JPH06228183A - Ｌ−アスコルビン酸糖誘導体の精製方法 - Google Patents
Ｌ−アスコルビン酸糖誘導体の精製方法Info
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- JPH06228183A JPH06228183A JP4054693A JP4054693A JPH06228183A JP H06228183 A JPH06228183 A JP H06228183A JP 4054693 A JP4054693 A JP 4054693A JP 4054693 A JP4054693 A JP 4054693A JP H06228183 A JPH06228183 A JP H06228183A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 酵素反応、菌体反応または有機化学的反応に
より合成されたＬ−アスコルビン酸の６位に糖類が結合
した誘導体の含有液をＣｌ- 型の強塩基性陰イオン交換
樹脂を用いて処理することを特徴とするＬ−アスコルビ
ン酸糖誘導体の精製方法。 【効果】 陰イオン交換カラムのみで容易にＬ−アスコ
ルビン酸糖誘導体を高い収率で精製することができる。
より合成されたＬ−アスコルビン酸の６位に糖類が結合
した誘導体の含有液をＣｌ- 型の強塩基性陰イオン交換
樹脂を用いて処理することを特徴とするＬ−アスコルビ
ン酸糖誘導体の精製方法。 【効果】 陰イオン交換カラムのみで容易にＬ−アスコ
ルビン酸糖誘導体を高い収率で精製することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＬ−アスコルビン酸糖誘
導体を高収率で得られる精製方法に関するものである。
導体を高収率で得られる精製方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アスコルビン酸とラクトースまたは
ラクトース含有物との混合物にアスペルギルス オリー
ゼ（Aspergillus oryzae）（特開平2-311490号公報）、
エッシェリキア コリ（Escherichia coli）、アスペル
ギルス ニガー（Aspergillusniger ）等の微生物由来
の酵素、牛肝臓等の動物臓器由来の酵素、ジャックビー
ンズ（Jack beans）等の植物種子由来のβーガラクトシ
ダーゼを作用させることにより合成したＬ−アスコルビ
ン酸誘導体である６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−Ｌ−アスコルビン酸の精製方法に関しては特開平２−
３１１４９０号公報および特開平４−１０８８６４号公
報において、６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ
−アスコルビン酸合成液から活性炭カラムクロマトグラ
フィーと陰イオン交換樹脂（ダウエックス２Ｘ８）カラ
ムクロマトグラフィーを併用して精製する方法が知られ
ている。
ラクトース含有物との混合物にアスペルギルス オリー
ゼ（Aspergillus oryzae）（特開平2-311490号公報）、
エッシェリキア コリ（Escherichia coli）、アスペル
ギルス ニガー（Aspergillusniger ）等の微生物由来
の酵素、牛肝臓等の動物臓器由来の酵素、ジャックビー
ンズ（Jack beans）等の植物種子由来のβーガラクトシ
ダーゼを作用させることにより合成したＬ−アスコルビ
ン酸誘導体である６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−Ｌ−アスコルビン酸の精製方法に関しては特開平２−
３１１４９０号公報および特開平４−１０８８６４号公
報において、６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ
−アスコルビン酸合成液から活性炭カラムクロマトグラ
フィーと陰イオン交換樹脂（ダウエックス２Ｘ８）カラ
ムクロマトグラフィーを併用して精製する方法が知られ
ている。
【０００３】Ｌ−アスコルビン酸とメリビオースまたは
ラフィノースとの混合物にピクノポラス シナバリヌス
（Pycnoporus cinnabarinus ）, ストレプトコッカス
ボビス（Streptococcus bovis ）, ディプロコッカス
ニューモニア（Diplococcuspneumoniae）, モルティエ
レラ ビナセ（Mortierella vinacea ）, アスペルギル
ス ニガー（Aspergillus nigar ）, エシェリヒア コ
リ（Escherichia coli）, シュードモナス フルオレッ
センス（Pseudomonas fluorescens ）, キャンディダ
ギリエルモンディー（Candida guilliermondii）などの
微生物やビシアサティバ（Visia sativa）, 緑色コーヒ
ー豆（Green coffee bean ）などの植物が生産するαー
ガラクトシダーゼを作用させることにより合成したＬ−
アスコルビン酸誘導体である６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の精製方法に関しては
特開平４−１５５８５７号公報で、６−Ｏ−α−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の合成液を活性
炭カラムクロマトグラフィーに付し、純水で溶出後、６
−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン
酸画分を濃縮して、次に陰イオン交換樹脂（ダウエック
ス２Ｘ８Ｃｌ- 型）カラムクロマトグラフィーに吸着さ
せてＮａＣｌで溶出させて高純度の６−Ｏ−α−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を得、脱塩する
方法が知られている。
ラフィノースとの混合物にピクノポラス シナバリヌス
（Pycnoporus cinnabarinus ）, ストレプトコッカス
ボビス（Streptococcus bovis ）, ディプロコッカス
ニューモニア（Diplococcuspneumoniae）, モルティエ
レラ ビナセ（Mortierella vinacea ）, アスペルギル
ス ニガー（Aspergillus nigar ）, エシェリヒア コ
リ（Escherichia coli）, シュードモナス フルオレッ
センス（Pseudomonas fluorescens ）, キャンディダ
ギリエルモンディー（Candida guilliermondii）などの
微生物やビシアサティバ（Visia sativa）, 緑色コーヒ
ー豆（Green coffee bean ）などの植物が生産するαー
ガラクトシダーゼを作用させることにより合成したＬ−
アスコルビン酸誘導体である６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の精製方法に関しては
特開平４−１５５８５７号公報で、６−Ｏ−α−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の合成液を活性
炭カラムクロマトグラフィーに付し、純水で溶出後、６
−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン
酸画分を濃縮して、次に陰イオン交換樹脂（ダウエック
ス２Ｘ８Ｃｌ- 型）カラムクロマトグラフィーに吸着さ
せてＮａＣｌで溶出させて高純度の６−Ｏ−α−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を得、脱塩する
方法が知られている。
【０００４】Ｌ−アスコルビン酸とマルトースの混合液
にアスペルギルス ニガー（Aspergillus nigar ）やペ
ニシリウム属菌、キャンディダ属酵母、キャベツなどが
生産するα−グルコシダーゼを作用させて合成した６−
Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の
精製方法に関してはトヨパールＨＷ４０Ｓによるゲルろ
過カラムクロマトグラフィー、分取用高速液体クロマト
グラフィーにより得る方法が知られている。（ビタミ
ン，６３，１９８９）
にアスペルギルス ニガー（Aspergillus nigar ）やペ
ニシリウム属菌、キャンディダ属酵母、キャベツなどが
生産するα−グルコシダーゼを作用させて合成した６−
Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の
精製方法に関してはトヨパールＨＷ４０Ｓによるゲルろ
過カラムクロマトグラフィー、分取用高速液体クロマト
グラフィーにより得る方法が知られている。（ビタミ
ン，６３，１９８９）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】前記したように、Ｌ−
アスコルビン酸誘導体の精製方法として活性炭カラムク
ロマトグラフィーと陰イオン交換（Ｃｌ- 型）カラムク
ロマトグラフィーを併用する方法やゲルろ過カラムクロ
マトグラフィーと高速液体クロマトグラフィーを併用す
る方法が知られているが、これらの方法では２種類以上
のカラムクロマトグラフィーを行う必要があるためコス
トが高く、時間および手間が掛かるなど問題点が多かっ
た。
アスコルビン酸誘導体の精製方法として活性炭カラムク
ロマトグラフィーと陰イオン交換（Ｃｌ- 型）カラムク
ロマトグラフィーを併用する方法やゲルろ過カラムクロ
マトグラフィーと高速液体クロマトグラフィーを併用す
る方法が知られているが、これらの方法では２種類以上
のカラムクロマトグラフィーを行う必要があるためコス
トが高く、時間および手間が掛かるなど問題点が多かっ
た。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、高純度のＬ
−アスコルビン酸糖誘導体を安価に、容易に精製できる
ことを見いだし本発明を完成するに至った。すなわち、
本発明は、酵素反応、菌体反応または有機化学的反応に
より合成されたＬ−アスコルビン酸の６位に糖類が結合
した誘導体の含有液をＣｌ- 型の強塩基性陰イオン交換
樹脂を用いて処理することを特徴とするＬ−アスコルビ
ン酸糖誘導体の精製方法を要旨とするものである。
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、高純度のＬ
−アスコルビン酸糖誘導体を安価に、容易に精製できる
ことを見いだし本発明を完成するに至った。すなわち、
本発明は、酵素反応、菌体反応または有機化学的反応に
より合成されたＬ−アスコルビン酸の６位に糖類が結合
した誘導体の含有液をＣｌ- 型の強塩基性陰イオン交換
樹脂を用いて処理することを特徴とするＬ−アスコルビ
ン酸糖誘導体の精製方法を要旨とするものである。
【０００７】以下、本発明について詳細に説明する。本
発明に用いることができるＬ−アスコルビン酸糖誘導体
としては、６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−
アスコルビン酸、６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−Ｌ−アスコルビン酸、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−Ｌ−アスコルビン酸などのＬ−アスコルビン酸の
６位に単糖類が結合した化合物であればよい。その合成
方法に関しては酵素を用いた酵素合成法でも、酵素産生
菌体による菌体合成法でも、あるいは有機合成法による
ものでもよい。
発明に用いることができるＬ−アスコルビン酸糖誘導体
としては、６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−
アスコルビン酸、６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−Ｌ−アスコルビン酸、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−Ｌ−アスコルビン酸などのＬ−アスコルビン酸の
６位に単糖類が結合した化合物であればよい。その合成
方法に関しては酵素を用いた酵素合成法でも、酵素産生
菌体による菌体合成法でも、あるいは有機合成法による
ものでもよい。
【０００８】本発明においてＬ−アスコルビン酸糖誘導
体の精製に用いることができる強塩基性陰イオン交換樹
脂としてはオルガノ社製のアンバーライトＩＲＡ−４０
０、ＩＲＡー９００、ＩＲＡ−９０４、ＩＲＡ−９５
８、ＩＲＡ−４１０、ＩＲＡ−４１１Ｓ，ＩＲＡ−９１
０やダウケミカル製のダウエックス１、ダウエックス
２、ダウエックス１１、ダウエックスＳＢＲ−Ｐ，ダウ
エックスＳＢＲ，ダウエックスＳＡＲ、ダウエックスＭ
ＷＡ−２さらには三菱化成社製のダイアイオンＳＡ１０
Ａ，ＳＡ１１Ａ，ＳＡ１２Ａ、ＰＫ２０８，ＰＫ２１
２，ＰＫ２１６，ＰＫ２２０，ＰＫ２２８，ＰＡ３０
６，ＰＡ３０８，ＰＡ３１２，ＰＡ３１６，ＰＡ３１
８，ＰＡ４１６，ＰＡ４０８，ＰＡ４１２、ＰＡ４１
６、ＰＡ４１８などがある。なかでも、収率の観点から
ダウエックス２が最も好ましい。
体の精製に用いることができる強塩基性陰イオン交換樹
脂としてはオルガノ社製のアンバーライトＩＲＡ−４０
０、ＩＲＡー９００、ＩＲＡ−９０４、ＩＲＡ−９５
８、ＩＲＡ−４１０、ＩＲＡ−４１１Ｓ，ＩＲＡ−９１
０やダウケミカル製のダウエックス１、ダウエックス
２、ダウエックス１１、ダウエックスＳＢＲ−Ｐ，ダウ
エックスＳＢＲ，ダウエックスＳＡＲ、ダウエックスＭ
ＷＡ−２さらには三菱化成社製のダイアイオンＳＡ１０
Ａ，ＳＡ１１Ａ，ＳＡ１２Ａ、ＰＫ２０８，ＰＫ２１
２，ＰＫ２１６，ＰＫ２２０，ＰＫ２２８，ＰＡ３０
６，ＰＡ３０８，ＰＡ３１２，ＰＡ３１６，ＰＡ３１
８，ＰＡ４１６，ＰＡ４０８，ＰＡ４１２、ＰＡ４１
６、ＰＡ４１８などがある。なかでも、収率の観点から
ダウエックス２が最も好ましい。
【０００９】本発明において、精製に使用する樹脂のイ
オン形はＣｌ- 型である。
オン形はＣｌ- 型である。
【００１０】Ｌ−アスコルビン酸糖誘導体をカラムにア
プライする場合、合成液のｐＨは４〜７が好ましく、さ
らに好ましくは４．５〜６．５がよい。また、合成液は
アプライ時に純水で１０〜１０００倍に希釈することが
好ましく、さらに好ましくは１００〜５００倍に希釈す
るのがよい。
プライする場合、合成液のｐＨは４〜７が好ましく、さ
らに好ましくは４．５〜６．５がよい。また、合成液は
アプライ時に純水で１０〜１０００倍に希釈することが
好ましく、さらに好ましくは１００〜５００倍に希釈す
るのがよい。
【００１１】本発明において、アプライする合成液中の
アスコルビン酸関連化合物の総重量はカラム内樹脂重量
の１／５０〜１／５倍量が好ましく、１／１０〜１／７
がさらに好ましい。
アスコルビン酸関連化合物の総重量はカラム内樹脂重量
の１／５０〜１／５倍量が好ましく、１／１０〜１／７
がさらに好ましい。
【００１２】合成液や純水、溶出液をカラムに通液する
ときの流速は体積速度（ＳＶ）で４〜６が好ましく、最
も好ましくは５である。
ときの流速は体積速度（ＳＶ）で４〜６が好ましく、最
も好ましくは５である。
【００１３】また、本発明においてＬ−アスコルビン酸
糖誘導体をカラムから溶出させるときに用いる塩として
は特に限定する必要はなく塩化ナトリウム、酢酸アンモ
ニウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムなどが用いられ
るが、コスト面から塩化ナトリウムが好ましい。
糖誘導体をカラムから溶出させるときに用いる塩として
は特に限定する必要はなく塩化ナトリウム、酢酸アンモ
ニウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウムなどが用いられ
るが、コスト面から塩化ナトリウムが好ましい。
【００１４】溶出に用いる塩の濃度はＬ−アスコルビン
酸糖誘導体の種類やカラム内樹脂の種類、溶出に用いる
塩の種類などによって異なり、それぞれの場合に適当な
濃度で溶出させればよい。
酸糖誘導体の種類やカラム内樹脂の種類、溶出に用いる
塩の種類などによって異なり、それぞれの場合に適当な
濃度で溶出させればよい。
【００１５】高度に精製されたＬ−アスコルビン酸糖誘
導体と塩を含む回収画分は逆浸透膜、電気透析器などの
公知の方法により、容易に脱塩できる。
導体と塩を含む回収画分は逆浸透膜、電気透析器などの
公知の方法により、容易に脱塩できる。
【００１６】
【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。
する。
【００１７】実施例１ Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（石津製薬特級試薬）１
０ｇ及び乳糖３０ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解して、
ｐＨを４．５に調製した。これにアスペルギルスオリー
ゼ（Aspergillus oryzae）由来のβーガラクトシダーゼ
（新日本化学社製スミラクトＧＬＬ）を３７５０ユニッ
ト加えて、４０℃で１時間反応させて反応物を得た。得
られた反応物をバイオラッド（BIO-RAD ）社製高速液体
カラムクロマトグラフィー用カラムアミネックスイオン
エクスクルージョン（AMINEX ION EXCLUSION）ＨＰＸ−
８７Ｈを用いて分析した。このとき、溶出液として0.01
ＮのＨ2 ＳＯ4 を用い、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで反応
物を溶出させた。また、そのときの検出をＵＶ245 で行
った。その結果、２．５５ｇの６−Ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成していた。こ
のときの反応収率は１３．５％であった。
０ｇ及び乳糖３０ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解して、
ｐＨを４．５に調製した。これにアスペルギルスオリー
ゼ（Aspergillus oryzae）由来のβーガラクトシダーゼ
（新日本化学社製スミラクトＧＬＬ）を３７５０ユニッ
ト加えて、４０℃で１時間反応させて反応物を得た。得
られた反応物をバイオラッド（BIO-RAD ）社製高速液体
カラムクロマトグラフィー用カラムアミネックスイオン
エクスクルージョン（AMINEX ION EXCLUSION）ＨＰＸ−
８７Ｈを用いて分析した。このとき、溶出液として0.01
ＮのＨ2 ＳＯ4 を用い、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで反応
物を溶出させた。また、そのときの検出をＵＶ245 で行
った。その結果、２．５５ｇの６−Ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成していた。こ
のときの反応収率は１３．５％であった。
【００１８】次に上記の反応物１００ｍｌを純水３２２
０ｍｌで希釈し、ｐＨを７．０に調製した。この反応液
を７００ｍｌのダウエックス２Ｘ８（Ｃｌ- 型）カラム
クロマトグラフィーに流速６０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝
５．１）でアプライし、次に１０ｍＭ ＮａＣｌ液１．
６ｌを通液した。その後、１０ｍＭから５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ液各６ｌを用いてリニアグラジエントを形成させ、
カラムに通液し、目的の６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル−Ｌ−アスコルビン酸を溶出させた。このとき、
４００ｍｌずつ分画した。ＨＰＬＣで各画分の純度を確
認し、高純度画分を回収し、濃縮した。この液をマイク
ロアシライザー（旭化成社製）で電気透析し、凍結乾燥
して２．２４ｇの６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−Ｌ−アスコルビン酸を得た。このときの精製収率は８
７．８％であり、純度は９２．２％であった。
０ｍｌで希釈し、ｐＨを７．０に調製した。この反応液
を７００ｍｌのダウエックス２Ｘ８（Ｃｌ- 型）カラム
クロマトグラフィーに流速６０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝
５．１）でアプライし、次に１０ｍＭ ＮａＣｌ液１．
６ｌを通液した。その後、１０ｍＭから５０ｍＭのＮａ
Ｃｌ液各６ｌを用いてリニアグラジエントを形成させ、
カラムに通液し、目的の６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル−Ｌ−アスコルビン酸を溶出させた。このとき、
４００ｍｌずつ分画した。ＨＰＬＣで各画分の純度を確
認し、高純度画分を回収し、濃縮した。この液をマイク
ロアシライザー（旭化成社製）で電気透析し、凍結乾燥
して２．２４ｇの６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
−Ｌ−アスコルビン酸を得た。このときの精製収率は８
７．８％であり、純度は９２．２％であった。
【００１９】比較例１ 実施例１で合成した反応物１００ｍｌを９００ｍｌの活
性炭カラム（和光純薬製クロマトグラフィー用活性炭）
にアプライし、流速３０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝２）でア
スコルビン酸、６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
Ｌ−アスコルビン酸を純水で溶出させた。ＨＰＬＣで各
画分の純度を確認し、高純度画分を回収し、濃縮した。
濃縮液を１０ｍｌのダウエックス２Ｘ８（Ｃｌ- 型）に
付し、流速２ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝１２）で１００ｍｌ
の蒸留水を通液させたのち、２００ｍｌの４０ｍＭ Ｎ
ａＣｌを通液し、目的の６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル−Ｌ−アスコルビン酸を溶出させた。この画分を
マイクロアシライザー（旭化成社製）により脱塩し、凍
結乾燥して１．７７ｇの６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル−Ｌ−アスコルビン酸を得た。このときの精製収
率は８２．５％であり、純度は９３．２％であった。
性炭カラム（和光純薬製クロマトグラフィー用活性炭）
にアプライし、流速３０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝２）でア
スコルビン酸、６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
Ｌ−アスコルビン酸を純水で溶出させた。ＨＰＬＣで各
画分の純度を確認し、高純度画分を回収し、濃縮した。
濃縮液を１０ｍｌのダウエックス２Ｘ８（Ｃｌ- 型）に
付し、流速２ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝１２）で１００ｍｌ
の蒸留水を通液させたのち、２００ｍｌの４０ｍＭ Ｎ
ａＣｌを通液し、目的の６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル−Ｌ−アスコルビン酸を溶出させた。この画分を
マイクロアシライザー（旭化成社製）により脱塩し、凍
結乾燥して１．７７ｇの６−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシル−Ｌ−アスコルビン酸を得た。このときの精製収
率は８２．５％であり、純度は９３．２％であった。
【００２０】実施例２ Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（石津製薬特級試薬）１
０ｇ及びラフィノース５水和物３５ｇを１００ｍｌの蒸
留水に溶解して、ｐＨを４．５に調製した。これにキャ
ンディダ ギリエルモンディー（Candida guilliermond
ii）由来のαーガラクトシダーゼを３６０００ユニット
加えて、５０℃で８時間反応させて反応物を得た。得ら
れた反応物をバイオラッド（BIO-RAD ）社製高速液体カ
ラムクロマトグラフィー用カラムアミネックスイオンエ
クスクルージョン（AMINEX ION EXCLUSION）ＨＰＸ−８
７Ｈを用いて分析した。このとき、溶出液として0.01Ｎ
のＨ2 ＳＯ4 を用い、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで反応物
を溶出させた。また、そのときの検出をＵＶ245 で行っ
た。その結果、２．１４ｇの６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成していた。この
ときの反応収率は１１．０％であった。
０ｇ及びラフィノース５水和物３５ｇを１００ｍｌの蒸
留水に溶解して、ｐＨを４．５に調製した。これにキャ
ンディダ ギリエルモンディー（Candida guilliermond
ii）由来のαーガラクトシダーゼを３６０００ユニット
加えて、５０℃で８時間反応させて反応物を得た。得ら
れた反応物をバイオラッド（BIO-RAD ）社製高速液体カ
ラムクロマトグラフィー用カラムアミネックスイオンエ
クスクルージョン（AMINEX ION EXCLUSION）ＨＰＸ−８
７Ｈを用いて分析した。このとき、溶出液として0.01Ｎ
のＨ2 ＳＯ4 を用い、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで反応物
を溶出させた。また、そのときの検出をＵＶ245 で行っ
た。その結果、２．１４ｇの６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成していた。この
ときの反応収率は１１．０％であった。
【００２１】次に上記の反応物１００ｍｌを純水３２２
０ｍｌで希釈し、ｐＨを７．０に調製した。この反応液
を７００ｍｌのダウエックス２Ｘ８（Ｃｌ- 型）カラム
クロマトグラフィーに流速６０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝
５．１）で付し、次に１０ｍＭＮａＣｌ液１．６ｌを通
液した。その後、１０ｍＭから５０ｍＭのＮａＣｌ液各
６ｌを用いてリニアグラジエントを形成させ、カラムに
通液し、目的の６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−
Ｌ−アスコルビン酸を溶出させた。このとき、４００ｍ
ｌずつ分画した。ＨＰＬＣで各画分の純度を確認し、高
純度画分を回収し、濃縮した。この液をマイクロアシラ
イザー（旭化成社製）で電気透析し、凍結乾燥して１．
８２ｇの６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−ア
スコルビン酸を得た。このときの精製収率は７７．０％
であり、このときの純度は９７％であった。
０ｍｌで希釈し、ｐＨを７．０に調製した。この反応液
を７００ｍｌのダウエックス２Ｘ８（Ｃｌ- 型）カラム
クロマトグラフィーに流速６０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝
５．１）で付し、次に１０ｍＭＮａＣｌ液１．６ｌを通
液した。その後、１０ｍＭから５０ｍＭのＮａＣｌ液各
６ｌを用いてリニアグラジエントを形成させ、カラムに
通液し、目的の６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−
Ｌ−アスコルビン酸を溶出させた。このとき、４００ｍ
ｌずつ分画した。ＨＰＬＣで各画分の純度を確認し、高
純度画分を回収し、濃縮した。この液をマイクロアシラ
イザー（旭化成社製）で電気透析し、凍結乾燥して１．
８２ｇの６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−ア
スコルビン酸を得た。このときの精製収率は７７．０％
であり、このときの純度は９７％であった。
【００２２】比較例２ 実施例２で合成した反応物１００ｍｌを９００ｍｌの活
性炭カラムクロマト（和光純薬製クロマトグラフ用）に
付し、流速３０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝２）で純水でアス
コルビン酸、６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ
−アスコルビン酸を溶出させた。ＨＰＬＣで各画分の純
度を確認し、高純度画分を回収し、濃縮した。濃縮液の
ｐＨを７に調製し、１０ｍｌのダウエックス２×８カラ
ム（Ｃｌ- 型）に付し、流速２ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝１
２）で２００ｍｌの蒸留水を通液させたのち、１００ｍ
ｌの４０ｍＭ ＮａＣｌを通液し、目的の６−Ｏ−α−
Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を溶出さ
せた。この画分をマイクロアシライザー（旭化成社製）
により脱塩し、凍結乾燥して１．４７ｇの６−Ｏ−α−
Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を得た。
このときの精製収率は６８．８％であり、純度は９６．
６％であった。
性炭カラムクロマト（和光純薬製クロマトグラフ用）に
付し、流速３０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝２）で純水でアス
コルビン酸、６−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ
−アスコルビン酸を溶出させた。ＨＰＬＣで各画分の純
度を確認し、高純度画分を回収し、濃縮した。濃縮液の
ｐＨを７に調製し、１０ｍｌのダウエックス２×８カラ
ム（Ｃｌ- 型）に付し、流速２ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝１
２）で２００ｍｌの蒸留水を通液させたのち、１００ｍ
ｌの４０ｍＭ ＮａＣｌを通液し、目的の６−Ｏ−α−
Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を溶出さ
せた。この画分をマイクロアシライザー（旭化成社製）
により脱塩し、凍結乾燥して１．４７ｇの６−Ｏ−α−
Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を得た。
このときの精製収率は６８．８％であり、純度は９６．
６％であった。
【００２３】実施例３ 実施例２で合成した反応物１００ｍｌを純水３２２０ｍ
ｌで希釈し、ｐＨを７．０に調製した。この反応液を７
００ｍｌのダイアイオンＳＡ１０Ａ（Ｃｌ- 型）カラム
クロマトグラフィーに流速６０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝
５．１）で付し、次に１０ｍＭ 酢酸アンモニウム液
１．６ｌを通液した。その後、４０ｍＭの酢酸アンモニ
ウム液５ｌをカラムに通液し、目的の６−Ｏ−α−Ｄ−
ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を溶出させ
た。このとき、４００ｍｌずつ分画した。ＨＰＬＣで各
画分の純度を確認し、高純度画分を回収し、乾燥させ
た。乾固物を純水に溶解しメンブレンマスター（日東電
工社製）でＮＴＲ−７４２０膜（日東電工社製）を用い
て脱塩処理を行ったあと、凍結乾燥して１．５５ｇの６
−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン
酸を得た。このときの精製収率は７２．４％であり、こ
のときの純度は８８．８％であった。
ｌで希釈し、ｐＨを７．０に調製した。この反応液を７
００ｍｌのダイアイオンＳＡ１０Ａ（Ｃｌ- 型）カラム
クロマトグラフィーに流速６０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝
５．１）で付し、次に１０ｍＭ 酢酸アンモニウム液
１．６ｌを通液した。その後、４０ｍＭの酢酸アンモニ
ウム液５ｌをカラムに通液し、目的の６−Ｏ−α−Ｄ−
ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を溶出させ
た。このとき、４００ｍｌずつ分画した。ＨＰＬＣで各
画分の純度を確認し、高純度画分を回収し、乾燥させ
た。乾固物を純水に溶解しメンブレンマスター（日東電
工社製）でＮＴＲ−７４２０膜（日東電工社製）を用い
て脱塩処理を行ったあと、凍結乾燥して１．５５ｇの６
−Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン
酸を得た。このときの精製収率は７２．４％であり、こ
のときの純度は８８．８％であった。
【００２４】実施例４ Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（石津製薬特級試薬）１
０ｇ及びマルトース３５ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解
して、ｐＨを４．５に調製した。これにアスペルギルス
ニガー（Aspergillus nigar ）由来のαーグルコシダ
ーゼを１００００ユニット加えて、４０℃で８時間反応
させて反応物を得た。得られた反応物をバイオラッド
（BIO-RAD ）社製高速液体カラムクロマトグラフィー用
カラムアミネックスイオンエクスクルージョン（AMINEX
ION EXCLUSION）ＨＰＸ−８７Ｈを用いて分析した。こ
のとき、溶出液として0.01ＮのＨ2 ＳＯ4 を用い、流速
０．６ｍｌ／ｍｉｎで反応物を溶出させた。また、その
ときの検出をＵＶ245 で行った。その結果、１７．５ｇ
の６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビ
ン酸が生成していた。このときの反応収率は８７．５％
であった。
０ｇ及びマルトース３５ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解
して、ｐＨを４．５に調製した。これにアスペルギルス
ニガー（Aspergillus nigar ）由来のαーグルコシダ
ーゼを１００００ユニット加えて、４０℃で８時間反応
させて反応物を得た。得られた反応物をバイオラッド
（BIO-RAD ）社製高速液体カラムクロマトグラフィー用
カラムアミネックスイオンエクスクルージョン（AMINEX
ION EXCLUSION）ＨＰＸ−８７Ｈを用いて分析した。こ
のとき、溶出液として0.01ＮのＨ2 ＳＯ4 を用い、流速
０．６ｍｌ／ｍｉｎで反応物を溶出させた。また、その
ときの検出をＵＶ245 で行った。その結果、１７．５ｇ
の６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビ
ン酸が生成していた。このときの反応収率は８７．５％
であった。
【００２５】次に上記の反応物１００ｍｌを純水３２２
０ｍｌで希釈し、ｐＨを７．０に調製した。この反応液
を７００ｍｌのダウエックス２Ｘ８（Ｃｌ- 型）カラム
クロマトグラフィーに流速６０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝
５．１）で付し、次に１０ｍＭＮａＣｌ液１．６ｌを通
液した。その後、１０ｍＭから５０ｍＭのＮａＣｌ液各
６ｌを用いてリニアグラジエントを形成させ、カラムに
通液し、目的の６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ
−アスコルビン酸を溶出させた。このとき、４００ｍｌ
ずつ分画した。ＨＰＬＣで各画分の純度を確認し、高純
度画分を回収し、濃縮した。この液をマイクロアシライ
ザー（旭化成社製）で電気透析し、凍結乾燥して１３．
５ｇの６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコ
ルビン酸を得た。このときの精製収率は７７．１％であ
り、このときの純度は９２．０％であった。
０ｍｌで希釈し、ｐＨを７．０に調製した。この反応液
を７００ｍｌのダウエックス２Ｘ８（Ｃｌ- 型）カラム
クロマトグラフィーに流速６０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝
５．１）で付し、次に１０ｍＭＮａＣｌ液１．６ｌを通
液した。その後、１０ｍＭから５０ｍＭのＮａＣｌ液各
６ｌを用いてリニアグラジエントを形成させ、カラムに
通液し、目的の６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ
−アスコルビン酸を溶出させた。このとき、４００ｍｌ
ずつ分画した。ＨＰＬＣで各画分の純度を確認し、高純
度画分を回収し、濃縮した。この液をマイクロアシライ
ザー（旭化成社製）で電気透析し、凍結乾燥して１３．
５ｇの６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコ
ルビン酸を得た。このときの精製収率は７７．１％であ
り、このときの純度は９２．０％であった。
【００２６】比較例３ 実施例４で合成した反応物１００ｍｌを９００ｍｌの活
性炭カラムクロマト（和光純薬製クロマトグラフ用）に
付し、流速３０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝２）で純水でアス
コルビン酸、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−
アスコルビン酸を溶出させた。ＨＰＬＣで各画分の純度
を確認し、高純度画分を回収し、濃縮した。濃縮液のｐ
Ｈを７に調製し、１０ｍｌのダウエックス２×８カラム
（Ｃｌ-型）に付し、流速２ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝１
２）で２００ｍｌの蒸留水を通液させたのち、１００ｍ
ｌの４０ｍＭ ＮａＣｌを通液し、目的の６−Ｏ−α−
Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を溶出させ
た。この画分をマイクロアシライザー（旭化成社製）に
より脱塩し、凍結乾燥して１２．３ｇの６−Ｏ−α−Ｄ
−ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を得た。こ
のときの精製収率は７０．３％であり、純度は９３．５
％であった。
性炭カラムクロマト（和光純薬製クロマトグラフ用）に
付し、流速３０ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝２）で純水でアス
コルビン酸、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−
アスコルビン酸を溶出させた。ＨＰＬＣで各画分の純度
を確認し、高純度画分を回収し、濃縮した。濃縮液のｐ
Ｈを７に調製し、１０ｍｌのダウエックス２×８カラム
（Ｃｌ-型）に付し、流速２ｍｌ／ｍｉｎ（ＳＶ＝１
２）で２００ｍｌの蒸留水を通液させたのち、１００ｍ
ｌの４０ｍＭ ＮａＣｌを通液し、目的の６−Ｏ−α−
Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を溶出させ
た。この画分をマイクロアシライザー（旭化成社製）に
より脱塩し、凍結乾燥して１２．３ｇの６−Ｏ−α−Ｄ
−ガラクトピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸を得た。こ
のときの精製収率は７０．３％であり、純度は９３．５
％であった。
【００２７】実施例、比較例より明らかなように、本発
明では、精製に用いるカラムが一種類であるにもかかわ
らず、従来の方法と比較して同程度か、それ以上の精製
収率、純度のＬ−アスコルビン酸糖誘導体を得ることが
できた。
明では、精製に用いるカラムが一種類であるにもかかわ
らず、従来の方法と比較して同程度か、それ以上の精製
収率、純度のＬ−アスコルビン酸糖誘導体を得ることが
できた。
【００２８】
【発明の効果】本発明によると陰イオン交換カラムのみ
で容易にＬ−アスコルビン酸糖誘導体を高い収率で精製
することができる。
で容易にＬ−アスコルビン酸糖誘導体を高い収率で精製
することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈍寳 宗彦 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 酵素反応、菌体反応または有機化学的反
応により合成されたＬ−アスコルビン酸の６位に糖類が
結合した誘導体の含有液をＣｌ- 型の強塩基性陰イオン
交換樹脂を用いて処理することを特徴とするＬ−アスコ
ルビン酸糖誘導体の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4054693A JPH06228183A (ja) | 1993-02-03 | 1993-02-03 | Ｌ−アスコルビン酸糖誘導体の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4054693A JPH06228183A (ja) | 1993-02-03 | 1993-02-03 | Ｌ−アスコルビン酸糖誘導体の精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06228183A true JPH06228183A (ja) | 1994-08-16 |
Family
ID=12583451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4054693A Pending JPH06228183A (ja) | 1993-02-03 | 1993-02-03 | Ｌ−アスコルビン酸糖誘導体の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06228183A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0779286A1 (de) * | 1995-12-14 | 1997-06-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Herstellung von Ascorbinsäure |
| US6248905B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-06-19 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Acyl derivatives of glycosyl-L-ascorbic acid |
| EP1162205A2 (en) * | 2000-06-08 | 2001-12-12 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for producing 2-O-Alpha-D-Glucopyranosyl-L-ascorbic acid in high content |
-
1993
- 1993-02-03 JP JP4054693A patent/JPH06228183A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0779286A1 (de) * | 1995-12-14 | 1997-06-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Herstellung von Ascorbinsäure |
| US6248905B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-06-19 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Acyl derivatives of glycosyl-L-ascorbic acid |
| EP1162205A2 (en) * | 2000-06-08 | 2001-12-12 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for producing 2-O-Alpha-D-Glucopyranosyl-L-ascorbic acid in high content |
| EP1162205A3 (en) * | 2000-06-08 | 2002-02-06 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for producing 2-O-Alpha-D-Glucopyranosyl-L-ascorbic acid in high content |
| US6576446B2 (en) | 2000-06-08 | 2003-06-10 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for producing high 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid |
| KR100776895B1 (ko) * | 2000-06-08 | 2007-11-19 | 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조 | 2-Ｏ-α-Ｄ-글루코피라노실-Ｌ-아스코르브산 고함유물의제조방법 |
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