictosidin

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Strictosidin-Synthase unter Verwendung von CNBraktivierter Sepharose, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Zellgewebe von caiharanthus roseus Strictosidin-Synthase abtrennt, aus der Lösung mit Ammoniumsulfat ausfallt, den abgetrennten Niederschlag in einer Mercaptoethanol enthaltenden K2Üumphosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7 aufnimmt, einer Dialyse mit 100-fachem Überschuß des Puffers unterwirft, die unlöslichen Proteine abtrennt, der so gereinigten Lösung eine solche Menge an Glycerin hinzufügt, daß dessen Konzentration 5% beträgt, die Lösung einer Gelfiltration unterzieht, die vereinigten Enzymfraktionen durch Ultrafiltration

ίο bis zu einem Proteingehalt von mindestens 3 mg/ml einer hochreinen Enzymlösung aufkonzentriert,

die hochreine aufkonzentrierte Enzymlösung mit einem Überschuß einer 0,5 M NaCl enthaltenden 0,1 M NaHCCVPufTerlösung mit pH 8,5 dialysiert, in der Enzymlösung CNBr-aktivierte Sepharose als Trägermaterial suspendiert, das abfiltrierte Gel dreimal mit der Bikarbonat-Pufferlösung wäscht, anschließend 1 bis 4 Stunden unter Rühren in 0,1 M Tris-HCl-Lösung bei pK 8,0 unter Rühren suspendiert, nach Abtrennen das Gel mit der 0,1 M Bikarbonat· Pufferlösung mit pH 8,5, dann mit 0,5 M NaCl enthaltender 0,1 M Citrat-Pufferlösung von pH 3,8, hierauf mit der dreifachen Menge 0,1 M Phosphat-Pufferlösung von pH 6,5 wäscht und das gebundene Enzym gewinnt.

2. Verwendung der immobilisierten Strictosidin-Synthase des Anspruchs 1 zur Synthese von 3a(S)-Strictosidin durch Kondensation von Tryptamin mit Secologanin.