JP4697697B2 - ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、安定型Ｌ−アスコルビン酸である２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸（以下、特に断りがない限り、「αＧ−ＡＡ」と略記する。）高含有物の新規な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
αＧ−ＡＡは、特開平３−１８３４９２号公報にも開示されているように、下記に示すような優れた理化学的性質を有していることが知られている。即ち、αＧ−ＡＡは、
【０００３】
（１）直接還元性を示さず、極めて安定で、Ｌ−アスコルビン酸と異なりメイラード反応を起こし難く、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、脂質、糖質、生理活性物質などと共存させても、無用の反応を起こすことがないばかりか、これらの物質を安定化させる効果すら持っている。
（２）加水分解を受けてＬ−アスコルビン酸を生成し、Ｌ−アスコルビン酸と同様の還元作用、抗酸化作用を示す。
（３）体内の酵素により、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースとに容易に加水分解され、Ｌ−アスコルビン酸本来の生理活性を示す。又、ビタミンＥ、ビタミンＰなどとの併用により、その生理活性を増強することができる。
（４）Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物などとを経口摂取することにより、生体内でも自然に少量ながら生成し、代謝される物質であることから、その安全性は極めて高い。
（５）結晶形態のαＧ−ＡＡは、実質的に非吸湿性又は難吸湿性であるにもかかわらず、水に対して大きな溶解速度、溶解度を有しており、粉末、顆粒、錠剤などのビタミン剤、サンドクリーム、チョコレート、チューインガム、即席ジュース、即席調味料などの飲食物のためのビタミンＣ強化剤、呈味改善剤、酸味剤、安定剤などとして有利に利用できる。
（６）結晶形態のαＧ−ＡＡは、実質的に非吸湿性又は難吸湿性であり、保存中、固結することなく流動性を保持していることから、その取扱いは容易で非晶質の場合と比較して、その包装、輸送、貯蔵に要する物的、人的経費が大幅に削減できる。
【０００４】
現在、αＧ−ＡＡは、主として化粧品の分野に広く利用されている。更に、他の用途、例えば、食品、医薬品、飼料、餌料或いは工業用原料など、より広範な分野への用途開発が期待されている。
【０００５】
αＧ−ＡＡの代表的な工業的製造方法としては、例えば、特開平３−１８３４９２号公報に開示された製造方法を例示することができる。この製造方法は、図１に示すように、先ず、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素又は糖転移酵素とグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）とを反応させてαＧ−ＡＡを生成させて、αＧ−ＡＡと未反応のＬ−アスコルビン酸の他、α−グルコシル糖化合物やα−グルコシル糖化合物由来の糖類を含む溶液を得、次いで、この溶液を濾過し、Ｈ形陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて脱ミネラルした後、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰イオン交換樹脂に吸着させ、次いで、陰イオン交換樹脂を水洗して糖類をカラムから除去し、更に、溶離液を用いてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰イオン交換樹脂から共に溶出させた後、得られる溶出液を濃縮し、この濃縮液を強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、αＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を濃縮してαＧ−ＡＡ高含有物を得る方法である。
【０００６】
前記した陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーに於いては、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とが共に脱着し溶出してくることから、得られるαＧ−ＡＡはＬ−アスコルビン酸との混合物である。そのため、αＧ−ＡＡ高含有物を得るためには、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを含む溶出液を一旦濃縮した後、更に強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけてαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画することが必要不可欠であった。
【０００７】
このように、従来のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法に於いては、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーと強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーとによる２段階のカラムクロマトグラフィーが必要不可欠であり、しかも、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーで得られる溶出液は、強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかける前に一旦濃縮しなければならず、その分、操作が煩雑となり、αＧ−ＡＡ高含有物の収率低下や製造コストが上昇するなどの欠点があった。
【０００８】
斯かる状況下、操作性、製造コスト、及び収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物の工業的製造方法が鶴首されていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、操作性、製造コスト、及び収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物の工業的製造方法を提供することにある。本発明で言うαＧ−ＡＡ高含有物とは、αＧ−ＡＡを固形分当たり８０％（ｗ／ｗ）（本願明細書に於いては、特に断りがない限り、「％（ｗ／ｗ）」を「％」と略記する。）以上、好ましくは、９０％以上含有するαＧ−ＡＡ高含有物を意味し、その形態としては、溶液状、ペースト状、固体状又は粉末状の何れのものであってもよい。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記従来技術に鑑み、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶液をカラムに充填したイオン交換樹脂と接触させて、より簡便にαＧ−ＡＡ高含有物を得る方法について鋭意研究を続けた。その結果、カラムに充填するイオン交換樹脂として、陰イオン交換樹脂を用い、この陰イオン交換樹脂にαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを吸着させ、溶離液として０．５Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給してαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を採取することにより本発明の課題を達成できることを見出した。
【００１１】
即ち、本発明のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法の特徴は、図２に示すように、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素又は糖転移酵素とグルコアミラーゼとを反応させてαＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶液を得、この溶液を濾過し、脱ミネラルした後、得られる溶液を原料溶液として、カラムに充填した陰イオン交換樹脂と接触させてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰イオン交換樹脂に吸着せしめ、次いで陰イオン交換樹脂を水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給してαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を濃縮してαＧ−ＡＡ高含有物を採取する方法である。このように、本発明によれば、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離を陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーのみにより分離できることとなったことから、図１に示す従来の製造方法に於いては必要不可欠であった強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーが不要となった。その結果、操作性、経済性、収率の何れの点に於いても優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物を工業的規模で製造できることとなった。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明で用いる原料溶液について述べる。当該原料溶液は、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する水溶液を意味する。斯かる原料溶液の製造方法としては、酵素法であれ合成法であれ、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶液が得られる限り特に問わない。例えば、その代表的な製造方法として、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に糖転移酵素又は糖転移酵素とグルコアミラーゼとを作用させる方法を例示できる。具体的には、特開平３−１８３４９２号公報に記載された方法を例示することができる。
【００１３】
本発明で用いる原料溶液の固形分濃度は、通常、１乃至７５％、望ましくは、１０乃至７０％、より望ましくは、２０乃至６０％、更に望ましくは、３０乃至４０％の範囲が好適に使用される。又、原料溶液のｐＨは、アルカリ性側ではＬ−アスコルビン酸が分解し易いので酸性側のｐＨが望ましく、通常、ｐＨ７未満、望ましくは、ｐＨ１．０乃至６．５、更に望ましくは、ｐＨ１．５乃至６．０の範囲とするのが望ましい。更に、ＯＨ形陰イオン交換樹脂を用いることから、原料溶液を陰イオン交換樹脂と接触させる前に、原料溶液中に存在する陰イオン、有機酸、アミノ酸等の不純物をできるだけ除去又は低減させておくのが望ましい。
【００１４】
本発明で言うＬ−アスコルビン酸とは、通常、遊離のＬ−アスコルビン酸のみならず、Ｌ−アスコルビン酸のアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩などのＬ−アスコルビン酸の塩、又は、それらの混合物を包含する場合がある。つまり、本発明の糖転移反応に用いるＬ−アスコルビン酸は、遊離のＬ−アスコルビン酸だけでなく、本発明の実施を妨げない限り、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸カルシウムなどのＬ−アスコルビン酸の塩、及びそれらの混合物を包含するものとする。又、本発明で言うαＧ−ＡＡについても、遊離の酸のみならず、本発明の実施を妨げない限りその塩をも包含するものとする。
【００１５】
更に、本発明で言うα−グルコシル糖化合物は、同時に用いる糖転移酵素の作用により、Ｌ−アスコルビン酸にα−Ｄ−グルコシル残基が等モル以上結合したαＧ−ＡＡを含むα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成し得るものであればよく、例えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオースなどのマルトオリゴ糖の他、デキストリン、シクロデキストリン、アミロースなどの澱粉部分加水分解物、更には、液化澱粉、糊化澱粉、溶性澱粉などを例示できる。αＧ−ＡＡの生成を容易にするためには、用いる糖転移酵素に好適なα−グルコシル糖化合物を選択すればよい。例えば、糖転移酵素として、α−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０）を用いる場合には、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオースなどのマルトオリゴ糖、又は、ＤＥ約５乃至６０のデキストリン、澱粉部分加水分解物などが好適に用いられる。又、糖転移酵素として、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９）を用いる場合には、シクロデキストリン又はＤＥ１未満の澱粉糊化物からＤＥ約６０のデキストリンまでの澱粉部分加水分解物などが好適に用いられる。更に、糖転移酵素として、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）を用いる場合には、ＤＥ１未満の糊化澱粉からＤＥ約３０のデキストリンまでの澱粉部分加水分解物などが好適に使用される。
【００１６】
前記糖転移反応に用いるＬ−アスコルビン酸の濃度（ｗ／ｖ％）は、通常、１ｗ／ｖ％以上、望ましくは、約２乃至３０ｗ／ｖ％が好適であり、α−グルコシル糖化合物の濃度は、Ｌ−アスコルビン酸の濃度に対して、通常、約０．５乃至３０倍の範囲が望ましい。
【００１７】
本発明に用いる糖転移酵素は、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物を含有する水溶液に作用させるとき、Ｌ−アスコルビン酸を分解せずに、Ｌ−アスコルビン酸の２位の炭素のアルコール基にα−グルコシル基を１個以上糖転移したαＧ−ＡＡなどのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成し得るものである限り、その性質、性状、由来は特に問わない。例えば、前記糖転移酵素として用いることのできるα−グルコシダーゼとしては、マウスの腎臓、ラットの腸粘膜、イヌ、ブタの小腸など動物由来のもの、イネ種子、トウモロコシ種子など植物由来のもの、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属などに属するカビ、又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属などに属する酵母などの微生物由来のものが、更に、他の糖転移酵素であるシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クレブシーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属などに属する細菌由来のものが、又、他の糖転移酵素であるα−アミラーゼとしては、バチルス属などに属する細菌由来のものを例示できる。
【００１８】
これらの糖転移酵素は、必ずしも精製品である必要はなく、粗酵素であっても本発明に於いては使用することができる。しかしながら、好適には、斯かる粗酵素は、使用前、公知の方法で精製して用いられる。又、市販の糖転移酵素を利用することも可能である。使用に際し、これら酵素を固定化して用いることも随意である。糖転移酵素反応時のｐＨと温度は、糖転移酵素がＬ−アスコルビン酸及びα−グルコシル糖化合物に作用してαＧ−ＡＡが生成する条件であればよく、通常、ｐＨ３乃至９、望ましくは、ｐＨ４乃至７、温度約２０乃至８０℃の範囲から選ばれる。使用酵素量と反応時間とは密接に関連しており、通常、経済性の観点から、約３乃至８０時間で反応が終了するように酵素量を設定する。又、固定化された糖転移酵素をバッチ式で繰り返し用いたり、連続式で用いることも有利に実施できる。
【００１９】
又、酵素反応中、Ｌ−アスコルビン酸は反応系に存在する酸素による酸化分解を受け易いので、できるだけ低酸素又は無酸素条件下、或いは還元条件下に保ち、必要ならば、チオ尿素、亜硫酸塩などを共存せるのがよい。又、Ｌ−アスコルビン酸は光分解を受け易いことから、暗所又は遮光下で反応させるのが望ましい。
【００２０】
更に、必要ならば、糖転移反応能を有する微生物を、その増殖用培地中にＬ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを共存させて、αＧ−ＡＡを含むα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させることも可能である。
【００２１】
糖転移酵素の作用により生成するα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸は、Ｌ−アスコルビン酸の２位の炭素のアルコール基に１個又は複数のα−Ｄ−グルコシル基が結合した化合物である。これらα−Ｄ−グルコシル基の数は、通常、２乃至７個程度で、α−Ｄ−グルコシル基同士はα−１，４結合で結合している。具体的な化合物としては、αＧ−ＡＡ、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトテトラオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトペンタオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトヘキサオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトヘプタオシル−Ｌ−アスコルビン酸などを例示できる。α−グルコシダーゼによって生成させる場合には、通常、αＧ−ＡＡのみが生成するが、使用する糖転移酵素の種類や反応条件によっては、αＧ−ＡＡと共に、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸や２−Ｏ−α−Ｄ−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を共に生成させることもできる。
【００２２】
シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼやα−アミラーゼによってα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させる場合には、一般に、α−グルコシダーゼの場合よりもα−Ｄ−グルコシル基の結合数の多いα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を混在生成させることができる。又、使用するα−グルコシル糖化合物の種類にもよるが、一般的には、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの場合には、Ｌ−アスコルビン酸にα−Ｄ−グルコシル基が１乃至７個程度結合したα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成し、α−アミラーゼの場合には、生成するα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸の種類が少ない傾向にある。
【００２３】
又、αＧ−ＡＡを生成させるに際し、糖転移酵素とグルコアミラーゼとを併用してαＧ−ＡＡの生成率を高めることもできる。一般的には、糖転移反応効率を高めるために、予め、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物に糖転移酵素を作用させて、Ｌ−アスコルビン酸にα−Ｄ−グルコシル残基を等モル以上転移させてαＧ−ＡＡを含むα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成せしめ、次いでこれにグルコアミラーゼを作用させてαＧ−ＡＡ以外のα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸に結合したα−Ｄ−グルコシル残基を加水分解してαＧ−ＡＡを生成、蓄積させるのが望ましい。
【００２４】
グルコアミラーゼとしては、微生物、植物、動物など各種起源のものが利用できる。通常、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する細菌由来の市販のグルコアミラーゼが有利に利用できる。又、グルコアミラーゼと共にβ−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）を併用することも随意である。
【００２５】
本発明で用いる陰イオン交換樹脂について説明するに、その母体構造は、ゲル形、巨大網目構造型（ＭＲ形）、或いは多孔型の何れのものでもよく、その基材は、強塩基性又は弱塩基性のスチレン系（スチレン−ジビニルベゼン共重合体）、アクリル系の陰イオン交換樹脂の何れのものも用いることができる。又、陰イオン交換樹脂の交換基は、陰イオン吸着能を有するものである限り使用でき、強塩基性（Ｉ型、ＩＩ型）、中塩基性、弱塩基性のいずれの陰イオン交換樹脂も用いることができる。市販品としては、例えば、ローム・アンド・ハース社製の商品名『アンバーライトＩＲＡ６７』、『アンバーライトＩＲＡ９６ＳＢ』、『アンバーライトＩＲＡ４００』、『アンバーライトＩＲＡ４０１Ｂ』、『アンバーライトＩＲＡ４０２』、『アンバーライトＩＲＡ４０２ＢＬ』、『アンバーライトＩＲＡ４１０』、『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ』、『アンバーライトＩＲＡ４４０Ｂ』、『アンバーライトＩＲＡ４５８ＲＦ』、『アンバーライトＩＲＡ４７３』、『アンバーライトＩＲＡ４７８ＲＦ』、『アンバーライトＩＲＡ９００』、『アンバーライトＩＲＡ９０４』、『アンバーライトＩＲＡ９１０ＣＴ』、『アンバーライトＩＲＡ９５８』、『アンバーライトＸＴ５００７』、『アンバーライトＸＴ６０５０ＲＦ』、『アンバーライトＸＥ５８３』及び『アンバーライトＣＧ４００』、三菱化学社製造の商品名『ダイヤイオンＳＡ１０Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ１１Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ１２Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ２０Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ２１Ａ』、『ダイヤイオンＮＳＡ１００』、『ダイヤイオンＰＡ３０８』、『ダイヤイオンＰＡ３１２』、『ダイヤイオンＰＡ３１６』、『ダイヤイオンＰＡ４０８』、『ダイヤイオンＰＡ４１２』、『ダイヤイオンＰＡ４１８』、『ダイヤイオンＨＰＡ２５』、『ダイヤイオンＨＰＡ７５』、『ダイヤイオンＷＡ１０』、『ダイヤイオンＷＡ２０』、『ダイヤイオンＷＡ２１Ｊ』、『ダイヤイオンＷＡ３０』及び『ダイヤイオンＤＣＡ１１』、ダウケミカル社製造の商品名『ダウエックスＳＢＲ』、『ダウエックスＳＢＲ−Ｐ−Ｃ』、『ダウエックスＳＡＲ』、『ダウエックスＭＳＡ−１』、『ダウエックスＭＳＡ−２』、『ダウエックスＭＳＡ−２２』、『ダウエックスＭＳＡ−６６』、『ダウエックスＭＷＡ−１』、『ダウエックスモノスフィアー５５０Ａ』、『ダウエックスマラソンＡ』、『ダウエックスマラソンＡ２』、『ダウエックス１×２』、『ダウエックス１×４』、『ダウエックス１×８』及び『ダウエックス２×８』などの陰イオン交換樹脂を例示できる。これら陰イオン交換樹脂の内、『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ』、『ダイヤイオンＷＡ３０』、『アンバーライトＩＲＡ４７８ＲＦ』及び『アンバーライトＩＲＡ９１０ＣＴ』は、αＧ−ＡＡ及びＬ−アスコルビン酸の吸着量が大で、それらの分離能も良好であり、本発明に於いては好適に用いることができる。陰イオン交換樹脂のイオン形としては、ＯＨ形に加えて、Ｃｌ形やＣＨ３ＣＯＯ形のものも適宜使用できる。本発明に於いては、吸着量の点で、ＯＨ形のものが優れており有利に用いられる。
【００２６】
本発明で用いる溶離液としては、塩酸、硫酸、硝酸、クエン酸などの１種又は２種以上の酸の水溶液や、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム等の１種又は２種以上の塩類の水溶液を用いることができる。又、これら１種又は２種以上の酸及び塩類を適宜組み合わせて用いることも可能である。溶離液として、塩類の水溶液を用いる場合には、カラムに充填した陰イオン交換樹脂から脱着し、溶出した溶出液中に含まれるαＧ−ＡＡは、通常、塩形である。この塩形のαＧ−ＡＡは、必要ならば、Ｈ形陽イオン交換樹脂を用いて脱ミネラルして遊離の酸形のαＧ−ＡＡとすることができる。又、溶離液として、酸の水溶液を用いる場合には、カラムに充填した陰イオン交換樹脂から脱着し、溶出した溶出液中に含まれるαＧ−ＡＡは、通常、遊離の酸形のαＧ−ＡＡである。本発明に於いては、溶離液として用いる酸の水溶液の内、経済性と陰イオン交換樹脂の再生のし易さの観点から塩酸の水溶液が好適に用いられる。又、溶離液として用いる酸又は塩類の水溶液濃度は必ずしも一定である必要はなく、目的に応じて、段階的に変更したり、グラジエント溶出することも可能である。又、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の脱着、溶出に使用した溶離液は、製造コスト低減の目的で、回収して再利用することもできる。
【００２７】
次に、前記した原料溶液、陰イオン交換樹脂、及び溶離液を用いて、αＧ−ＡＡ高含有物を得る方法について述べる。前記したように、本発明で用いる原料溶液は、通常、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸と共に、α−グルコシル糖化合物、このα−グルコシル糖化合物由来のＤ−グルコースやα−グルコシル糖化合物の分解物などの糖類、更には、塩類を含有している。したがって、本発明に於いては、原料溶液を先ず濾過し、Ｈ形陽イオン交換樹脂又は活性炭処理とＨ形陽イオン交換樹脂により脱ミネラル処理を行う。次いで、脱ミネラル処理液をカラムに充填した陰イオン交換樹脂と接触させて、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを吸着せしめ、次いで水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給して、αＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を採取する。この際、分離された未反応のＬ−アスコルビン酸及びα−グルコシル糖化合物は、経済性を考慮して、再度、次の糖転移反応の原料として用いることもできる。
【００２８】
本発明に於いて用いるカラムは、適宜形状、大きさ、長さの１乃至複数のカラムを直列又は並列に配置して用いればよい。複数のカラムを用いる場合、適宜の樹脂層長となるように、カラムを直列接続して用いることができる。原料溶液を陰イオン交換樹脂に通液するときの流速は、ＳＶ５以下が望ましく、より望ましくは、ＳＶ１乃至３の範囲が望ましい。又、溶離液を陰イオン交換樹脂に供給するときの流速は、ＳＶ１以下が望ましく、より望ましくは、ＳＶ０．３乃至０．７の範囲が望ましい。カラムから脱着し、溶出してくるαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含画分の溶出順序は、使用する陰イオン交換樹脂の種類、殊に、陰イオン交換樹脂の母体構造や官能基の種類により変えることができる。カラム操作時の温度は、αＧ−ＡＡやＬ−アスコルビン酸の温度による分解の影響を考慮して、通常、０乃至８０℃、望ましくは、１０乃至４０℃、更に望ましくは、１５乃至２５℃の範囲が望ましい。又、使用する酸及び／又は塩類の水溶液に関し、０．５Ｎ以上の酸及び／又は塩類の水溶液を用いる場合、αＧ−ＡＡを陰イオン交換樹脂から迅速かつ容易に脱着し、溶出させることができるものの、αＧ−ＡＡと共にＬ−アスコルビン酸も脱着し、溶出してくることから、両者の分離が不十分となり、高純度のαＧ−ＡＡ高含有画分を高収率で得ることは困難となる。ところが、酸及び／又は塩類の水溶液濃度が全体で０．５Ｎ未満、望ましくは、０．１乃至０．４５Ｎ、更に望ましくは、０．２乃至０．３Ｎのとき、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸は、カラムに充填した陰イオン交換樹脂からそれぞれの高含有画分として脱着し、溶出してくることから、両者を効率よく分離でき、両者の高含有画分を高収率で採取することができる。尚、酸及び／又は塩類の水溶液濃度を０．１Ｎ未満とした場合でも、αＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分を採取することは可能である。しかしながら、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の陰イオン交換樹脂からの脱着、溶出時間が長くなると共に、得られるαＧ−ＡＡの濃度が低くなる傾向にある。
【００２９】
カラムに充填した陰イオン交換樹脂から脱着し、溶出してきたαＧ−ＡＡ高含有画分は、必要により、精製した後、濃縮して過飽和溶液にすれば、容易に結晶形態のαＧ−ＡＡが析出してくるので、結晶形態のαＧ−ＡＡ高含有物として採取することも随意である。一方、Ｌ−アスコルビン酸高含有画分は、αＧ−ＡＡを得るための酵素反応の原料として再利用することも可能である。又、前記αＧ−ＡＡ高含画分、又はＬ−アスコルビン酸高含有画分以外の画分である。しかしながら、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離が不完全な両者の混合画分を、再度、本発明の原料溶液として用いると、より高純度のαＧ−ＡＡ高含有物とＬ−アスコルビン酸高含有物を高収率で容易に得ることができる利点がある。
【００３０】
このように、本発明のαＧ−ＡＡの製造方法は、操作性、製造コストの点で優れているだけでなく、固形分当たりの純度が約９０％以上の高品質のαＧ−ＡＡ高含有物を、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率約８５％以上、より好ましくは、９０％以上で得ることを可能にしたものである。
【００３１】
斯くして得られた本発明のαＧ−ＡＡ高含有物は、安定型Ｌ−アスコルビン酸高含有物として、ビタミンＣ強化剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤などとして、各種食品、化粧品、医薬品、飼料、餌料、工業用原料などの広範な用途に有利に用いることができる。
【００３２】
以下、実験により本発明を更に詳細に説明する。
【００３３】
【実験】
＜陰イオン交換樹脂に吸着したαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の分離と溶出に及ぼす溶離液の濃度の影響＞
デキストリン（ＤＥ約６）２重量部を水６重量部に加熱溶解し、これを還元下に保って、Ｌ−アスコルビン酸１重量部を加え、ｐＨ５．５、６０℃に維持しつつ、これにシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）をデキストリングラム当り４００単位加えて２４時間反応させた。本反応液をＵＦ膜で濾過して酵素を除去した後、濾液を５５℃、ｐＨ５．０に調整し、これにグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製）を前記デキストリングラム当り１０単位加えて２４時間反応させた。本反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、得られた濾液を固形分濃度約４０％に濃縮した。この濃縮液中の固形分組成は、高速液体クロマトグラフィーにより分析した（高速液体クロマトグラフィーで用いた装置は、島津製作所製『ＬＣ−６Ａ』；カラムは、島津テクノリサーチ株式会社製『ＳＴＲカラム ＯＤＳ−ＩＩ』；溶離液は、０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ３ＰＯ４（ｐＨ２．０）；流速は、０．５ｍｌ／ｍｉｎ；検出に用いた示差屈折計は、東ソー株式会社製『ＲＩ−８０２０』。）。その結果、濃縮液中の固形分組成は、αＧ−ＡＡ約３１％、Ｌ−アスコルビン酸約２１％、Ｄ−グルコース約３１％、及びα−グルコシル糖化合物約１７％であった。前記活性炭で脱色濾過して得た濾液を強酸性陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ形）』、三菱化学株式会社製）１００ｍｌを充填したカラム（内径２０ｍｍ、長さ３５０ｍｍ、カラム内温度２５℃）にＳＶ２で通液して脱ミネラルした。得られた固形分濃度３０％の溶液を３３０ｇずつ、２００ｍｌの陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）を充填した７本のカラム（それぞれ内径２０ｍｍ、長さ６５０ｍｍ、カラム内温度２５℃）にそれぞれＳＶ２で通液し、その後、各カラムに水約１，０００ｍｌをＳＶ２で通液して陰イオン交換樹脂を水洗し、非吸着成分を溶出させた。次いで、７本のカラムにそれぞれ０．１Ｎ、０．１５Ｎ、０．２Ｎ、０．３Ｎ、０．４Ｎ、０．４５Ｎ又は０．５Ｎの塩酸水溶液をＳＶ０．５で通液し、カラム出口の固形分濃度が０．２％以上となった時点から溶出液の回収を始め、カラム出口の溶出液がそれぞれ０．１Ｎ、０．１５Ｎ、０．２Ｎ、０．３Ｎ、０．４Ｎ、０．４５Ｎ又は０．５Ｎの塩酸水溶液に置換されるまで分画を続けた。分画はフラクションコレクターを用いて、２０分毎に分画してサンプリングし、各サンプル中の固形分組成を上記したと同様にして高速液体クロマトグラフィーで分析した。その分析結果に基づいて、溶離液として０．１Ｎ及び０．５Ｎの塩酸水溶液を用いたときの溶出液中の固形分当たりの各成分の濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を図３、図４にそれぞれ示す。尚、図３、図４に於いて、縦軸は溶出液中の固形分当たりの各成分の濃度（％（ｗ／ｗ））を、横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン酸を、又「−△−」は糖類を示す。図３から、塩酸の水溶液濃度０．１Ｎの条件下では、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離は良好である。しかしながら、塩酸の水溶液濃度が高い場合と比較して、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の溶出は遅くなり、得られるαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分の濃度が若干低くなる傾向を示した。又、図４から、脱着剤として用いる塩酸の水溶液濃度が０．５Ｎの条件下では、塩酸の水溶液濃度が低い場合と比較して、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の溶出が早くなり、両者の分離が不十分となり、αＧ−ＡＡ高含有画分の収率が低くなることが判明した。又、図３、図４から明らかなように、糖類の大部分は陰イオン交換樹脂に吸着しないものの、僅かながら陰イオン交換樹脂に吸着し、溶離液で溶離されることが判明した。
【００３４】
更に、具体的には図示しないものの、脱着剤として用いる塩酸の水溶液濃度が０．１乃至０．４５Ｎの条件下では、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の分離、溶出が良好で、殊に、脱着剤として用いる塩酸の水溶液濃度が０．２乃至０．３Ｎの条件下での溶出が好適であることが判明した。又、溶離液として、これら塩酸の水溶液を用いて得られた結果は、塩酸の水溶液に代えて他の種類の酸又は塩類、及び各種酸及び塩類を併用する水溶液を溶離液として用いた場合、更に、陰イオン交換樹脂の種類を変えた場合にも同様に当てはまる結果である。
【００３５】
以下、本発明のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法を実施例により詳細に説明する。
【００３６】
【実施例１】
＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞
溶離液として、０．２５Ｎ塩酸水溶液を使用した以外は実験と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。本実施例に於ける、陰イオン交換樹脂から溶出してくる溶出液を前記実験と同様にして分画してサンプリングし、各サンプル中の固形分組成を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その分析結果に基づいて溶出液中の各成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を図５に示す。尚、図５に於いて、縦軸は溶出液中の固形分当たりの各成分の固形分濃度（％（ｗ／ｗ））を、横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン酸を、「−△−」は糖類を示す。本品は固形分当たり純度約９３％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９２％であった。尚、図５から明らかなように、糖類の大部分は陰イオン交換樹脂に吸着しないものの、僅かながら陰イオン交換樹脂に吸着し、溶離液で溶出されることが判明した。
【００３７】
【実施例２】
＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞
デキストリン（ＤＥ約６）２重量部を水６重量部に加熱溶解し、これを還元下に保って、Ｌ−アスコルビン酸１重量部を加え、ｐＨ５．５、６０℃に維持しつつ、これにシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）をデキストリングラム当り４００単位加えて２４時間反応させた。本反応液をＵＦ膜で濾過して酵素を除去した後、濾液を５５℃、ｐＨ５．０に調整し、これにグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社販売）を前記デキストリングラム当り１０単位加えて２４時間反応させた。本反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、得られる濾液を固形分濃度約４０％に濃縮した。この濃縮液中の固形分組成を前記実験で用いたのと同じ高速液体クロマトグラフィー条件で分析したところ、αＧ−ＡＡ約３１％、Ｌ−アスコルビン酸約２１％、Ｄ−グルコース約３１％、及びα−グルコシル糖化合物約１７％であった。前記活性炭で脱色濾過して得た濾液を強酸性陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ形）』、三菱化学株式会社製）を１００ｍｌ充填したカラム（内径２０ｍｍ、長さ３５０ｍｍ、カラム内温度２５℃）にＳＶ２で通液して脱ミネラルした。得られた濃度３０％の溶液３３０ｇを２００ｍｌの陰イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＷＡ３０（ＯＨ形）』、三菱化学株式会社製）を充填したカラム（内径２０ｍｍ、長さ６５０ｍｍ、カラム内温度２５℃）にＳＶ２で通液し、その後、水約１，０００ｍｌをＳＶ２で通液して水洗し、非吸着成分を溶離させた。次いで、溶離液として０．２５Ｎ塩酸水溶液をＳＶ０．５で通液し、カラム出口の固形分濃度が０．２％以上となった時点から溶出液の回収を始め、カラム出口の溶出液が０．２５Ｎの塩酸水溶液に置換されるまで分画を続けた。この分画は、フラクションコレクターを用いて２０分毎に行い、得られた各画分の一部をサンプリングし、各サンプル中の固形分組成を前記実験と同様にして高速液体クロマトグラフィーで分析した。溶出液中の各成分の固形物濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を図６に示す。図６から明らかなように、本実施例に於いては、実施例１とは異なる陰イオン交換樹脂を用いたことから、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の溶出順序が逆転したけれども、実施例１と同様に、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離は良好で、所望のαＧ−ＡＡ高含有画分を回収してαＧ−ＡＡ高含有物を得た。尚、図６に於いて、縦軸は溶出液中の固形分当たりの各成分の濃度（％（ｗ／ｗ））を、横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン酸を、「−△−」は糖類を示す。図６から明らかなように、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸は陰イオン交換樹脂から良好に脱着、溶離し、所望のαＧ−ＡＡ高含有画分を回収してαＧ−ＡＡ高含有物を得た。本品は固形分当たり純度約９３％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９０％であった。尚、図６から明らかなように、糖類の大部分は陰イオン交換樹脂に吸着しないものの、僅かながら陰イオン交換樹脂に吸着し、溶離液で溶離されることが判明した。
【００３８】
【実施例３】
＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞
強酸性陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ形）』、三菱化学株式会社製）を充填したカラム（内径４００ｍｍ、長さ１，０００ｍｍ）を用いて脱ミネラルし、陰イオン交換樹脂として、ローム・アンド・ハース社製の陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ９１０ＣＴ（ＯＨ形）』）を充填したカラム（内径５６０ｍｍ、長さ１，０００ｍｍ、カラム内温度２５℃）を使用し、溶離液として０．３Ｎ硝酸水溶液を用いた以外は実施例２と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。本品は、液状αＧ−ＡＡ高含有物で、固形分当たり純度約９２％のαＧ−ＡＡ高含有物で、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９０％であった。次いで、この液状αＧ−ＡＡ高含有物を固形分濃度約７６％になるまで減圧濃縮し、得られた濃縮液を助晶缶にとり、結晶αＧ−ＡＡを種晶として１％加えて４０℃に保ち、ゆっくり攪拌しつつ徐冷して２日間かけて２５℃まで下げ、次いで、バスケット型遠心分離機で分蜜し、得られた結晶に少量の水をスプレーして洗浄し、結晶形態のαＧ−ＡＡを採取して、αＧ−ＡＡ高含有物を得た。本品は固形分当たり、純度約９９％のαＧ−ＡＡ高含有物であった。
【００３９】
【実施例４】
＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞
溶離液として、０．４５Ｎの塩酸水溶液を用いた以外は実施例２と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。実施例２同様、カラムに充填した陰イオン交換樹脂からのαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離は良好であった。本実施例で得られたαＧ−ＡＡ高含有物は、固形分当たり純度約９０％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９１％であった。
【００４０】
【実施例５】
＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞
強酸性陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ形）』、三菱化学株式会社製）を充填したカラム（内径８００ｍｍ、長さ１，６００ｍｍ）を用いて脱ミネラルし、陰イオン交換樹脂として、『アンバーライトＩＲＡ４７８ＲＦ（ＯＨ形）』（ローム・アンド・ハース社製）を充填したカラム（内径１，２００ｍｍ、長さ１，６００ｍｍ、カラム内温度２５℃）を使用し、溶離液として０．２Ｎ ＮａＣｌ水溶液を用いた以外は実施例２と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。本品は、αＧ−ＡＡのナトリウム塩で（αＧ−ＡＡ−Ｎａ）、固形分当たり純度約９０％のαＧ−ＡＡ−Ｎａを含有し、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡ−Ｎａの収率はモル比で約９０％であった。
【００４１】
【発明の効果】
上記したように、本発明によれば、原料溶液として、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶液を、カラムに充填した陰イオン交換樹脂と接触させてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰イオン交換樹脂に吸着せしめ、次いで陰イオン交換樹脂を水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給してαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を採取することにより、αＧ−ＡＡ高含有物とＬ−アスコルビン酸高含有物を高収率で得ることができるようになった。即ち、本発明によれば、従来のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法に於いて、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー後に必要不可欠とされていた強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーと、その処理前に必要とされていた濃縮工程とを省略できることから、その分、αＧ−ＡＡ高含有物の製造工程が簡略化され、製造コストが低減され、加えて高収率で高純度αＧ−ＡＡを得ることができることとなった。本発明の製造方法は、従来の製造方法とは違って、強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを経由する必要がないことから、従来の製造方法に於いて、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率が約７５乃至８０％どまりであったものを約８５％以上、より好ましくは、９０％以上にまで高めることが可能となった。
【００４２】
このように、本発明は、操作性、製造コスト、及び収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法を可能としたものである。又、本発明の製造方法により得られるαＧ−ＡＡ高含有物は、安定型Ｌ−アスコルビン酸高含有物として、ビタミンＣ強化剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤などとして、各種食品、化粧品、医薬品、飼料、餌料、工業用原料などの広範な用途に有利に用いることができる。
【００４３】
本発明は斯くも顕著なる作用効果を奏する発明であり、斯界に与える影響は誠に多大なものがある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、従来のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法に於ける製造工程の流れ図である。
【図２】図２は、本発明のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法に於ける製造工程の流れ図である。
【図３】図３は、溶離液として０．１Ｎ塩酸を用いて陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）からαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を示す図である。
【図４】図４は、溶離液として０．５Ｎ塩酸を用いて陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）からαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を示す図である。
【図５】図５は、溶離液として０．２５Ｎ塩酸を用いて陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）からαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を示す図である。
【図６】図６は、溶離液として０．２５Ｎ塩酸を用いて陰イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＷＡ３０（ＯＨ形）』、三菱化学株式会社製）からαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を示す図である。
【符号の説明】
−〇−．．．．αＧ−ＡＡ
−●−．．．．Ｌ−アスコルビン酸
−△−．．．．糖類
【発明の属する技術分野】
本発明は、安定型Ｌ−アスコルビン酸である２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸（以下、特に断りがない限り、「αＧ−ＡＡ」と略記する。）高含有物の新規な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
αＧ−ＡＡは、特開平３−１８３４９２号公報にも開示されているように、下記に示すような優れた理化学的性質を有していることが知られている。即ち、αＧ−ＡＡは、
【０００３】
（１）直接還元性を示さず、極めて安定で、Ｌ−アスコルビン酸と異なりメイラード反応を起こし難く、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、脂質、糖質、生理活性物質などと共存させても、無用の反応を起こすことがないばかりか、これらの物質を安定化させる効果すら持っている。
（２）加水分解を受けてＬ−アスコルビン酸を生成し、Ｌ−アスコルビン酸と同様の還元作用、抗酸化作用を示す。
（３）体内の酵素により、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グルコースとに容易に加水分解され、Ｌ−アスコルビン酸本来の生理活性を示す。又、ビタミンＥ、ビタミンＰなどとの併用により、その生理活性を増強することができる。
（４）Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物などとを経口摂取することにより、生体内でも自然に少量ながら生成し、代謝される物質であることから、その安全性は極めて高い。
（５）結晶形態のαＧ−ＡＡは、実質的に非吸湿性又は難吸湿性であるにもかかわらず、水に対して大きな溶解速度、溶解度を有しており、粉末、顆粒、錠剤などのビタミン剤、サンドクリーム、チョコレート、チューインガム、即席ジュース、即席調味料などの飲食物のためのビタミンＣ強化剤、呈味改善剤、酸味剤、安定剤などとして有利に利用できる。
（６）結晶形態のαＧ−ＡＡは、実質的に非吸湿性又は難吸湿性であり、保存中、固結することなく流動性を保持していることから、その取扱いは容易で非晶質の場合と比較して、その包装、輸送、貯蔵に要する物的、人的経費が大幅に削減できる。
【０００４】
現在、αＧ−ＡＡは、主として化粧品の分野に広く利用されている。更に、他の用途、例えば、食品、医薬品、飼料、餌料或いは工業用原料など、より広範な分野への用途開発が期待されている。
【０００５】
αＧ−ＡＡの代表的な工業的製造方法としては、例えば、特開平３−１８３４９２号公報に開示された製造方法を例示することができる。この製造方法は、図１に示すように、先ず、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素又は糖転移酵素とグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）とを反応させてαＧ−ＡＡを生成させて、αＧ−ＡＡと未反応のＬ−アスコルビン酸の他、α−グルコシル糖化合物やα−グルコシル糖化合物由来の糖類を含む溶液を得、次いで、この溶液を濾過し、Ｈ形陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて脱ミネラルした後、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰イオン交換樹脂に吸着させ、次いで、陰イオン交換樹脂を水洗して糖類をカラムから除去し、更に、溶離液を用いてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰イオン交換樹脂から共に溶出させた後、得られる溶出液を濃縮し、この濃縮液を強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、αＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を濃縮してαＧ−ＡＡ高含有物を得る方法である。
【０００６】
前記した陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーに於いては、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とが共に脱着し溶出してくることから、得られるαＧ−ＡＡはＬ−アスコルビン酸との混合物である。そのため、αＧ−ＡＡ高含有物を得るためには、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを含む溶出液を一旦濃縮した後、更に強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけてαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画することが必要不可欠であった。
【０００７】
このように、従来のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法に於いては、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーと強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーとによる２段階のカラムクロマトグラフィーが必要不可欠であり、しかも、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーで得られる溶出液は、強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかける前に一旦濃縮しなければならず、その分、操作が煩雑となり、αＧ−ＡＡ高含有物の収率低下や製造コストが上昇するなどの欠点があった。
【０００８】
斯かる状況下、操作性、製造コスト、及び収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物の工業的製造方法が鶴首されていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、操作性、製造コスト、及び収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物の工業的製造方法を提供することにある。本発明で言うαＧ−ＡＡ高含有物とは、αＧ−ＡＡを固形分当たり８０％（ｗ／ｗ）（本願明細書に於いては、特に断りがない限り、「％（ｗ／ｗ）」を「％」と略記する。）以上、好ましくは、９０％以上含有するαＧ−ＡＡ高含有物を意味し、その形態としては、溶液状、ペースト状、固体状又は粉末状の何れのものであってもよい。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記従来技術に鑑み、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶液をカラムに充填したイオン交換樹脂と接触させて、より簡便にαＧ−ＡＡ高含有物を得る方法について鋭意研究を続けた。その結果、カラムに充填するイオン交換樹脂として、陰イオン交換樹脂を用い、この陰イオン交換樹脂にαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを吸着させ、溶離液として０．５Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給してαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を採取することにより本発明の課題を達成できることを見出した。
【００１１】
即ち、本発明のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法の特徴は、図２に示すように、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素又は糖転移酵素とグルコアミラーゼとを反応させてαＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶液を得、この溶液を濾過し、脱ミネラルした後、得られる溶液を原料溶液として、カラムに充填した陰イオン交換樹脂と接触させてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰イオン交換樹脂に吸着せしめ、次いで陰イオン交換樹脂を水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給してαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を濃縮してαＧ−ＡＡ高含有物を採取する方法である。このように、本発明によれば、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離を陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーのみにより分離できることとなったことから、図１に示す従来の製造方法に於いては必要不可欠であった強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーが不要となった。その結果、操作性、経済性、収率の何れの点に於いても優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物を工業的規模で製造できることとなった。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明で用いる原料溶液について述べる。当該原料溶液は、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する水溶液を意味する。斯かる原料溶液の製造方法としては、酵素法であれ合成法であれ、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶液が得られる限り特に問わない。例えば、その代表的な製造方法として、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に糖転移酵素又は糖転移酵素とグルコアミラーゼとを作用させる方法を例示できる。具体的には、特開平３−１８３４９２号公報に記載された方法を例示することができる。
【００１３】
本発明で用いる原料溶液の固形分濃度は、通常、１乃至７５％、望ましくは、１０乃至７０％、より望ましくは、２０乃至６０％、更に望ましくは、３０乃至４０％の範囲が好適に使用される。又、原料溶液のｐＨは、アルカリ性側ではＬ−アスコルビン酸が分解し易いので酸性側のｐＨが望ましく、通常、ｐＨ７未満、望ましくは、ｐＨ１．０乃至６．５、更に望ましくは、ｐＨ１．５乃至６．０の範囲とするのが望ましい。更に、ＯＨ形陰イオン交換樹脂を用いることから、原料溶液を陰イオン交換樹脂と接触させる前に、原料溶液中に存在する陰イオン、有機酸、アミノ酸等の不純物をできるだけ除去又は低減させておくのが望ましい。
【００１４】
本発明で言うＬ−アスコルビン酸とは、通常、遊離のＬ−アスコルビン酸のみならず、Ｌ−アスコルビン酸のアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩などのＬ−アスコルビン酸の塩、又は、それらの混合物を包含する場合がある。つまり、本発明の糖転移反応に用いるＬ−アスコルビン酸は、遊離のＬ−アスコルビン酸だけでなく、本発明の実施を妨げない限り、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸カルシウムなどのＬ−アスコルビン酸の塩、及びそれらの混合物を包含するものとする。又、本発明で言うαＧ−ＡＡについても、遊離の酸のみならず、本発明の実施を妨げない限りその塩をも包含するものとする。
【００１５】
更に、本発明で言うα−グルコシル糖化合物は、同時に用いる糖転移酵素の作用により、Ｌ−アスコルビン酸にα−Ｄ−グルコシル残基が等モル以上結合したαＧ−ＡＡを含むα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成し得るものであればよく、例えば、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオースなどのマルトオリゴ糖の他、デキストリン、シクロデキストリン、アミロースなどの澱粉部分加水分解物、更には、液化澱粉、糊化澱粉、溶性澱粉などを例示できる。αＧ−ＡＡの生成を容易にするためには、用いる糖転移酵素に好適なα−グルコシル糖化合物を選択すればよい。例えば、糖転移酵素として、α−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０）を用いる場合には、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオースなどのマルトオリゴ糖、又は、ＤＥ約５乃至６０のデキストリン、澱粉部分加水分解物などが好適に用いられる。又、糖転移酵素として、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９）を用いる場合には、シクロデキストリン又はＤＥ１未満の澱粉糊化物からＤＥ約６０のデキストリンまでの澱粉部分加水分解物などが好適に用いられる。更に、糖転移酵素として、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）を用いる場合には、ＤＥ１未満の糊化澱粉からＤＥ約３０のデキストリンまでの澱粉部分加水分解物などが好適に使用される。
【００１６】
前記糖転移反応に用いるＬ−アスコルビン酸の濃度（ｗ／ｖ％）は、通常、１ｗ／ｖ％以上、望ましくは、約２乃至３０ｗ／ｖ％が好適であり、α−グルコシル糖化合物の濃度は、Ｌ−アスコルビン酸の濃度に対して、通常、約０．５乃至３０倍の範囲が望ましい。
【００１７】
本発明に用いる糖転移酵素は、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物を含有する水溶液に作用させるとき、Ｌ−アスコルビン酸を分解せずに、Ｌ−アスコルビン酸の２位の炭素のアルコール基にα−グルコシル基を１個以上糖転移したαＧ−ＡＡなどのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成し得るものである限り、その性質、性状、由来は特に問わない。例えば、前記糖転移酵素として用いることのできるα−グルコシダーゼとしては、マウスの腎臓、ラットの腸粘膜、イヌ、ブタの小腸など動物由来のもの、イネ種子、トウモロコシ種子など植物由来のもの、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属などに属するカビ、又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属などに属する酵母などの微生物由来のものが、更に、他の糖転移酵素であるシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クレブシーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属などに属する細菌由来のものが、又、他の糖転移酵素であるα−アミラーゼとしては、バチルス属などに属する細菌由来のものを例示できる。
【００１８】
これらの糖転移酵素は、必ずしも精製品である必要はなく、粗酵素であっても本発明に於いては使用することができる。しかしながら、好適には、斯かる粗酵素は、使用前、公知の方法で精製して用いられる。又、市販の糖転移酵素を利用することも可能である。使用に際し、これら酵素を固定化して用いることも随意である。糖転移酵素反応時のｐＨと温度は、糖転移酵素がＬ−アスコルビン酸及びα−グルコシル糖化合物に作用してαＧ−ＡＡが生成する条件であればよく、通常、ｐＨ３乃至９、望ましくは、ｐＨ４乃至７、温度約２０乃至８０℃の範囲から選ばれる。使用酵素量と反応時間とは密接に関連しており、通常、経済性の観点から、約３乃至８０時間で反応が終了するように酵素量を設定する。又、固定化された糖転移酵素をバッチ式で繰り返し用いたり、連続式で用いることも有利に実施できる。
【００１９】
又、酵素反応中、Ｌ−アスコルビン酸は反応系に存在する酸素による酸化分解を受け易いので、できるだけ低酸素又は無酸素条件下、或いは還元条件下に保ち、必要ならば、チオ尿素、亜硫酸塩などを共存せるのがよい。又、Ｌ−アスコルビン酸は光分解を受け易いことから、暗所又は遮光下で反応させるのが望ましい。
【００２０】
更に、必要ならば、糖転移反応能を有する微生物を、その増殖用培地中にＬ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物とを共存させて、αＧ−ＡＡを含むα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させることも可能である。
【００２１】
糖転移酵素の作用により生成するα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸は、Ｌ−アスコルビン酸の２位の炭素のアルコール基に１個又は複数のα−Ｄ−グルコシル基が結合した化合物である。これらα−Ｄ−グルコシル基の数は、通常、２乃至７個程度で、α−Ｄ−グルコシル基同士はα−１，４結合で結合している。具体的な化合物としては、αＧ−ＡＡ、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトテトラオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトペンタオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトヘキサオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトヘプタオシル−Ｌ−アスコルビン酸などを例示できる。α−グルコシダーゼによって生成させる場合には、通常、αＧ−ＡＡのみが生成するが、使用する糖転移酵素の種類や反応条件によっては、αＧ−ＡＡと共に、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸や２−Ｏ−α−Ｄ−マルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を共に生成させることもできる。
【００２２】
シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼやα−アミラーゼによってα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させる場合には、一般に、α−グルコシダーゼの場合よりもα−Ｄ−グルコシル基の結合数の多いα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を混在生成させることができる。又、使用するα−グルコシル糖化合物の種類にもよるが、一般的には、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの場合には、Ｌ−アスコルビン酸にα−Ｄ−グルコシル基が１乃至７個程度結合したα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸が生成し、α−アミラーゼの場合には、生成するα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸の種類が少ない傾向にある。
【００２３】
又、αＧ−ＡＡを生成させるに際し、糖転移酵素とグルコアミラーゼとを併用してαＧ−ＡＡの生成率を高めることもできる。一般的には、糖転移反応効率を高めるために、予め、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物に糖転移酵素を作用させて、Ｌ−アスコルビン酸にα−Ｄ−グルコシル残基を等モル以上転移させてαＧ−ＡＡを含むα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成せしめ、次いでこれにグルコアミラーゼを作用させてαＧ−ＡＡ以外のα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸に結合したα−Ｄ−グルコシル残基を加水分解してαＧ−ＡＡを生成、蓄積させるのが望ましい。
【００２４】
グルコアミラーゼとしては、微生物、植物、動物など各種起源のものが利用できる。通常、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する細菌由来の市販のグルコアミラーゼが有利に利用できる。又、グルコアミラーゼと共にβ−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）を併用することも随意である。
【００２５】
本発明で用いる陰イオン交換樹脂について説明するに、その母体構造は、ゲル形、巨大網目構造型（ＭＲ形）、或いは多孔型の何れのものでもよく、その基材は、強塩基性又は弱塩基性のスチレン系（スチレン−ジビニルベゼン共重合体）、アクリル系の陰イオン交換樹脂の何れのものも用いることができる。又、陰イオン交換樹脂の交換基は、陰イオン吸着能を有するものである限り使用でき、強塩基性（Ｉ型、ＩＩ型）、中塩基性、弱塩基性のいずれの陰イオン交換樹脂も用いることができる。市販品としては、例えば、ローム・アンド・ハース社製の商品名『アンバーライトＩＲＡ６７』、『アンバーライトＩＲＡ９６ＳＢ』、『アンバーライトＩＲＡ４００』、『アンバーライトＩＲＡ４０１Ｂ』、『アンバーライトＩＲＡ４０２』、『アンバーライトＩＲＡ４０２ＢＬ』、『アンバーライトＩＲＡ４１０』、『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ』、『アンバーライトＩＲＡ４４０Ｂ』、『アンバーライトＩＲＡ４５８ＲＦ』、『アンバーライトＩＲＡ４７３』、『アンバーライトＩＲＡ４７８ＲＦ』、『アンバーライトＩＲＡ９００』、『アンバーライトＩＲＡ９０４』、『アンバーライトＩＲＡ９１０ＣＴ』、『アンバーライトＩＲＡ９５８』、『アンバーライトＸＴ５００７』、『アンバーライトＸＴ６０５０ＲＦ』、『アンバーライトＸＥ５８３』及び『アンバーライトＣＧ４００』、三菱化学社製造の商品名『ダイヤイオンＳＡ１０Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ１１Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ１２Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ２０Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ２１Ａ』、『ダイヤイオンＮＳＡ１００』、『ダイヤイオンＰＡ３０８』、『ダイヤイオンＰＡ３１２』、『ダイヤイオンＰＡ３１６』、『ダイヤイオンＰＡ４０８』、『ダイヤイオンＰＡ４１２』、『ダイヤイオンＰＡ４１８』、『ダイヤイオンＨＰＡ２５』、『ダイヤイオンＨＰＡ７５』、『ダイヤイオンＷＡ１０』、『ダイヤイオンＷＡ２０』、『ダイヤイオンＷＡ２１Ｊ』、『ダイヤイオンＷＡ３０』及び『ダイヤイオンＤＣＡ１１』、ダウケミカル社製造の商品名『ダウエックスＳＢＲ』、『ダウエックスＳＢＲ−Ｐ−Ｃ』、『ダウエックスＳＡＲ』、『ダウエックスＭＳＡ−１』、『ダウエックスＭＳＡ−２』、『ダウエックスＭＳＡ−２２』、『ダウエックスＭＳＡ−６６』、『ダウエックスＭＷＡ−１』、『ダウエックスモノスフィアー５５０Ａ』、『ダウエックスマラソンＡ』、『ダウエックスマラソンＡ２』、『ダウエックス１×２』、『ダウエックス１×４』、『ダウエックス１×８』及び『ダウエックス２×８』などの陰イオン交換樹脂を例示できる。これら陰イオン交換樹脂の内、『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ』、『ダイヤイオンＷＡ３０』、『アンバーライトＩＲＡ４７８ＲＦ』及び『アンバーライトＩＲＡ９１０ＣＴ』は、αＧ−ＡＡ及びＬ−アスコルビン酸の吸着量が大で、それらの分離能も良好であり、本発明に於いては好適に用いることができる。陰イオン交換樹脂のイオン形としては、ＯＨ形に加えて、Ｃｌ形やＣＨ３ＣＯＯ形のものも適宜使用できる。本発明に於いては、吸着量の点で、ＯＨ形のものが優れており有利に用いられる。
【００２６】
本発明で用いる溶離液としては、塩酸、硫酸、硝酸、クエン酸などの１種又は２種以上の酸の水溶液や、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム等の１種又は２種以上の塩類の水溶液を用いることができる。又、これら１種又は２種以上の酸及び塩類を適宜組み合わせて用いることも可能である。溶離液として、塩類の水溶液を用いる場合には、カラムに充填した陰イオン交換樹脂から脱着し、溶出した溶出液中に含まれるαＧ−ＡＡは、通常、塩形である。この塩形のαＧ−ＡＡは、必要ならば、Ｈ形陽イオン交換樹脂を用いて脱ミネラルして遊離の酸形のαＧ−ＡＡとすることができる。又、溶離液として、酸の水溶液を用いる場合には、カラムに充填した陰イオン交換樹脂から脱着し、溶出した溶出液中に含まれるαＧ−ＡＡは、通常、遊離の酸形のαＧ−ＡＡである。本発明に於いては、溶離液として用いる酸の水溶液の内、経済性と陰イオン交換樹脂の再生のし易さの観点から塩酸の水溶液が好適に用いられる。又、溶離液として用いる酸又は塩類の水溶液濃度は必ずしも一定である必要はなく、目的に応じて、段階的に変更したり、グラジエント溶出することも可能である。又、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の脱着、溶出に使用した溶離液は、製造コスト低減の目的で、回収して再利用することもできる。
【００２７】
次に、前記した原料溶液、陰イオン交換樹脂、及び溶離液を用いて、αＧ−ＡＡ高含有物を得る方法について述べる。前記したように、本発明で用いる原料溶液は、通常、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸と共に、α−グルコシル糖化合物、このα−グルコシル糖化合物由来のＤ−グルコースやα−グルコシル糖化合物の分解物などの糖類、更には、塩類を含有している。したがって、本発明に於いては、原料溶液を先ず濾過し、Ｈ形陽イオン交換樹脂又は活性炭処理とＨ形陽イオン交換樹脂により脱ミネラル処理を行う。次いで、脱ミネラル処理液をカラムに充填した陰イオン交換樹脂と接触させて、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを吸着せしめ、次いで水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給して、αＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を採取する。この際、分離された未反応のＬ−アスコルビン酸及びα−グルコシル糖化合物は、経済性を考慮して、再度、次の糖転移反応の原料として用いることもできる。
【００２８】
本発明に於いて用いるカラムは、適宜形状、大きさ、長さの１乃至複数のカラムを直列又は並列に配置して用いればよい。複数のカラムを用いる場合、適宜の樹脂層長となるように、カラムを直列接続して用いることができる。原料溶液を陰イオン交換樹脂に通液するときの流速は、ＳＶ５以下が望ましく、より望ましくは、ＳＶ１乃至３の範囲が望ましい。又、溶離液を陰イオン交換樹脂に供給するときの流速は、ＳＶ１以下が望ましく、より望ましくは、ＳＶ０．３乃至０．７の範囲が望ましい。カラムから脱着し、溶出してくるαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含画分の溶出順序は、使用する陰イオン交換樹脂の種類、殊に、陰イオン交換樹脂の母体構造や官能基の種類により変えることができる。カラム操作時の温度は、αＧ−ＡＡやＬ−アスコルビン酸の温度による分解の影響を考慮して、通常、０乃至８０℃、望ましくは、１０乃至４０℃、更に望ましくは、１５乃至２５℃の範囲が望ましい。又、使用する酸及び／又は塩類の水溶液に関し、０．５Ｎ以上の酸及び／又は塩類の水溶液を用いる場合、αＧ−ＡＡを陰イオン交換樹脂から迅速かつ容易に脱着し、溶出させることができるものの、αＧ−ＡＡと共にＬ−アスコルビン酸も脱着し、溶出してくることから、両者の分離が不十分となり、高純度のαＧ−ＡＡ高含有画分を高収率で得ることは困難となる。ところが、酸及び／又は塩類の水溶液濃度が全体で０．５Ｎ未満、望ましくは、０．１乃至０．４５Ｎ、更に望ましくは、０．２乃至０．３Ｎのとき、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸は、カラムに充填した陰イオン交換樹脂からそれぞれの高含有画分として脱着し、溶出してくることから、両者を効率よく分離でき、両者の高含有画分を高収率で採取することができる。尚、酸及び／又は塩類の水溶液濃度を０．１Ｎ未満とした場合でも、αＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分を採取することは可能である。しかしながら、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の陰イオン交換樹脂からの脱着、溶出時間が長くなると共に、得られるαＧ−ＡＡの濃度が低くなる傾向にある。
【００２９】
カラムに充填した陰イオン交換樹脂から脱着し、溶出してきたαＧ−ＡＡ高含有画分は、必要により、精製した後、濃縮して過飽和溶液にすれば、容易に結晶形態のαＧ−ＡＡが析出してくるので、結晶形態のαＧ−ＡＡ高含有物として採取することも随意である。一方、Ｌ−アスコルビン酸高含有画分は、αＧ−ＡＡを得るための酵素反応の原料として再利用することも可能である。又、前記αＧ−ＡＡ高含画分、又はＬ−アスコルビン酸高含有画分以外の画分である。しかしながら、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離が不完全な両者の混合画分を、再度、本発明の原料溶液として用いると、より高純度のαＧ−ＡＡ高含有物とＬ−アスコルビン酸高含有物を高収率で容易に得ることができる利点がある。
【００３０】
このように、本発明のαＧ−ＡＡの製造方法は、操作性、製造コストの点で優れているだけでなく、固形分当たりの純度が約９０％以上の高品質のαＧ−ＡＡ高含有物を、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率約８５％以上、より好ましくは、９０％以上で得ることを可能にしたものである。
【００３１】
斯くして得られた本発明のαＧ−ＡＡ高含有物は、安定型Ｌ−アスコルビン酸高含有物として、ビタミンＣ強化剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤などとして、各種食品、化粧品、医薬品、飼料、餌料、工業用原料などの広範な用途に有利に用いることができる。
【００３２】
以下、実験により本発明を更に詳細に説明する。
【００３３】
【実験】
＜陰イオン交換樹脂に吸着したαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の分離と溶出に及ぼす溶離液の濃度の影響＞
デキストリン（ＤＥ約６）２重量部を水６重量部に加熱溶解し、これを還元下に保って、Ｌ−アスコルビン酸１重量部を加え、ｐＨ５．５、６０℃に維持しつつ、これにシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）をデキストリングラム当り４００単位加えて２４時間反応させた。本反応液をＵＦ膜で濾過して酵素を除去した後、濾液を５５℃、ｐＨ５．０に調整し、これにグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社製）を前記デキストリングラム当り１０単位加えて２４時間反応させた。本反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、得られた濾液を固形分濃度約４０％に濃縮した。この濃縮液中の固形分組成は、高速液体クロマトグラフィーにより分析した（高速液体クロマトグラフィーで用いた装置は、島津製作所製『ＬＣ−６Ａ』；カラムは、島津テクノリサーチ株式会社製『ＳＴＲカラム ＯＤＳ−ＩＩ』；溶離液は、０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ３ＰＯ４（ｐＨ２．０）；流速は、０．５ｍｌ／ｍｉｎ；検出に用いた示差屈折計は、東ソー株式会社製『ＲＩ−８０２０』。）。その結果、濃縮液中の固形分組成は、αＧ−ＡＡ約３１％、Ｌ−アスコルビン酸約２１％、Ｄ−グルコース約３１％、及びα−グルコシル糖化合物約１７％であった。前記活性炭で脱色濾過して得た濾液を強酸性陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ形）』、三菱化学株式会社製）１００ｍｌを充填したカラム（内径２０ｍｍ、長さ３５０ｍｍ、カラム内温度２５℃）にＳＶ２で通液して脱ミネラルした。得られた固形分濃度３０％の溶液を３３０ｇずつ、２００ｍｌの陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）を充填した７本のカラム（それぞれ内径２０ｍｍ、長さ６５０ｍｍ、カラム内温度２５℃）にそれぞれＳＶ２で通液し、その後、各カラムに水約１，０００ｍｌをＳＶ２で通液して陰イオン交換樹脂を水洗し、非吸着成分を溶出させた。次いで、７本のカラムにそれぞれ０．１Ｎ、０．１５Ｎ、０．２Ｎ、０．３Ｎ、０．４Ｎ、０．４５Ｎ又は０．５Ｎの塩酸水溶液をＳＶ０．５で通液し、カラム出口の固形分濃度が０．２％以上となった時点から溶出液の回収を始め、カラム出口の溶出液がそれぞれ０．１Ｎ、０．１５Ｎ、０．２Ｎ、０．３Ｎ、０．４Ｎ、０．４５Ｎ又は０．５Ｎの塩酸水溶液に置換されるまで分画を続けた。分画はフラクションコレクターを用いて、２０分毎に分画してサンプリングし、各サンプル中の固形分組成を上記したと同様にして高速液体クロマトグラフィーで分析した。その分析結果に基づいて、溶離液として０．１Ｎ及び０．５Ｎの塩酸水溶液を用いたときの溶出液中の固形分当たりの各成分の濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を図３、図４にそれぞれ示す。尚、図３、図４に於いて、縦軸は溶出液中の固形分当たりの各成分の濃度（％（ｗ／ｗ））を、横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン酸を、又「−△−」は糖類を示す。図３から、塩酸の水溶液濃度０．１Ｎの条件下では、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離は良好である。しかしながら、塩酸の水溶液濃度が高い場合と比較して、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の溶出は遅くなり、得られるαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分の濃度が若干低くなる傾向を示した。又、図４から、脱着剤として用いる塩酸の水溶液濃度が０．５Ｎの条件下では、塩酸の水溶液濃度が低い場合と比較して、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の溶出が早くなり、両者の分離が不十分となり、αＧ−ＡＡ高含有画分の収率が低くなることが判明した。又、図３、図４から明らかなように、糖類の大部分は陰イオン交換樹脂に吸着しないものの、僅かながら陰イオン交換樹脂に吸着し、溶離液で溶離されることが判明した。
【００３４】
更に、具体的には図示しないものの、脱着剤として用いる塩酸の水溶液濃度が０．１乃至０．４５Ｎの条件下では、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の分離、溶出が良好で、殊に、脱着剤として用いる塩酸の水溶液濃度が０．２乃至０．３Ｎの条件下での溶出が好適であることが判明した。又、溶離液として、これら塩酸の水溶液を用いて得られた結果は、塩酸の水溶液に代えて他の種類の酸又は塩類、及び各種酸及び塩類を併用する水溶液を溶離液として用いた場合、更に、陰イオン交換樹脂の種類を変えた場合にも同様に当てはまる結果である。
【００３５】
以下、本発明のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法を実施例により詳細に説明する。
【００３６】
【実施例１】
＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞
溶離液として、０．２５Ｎ塩酸水溶液を使用した以外は実験と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。本実施例に於ける、陰イオン交換樹脂から溶出してくる溶出液を前記実験と同様にして分画してサンプリングし、各サンプル中の固形分組成を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その分析結果に基づいて溶出液中の各成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を図５に示す。尚、図５に於いて、縦軸は溶出液中の固形分当たりの各成分の固形分濃度（％（ｗ／ｗ））を、横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン酸を、「−△−」は糖類を示す。本品は固形分当たり純度約９３％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９２％であった。尚、図５から明らかなように、糖類の大部分は陰イオン交換樹脂に吸着しないものの、僅かながら陰イオン交換樹脂に吸着し、溶離液で溶出されることが判明した。
【００３７】
【実施例２】
＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞
デキストリン（ＤＥ約６）２重量部を水６重量部に加熱溶解し、これを還元下に保って、Ｌ−アスコルビン酸１重量部を加え、ｐＨ５．５、６０℃に維持しつつ、これにシクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）をデキストリングラム当り４００単位加えて２４時間反応させた。本反応液をＵＦ膜で濾過して酵素を除去した後、濾液を５５℃、ｐＨ５．０に調整し、これにグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社販売）を前記デキストリングラム当り１０単位加えて２４時間反応させた。本反応液を加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、得られる濾液を固形分濃度約４０％に濃縮した。この濃縮液中の固形分組成を前記実験で用いたのと同じ高速液体クロマトグラフィー条件で分析したところ、αＧ−ＡＡ約３１％、Ｌ−アスコルビン酸約２１％、Ｄ−グルコース約３１％、及びα−グルコシル糖化合物約１７％であった。前記活性炭で脱色濾過して得た濾液を強酸性陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ形）』、三菱化学株式会社製）を１００ｍｌ充填したカラム（内径２０ｍｍ、長さ３５０ｍｍ、カラム内温度２５℃）にＳＶ２で通液して脱ミネラルした。得られた濃度３０％の溶液３３０ｇを２００ｍｌの陰イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＷＡ３０（ＯＨ形）』、三菱化学株式会社製）を充填したカラム（内径２０ｍｍ、長さ６５０ｍｍ、カラム内温度２５℃）にＳＶ２で通液し、その後、水約１，０００ｍｌをＳＶ２で通液して水洗し、非吸着成分を溶離させた。次いで、溶離液として０．２５Ｎ塩酸水溶液をＳＶ０．５で通液し、カラム出口の固形分濃度が０．２％以上となった時点から溶出液の回収を始め、カラム出口の溶出液が０．２５Ｎの塩酸水溶液に置換されるまで分画を続けた。この分画は、フラクションコレクターを用いて２０分毎に行い、得られた各画分の一部をサンプリングし、各サンプル中の固形分組成を前記実験と同様にして高速液体クロマトグラフィーで分析した。溶出液中の各成分の固形物濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を図６に示す。図６から明らかなように、本実施例に於いては、実施例１とは異なる陰イオン交換樹脂を用いたことから、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の溶出順序が逆転したけれども、実施例１と同様に、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離は良好で、所望のαＧ−ＡＡ高含有画分を回収してαＧ−ＡＡ高含有物を得た。尚、図６に於いて、縦軸は溶出液中の固形分当たりの各成分の濃度（％（ｗ／ｗ））を、横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン酸を、「−△−」は糖類を示す。図６から明らかなように、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸は陰イオン交換樹脂から良好に脱着、溶離し、所望のαＧ−ＡＡ高含有画分を回収してαＧ−ＡＡ高含有物を得た。本品は固形分当たり純度約９３％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９０％であった。尚、図６から明らかなように、糖類の大部分は陰イオン交換樹脂に吸着しないものの、僅かながら陰イオン交換樹脂に吸着し、溶離液で溶離されることが判明した。
【００３８】
【実施例３】
＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞
強酸性陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ形）』、三菱化学株式会社製）を充填したカラム（内径４００ｍｍ、長さ１，０００ｍｍ）を用いて脱ミネラルし、陰イオン交換樹脂として、ローム・アンド・ハース社製の陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ９１０ＣＴ（ＯＨ形）』）を充填したカラム（内径５６０ｍｍ、長さ１，０００ｍｍ、カラム内温度２５℃）を使用し、溶離液として０．３Ｎ硝酸水溶液を用いた以外は実施例２と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。本品は、液状αＧ−ＡＡ高含有物で、固形分当たり純度約９２％のαＧ−ＡＡ高含有物で、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９０％であった。次いで、この液状αＧ−ＡＡ高含有物を固形分濃度約７６％になるまで減圧濃縮し、得られた濃縮液を助晶缶にとり、結晶αＧ−ＡＡを種晶として１％加えて４０℃に保ち、ゆっくり攪拌しつつ徐冷して２日間かけて２５℃まで下げ、次いで、バスケット型遠心分離機で分蜜し、得られた結晶に少量の水をスプレーして洗浄し、結晶形態のαＧ−ＡＡを採取して、αＧ−ＡＡ高含有物を得た。本品は固形分当たり、純度約９９％のαＧ−ＡＡ高含有物であった。
【００３９】
【実施例４】
＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞
溶離液として、０．４５Ｎの塩酸水溶液を用いた以外は実施例２と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。実施例２同様、カラムに充填した陰イオン交換樹脂からのαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離は良好であった。本実施例で得られたαＧ−ＡＡ高含有物は、固形分当たり純度約９０％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９１％であった。
【００４０】
【実施例５】
＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞
強酸性陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ形）』、三菱化学株式会社製）を充填したカラム（内径８００ｍｍ、長さ１，６００ｍｍ）を用いて脱ミネラルし、陰イオン交換樹脂として、『アンバーライトＩＲＡ４７８ＲＦ（ＯＨ形）』（ローム・アンド・ハース社製）を充填したカラム（内径１，２００ｍｍ、長さ１，６００ｍｍ、カラム内温度２５℃）を使用し、溶離液として０．２Ｎ ＮａＣｌ水溶液を用いた以外は実施例２と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。本品は、αＧ−ＡＡのナトリウム塩で（αＧ−ＡＡ−Ｎａ）、固形分当たり純度約９０％のαＧ−ＡＡ−Ｎａを含有し、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡ−Ｎａの収率はモル比で約９０％であった。
【００４１】
【発明の効果】
上記したように、本発明によれば、原料溶液として、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶液を、カラムに充填した陰イオン交換樹脂と接触させてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰イオン交換樹脂に吸着せしめ、次いで陰イオン交換樹脂を水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給してαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を採取することにより、αＧ−ＡＡ高含有物とＬ−アスコルビン酸高含有物を高収率で得ることができるようになった。即ち、本発明によれば、従来のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法に於いて、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー後に必要不可欠とされていた強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーと、その処理前に必要とされていた濃縮工程とを省略できることから、その分、αＧ−ＡＡ高含有物の製造工程が簡略化され、製造コストが低減され、加えて高収率で高純度αＧ−ＡＡを得ることができることとなった。本発明の製造方法は、従来の製造方法とは違って、強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを経由する必要がないことから、従来の製造方法に於いて、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率が約７５乃至８０％どまりであったものを約８５％以上、より好ましくは、９０％以上にまで高めることが可能となった。
【００４２】
このように、本発明は、操作性、製造コスト、及び収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法を可能としたものである。又、本発明の製造方法により得られるαＧ−ＡＡ高含有物は、安定型Ｌ−アスコルビン酸高含有物として、ビタミンＣ強化剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤などとして、各種食品、化粧品、医薬品、飼料、餌料、工業用原料などの広範な用途に有利に用いることができる。
【００４３】
本発明は斯くも顕著なる作用効果を奏する発明であり、斯界に与える影響は誠に多大なものがある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、従来のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法に於ける製造工程の流れ図である。
【図２】図２は、本発明のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法に於ける製造工程の流れ図である。
【図３】図３は、溶離液として０．１Ｎ塩酸を用いて陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）からαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を示す図である。
【図４】図４は、溶離液として０．５Ｎ塩酸を用いて陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）からαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を示す図である。
【図５】図５は、溶離液として０．２５Ｎ塩酸を用いて陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）からαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を示す図である。
【図６】図６は、溶離液として０．２５Ｎ塩酸を用いて陰イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＷＡ３０（ＯＨ形）』、三菱化学株式会社製）からαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を示す図である。
【符号の説明】
−〇−．．．．αＧ−ＡＡ
−●−．．．．Ｌ−アスコルビン酸
−△−．．．．糖類
Claims (5)
- 原料溶液として、２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶液を、カラムに充填した陰イオン交換樹脂と接触させて２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とＬ−アスコルビン酸とを陰イオン交換樹脂に吸着せしめ、次いで陰イオン交換樹脂を水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．２乃至０．３Ｎの酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給して２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、この２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を採取することを特徴とする２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法。
- 陰イオン交換樹脂が、ＯＨ形陰イオン交換樹脂であることを特徴とする請求項１記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法。
- 酸が、塩酸、硫酸、硝酸及びクエン酸から選ばれる１種又は２種以上の酸であることを特徴とする請求項１又は２記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法。
- 塩類が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、クエン酸ナトリウム、及びクエン酸カリウムから選ばれる１種又は２種以上の塩類であることを特徴とする請求項１又は２記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法。
- 更に濃縮工程及び晶出工程を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法。
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