DE60100642T2

DE60100642T2 - Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit einem hohen Gehalt an 2-O-Alpha-D-Glucopyranosyl-L-ascorbicsäure

Info

Publication number: DE60100642T2
Application number: DE60100642T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Okayama-shi Yamasaki; Koichi Okayama-shi Nishi; Toshio Okayama-shi Miyake
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 2000-06-08
Filing date: 2001-06-08
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2021-06-09
Also published as: US20010051711A1; EP1162205A2; EP1162205A3; KR20010111053A; TWI295294B; EP1162205B1; DE60100642D1; KR100776895B1; US6576446B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit einem hohen Gehalt an 2-O-α-D-Glucopyranosyl-L-ascorbinsäure (nachstehend, wenn nichts anderes angegeben ist, durch "αG-AA" abgekürzt), einer stabilisierten L-Ascorbinsäure.
Beschreibung des Standes der Technik
Wie im japanischen Patent Kokai Nr. 183,492/91 offenbart, weist αG-AA bekanntermaßen folgende zufriedenstellende physikalisch-chemische Eigenschaften auf:

(1) Sie zeigt im Wesentlichen keine direkte Reduzierbarkeit, sondern hat eine herausragend hohe Stabilität und verursacht im Gegensatz zu L-Ascorbinsäure selbst in Gegenwart von Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Lipiden, Sacchariden oder physiologisch aktiven Verbindungen keine Maillard-Reaktion und ünerwünschten Reaktionen, nicht einmal deren Stabilisierung;
(2) bei der Hydrolyse bildet sie L-Ascorbinsäure und zeigt dann im Wesentlichen dieselben Reduktions- und Antioxidationswirkungen wie L-Ascorbinsäure;
(3) sie lässt sich in vivo leicht von Enzymen zu L-Ascorbinsäure und D-Glucose hydrolysieren und zeigt die der L-Ascorbinsäure eigenen physiologischen Wirkungen und kann in Kombination die physiologischen Eigenschaften der Vitamine E und P verstärken;
(4) sie ist ausgesprochen sicher, da sie in geringen Mengen natürlich gebildet wird, und wird bei oraler Einnahme in vivo zu L-Ascorbinsäure und einer Verbindung, wie einer α-Glucosylsaccharid-Verbindung, metabolisiert;
(5) obwohl αG-AA in kristalliner Form nicht oder im Wesentlichen nicht hygroskopisch ist, hat sie eine relativ hohe Lösungsgeschwindigkeit und Löslichkeit in Wasser, und kann somit vorteilhaft als Mittel zur Anreicherung mit Vitamin C, Geschmacksverstärker, Säuerungsmittel oder Stabilisator für Vitaminpräparate in Form von Pulvern, Granulaten oder Tabletten, aber auch in 'Lebensmitteln und Getränken, wie Sandwich Cremes, Schokolade, Kaugummi, Instantsäften und Instantgewürze, verwendet werden; und
(6) sie zeigt eine zufriedenstellende Handhabung, da αG-AA in kristalliner Form nicht oder im Wesentlichen nicht hygroskopisch ist und die freifließende Eigenschaft ohne Zusammenbacken auch während der Lagerung bewahrt. Im Vergleich zu αG-AA in einer nicht kristallinen Form können mit αG-AA in kristalliner Form die Material- und Arbeitskosten für Verpackung, Transport und Lagerung erheblich gesenkt werden.

αG-AA kommt bereits im Kosmetikbereich in großem Umfang zum Einsatz und wird versuchsweise auch in anderen Bereichen, wie Lebensmittelerzeugnissen, Arzneimitteln, Futtermitteln, Haustierfutter und industriellen Werkstoffen, eingesetzt.
Zu repräsentativen Beispielen für industrielle Verfahren zur Herstellung von αG-AA gehört beispielsweise ein Verfahren, das im japanischen Patent Kokai Nr. 183,492/91 offenbart ist. Das in 1 dargestellte Verfahren umfasst die Schritte des Inberührungbringens einer Lösung mit L-Ascorbinsäure und einer α-Glucosylsaccharid-Verbindung(en) mit einer Saccharid-Transferase oder einer Glucoamylase (EC 3.2.1.3) zur Bildung von αG-AA, um eine Lösung mit αG-AA, intakter L-Ascorbinsäure, α-Glucosylsaccharid-Verbindung(en) und anderen Sacchariden zu erhalten, die aus der/den α-Glucosylsaccharid-Verbindung(en) produziert werden, des Filterns der gebildeten Lösung, des Entfernens von Mineralstoffen aus dem Filtrat, indem das Filtrat einer Säulenchromatographie mit einem Kationenaustauscherharz (H-Form) unterworfen wird, des Durchführens einer Säulenchromatographie mit der entmineralisierten Lösung und einem Anionenaustauscherharz zur Adsorption von αG-AA und L-Ascorbinsäure an das Anionenaustauscherharz, des Auswaschens des Anionenaustauscherharzes mit Wasser zum Entfernen von Sacchariden aus der Säule, des Eluierens der αG-AA und der L-Ascorbinsäure vom Anionenaustauscherharz, des Konzentrierens des Eluats, des Durchführens einer Säulenchromatographie mit dem Konzentrat unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes zur Fraktionierung in eine an αG-AA reiche Fraktion und eine an L-Ascorbinsäure reiche Fraktion und des Konzentrierens der ersteren Fraktion zu einem Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt.
Bei der vorstehend beschriebenen Säulenchromatographie mit einem Anionenaustauscherharz werden αG-AA und L-Ascorbinsäure gleichzeitig vom Harz desorbiert, was eine Mischung aus αG-AA und L-Ascorbinsäure ergibt. Um ein Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt zu erhalten, müssen Lösungen mit αG-AA und L-Ascorbinsäure zwangsläufig zuerst konzentriert und dann in eine an αG-AA reiche Fraktion und eine an L-Ascorbinsäure reiche Fraktion getrennt werden.
Das japanische Patent Nr. 6228183 offenbart ein Verfahren zur Reinigung eines Saccharidderivats der L-Ascorbinsäure. Dieses Verfahren umfasst die Behandlung einer Lösung mit einem Derivat, an dessen 6. Position der L-Ascorbinsäure Saccharide gebunden sind, das durch eine enzymatische Reaktion, eine mikrobielle Zellreaktion oder eine chemische organische Reaktion mit einem stark alkalischen Anionenaustauscherharz vom C1^–-Typ synthetisiert wurde.
Wie oben beschrieben sind bei herkömmlichen Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit hohem αG-AA-Gehalt zwangsläufig zwei Schritte mit Säulenchromatographie unter Einsatz eines Anionenaustauscherharzes und eines Kationenaustauscherharzes erforderlich, und das Eluat der Säulenchromatographie mit dem Anionenaustauscherharz sollte vor der Verwendung in der Säulenchromatographie mit dem Kationenaustauscherharz zuerst konzentriert werden, was aufgrund der komplizierten Herstellung von αG-AA, der geringen Ausbeute an Produkten mit hohem αG-AA-Gehalt und der hohen Produktionskosten mit Nachteilen verbunden ist.
Unter diesen Umständen besteht ein dringender Bedarf nach einer Produktion von Produkten mit hohem αG-AA-Gehalt mit einer relativ hohen Qualität und zufriedenstellender Verarbeitbarkeit und Ausbeute sowie zufriedenstellenden Produktionskosten im industriellen Maßstab.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Produktion von Produkten mit hohem αG-AA-Gehalt mit einer relativ hohen Qualität und zufriedenstellender Verarbeitbarkeit und Ausbeute sowie zufriedenstellenden Produktionskosten im industriellen Maßstab. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Produkt (e) mit hohem αG-AA-Gehalt" bedeutet Produkt (e) mit hohem αG-AA-Gehalt, die wenigstens 80 Gew.-% αG-AA ("Gew.-%" kann nachstehend durch "°" abgekürzt sein), bezogen auf das Trockengewicht (TG), vorzugsweise wenigstens 90%, enthalten und die die Form einer Flüssigkeit, einer Paste, eines Feststoffs oder eines Pulvers annehmen können.
Angesichts der vorstehenden Ausführungen setzten die Erfinder ihre Untersuchungen hinsichtlich einfacherer Verfahren zur Herstellung von Produkten mit hohem αG-AA-Gehalt fort, indem sie eine Lösung mit αG-AA und L-Ascorbinsäure mit einem in eine Säule gepackten Anionenaustauscherharz in Berührung brachten. Dabei stellten sie fest, dass die Aufgabe durch Verwenden eines Anionenaustauscherharzes als ein in eine Säule gepacktes Anionenaustauscherharz, Adsorbierenlassen von αG-AA und L-Ascorbinsäure an das Anionenaustauscherharz, Einbringen einer wässrigen Lösung einer Säure und/oder eines Salzes mit einer Konzentration von weniger als 0,5 N als Laufmittel in die Säule zur Fraktionierung in eine an αG-AA reiche Fraktion und eine an L-Ascorbinsäure reiche Fraktion und Sammeln der ersteren Fraktion gelöst werden kann.
Wie aus 2 ersichtlich ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit einem hohen αG-AA-Gehalt dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte des Einwirkenlassens einer Saccharid-Transferase mit oder ohne Glucoamylase auf eine Lösung mit L-Ascorbinsäure und einer α-Glucosylsaccharid-Verbindung(en) umfasst, um eine Lösung mit αG-AA, L-Ascorbinsäure und Sacchariden zu erhalten, des Filterns der Lösung, des Entmineralisierens des Filtrats, des Inberührungbringens der entmineralisierten Lösung als Materiallösung mit einem in eine Säule gepackten Anionenaustauscherharz zur Adsorption von αG-AA und L-Ascorbinsäure an das Harz, des Auswaschens des Harzes mit Wasser zum Entfernen des/der Saccharids/e aus der Säule, des Einbringens einer wässrigen Lösung einer Säure und/oder eines Salzes in einer Konzentration von weniger als 0,5 N zur Fraktionierung einer an αG-AA reichen Fraktion und einer an L-Ascorbinsäure reichen Fraktion und des Konzentrierens der ersteren Fraktion zum Erhalt eines Produkts mit hohem αG-AA-Gehalt. Erfindungsgemäß können αG-AA und L-Ascorbinsäure durch eine Säulenchromatographie mit Hilfe eines Anionenaustauscherharzes getrennt werden, was zu einer Neutralisierung der Säulenchromatographie mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz führt, die auf jeden Fall bei der herkömmlichen Herstellung gemäß 1 verwendet wird. Somit können Produkte relativ hoher Qualität, die reich an αG-AA sind, mit vorteilhafter Verarbeitbarkeit, Wirtschaftlichkeit und Ausbeute im industriellen Maßstab hergestellt werden.
Kurze Beschreibung der beiliegenden Zeichnung
1 ist ein Ablaufdiagramm eines herkömmlichen Verfahrens zur Herstellung eines Produkts mit hohem αG-AA-Gehalt.
2 ist ein Ablaufdiagramm des vorliegenden Verfahrens zur Herstellung eines Produkts mit hohem αG-AA-Gehalt.
3 ist eine Elutionskurve der Konzentrationsverteilung, die durch Auftragen der Feststoffkonzentration der Bestandteile αG-AA und L-Ascorbinsäure, die aus einer mit "AMBERLITE IRR411S (OH-Form)", einem Anionenaustauscherharz, das von Rohm & Haas Co., USA, erhältlich ist, gepackten Säule mit Hilfe von 0,1 N wässriger Salzsäurelösung als Laufmittel eluiert wurden, aufgezeichnet wurde.
4 ist eine Elutionskurve der Konzentrationsverteilung, die durch Auftragen der Feststoffkonzentration der Bestandteile αG-AA und L-Ascorbinsäure, die aus einer mit "AMBERLITE IRA411S (OH-Form)", einem Anionenaustauscherharz, das von Rohm & Haas Co., USA, erhältlich ist, gepackten Säule mit Hilfe von 0,5 N wässriger Salzsäurelösung als Laufmittel eluiert wurden, aufgezeichnet wurde.
5 ist eine Elutionskurve der Konzentrationsverteilung, die durch Auftragen der Feststoffkonzentration der Bestandteile αG-AA und L-Ascorbinsäure, die aus einer mit "AMBERLITE IRA411S (OH-Form)", einem Anionenaustauscher, der von Rohm & Haas Co., USA, erhältlich ist, gepackten Säule mit Hilfe von 0,25 N wässriger Salzsäurelösung als Laufmittel eluiert wurden, aufgezeichnet wurde.
6 ist eine Elutionskurve der Konzentrationsverteilung, die durch Auftragen der Feststoffkonzentration der Bestandteile αG-AA und L-Ascorbinsäure, die aus einer mit "DIAION (OH-Form)", einem Anionenaustauscher, der von Mitsubishi Chemical Co., Tokio, Japan, erhältlich ist, gepackten Säule mit Hilfe von 0,25 N wässriger Salzsäurelösung als Laufmittel eluiert wurden, aufgezeichnet wurde.
Erklärung der Symbole
Die Symbole "o", "•", und "Δ" bedeuten "αG-AA", "L-Ascorbinsäure" bzw. "Saccharide".
Genaue Beschreibung der Erfindung
Als Erklärung der Materiallösungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sei angeführt, dass es sich hierbei um wässrige Lösungen mit αG-AA, L-Ascorbinsäure und einem Saccharid(en) handelt. Das Verfahren zur Herstellung der Materiallösungen sollte nicht auf bestimmte Verfahren beschränkt sein, unabhängig davon, ob es sich um enzymatische oder synthetische Verfahren handelt, sofern Lösungen mit αG-AA, L-Ascorbinsäure und einem Saccharid(en) bereitgestellt werden. Als veranschaulichendes Beispiel für ein solches Verfahren, das einen Schritt des Einwirkenlassens einer Saccharid-Transferase mit oder ohne Glucoamylase auf eine Lösung mit L-Ascorbinsäure und einer α-Glucosylsaccharid- Verbindung(en) umfasst, sei beispielsweise das im japanischen Patent Kokai Nr. 183,492/91 offenbarte Verfahren genannt.
Die erfindungsgemäß bevorzugt verwendeten Materiallösungen haben eine Feststoffkonzentration von gewöhnlich 1–75 Gew./Vol.-%, vorzugsweise 10-70 Gew./Vol.-%, besonders bevorzugt 20–60 Gew./Vol.-% und am meisten bevorzugt 30–40 Gew./Vol.-%. Da L-Ascorbinsäure unter alkalischen Bedingungen zum Zersetzen neigt, sollten die Materiallösungen vorzugsweise auf saure pH-Werte eingestellt sein, in der Regel auf einen pH von weniger als 7, vorzugsweise auf einen pH von 1,0–6,5, besonders bevorzugt auf einen pH von 1,5–6,0. Vor dem Inberührungbringen der Materiallösungen mit Anionenaustauscherharzen sollten Verunreinigungen, wie Anionen, organische Säuren und Aminosäuren, die in den Materiallösungen vorhanden sind, wegen der Verwendung von Anionenaustauscherharzen (OH-Form) entfernt oder so weit wie möglich reduziert werden.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "L-Ascorbinsäure" bedeutet in der Regel freie L-Ascorbinsäure und kann L-Ascorbate, wie Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze der L-Ascorbinsäure, einschließen. Die in der erfindungsgemäßen Saccharid-Übertragungsreaktion verwendete L-Ascorbinsäure umfasst nicht nur freie L-Ascorbinsäure, sondern auch L-Ascorbate, wie Natrium-L-ascorbat, Calcium-L-ascorbat und Mischungen davon, sofern diese die vorliegende Erfindung nicht behindern. Außerdem bedeutet der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "αG-AA" nicht nur die freie Säure, sondern auch deren Salze, sofern diese die vorliegende Erfindung nicht behindern.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "α-Glucosylsaccharid Verbindung(en)" bedeutet die Verbindungen, die α-Glycosyl-L-ascorbinsäure, einschließlich αG-AA, bilden können und die aus äquimolaren oder mehr α-D-Glucosylrestgruppen bestehen, die aufgrund der Wirkung einer Saccharid-Transferase an L-Ascorbinsäure gebunden sind. Zu Beispielen für derartige α-Glucosylsaccharid-Verbindungen gehören Maltooligosaccharide, wie Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose und Maltooctaose, partielle Stärkehydrolysate, wie Dextrine, Cyclodextrine und Amylose und andere derartig verflüssigte Stärken, gelatinierte Stärken und lösliche Stärken. Zur Vereinfachung der αG-AA-Bildung sollten vorzugsweise α-Glucosylsaccharid-Verbindungen gewählt werden, die für die verwendete Saccharid-Transferase geeignet sind. Wird beispielsweise α-Glucosidase (EC 3.2.1.20) als Saccharid-Transferase verwendet, können vorzugsweise Maltooligosaccharide, wie Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose und Maltooctaose, Dextrine mit einem DE (Dextrose-Äquivalent) von etwa 50–60 und partielle Stärkehydrolysate als α-Glucosylsaccharid-Verbindungen verwendet werden. Wenn Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase (EC 2.4.1.19) als Saccharid-Transferase verwendet wird, werden vorzugsweise Cyclodextrine und partielle Stärkehydrolysate, wie gelatinierte Stärken und Dextrine mit einem DE von weniger als etwa 60, verwendet. Wenn α-Amylase (EC 3.2.1.1) als Saccharid-Transferase verwendet wird, werden vorzugsweise Cyclodextrine und partielle Stärkehydrolysate, wie gelatinierte Stärken und Dextrine mit einem DE von weniger als 1 bis etwa 30, verwendet.
Die Konzentration (Gew./Vol.-%) von L-Ascorbinsäure in der vorstehend beschriebenen enzymatischen Saccharid-Übertragungsreaktion beträgt in der Regel wenigstens 1 Gew./Vol.-%, vorzugsweise etwa 2–30 Gew./Vol.-%, wohingegen die bevorzugte Konzentration einer α- Glucosylsaccharid-Verbindung in der Regel etwa 0,5–30 Mal die der verwendeten L-Ascorbinsäure ausmacht.
Erfindungsgemäß kann jede Saccharid-Transferase ungeachtet ihrer Eigenschaften, ihrer Merkmale und ihres Ursprungs verwendet werden, sofern sie nach Einwirken auf eine wässrige Lösung mit L-Ascorbinsäure und einer α-Glucosylsaccharid-Verbindungen) eine α-Glycosyl-L-ascorbinsäure, wie αG-AA, bildet, wobei wenigstens eine α-Glucosylrestgruppe auf die Alkoholgruppe an der C-2-Position der L-Ascorbinsäure ohne Zersetzung der L-Ascorbinsäure übertragen wird. Die erfindungsgemäß als Saccharid-Transferasen geeigneten α-Glucosidasen umfassen beispielsweise diejenigen tierischen Ursprungs, wie solche aus Mäusenieren, Rattendarmschleimhaut und dem Dünndarm von Hunden und Schweinen, pflanzlichen Ursprungs, wie solche aus Reissamen und Maissamen, und bakteriellen Ursprungs, wie solche aus Pilzen der Gattungen Mucor und Penicillium und Hefen der Gattung Saccharomyces. Zu Beispielen für andere Saccharid-Transferasen, das heißt, Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase, gehören diejenigen bakteriellen Ursprungs der Gattungen Bacillus und Klebsiella, wohingegen zu Beispielen für andere Saccharid-Transferasen, das heißt α-Amylasen, solche bakteriellen Ursprungs der Gattung Bacillus gehören.
Diese Saccharid-Transferasen müssen nicht unbedingt in gereinigter Form vorliegen, erfindungsgemäß lassen sich auch nicht aufbereitete Formen verwenden. Solche nicht aufbereiteten Enzyme sollten jedoch vorzugsweise vor der Verwendung mit herkömmlichen Verfahren gereinigt werden. Erfindungsgemäß können im Handel erhältliche Saccharid-Transferasen verwendet werden. Bei der Verwendung können die vorstehend beschriebenen Enzyme beliebig auch in immobilisierter Form verwendet werden. Erfindungsgemäß kann jeder pH und jede Temperatur für die enzymatische Saccharid-Übertragungsreaktion verwendet werden, sofern die Saccharid-Transferasen auf die L-Ascorbinsäure und die α-Glucosylsaccharid-Verbindungen zur Bildung von αG-AA einwirken. Normalerweise wird ein pH von 3–9, vorzugsweise ein pH von 4–7, und eine Temperatur von etwa 20°C bis 80°C gewählt. Da die Menge der verwendeten Enzyme und die Reaktionszeit der enzymatischen Reaktion in direktem Zusammenhang stehen, wird die Enzymmenge in der Regel im vorstehend genannten Bereich gewählt, damit die enzymatische Reaktion aus wirtschaftlichen Gründen innerhalb von etwa 3–80 Stunden abgeschlossen ist. In immobilisierter Form können Saccharid-Transferasen vorteilhaft chargenweise oder fortlaufend verwendet werden.
Während der enzymatischen Reaktion neigt L-Ascorbinsäure zur Zersetzung durch Sauerstoff, der im Reaktionssystem vorhanden ist; sie sollte vorzugsweise unter Bedingungen mit wenig oder gar keinem Sauerstoff oder unter Reduktionsbedingungen aufbewahrt werden, falls erforderlich können vorzugsweise Thioharnstoff und Sulfite vorhanden sein. Da L-Ascorbinsäure zur Zersetzung durch Licht neigt, sollte die Reaktion vorzugsweise im Dunkeln oder vor Licht geschützt durchgeführt werden.
Falls erforderlich kann α-Glycosyl-L-ascorbinsäure mit αG-AA durch die Gegenwart von Mikroorganismen mit Saccharid übertragenden Fähigkeiten in einem Nährmedium mit L-Ascorbinsäure und α-Glucosylsaccharid-Verbindungen gebildet werden.
Die durch die Einwirkung einer Saccharid-Transferase gebildete α-Glycosyl-L-ascorbinsäure ist eine Verbindung mit einer oder mehreren α-D-Glucosyl-Restgruppen, die an die Alkoholgruppe der C-2-Position der L-Ascorbinsäure gebunden sind. Die Anzahl der α-D-Glucosyl-Restgruppen die über die α-1,4-Bindung gebunden sind, beträgt üblicherweise zwei bis sieben.
Beispiele für derartige α-Glycosyl-L-ascorbinsäuren sind αG-AA, 2-O-α-D-Maltosyl-L-ascorbinsäure, 2-O-α-D-Maltotriosyl-L-ascorbinsäure, 2-O-α-D-Maltotetraosyl-Lascorbinsäure, 2-O-α-D-Maltopentaosyl-L-ascorbinsäure, 2-O-α-D-Maltohexaosyl-L-ascorbinsäure und 2-O-α-D-Maltoheptaosyl-L-ascorbinsäure. Wenn α-Glycosyl-Lascorbinsäure mit Hilfe von α-Glucosidase erzeugt wird, wird in der Regel nur αG-AA gebildet. In Abhängigkeit von den verwendeten Saccharid-Transferasen und den Reaktionsbedingungen können zusammen mit αG-AA auch α-Glycosyl-L-ascorbinsäuren, wie 2-O-α-D-Maltosyl-Lascorbinsäure und 2-O-α-D-Maltotriosyl-L-ascorbinsäure, gebildet werden.
Wenn zur Bildung von α-Glycosyl-L-ascorbinsäuren Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase oder α-Amylase eingesetzt wird, können zusammen mit αG-AA α-Glycosyl-L-ascorbinsäuren gebildet werden, die mehr α-D-Glucosyl-Restgruppen aufweisen als die, die mit α-Glucosidase gebildet werden. Im Allgemeinen werden bei der Verwendung von Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase α-Glycosyl-L-ascorbinsäuren gebildet, die eine bis sieben an die L-Ascorbinsäure gebundene α-D-Glucosyl-Restgruppen enthalten, während im Falle der Verwendung von α-Amylase eher α-Glycosyl-L-ascorbinsäuren geringeren Typs gebildet werden.
Die gemeinsame Verwendung einer Saccharid-Transferase und einer Glucoamylase zu Bildung von αG-AA kann die αG-AA-Ausbeute erhöhen. Um den Wirkungsgrad der Saccharid-Transferase-Reaktion zu erhöhen, lässt man die Saccharid-Transferase im Allgemeinen vorzugsweise erst auf die L-Ascorbinsäure und eine α-Glucosylsaccharid-Verbindung en) einwirken, wobei äquimolare oder mehr α-D-Glucosyl-Restgruppen zur L-Ascorbinsäure übertragen werden und ein Gemisch aus α-Glycosyl-L-ascorbinsäuren und αG-AA gebildet wird, wonach man die Glucoamylase auf das gebildete Gemisch zur Hydrolysierung der α-D-Glucosyl-Restgruppen einwirken lässt, die an die α-Glycosyl-L-ascorbinsäuren abgesehen von αG-AA gebunden sind, um αG-AA zu bilden und anzusammeln.
Die erfindungsgemäß verwendete Glucoamylase umfasst jene pflanzlichen und tierischen Ursprungs und die von Mikroorganismen abgeleitet. In der Regel lassen sich vorteilhaft im Handel erhältliche Glucoamylasen von Bakterien der Gattungen Aspergillus und Rhizopus verwenden. In diesem Fall kann beliebig eine β-Amylase (EC 3.2.1.2) zusammen mit solchen Glucoamylasen verwendet werden.
Als Erklärung der Anionenaustauscherharze zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sei angeführt, dass jedes solcher Harze in Gelform, makroretikulärer Form (MR-Form) oder mit makroporöser Struktur als Mutterstruktur und jedes stark oder schwach alkalische Anionenaustauscherharz aus Styrol (Styroldivinylbenzol-Copolymer) und Acryl als Grundmaterial verwendet werden kann. Erfindungsgemäß kann jedes stark alkalische (Typ I und II), neutrale oder schwach alkalische Anionenaustauscherharz verwendet werden, sofern es Anionen absorbieren kann. Beispiele für solche im Handel erhältlichen Anionenaustauscher sind "AMBERLITE IRA67", "AMBERLITE IRA96SB", "AMBERLITE IRA400", "AMBERLITE IRA401B", "AMBERLITE IRA402", "AMBERLITE IRA402BL", "AMBERLITE IRA410", "AMBERLITE IRA411S", "AMBERLITE IRA440B", "AMBERLITE IRA458RF", "AMBERLITE IRA473", "AMBERLITE IRA478RF", "AMBERLITE IRA900", "AMBERLITE IRA904", "AMBERLITE IRA910CT", "AMBERLITE IRA958", "AMBERLITE XT5007", "AMBERLITE XT6050RF", "AMBERLITE XE583" und "AMBERLITE CG400", die alle von Rohm & Haas Co., Pennsylvania, USA, erhältlich sind, und "DIAION SA10A", "DIAION SA11A", "DIAION SA12A", "DIAION SA20A", "DIAION SA21A", "DIAION NSA100", "DIAION PA308", "DIAION PA312", "DIAION PA316", "DIAION PA408", "DIAION PA412", "DIAION PA418", "DIAION HPA25", "DIAION HPA75", "DIAION WA10", "DIAION WA20", "DIAION WA21J", "DIAION WA30" und "DIAION DCA11", die alle von Mitsubishi Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan, erhältlich sind, "DOWEX SBR", "DOWEX SBR-P-C", "DOWEX SAR", "DOWEX MSA-1", "DOWEX MSA-2", "DOWEX MSA-22", "DOWEX MSA-66", "DOWEX MWA-1", "DOWEX MONOSPHERE 550A", "DOWEX MARASON A", "DOWEX MARASON A2", "DOWER 1X2", "DOWEX 1X4", "DOWEX 1X8" und "DOWEX 2X8", die alle von The Dow Chemical Co., Michigan, USA, erhältlich sind. Von diesen Anionenaustauschern können erfindungsgemäß vorzugsweise "AMBERLITE IRA411S", "DIAION WA30", "AMBERLITE IRA478RF" und "AMBERLITE IRA 910CT" verwendet werden, da diese über eine relativ hohe Absorbierbarkeit und Trennbarkeit von αG-AA und L-Ascorbinsäure verfügen. Hinsichtlich der Ionenform der Anionenaustauscherharze eignen sich zweckmäßigerweise die OH-, Cl- und CH₃000-Form. Erfindungsgemäß werden vorteilhaft aufgrund ihrer Absorbierbarkeit solche in der OH-Form verwendet.
Die erfindungsgemäß verwendeten Laufmittel umfassen eine oder mehrere Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und Zitronensäure sowie deren wässrige Lösungen, und ein oder mehrere Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulfat, Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Natriumcitrat und Kaliumcitrat sowie deren wässrige Lösungen. Eine/s oder mehrere der vorstehend genannten Säuren und Salze können auch in einer passenden Kombination verwendet werden. Bei der Verwendung von wässrigen Salzlösungen als Laufmittel liegt αG-AA in den Eluaten, die desorbiert und aus mit Anionenaustauschern gepackten Säulen eluiert wurden, im Allgemeinen in Salzform vor. Falls erforderlich kann eine solche αG-AA mit Hilfe von Kationenaustauschern (H-Form) entmineralisiert und in die Form der freien Säure αG-AA umgewandelt werden. Bei der Verwendung von wässrigen Säurelösungen als Laufmittel liegt die αG-AA in den Eluaten, die desorbiert und aus mit Anionenaustauschern gepackten Säulen eluiert wurden, im Allgemeinen in Form der freien Säure vor. Von den wässrigen Säurelösungen, die erfindungsgemäß als Laufmittel verwendet werden, können aus wirtschaftlichen Gründen und aufgrund der einfachen Regeneration der Anionenaustauscherharze vorteilhaft wässrige Lösungen von Salzsäure verwendet werden. Die Konzentration der als Laufmittel verwendeten wässrigen Säure- und Salzlösungen muss nicht unbedingt auf einen festen Wert festgelegt werden, sondern kann, falls erforderlich, schrittweise oder linear wie bei der Gradienteneluierung verändert werden. Laufmittel, die für das Desorbieren und Eluieren von αG-AA und L-Ascorbinsäure verwendet wurden, können, um die Produktionskosten zu senken, wiedergewonnen und erneut verwendet werden.
Das Verfahren zur Herstellung von Produkten mit hohem αG-AA-Gehalt mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Materiallösungen, Anionenaustauscherharze und Eluate läuft wie folgt ab: Wie vorstehend beschrieben enthalten die erfindungsgemäß verwendeten Materiallösungen in der Regel αG-AA, L-Ascorbinsäure und α-Glucosylsaccharid-Verbindungen sowie α-Glucosylsaccharid-Verbindungen, D-Glucose aus α-Glucosylsaccharid-Verbindungen, Saccharide, wie Hydrolysate der α-Glucosylsaccharid-Verbindungen, und Salze. Somit werden die Materiallösungen zunächst filtriert und dann mit Hilfe von Kationenaustauscherharzen (H-Form) mit und ohne Aktivkohle entmineralisiert. Die entmineralisierten Lösungen werden mit in Säulen gepackten Anionenaustauscherharzen in Berührung gebracht, um αG-AA und L-Ascorbinsäure daran zu absorbieren, gefolgt von einem Auswaschen der Säulen mit Wasser zum Entfernen der Saccharide, Einbringen von wässrigen Lösungen von Säuren und/oder Salzen in einer Konzentration von weniger als 0,5 N als Laufmittel in die Säulen zur Fraktionierung in eine Fraktion reich an αG-AA und eine Fraktion reich an L-Ascorbinsäure. In diesem Fall können die abgetrennte, intakte L- Ascorbinsäure und die α-Glucosylsaccharid-Verbindungen aus wirtschaftlichen Gründen als Materialien für die nächste Saccharid-Übertragungsreaktion wiederverwendet werden.
Die erfindungsgemäß verwendete Säule kann aus einer oder mehreren Säulen mit passender Form, Größe und Länge entweder seriell in Kaskadenform oder parallel verbunden zusammengesetzt sein. Bei der Verwendung von mehreren Säulen können diese seriell in Kaskadenform angeordnet sein, um eine passende Tiefe des Säulenbetts zu erreichen. Die Durchflussrate beim Einbringen der Materiallösungen auf die Anionenaustauscherharze beträgt vorzugsweise RG (Raumgeschwindigkeit) 5 oder weniger, besonders bevorzugt RG 1–3. Die Durchflussrate beim Einbringen der Laufmittel auf die Anionenaustauscherharze beträgt vorzugsweise RG (Raumgeschwindigkeit) 1 oder weniger, besonders bevorzugt RG 0,3–0,7. Die Reihenfolge, mit der eine an αG-AA reiche Fraktion und eine an L-Ascorbinsäure reiche Fraktion aus den Säulen eluiert wird, kann durch Ändern der Art der verwendeten Anionenaustauscherharze, insbesondere durch Ändern der Mutterstrukturen und funktionellen Gruppen der Anionenaustauscherharze, umgekehrt werden. Die Temperatur während einer Säulenchromatographie liegt normalerweise im Bereich von 0–80°C, vorzugsweise 10–40°C und besonders bevorzugt 15–-25°C, wobei der Einfluss der Temperatur auf die Zersetzung von αG-AA und L-Ascorbinsäure zu beachten ist. Bei der Verwendung von wässrigen Lösungen von Säuren und/oder Salzen in einer Konzentration von wenigstens 0,5 N wird αG-AA sofort und leicht von Anionenaustauscherharzen desorbiert und aus den Säulen eluiert, während L-Ascorbinsäure ebenfalls zusammen mit αG-AA desorbiert und eluiert wird, was zu einer unzureichenden Trennung und Schwierigkeiten beim Erhalten von an αG-AA reichen Fraktionen mit einer relativen hohen Reinheit und Ausbeute führt. Wenn als Laufmittel wässrige Lösungen von Säuren und/oder Salzen in einer Gesamtkonzentration von weniger als 0,5 N, vorzugsweise 0,1–0,45 N und besonders bevorzugt 0,2-0,3 N, verwendet werden, werden αG-AA und L-Ascorbinsäure von Anionenaustauscherharzen in Form ihrer jeweiligen angereicherten Fraktion desorbiert und aus den mit Anionenaustauscherharzen gepackten Säulen eluiert, was zu einer effizienten Trennung und Sammlung der jeweiligen angereicherten Fraktion mit einer zufriedenstellend hohen Ausbeute führt. Mit einer solchen Säulenchromatographie werden auch mit wässrigen Lösungen von Säuren und/oder Salzen in einer Konzentration von weniger als 0,1 N an αG-AA reiche Fraktionen und an L-Ascorbinsäure reiche Fraktionen erzielt, aber die erforderliche Zeit für die Desorption und Elution von αG-AA und L-Ascorbinsäure ist in der Regel länger und die Konzentration der erhaltenen αG-AA in der Regel niedriger.
Nach der Reinigung und Konzentration zu übersättigten Lösungen können an αG-AA reiche Fraktionen, die von in Säulen gepackten Anionenaustauscherharzen desorbiert und eluiert wurden, αG-AA-Kristalle bilden, und somit kann ein Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt in Kristallform erreicht werden. An L-Ascorbinsäure reiche Fraktionen wiederum können als Material für die nächste enzymatische Reaktion zur Bildung von αG-AA wiederverwendet werden. Die Wiederverwendung von gemischten Fraktionen mit unvollständig getrennter αG-AA und L-Ascorbinsäure als eine erfindungsgemäße Materiallösung kann vorteilhaft zum Erzielen von Produkten mit hohem αG-AA-Gehalt und Produkten mit einem hohen Gehalt an L-Ascorbinsäure in relativ hohen Ausbeuten genutzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von αG-AA hat zufriedenstellende Vorteile für die Verarbeitbarkeit und die Produktionskosten und ermöglicht die Herstellung von Produkten mit hohem αG-AA-Gehalt mit zufriedenstellend hoher Qualität und einer Reinheit von wenigstens etwa 90%, bezogen auf das Trockengewicht (TG), bei einer αG-AA-Ausbeute von wenigstens 85%, vorzugsweise wenigstens 90%, bezogen auf die αG-AA in den Materiallösungen.
Die so erhaltenen Produkte mit hohem αG-AA-Gehalt sind stabile Produkte mit einem hohen Gehalt an L-Ascorbinsäure, die beliebig als Mittel zur Anreicherung mit Vitamin C, Stabilisator, Qualitätsverbesserer, Antioxidans, physiologischer Wirkstoff und UV-Absorptionsmittel in den verschiedensten Bereichen, wie Lebensmittelerzeugnisse, Kosmetik, Arzneimittel, Futtermittel, Haustierfutter, industrielle Materialien usw., verwendet werden können.
Die Erfindung wird anhand des folgenden Experiments ausführlicher beschrieben:
Experiment
Einfluss der Konzentration des Laufmittels auf die Trennung und Elution von αG-AA und L-Ascorbinsäure, die an Anionenaustauscherharz adsorbiert sind
2 Gewichtsteile Dextrin (DE etwa sechs) wurden durch Erhitzen in 6 Gewichtsteilen Wasser unter Reduktionsbedingungen gelöst und 1 Gewichtsteil L-Ascorbinsäure in die Lösung eingebracht. Die Mischung wurde bei pH 5,5 und 60°C gehalten und mit 400 Einheiten/g Dextrin Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase, erhältlich von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, versetzt und 24 Stunden lang einer enzymatischen Reaktion unterworfen: Die Reaktionsmischung wurde über eine UF-Membran gefiltert, um restliches Enzym zu entfernen und das Filtrat auf 55°C und pH 5,0 eingestellt, mit 10 Einheiten/g Dextrin Glucoamylase, erhältlich von Seikagaku-Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japan, versetzt und 24 Stunden lang einer enzymatischen Reaktion unterworfen. Die gebildete Reaktionsmischung wurde erhitzt, um restliches Enzym zu inaktivieren, dann entfärbt und über Aktivkohle gefiltert, wonach das erhaltene Filtrat zu einer Konzentration von etwa 40 konzentriert wurde. Die Feststoffzusammensetzung des Konzentrats wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) unter den folgenden Bedingungen analysiert: "LC-6A", HPLC-Gerät erhältlich von Shimadzu Corporation, Tokio, Japan, "STR COLUMN ODS-II", Säule erhältlich von Shimadzu Techno Research Co., Tokio, Japan, 0,02 M NaH₂PO₄-H₃PO₄ (pH 2,0), Laufmittel, 0,5 ml/min Durchflussgeschwindigkeit und "RI-8020", Differenzialrefraktometer erhältlich von Tosho Corporation, Tokio, Japan. Das Ergebnis zeigt eine Feststoffzusammensetzung des Konzentrats von etwa 31 αG-AA, etwa 21% L-Ascorbinsäure, etwa 31% D-Glucose und etwa 17% α-Glucosylsaccharid-Verbindungen. Das vorstehende Filtrat wurde durch Einbringen mit RG 2 in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 20 mm, einer Länge von 350 mm und einer Temperatur im Inneren der Säule von 25°C, die mit 100 ml "DIAION SK1B (H-Form)", einem stark sauren Kationenaustauscherharz, erhältlich von Mitsubishi Chemical Co., Tokio, Japan, gepackt war, entmineralisiert, wobei die Temperatur im Inneren der Säule auf 25°C gehalten wurde. 330-g-Rliquote des erhaltenen Eluats mit einer Konzentration von 30 wurden jeweils mit RG 2 in sieben Säulen mit jeweils einem Innendurchmesser von 20 mm, einer Länge von 650 mm und einer Temperatur im Inneren der Säule von 25°C eingebracht, die mit 200 ml "AMBERLITE IRA411S (OH-Form)", einem Anionenaustauscher, erhältlich von Rotem & Haas Co., Pennsylvania, USA, gepackt waren. Daraufhin wurden etwa 1.000 ml Wasser mit RG 2 zum Auswaschen des Anionenaustauschers in jede Säule gegeben, um die nicht adsorbierten Bestandteile aus jeder Säule zu eluieren. Die sieben Säulen wurden mit RG 0,5 mit einer wässrigen Salzsäurelösung von 0,1 N, 0,15 N, 0,2 N, 0,3 N, 0,4 N, 0,45 N und 0,5 N beschickt, und die Fraktionierung der Eluate wurde eingeleitet, nachdem die Feststoffkonzentration der aus dem Ausfluss jeder Säule fließenden Eluate 0,2% oder mehr erreicht hatte, und die Fraktionierung wurde fortgesetzt, bis jedes Eluat vollständig durch die wässrige Salzsäurelösung von 0,1 N, 0,15 N, 0,2 N, 0,3 N, 0,4 N, 0,45 N bzw. 0,5 N ersetzt war. Jede Fraktionierung wurde mit Hilfe eines Fraktionssammlers in Zeitabständen von 20 min durchgeführt, wobei die Feststoffzusammensetzung jeder Fraktion mittels Probenahme und HPLC ähnlich wie vorstehend beschrieben ermittelt wurde. 3 und 4 zeigen die Elutionskurven der Konzentrationsverteilung, die mit diesen Ergebnissen durch Auftragen der Feststoffkonzentration jedes Bestandteils jedes Eluats mit 0,1 N bzw. 0,5 N wässriger Salzsäurelösung als Laufmittel erhalten wurden. In 3 und 4 zeigt die Ordinate die Feststoffkonzentration (Gew.-%), bezogen auf das Trockengewicht (TG) jedes Bestandteils des Eluats, die Abszisse zeigt das Elutionsvolumen (ml) einer Säule, und die Symbole "o", "•" und "Δ" stehen für αG-AA, L-Ascorbinsäure bzw. Saccharide. Aus 3 geht hervor, dass αG-AA und L-Ascorbinsäure unter den Bedingungen mit 0,1 N wässriger Salzsäurelösung zufriedenstellend getrennt wurden. Im Vergleich zu den Bedingungen, bei denen eine wässrige Salzsäurelösung höherer Konzentration benutzt wurde, war die Elutionsgeschwindigkeit von αG-AA und L-Ascorbinsäure eher langsam, und die Konzentration der gebildeten an αG-AA und L-Ascorbinsäure reichen Fraktionen war eher etwas gering. Aus 4 geht hervor, dass unter den Bedingungen, bei denen 0,5 N wässrige Salzsäurelösung für die Desorption benutzt wurde, im Vergleich zu den Bedingungen, bei denen eine wässrige Salzsäurelösung mit einer relativ geringen Konzentration benutzt wurde, die Elutionsgeschwindigkeit von αG-AA und L-Ascorbinsäure aus der Säule zunimmt und zu einer unvollständigen Trennung von αG-AA und L-Ascorbinsäure und einer Verringerung der Ausbeute der Fraktion mit hohem αG-AA-Gehalt führt. Wie aus den Ergebnissen aus 3 und 4 zu sehen ist, wurde der Großteil der Saccharide nicht an den Anionenaustauscherharzen absorbiert, sondern nur leicht adsorbiert und mit dem Laufmittel eluiert.
Die Figuren zeigen es zwar nicht konkret, es stellte sich aber heraus, dass unten den Bedingungen, bei denen 0,1–0,45 N wässrige Salzsäure benutzt wurde, αG-AA und L-Ascorbinsäure in der Säule zufriedenstellend getrennt und daraus eluiert wurden, insbesondere war die Trennung und Elution unter Bedingungen, bei denen 0,2-0,3 N wässrige Salzsäure benutzt wurde, effektiver. Die Ergebnisse, die unter Bedingungen erzielt wurden, bei denen wässrige Salzsäurelösungen als Laufmittel verwendet wurden, gelten auch für den Fall, dass anstatt der vorstehend genannten wässrigen Salzsäurelösungen wässrige Lösungen anderer, unterschiedlicher Säuren, Salze und deren Kombinationen als Eluat verwendet werden, und den Fall, dass andere, unterschiedliche Anionenaustauscherharze verwendet werden.
Die folgenden Beispiele beschreiben das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Produkten mit hohem αG-AA-Gehalt ausführlicher:
Beispiel 1
Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit hohem αG-AA-Gehalt
Ein Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt wurde unter denselben Bedingungen erhalten, wie sie im vorstehend beschriebenen Experiment verwendet wurden, abgesehen von der Verwendung einer 0,25 N wässrigen Salzsäurelösung als Laufmittel. Das Eluat aus dem Anionenaustauscher dieses Beispiels wurde ähnlich dem vorstehend beschriebenen Experiment fraktioniert, und es wurden Proben zur Analyse der Feststoffzusammensetzung mittels HPLC genommen. 5 zeigt eine Elutionskurve der Konzentrationsverteilung, die durch Auftragen der Feststoffkonzentration jedes Bestandteils jedes Eluats auf Grundlage der Analysedaten gezeichnet wurde. In 5 zeigt die Ordinate die Feststoffkonzentration (Gew.-%), bezogen auf das Trockengewicht (TG) jedes Bestandteils des Feststoffgehalts jedes Eluats, die Abszisse zeigt das Elutionsvolumen (ml) der Säule, das Symbol "o" steht für αG-AA, das Symbol "•" für L-Ascorbinsäure und das Symbol "Δ" für Saccharide. Das in diesem Beispiel erhaltene Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt enthielt αG-AA mit einer Reinheit von etwa 93%, bezogen auf das Trockengewicht, bei einer Ausbeute von etwa 92%, bezogen auf den αG-AA-Gehalt der Materiallösung. Wie aus 5 zu sehen ist, wurde der Großteil der Saccharide nicht am Anionenaustauscher absorbiert, sondern nur leicht adsorbiert und mit dem Laufmittel eluiert.
Beispiel 2
Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit hohem αG-AA-Gehalt
2 Gewichtsteile Dextrin (DE etwa sechs) wurden durch Erhitzen in 6 Gewichtsteilen Wasser unter Reduktionsbedingungen gelöst, die Lösung wurde mit 1 Gewichtsteil L-Ascorbinsäure und anschließend mit 400 Einheiten/g Dextrin Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase, erhältlich von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, versetzt und bei pH 5,5 und 60°C 24 Stunden lang einer enzymatischen Reaktion unterworfen. Die Reaktionsmischung wurde über eine UF-Membran gefiltert, um Enzym zu entfernen, und das Filtrat auf 55°C und pH 5,0 eingestellt, mit 10 Einheiten/g Dextrin Glucoamylase, erhältlich von Seikagaku-Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japan, versetzt und einer 24 Stunden langen enzymatischen Reaktion unterworfen. Die gebildete Reaktionsmischung wurde erhitzt, um restliches Enzym zu inaktivieren, entfärbt und über Aktivkohle gefiltert, wonach das Filtrat zu einer Feststoffkonzentration von etwa 40% konzentriert wurde. Die Analyse der Feststoffzusammensetzung des Konzentrats unter denselben HPLC-Bedingungen wie im vorstehend beschriebenen Experiment ergab, dass die Feststoffzusammensetzung aus etwa 31% αG-AA, etwa 21% L-Ascorbinsäure, etwa 31 D-Glucose und etwa 17% α-Glucosylsaccharid-Verbindung bestand. Das vorstehende Filtrat, das entfärbt und über Aktivkohle gefiltert war, wurde durch Einbringen mit RG 2 in eine Säule (Innendurchmesser 20 mm, Länge 350 mm und Temperatur im Inneren der Säule 25°C), die mit 100 ml "DIAION SK1B (H-Form)", einem stark sauren Kationenaustauscher, erhältlich von Mitsubishi Chemical Co., Tokio, Japan, gepackt war, entmineralisiert. 330 g der erhaltenen entmineralisierten Lösung mit einer Konzentration von 30% wurden mit RG 2 in eine Säule (Innendurchmesser 20 mm, Länge 650 mm, Temperatur im Inneren der Säule 25°C) eingebracht, die mit 200 ml "DIAION WA30 (OH-Form)", einem Anionenaustauscher, erhältlich von Mitsubishi Chemical Co., Tokio, Japan, gepackt war, eingebracht und durch Zugabe von etwa 1.000 ml Wasser mit RG 2 zum Desorbieren und Eluieren von nicht adsorbierten Bestandteilen aus der Säule ausgewaschen. Dann wurde 0,25 N wässrige Salzsäurelösung als Laufmittel mit RG 0,5 in die Säule eingebracht und die Sammlung der Eluate eingeleitet, nachdem die Konzentration des Eluats am Ausfluss der Säule eine Konzentration von 0,2% oder mehr erreicht hatte, und so lange fortgesetzt, bis das Eluat durch die wässrige 0,25 N Salzsäurelösung ersetzt war. Das Eluat wurde in Zeitabständen von 20 min mit einem Fraktionssammler fraktioniert, wobei eine Probe genommen und die Feststoffzusammensetzung jeder Probe mittels HPLC ähnlich wie im vorstehenden Experiment beschrieben ermittelt wurde. 6 zeigt eine Elutionskurve der Konzentrationsverteilung, die durch Auftragen der Feststoffkonzentration jedes Bestandteils jedes Eluats gezeichnet wurde. Wie aus 6 hervorgeht, war die Elutionsreiheniolge von αG-AA und L-Ascorbinsäure im Vergleich zu Beispiel 1 umgekehrt, da ein anderer Anionenaustauscher als in Beispiel 1 verwendet wurde, und die Trennung von αG-AA und L-Ascorbinsäure war ähnlich wie in Beispiel 1 zufriedenstellend, wobei durch Sammeln der an αG-AA reichen Fraktion ein Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt erhalten wurde. In 6 zeigt die Ordinate die Feststoffkonzentration (Gew.-%) jedes Bestandteils des Feststoffgehalts jedes Eluats, die Abszisse zeigt das Elutionsvolumen (ml) der Säule, das Symbol "o" steht für αG-AA, das Symbol "•" für L-Ascorbinsäure und das Symbol "Δ" für Saccharide. Wie aus 6 hervorgeht, wurden αG-AA und L-Ascorbinsäure zufriedenstellend aus dem Anionenaustauscher desorbiert und eluiert, wobei durch Sammeln der an αG-AA reichen gewünschten Fraktion ein Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt erhalten wurde. Das Produkt enthielt αG-AA mit einer Reinheit von etwa 93%, bezogen auf das Trockengewicht, bei einer Ausbeute von etwa 90%, bezogen auf den αG-AA-Gehalt der Materiallösung. Wie aus 6 zu sehen ist, wurde der Großteil der Saccharide nicht am Anionenaustauscher absorbiert, sondern nur leicht adsorbiert und mit dem Laufmittel eluiert.
Beispiel 3
Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit hohem αG-AA-Gehalt
Ein Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt wurde unter ähnlichen Bedingungen erhalten, wie sie im vorstehend beschriebenen Beispiel 2 verwendet wurden, abgesehen von der Verwendung einer Säule (Innendurchmesser 400 mm, Länge 1.000 mm), gepackt mit "DIAION SK1B (H-Form)", einem stark sauren Kationenaustauscher, erhältlich von Mitsubishi Chemical Co., Tokio, Japan, zum Entmineralisieren, einer Säule (Innendurchmesser 560 mm, Länge 1.000 mm, Temperatur im Inneren der Säule 25°C), gepackt mit "AMBERLITE IRA910CT (OH-Form)", einem Anionenaustauscher, erhältlich von Rohm & Haas Co., Pennsylvania, USA, als Anionenaustauscher und 0,3 N wässriger Salpetersäurelösung als Laufmittel. Das Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt war flüssig, hatte eine Reinheit von etwa 92% und eine αG-AA-Ausbeute von etwa 90%, bezogen auf den αG-AA-Gehalt der Materiallösung. Das flüssige Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt wurde unter Vakuum zu einer Lösung mit einer Feststoffkonzentration von etwa 76% konzentriert, in einen Kristallisator gegeben, mit 1% αG-AA-Kristallen, bezogen auf das Trockengewicht, als Zuchtkeime geimpft, bei 40°C gehalten und dann allmählich. über zwei Tage unter leichtem Rühren auf 25°C abgekühlt und mit Hilfe einer Siebtrommelzentrifuge getrennt. Die gebildeten Kristalle wurden durch Besprühen mit einer geringen Menge Wasser gewaschen und αG-AA in kristalliner Form anschließend zum Erhalten eines Produkts mit hohem αG-AA-Gehalt und einer Reinheit von etwa 99%, bezogen auf das Trockengewicht, gesammelt.
Beispiel 4
Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit hohem αG-AA-Gehalt
Ein Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt wurde unter ähnlichen Bedingungen erhalten, wie sie im vorstehend beschriebenen Beispiel 2 verwendet wurden, abgesehen von der Verwendung einer 0,45 N wässrigen Salzsäurelösung als Laufmittel. Ähnlich wie in Beispiel 2 wurden αG-AA und L-Ascorbinsäure zufriedenstellend aus dem in eine Säule gepackten Anionenaustauscher eluiert. Das in diesem Beispiel erhaltene Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt enthielt αG-AA mit einer Reinheit von etwa 90%, bezogen auf das Trockengewicht, bei einer Ausbeute von etwa 91%, bezogen auf den αG-AA-Gehalt der Materiallösung.
Beispiel 5
Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit hohem αG-AA-Gehalt
Ein Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt wurde unter ähnlichen Bedingungen erhalten, wie sie im vorstehend beschriebenen Beispiel 2 verwendet wurden, abgesehen von der Verwendung einer Säule (Innendurchmesser 800 mm, Länge 1.600 mm), gepackt mit "DIAION SK1B (H-Form)", einem stark sauren Kationenaustauscherharz, erhältlich von Mitsubishi Chemical Co., Tokio, Japan, zum Entmineralisieren, einer Säule (Innendurchmesser 1.200 mm, Länge 1.600 mm, Temperatur im Inneren der Säule 25°C), gepackt mit "AMBERLITE IRA478RF (OH-Form)", einem Anionenaustauscher, erhältlich von Rohm & Haas Co., Pennsylvania, USA, als Anionenaustauscher und 0,2 N wässriger Natriumchloridlösung als Laufmittel. Das Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt war das Natriumsalz der αG-AA (αG-AA-Na), das αG-AA-Na mit einer Reinheit von etwa 90% enthielt, bei einer αG-AA-Na-Ausbeute von etwa 90% Molverhältnis, bezogen auf den αG-AA-Gehalt der Materiallösung.
[Wirkung der Erfindung]
Wie vorstehend beschrieben ermöglicht die vorliegende Erfindung die Herstellung eines Produkts mit hohem αG-AA-Gehalt und einem Produkt mit hohem L-Ascorbinsäure-Gehalt mit einer relativ hohen Ausbeute mittels eines Verfahrens, das folgende Schritte umfasst: Inberührungbringen einer Lösung, die αG-AA, L-Ascorbinsäure und ein Saccharid(e) enthält, als Materiallösung mit einem Anionenaustauscherharz, das in eine Säule gepackt ist, zum Adsorbieren der αG-AA und oder der L-Ascorbinsäure am Anionenaustauscherharz, Auswaschen des Austauschers mit Wasser zum Entfernen des/der Saccharid(e), Einbringen einer wässrigen Lösung einer Säure und/oder eines Salzes mit einer Konzentration von weniger als 0,5 N als Laufmittel in die Säule zur Fraktionierung einer an αG-AA reichen Fraktion und einer an L-Ascorbinsäure reichen Fraktion und Sammeln der ersteren Fraktion. Erfindungsgemäß können sowohl die Säulenchromatographie mit einem stark sauren Kationenaustauscher, der für die Vorsäulenchromatographie mit einem Anionenaustauscher erforderlich ist, wie im herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Produkten mit hohem αG-AA-Gehalt üblich, als auch die Konzentration, die für die Vorbehandlung für die Säulenchromatographie mit einem Kationenaustauscher erforderlich ist, unterlassen werden, was das Verfahren zur Herstellung von αG-AA vereinfacht, die Produktionskosten senkt und ein Produkt mit hohem αG-AA-Gehalt und einer relativ hohen Ausbeute ergibt. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren verlangt das erfindungsgemäße Verfahren keine Säulenchromatographie mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz, wodurch die αG-AA-Ausbeute von einem Niveau von 75–80% in herkömmlichen Verfahren auf ein Niveau von etwa 85% oder mehr, vorzugsweise 90% oder mehr, bezogen auf den αG-AA-Gehalt der Materiallösung, erhöht werden kann.
Somit ermöglicht die vorliegende Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Produkten mit hohem αG-AA-Gehalt mit zufriedenstellender Verarbeitbarkeit und Ausbeute sowie zufriedenstellenden Produktionskosten. Die erhaltenen Produkte mit hohem αG-AA-Gehalt können beliebig als ein stabiles Produkt mit einem hohen Gehalt an L-Ascorbinsäure, Mittel zur Anreicherung mit Vitamin C, Stabilisator, Qualitätsverbesserer, Antioxidans, physiologischer Wirkstoff, UV-Absorptionsmittel usw. in den verschiedensten Bereichen, wie Lebensmittelerzeugnisse, Kosmetik, Arzneimittel, Futtermittel, Haustierfutter, industrielle Materialien usw., verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung leistet mit ihren herausragenden Funktionen und Wirkungen einen wichtigen Beitrag zum Stand der Technik.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Produkts mit einem hohen Gehalt an 2-O-α-D-Glucopyranosyl-L-ascorbinsäure, das folgende Schritte umfasst: Inberührungbringen einer Lösung, die 2-O-α-D-Glucopyranosyl-L-ascorbinsäure, L-Ascorbinsäure und ein oder mehrere Saccharide enthält, als Materiallösung mit einem Anionenaustauscherharz in OH-Form oder CH₃C00^–-Form, das zur Adsorption der 2-O-α-D-Glucopyranosyl--L-ascorbinsäure und der L-Ascorbinsäure an das Anionenaustauscherharz in eine Säule gepackt ist; Auswaschen des Anionenaustauscherharzes mit Wasser zum Entfernen des/der Saccharids/e aus dem Anionenaustauscherharz; Einbringen einer wässrigen Lösung einer Säure und/oder eines Salzes mit einer Konzentration von weniger als 0,5 N als Laufmittel in die Säule zur Fraktionierung einer an 2-O-α-D-Glucopyranosyl-L-ascorbinsäure reichen Fraktion und einer an L-Ascorbinsäure reichen Fraktion ; und Sammeln der an 2-O-α-D-Glucopyranosyl-L-ascorbinsäure reichen Fraktion.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Materiallösung durch Einwirkenlassen einer Saccharid-Transferase mit oder ohne Glucoamylase auf eine Lösung mit L-Ascorbinsäure und einer α-Glucosylsaccharid-Verbindung erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Materiallösung durch Inberührungbringen mit einem Kationenaustauscherharz in H-Form zum Entfernen von Mineralstoffen erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Säure einen oder mehrere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und Zitronensäure darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Salz einen oder mehrere Bestandteile ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulfat, Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Natriumcitrat und Kaliumcitrat darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei, die wässrige Lösung der Säure und/oder des Salzes eine Konzentration von 0,1–0,45 N aufweist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die wässrige Lösung der Säure und/oder des Salzes eine Konzentration von 0,2–0,3 N aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin die Schritte der Konzentrierung und der Kristallisierung umfasst.