JP2002088095A - ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法 - Google Patents
２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 操作性、製造コスト、及び収率の優れた高品
質のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法を提供することを課
題とする。 【解決手段】 原料溶液として、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アス
コルビン酸及び糖類を含有する溶液を、カラムに充填し
た陰イオン交換樹脂と接触させてαＧ−ＡＡとＬ−アス
コルビン酸とを陰イオン交換樹脂に吸着せしめ、次いで
陰イオン交換樹脂を水洗して糖類を除去した後、溶離液
として０．５Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラ
ムに供給してαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン
酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を
採取するαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法を確立すること
により解決する。
質のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法を提供することを課
題とする。 【解決手段】 原料溶液として、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アス
コルビン酸及び糖類を含有する溶液を、カラムに充填し
た陰イオン交換樹脂と接触させてαＧ−ＡＡとＬ−アス
コルビン酸とを陰イオン交換樹脂に吸着せしめ、次いで
陰イオン交換樹脂を水洗して糖類を除去した後、溶離液
として０．５Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラ
ムに供給してαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン
酸高含有画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を
採取するαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法を確立すること
により解決する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、安定型Ｌ−アスコ
ルビン酸である２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ
−アスコルビン酸（以下、特に断りがない限り、「αＧ
−ＡＡ」と略記する。）高含有物の新規な製造方法に関
する。
ルビン酸である２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ
−アスコルビン酸（以下、特に断りがない限り、「αＧ
−ＡＡ」と略記する。）高含有物の新規な製造方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】αＧ−ＡＡは、特開平３−１８３４９２
号公報にも開示されているように、下記に示すような優
れた理化学的性質を有していることが知られている。即
ち、αＧ−ＡＡは、
号公報にも開示されているように、下記に示すような優
れた理化学的性質を有していることが知られている。即
ち、αＧ−ＡＡは、
【０００３】（１）直接還元性を示さず、極めて安定
で、Ｌ−アスコルビン酸と異なりメイラード反応を起こ
し難く、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、脂質、糖質、生
理活性物質などと共存させても、無用の反応を起こすこ
とがないばかりか、これらの物質を安定化させる効果す
ら持っている。 （２）加水分解を受けてＬ−アスコルビン酸を生成し、
Ｌ−アスコルビン酸と同様の還元作用、抗酸化作用を示
す。 （３）体内の酵素により、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グ
ルコースとに容易に加水分解され、Ｌ−アスコルビン酸
本来の生理活性を示す。又、ビタミンＥ、ビタミンＰな
どとの併用により、その生理活性を増強することができ
る。 （４）Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物な
どとを経口摂取することにより、生体内でも自然に少量
ながら生成し、代謝される物質であることから、その安
全性は極めて高い。 （５）結晶形態のαＧ−ＡＡは、実質的に非吸湿性又は
難吸湿性であるにもかかわらず、水に対して大きな溶解
速度、溶解度を有しており、粉末、顆粒、錠剤などのビ
タミン剤、サンドクリーム、チョコレート、チューイン
ガム、即席ジュース、即席調味料などの飲食物のための
ビタミンＣ強化剤、呈味改善剤、酸味剤、安定剤などと
して有利に利用できる。 （６）結晶形態のαＧ−ＡＡは、実質的に非吸湿性又は
難吸湿性であり、保存中、固結することなく流動性を保
持していることから、その取扱いは容易で非晶質の場合
と比較して、その包装、輸送、貯蔵に要する物的、人的
経費が大幅に削減できる。
で、Ｌ−アスコルビン酸と異なりメイラード反応を起こ
し難く、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、脂質、糖質、生
理活性物質などと共存させても、無用の反応を起こすこ
とがないばかりか、これらの物質を安定化させる効果す
ら持っている。 （２）加水分解を受けてＬ−アスコルビン酸を生成し、
Ｌ−アスコルビン酸と同様の還元作用、抗酸化作用を示
す。 （３）体内の酵素により、Ｌ−アスコルビン酸とＤ−グ
ルコースとに容易に加水分解され、Ｌ−アスコルビン酸
本来の生理活性を示す。又、ビタミンＥ、ビタミンＰな
どとの併用により、その生理活性を増強することができ
る。 （４）Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル糖化合物な
どとを経口摂取することにより、生体内でも自然に少量
ながら生成し、代謝される物質であることから、その安
全性は極めて高い。 （５）結晶形態のαＧ−ＡＡは、実質的に非吸湿性又は
難吸湿性であるにもかかわらず、水に対して大きな溶解
速度、溶解度を有しており、粉末、顆粒、錠剤などのビ
タミン剤、サンドクリーム、チョコレート、チューイン
ガム、即席ジュース、即席調味料などの飲食物のための
ビタミンＣ強化剤、呈味改善剤、酸味剤、安定剤などと
して有利に利用できる。 （６）結晶形態のαＧ−ＡＡは、実質的に非吸湿性又は
難吸湿性であり、保存中、固結することなく流動性を保
持していることから、その取扱いは容易で非晶質の場合
と比較して、その包装、輸送、貯蔵に要する物的、人的
経費が大幅に削減できる。
【０００４】現在、αＧ−ＡＡは、主として化粧品の分
野に広く利用されている。更に、他の用途、例えば、食
品、医薬品、飼料、餌料或いは工業用原料など、より広
範な分野への用途開発が期待されている。
野に広く利用されている。更に、他の用途、例えば、食
品、医薬品、飼料、餌料或いは工業用原料など、より広
範な分野への用途開発が期待されている。
【０００５】αＧ−ＡＡの代表的な工業的製造方法とし
ては、例えば、特開平３−１８３４９２号公報に開示さ
れた製造方法を例示することができる。この製造方法
は、図１に示すように、先ず、Ｌ−アスコルビン酸とα
−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素
又は糖転移酵素とグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．
１．３）とを反応させてαＧ−ＡＡを生成させて、αＧ
−ＡＡと未反応のＬ−アスコルビン酸の他、α−グルコ
シル糖化合物やα−グルコシル糖化合物由来の糖類を含
む溶液を得、次いで、この溶液を濾過し、Ｈ形陽イオン
交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて脱
ミネラルした後、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロ
マトグラフィーにかけて、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビ
ン酸とを陰イオン交換樹脂に吸着させ、次いで、陰イオ
ン交換樹脂を水洗して糖類をカラムから除去し、更に、
溶離液を用いてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰
イオン交換樹脂から共に溶出させた後、得られる溶出液
を濃縮し、この濃縮液を強酸性陽イオン交換樹脂を用い
るカラムクロマトグラフィーにかけて、αＧ−ＡＡ高含
有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、こ
のαＧ−ＡＡ高含有画分を濃縮してαＧ−ＡＡ高含有物
を得る方法である。
ては、例えば、特開平３−１８３４９２号公報に開示さ
れた製造方法を例示することができる。この製造方法
は、図１に示すように、先ず、Ｌ−アスコルビン酸とα
−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素
又は糖転移酵素とグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．
１．３）とを反応させてαＧ−ＡＡを生成させて、αＧ
−ＡＡと未反応のＬ−アスコルビン酸の他、α−グルコ
シル糖化合物やα−グルコシル糖化合物由来の糖類を含
む溶液を得、次いで、この溶液を濾過し、Ｈ形陽イオン
交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて脱
ミネラルした後、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロ
マトグラフィーにかけて、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビ
ン酸とを陰イオン交換樹脂に吸着させ、次いで、陰イオ
ン交換樹脂を水洗して糖類をカラムから除去し、更に、
溶離液を用いてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰
イオン交換樹脂から共に溶出させた後、得られる溶出液
を濃縮し、この濃縮液を強酸性陽イオン交換樹脂を用い
るカラムクロマトグラフィーにかけて、αＧ−ＡＡ高含
有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、こ
のαＧ−ＡＡ高含有画分を濃縮してαＧ−ＡＡ高含有物
を得る方法である。
【０００６】前記した陰イオン交換樹脂を用いるカラム
クロマトグラフィーに於いては、αＧ−ＡＡとＬ−アス
コルビン酸とが共に脱着し溶出してくることから、得ら
れるαＧ−ＡＡはＬ−アスコルビン酸との混合物であ
る。そのため、αＧ−ＡＡ高含有物を得るためには、α
Ｇ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを含む溶出液を一旦濃
縮した後、更に強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラム
クロマトグラフィーにかけてαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ
−アスコルビン酸高含有画分とに分画することが必要不
可欠であった。
クロマトグラフィーに於いては、αＧ−ＡＡとＬ−アス
コルビン酸とが共に脱着し溶出してくることから、得ら
れるαＧ−ＡＡはＬ−アスコルビン酸との混合物であ
る。そのため、αＧ−ＡＡ高含有物を得るためには、α
Ｇ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを含む溶出液を一旦濃
縮した後、更に強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラム
クロマトグラフィーにかけてαＧ−ＡＡ高含有画分とＬ
−アスコルビン酸高含有画分とに分画することが必要不
可欠であった。
【０００７】このように、従来のαＧ−ＡＡ高含有物の
製造方法に於いては、陰イオン交換樹脂を用いるカラム
クロマトグラフィーと強酸性陽イオン交換樹脂を用いる
カラムクロマトグラフィーとによる２段階のカラムクロ
マトグラフィーが必要不可欠であり、しかも、陰イオン
交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーで得られる
溶出液は、強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロ
マトグラフィーにかける前に一旦濃縮しなければなら
ず、その分、操作が煩雑となり、αＧ−ＡＡ高含有物の
収率低下や製造コストが上昇するなどの欠点があった。
製造方法に於いては、陰イオン交換樹脂を用いるカラム
クロマトグラフィーと強酸性陽イオン交換樹脂を用いる
カラムクロマトグラフィーとによる２段階のカラムクロ
マトグラフィーが必要不可欠であり、しかも、陰イオン
交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーで得られる
溶出液は、強酸性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロ
マトグラフィーにかける前に一旦濃縮しなければなら
ず、その分、操作が煩雑となり、αＧ−ＡＡ高含有物の
収率低下や製造コストが上昇するなどの欠点があった。
【０００８】斯かる状況下、操作性、製造コスト、及び
収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物の工業的製造
方法が鶴首されていた。
収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物の工業的製造
方法が鶴首されていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、操作
性、製造コスト、及び収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ
高含有物の工業的製造方法を提供することにある。本発
明で言うαＧ−ＡＡ高含有物とは、αＧ−ＡＡを固形分
当たり８０％（ｗ／ｗ）（本願明細書に於いては、特に
断りがない限り、「％（ｗ／ｗ）」を「％」と略記す
る。）以上、好ましくは、９０％以上含有するαＧ−Ａ
Ａ高含有物を意味し、その形態としては、溶液状、ペー
スト状、固体状又は粉末状の何れのものであってもよ
い。
性、製造コスト、及び収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ
高含有物の工業的製造方法を提供することにある。本発
明で言うαＧ−ＡＡ高含有物とは、αＧ−ＡＡを固形分
当たり８０％（ｗ／ｗ）（本願明細書に於いては、特に
断りがない限り、「％（ｗ／ｗ）」を「％」と略記す
る。）以上、好ましくは、９０％以上含有するαＧ−Ａ
Ａ高含有物を意味し、その形態としては、溶液状、ペー
スト状、固体状又は粉末状の何れのものであってもよ
い。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記従来
技術に鑑み、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類
を含有する溶液をカラムに充填したイオン交換樹脂と接
触させて、より簡便にαＧ−ＡＡ高含有物を得る方法に
ついて鋭意研究を続けた。その結果、カラムに充填する
イオン交換樹脂として、陰イオン交換樹脂を用い、この
陰イオン交換樹脂にαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸と
を吸着させ、溶離液として０．５Ｎ未満の酸及び／又は
塩類の水溶液をカラムに供給してαＧ−ＡＡ高含有画分
とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ
−ＡＡ高含有画分を採取することにより本発明の課題を
達成できることを見出した。
技術に鑑み、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類
を含有する溶液をカラムに充填したイオン交換樹脂と接
触させて、より簡便にαＧ−ＡＡ高含有物を得る方法に
ついて鋭意研究を続けた。その結果、カラムに充填する
イオン交換樹脂として、陰イオン交換樹脂を用い、この
陰イオン交換樹脂にαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸と
を吸着させ、溶離液として０．５Ｎ未満の酸及び／又は
塩類の水溶液をカラムに供給してαＧ−ＡＡ高含有画分
とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、このαＧ
−ＡＡ高含有画分を採取することにより本発明の課題を
達成できることを見出した。
【００１１】即ち、本発明のαＧ−ＡＡ高含有物の製造
方法の特徴は、図２に示すように、Ｌ−アスコルビン酸
とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移
酵素又は糖転移酵素とグルコアミラーゼとを反応させて
αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶
液を得、この溶液を濾過し、脱ミネラルした後、得られ
る溶液を原料溶液として、カラムに充填した陰イオン交
換樹脂と接触させてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸と
を陰イオン交換樹脂に吸着せしめ、次いで陰イオン交換
樹脂を水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５
Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給して
αＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分
とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を濃縮してαＧ
−ＡＡ高含有物を採取する方法である。このように、本
発明によれば、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分
離を陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィ
ーのみにより分離できることとなったことから、図１に
示す従来の製造方法に於いては必要不可欠であった強酸
性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー
が不要となった。その結果、操作性、経済性、収率の何
れの点に於いても優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物を
工業的規模で製造できることとなった。
方法の特徴は、図２に示すように、Ｌ−アスコルビン酸
とα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移
酵素又は糖転移酵素とグルコアミラーゼとを反応させて
αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶
液を得、この溶液を濾過し、脱ミネラルした後、得られ
る溶液を原料溶液として、カラムに充填した陰イオン交
換樹脂と接触させてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸と
を陰イオン交換樹脂に吸着せしめ、次いで陰イオン交換
樹脂を水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５
Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給して
αＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分
とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を濃縮してαＧ
−ＡＡ高含有物を採取する方法である。このように、本
発明によれば、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分
離を陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィ
ーのみにより分離できることとなったことから、図１に
示す従来の製造方法に於いては必要不可欠であった強酸
性陽イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー
が不要となった。その結果、操作性、経済性、収率の何
れの点に於いても優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物を
工業的規模で製造できることとなった。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明で用いる原料溶液について
述べる。当該原料溶液は、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビ
ン酸及び糖類を含有する水溶液を意味する。斯かる原料
溶液の製造方法としては、酵素法であれ合成法であれ、
αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶
液が得られる限り特に問わない。例えば、その代表的な
製造方法として、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル
糖化合物とを含有する溶液に糖転移酵素又は糖転移酵素
とグルコアミラーゼとを作用させる方法を例示できる。
具体的には、特開平３−１８３４９２号公報に記載され
た方法を例示することができる。
述べる。当該原料溶液は、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビ
ン酸及び糖類を含有する水溶液を意味する。斯かる原料
溶液の製造方法としては、酵素法であれ合成法であれ、
αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類を含有する溶
液が得られる限り特に問わない。例えば、その代表的な
製造方法として、Ｌ−アスコルビン酸とα−グルコシル
糖化合物とを含有する溶液に糖転移酵素又は糖転移酵素
とグルコアミラーゼとを作用させる方法を例示できる。
具体的には、特開平３−１８３４９２号公報に記載され
た方法を例示することができる。
【００１３】本発明で用いる原料溶液の固形分濃度は、
通常、１乃至７５％、望ましくは、１０乃至７０％、よ
り望ましくは、２０乃至６０％、更に望ましくは、３０
乃至４０％の範囲が好適に使用される。又、原料溶液の
ｐＨは、アルカリ性側ではＬ−アスコルビン酸が分解し
易いので酸性側のｐＨが望ましく、通常、ｐＨ７未満、
望ましくは、ｐＨ１．０乃至６．５、更に望ましくは、
ｐＨ１．５乃至６．０の範囲とするのが望ましい。更
に、ＯＨ形陰イオン交換樹脂を用いることから、原料溶
液を陰イオン交換樹脂と接触させる前に、原料溶液中に
存在する陰イオン、有機酸、アミノ酸等の不純物をでき
るだけ除去又は低減させておくのが望ましい。
通常、１乃至７５％、望ましくは、１０乃至７０％、よ
り望ましくは、２０乃至６０％、更に望ましくは、３０
乃至４０％の範囲が好適に使用される。又、原料溶液の
ｐＨは、アルカリ性側ではＬ−アスコルビン酸が分解し
易いので酸性側のｐＨが望ましく、通常、ｐＨ７未満、
望ましくは、ｐＨ１．０乃至６．５、更に望ましくは、
ｐＨ１．５乃至６．０の範囲とするのが望ましい。更
に、ＯＨ形陰イオン交換樹脂を用いることから、原料溶
液を陰イオン交換樹脂と接触させる前に、原料溶液中に
存在する陰イオン、有機酸、アミノ酸等の不純物をでき
るだけ除去又は低減させておくのが望ましい。
【００１４】本発明で言うＬ−アスコルビン酸とは、通
常、遊離のＬ−アスコルビン酸のみならず、Ｌ−アスコ
ルビン酸のアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩
などのＬ−アスコルビン酸の塩、又は、それらの混合物
を包含する場合がある。つまり、本発明の糖転移反応に
用いるＬ−アスコルビン酸は、遊離のＬ−アスコルビン
酸だけでなく、本発明の実施を妨げない限り、Ｌ−アス
コルビン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸カルシウム
などのＬ−アスコルビン酸の塩、及びそれらの混合物を
包含するものとする。又、本発明で言うαＧ−ＡＡにつ
いても、遊離の酸のみならず、本発明の実施を妨げない
限りその塩をも包含するものとする。
常、遊離のＬ−アスコルビン酸のみならず、Ｌ−アスコ
ルビン酸のアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩
などのＬ−アスコルビン酸の塩、又は、それらの混合物
を包含する場合がある。つまり、本発明の糖転移反応に
用いるＬ−アスコルビン酸は、遊離のＬ−アスコルビン
酸だけでなく、本発明の実施を妨げない限り、Ｌ−アス
コルビン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸カルシウム
などのＬ−アスコルビン酸の塩、及びそれらの混合物を
包含するものとする。又、本発明で言うαＧ−ＡＡにつ
いても、遊離の酸のみならず、本発明の実施を妨げない
限りその塩をも包含するものとする。
【００１５】更に、本発明で言うα−グルコシル糖化合
物は、同時に用いる糖転移酵素の作用により、Ｌ−アス
コルビン酸にα−Ｄ−グルコシル残基が等モル以上結合
したαＧ−ＡＡを含むα−グリコシル−Ｌ−アスコルビ
ン酸を生成し得るものであればよく、例えば、マルトー
ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペ
ンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス、マルトオクタオースなどのマルトオリゴ糖の他、デ
キストリン、シクロデキストリン、アミロースなどの澱
粉部分加水分解物、更には、液化澱粉、糊化澱粉、溶性
澱粉などを例示できる。αＧ−ＡＡの生成を容易にする
ためには、用いる糖転移酵素に好適なα−グルコシル糖
化合物を選択すればよい。例えば、糖転移酵素として、
α−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０）を用い
る場合には、マルトース、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス、マルトヘプタオース、マルトオクタオースなどのマ
ルトオリゴ糖、又は、ＤＥ約５乃至６０のデキストリ
ン、澱粉部分加水分解物などが好適に用いられる。又、
糖転移酵素として、シクロマルトデキストリン・グルカ
ノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９）を用
いる場合には、シクロデキストリン又はＤＥ１未満の澱
粉糊化物からＤＥ約６０のデキストリンまでの澱粉部分
加水分解物などが好適に用いられる。更に、糖転移酵素
として、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）を用
いる場合には、ＤＥ１未満の糊化澱粉からＤＥ約３０の
デキストリンまでの澱粉部分加水分解物などが好適に使
用される。
物は、同時に用いる糖転移酵素の作用により、Ｌ−アス
コルビン酸にα−Ｄ−グルコシル残基が等モル以上結合
したαＧ−ＡＡを含むα−グリコシル−Ｌ−アスコルビ
ン酸を生成し得るものであればよく、例えば、マルトー
ス、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペ
ンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス、マルトオクタオースなどのマルトオリゴ糖の他、デ
キストリン、シクロデキストリン、アミロースなどの澱
粉部分加水分解物、更には、液化澱粉、糊化澱粉、溶性
澱粉などを例示できる。αＧ−ＡＡの生成を容易にする
ためには、用いる糖転移酵素に好適なα−グルコシル糖
化合物を選択すればよい。例えば、糖転移酵素として、
α−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０）を用い
る場合には、マルトース、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス、マルトヘプタオース、マルトオクタオースなどのマ
ルトオリゴ糖、又は、ＤＥ約５乃至６０のデキストリ
ン、澱粉部分加水分解物などが好適に用いられる。又、
糖転移酵素として、シクロマルトデキストリン・グルカ
ノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９）を用
いる場合には、シクロデキストリン又はＤＥ１未満の澱
粉糊化物からＤＥ約６０のデキストリンまでの澱粉部分
加水分解物などが好適に用いられる。更に、糖転移酵素
として、α−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）を用
いる場合には、ＤＥ１未満の糊化澱粉からＤＥ約３０の
デキストリンまでの澱粉部分加水分解物などが好適に使
用される。
【００１６】前記糖転移反応に用いるＬ−アスコルビン
酸の濃度（ｗ／ｖ％）は、通常、１ｗ／ｖ％以上、望ま
しくは、約２乃至３０ｗ／ｖ％が好適であり、α−グル
コシル糖化合物の濃度は、Ｌ−アスコルビン酸の濃度に
対して、通常、約０．５乃至３０倍の範囲が望ましい。
酸の濃度（ｗ／ｖ％）は、通常、１ｗ／ｖ％以上、望ま
しくは、約２乃至３０ｗ／ｖ％が好適であり、α−グル
コシル糖化合物の濃度は、Ｌ−アスコルビン酸の濃度に
対して、通常、約０．５乃至３０倍の範囲が望ましい。
【００１７】本発明に用いる糖転移酵素は、Ｌ−アスコ
ルビン酸とα−グルコシル糖化合物を含有する水溶液に
作用させるとき、Ｌ−アスコルビン酸を分解せずに、Ｌ
−アスコルビン酸の２位の炭素のアルコール基にα−グ
ルコシル基を１個以上糖転移したαＧ−ＡＡなどのα−
グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成し得るものであ
る限り、その性質、性状、由来は特に問わない。例え
ば、前記糖転移酵素として用いることのできるα−グル
コシダーゼとしては、マウスの腎臓、ラットの腸粘膜、
イヌ、ブタの小腸など動物由来のもの、イネ種子、トウ
モロコシ種子など植物由来のもの、ムコール（Ｍｕｃｏ
ｒ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属な
どに属するカビ、又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属などに属する酵母などの微生物由来の
ものが、更に、他の糖転移酵素であるシクロマルトデキ
ストリン・グルカノトランスフェラーゼとしては、バチ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クレブシーラ（Ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ）属などに属する細菌由来のものが、又、
他の糖転移酵素であるα−アミラーゼとしては、バチル
ス属などに属する細菌由来のものを例示できる。
ルビン酸とα−グルコシル糖化合物を含有する水溶液に
作用させるとき、Ｌ−アスコルビン酸を分解せずに、Ｌ
−アスコルビン酸の２位の炭素のアルコール基にα−グ
ルコシル基を１個以上糖転移したαＧ−ＡＡなどのα−
グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成し得るものであ
る限り、その性質、性状、由来は特に問わない。例え
ば、前記糖転移酵素として用いることのできるα−グル
コシダーゼとしては、マウスの腎臓、ラットの腸粘膜、
イヌ、ブタの小腸など動物由来のもの、イネ種子、トウ
モロコシ種子など植物由来のもの、ムコール（Ｍｕｃｏ
ｒ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属な
どに属するカビ、又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属などに属する酵母などの微生物由来の
ものが、更に、他の糖転移酵素であるシクロマルトデキ
ストリン・グルカノトランスフェラーゼとしては、バチ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クレブシーラ（Ｋｌｅｂ
ｓｉｅｌｌａ）属などに属する細菌由来のものが、又、
他の糖転移酵素であるα−アミラーゼとしては、バチル
ス属などに属する細菌由来のものを例示できる。
【００１８】これらの糖転移酵素は、必ずしも精製品で
ある必要はなく、粗酵素であっても本発明に於いては使
用することができる。しかしながら、好適には、斯かる
粗酵素は、使用前、公知の方法で精製して用いられる。
又、市販の糖転移酵素を利用することも可能である。使
用に際し、これら酵素を固定化して用いることも随意で
ある。糖転移酵素反応時のｐＨと温度は、糖転移酵素が
Ｌ−アスコルビン酸及びα−グルコシル糖化合物に作用
してαＧ−ＡＡが生成する条件であればよく、通常、ｐ
Ｈ３乃至９、望ましくは、ｐＨ４乃至７、温度約２０乃
至８０℃の範囲から選ばれる。使用酵素量と反応時間と
は密接に関連しており、通常、経済性の観点から、約３
乃至８０時間で反応が終了するように酵素量を設定す
る。又、固定化された糖転移酵素をバッチ式で繰り返し
用いたり、連続式で用いることも有利に実施できる。
ある必要はなく、粗酵素であっても本発明に於いては使
用することができる。しかしながら、好適には、斯かる
粗酵素は、使用前、公知の方法で精製して用いられる。
又、市販の糖転移酵素を利用することも可能である。使
用に際し、これら酵素を固定化して用いることも随意で
ある。糖転移酵素反応時のｐＨと温度は、糖転移酵素が
Ｌ−アスコルビン酸及びα−グルコシル糖化合物に作用
してαＧ−ＡＡが生成する条件であればよく、通常、ｐ
Ｈ３乃至９、望ましくは、ｐＨ４乃至７、温度約２０乃
至８０℃の範囲から選ばれる。使用酵素量と反応時間と
は密接に関連しており、通常、経済性の観点から、約３
乃至８０時間で反応が終了するように酵素量を設定す
る。又、固定化された糖転移酵素をバッチ式で繰り返し
用いたり、連続式で用いることも有利に実施できる。
【００１９】又、酵素反応中、Ｌ−アスコルビン酸は反
応系に存在する酸素による酸化分解を受け易いので、で
きるだけ低酸素又は無酸素条件下、或いは還元条件下に
保ち、必要ならば、チオ尿素、亜硫酸塩などを共存せる
のがよい。又、Ｌ−アスコルビン酸は光分解を受け易い
ことから、暗所又は遮光下で反応させるのが望ましい。
応系に存在する酸素による酸化分解を受け易いので、で
きるだけ低酸素又は無酸素条件下、或いは還元条件下に
保ち、必要ならば、チオ尿素、亜硫酸塩などを共存せる
のがよい。又、Ｌ−アスコルビン酸は光分解を受け易い
ことから、暗所又は遮光下で反応させるのが望ましい。
【００２０】更に、必要ならば、糖転移反応能を有する
微生物を、その増殖用培地中にＬ−アスコルビン酸とα
−グルコシル糖化合物とを共存させて、αＧ−ＡＡを含
むα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させるこ
とも可能である。
微生物を、その増殖用培地中にＬ−アスコルビン酸とα
−グルコシル糖化合物とを共存させて、αＧ−ＡＡを含
むα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させるこ
とも可能である。
【００２１】糖転移酵素の作用により生成するα−グリ
コシル−Ｌ−アスコルビン酸は、Ｌ−アスコルビン酸の
２位の炭素のアルコール基に１個又は複数のα−Ｄ−グ
ルコシル基が結合した化合物である。これらα−Ｄ−グ
ルコシル基の数は、通常、２乃至７個程度で、α−Ｄ−
グルコシル基同士はα−１，４結合で結合している。具
体的な化合物としては、αＧ−ＡＡ、２−Ｏ−α−Ｄ−
マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マ
ルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ
−マルトテトラオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−
α−Ｄ−マルトペンタオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２
−Ｏ−α−Ｄ−マルトヘキサオシル−Ｌ−アスコルビン
酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトヘプタオシル−Ｌ−アスコ
ルビン酸などを例示できる。α−グルコシダーゼによっ
て生成させる場合には、通常、αＧ−ＡＡのみが生成す
るが、使用する糖転移酵素の種類や反応条件によって
は、αＧ−ＡＡと共に、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−
Ｌ−アスコルビン酸や２−Ｏ−α−Ｄ−マルトトリオシ
ル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−ア
スコルビン酸を共に生成させることもできる。
コシル−Ｌ−アスコルビン酸は、Ｌ−アスコルビン酸の
２位の炭素のアルコール基に１個又は複数のα−Ｄ−グ
ルコシル基が結合した化合物である。これらα−Ｄ−グ
ルコシル基の数は、通常、２乃至７個程度で、α−Ｄ−
グルコシル基同士はα−１，４結合で結合している。具
体的な化合物としては、αＧ−ＡＡ、２−Ｏ−α−Ｄ−
マルトシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マ
ルトトリオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−α−Ｄ
−マルトテトラオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２−Ｏ−
α−Ｄ−マルトペンタオシル−Ｌ−アスコルビン酸、２
−Ｏ−α−Ｄ−マルトヘキサオシル−Ｌ−アスコルビン
酸、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトヘプタオシル−Ｌ−アスコ
ルビン酸などを例示できる。α−グルコシダーゼによっ
て生成させる場合には、通常、αＧ−ＡＡのみが生成す
るが、使用する糖転移酵素の種類や反応条件によって
は、αＧ−ＡＡと共に、２−Ｏ−α−Ｄ−マルトシル−
Ｌ−アスコルビン酸や２−Ｏ−α−Ｄ−マルトトリオシ
ル−Ｌ−アスコルビン酸などのα−グリコシル−Ｌ−ア
スコルビン酸を共に生成させることもできる。
【００２２】シクロマルトデキストリン・グルカノトラ
ンスフェラーゼやα−アミラーゼによってα−グリコシ
ル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させる場合には、一般
に、α−グルコシダーゼの場合よりもα−Ｄ−グルコシ
ル基の結合数の多いα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン
酸を混在生成させることができる。又、使用するα−グ
ルコシル糖化合物の種類にもよるが、一般的には、シク
ロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの
場合には、Ｌ−アスコルビン酸にα−Ｄ−グルコシル基
が１乃至７個程度結合したα−グリコシル−Ｌ−アスコ
ルビン酸が生成し、α−アミラーゼの場合には、生成す
るα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸の種類が少ない
傾向にある。
ンスフェラーゼやα−アミラーゼによってα−グリコシ
ル−Ｌ−アスコルビン酸を生成させる場合には、一般
に、α−グルコシダーゼの場合よりもα−Ｄ−グルコシ
ル基の結合数の多いα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン
酸を混在生成させることができる。又、使用するα−グ
ルコシル糖化合物の種類にもよるが、一般的には、シク
ロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼの
場合には、Ｌ−アスコルビン酸にα−Ｄ−グルコシル基
が１乃至７個程度結合したα−グリコシル−Ｌ−アスコ
ルビン酸が生成し、α−アミラーゼの場合には、生成す
るα−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸の種類が少ない
傾向にある。
【００２３】又、αＧ−ＡＡを生成させるに際し、糖転
移酵素とグルコアミラーゼとを併用してαＧ−ＡＡの生
成率を高めることもできる。一般的には、糖転移反応効
率を高めるために、予め、Ｌ−アスコルビン酸とα−グ
ルコシル糖化合物に糖転移酵素を作用させて、Ｌ−アス
コルビン酸にα−Ｄ−グルコシル残基を等モル以上転移
させてαＧ−ＡＡを含むα−グリコシル−Ｌ−アスコル
ビン酸を生成せしめ、次いでこれにグルコアミラーゼを
作用させてαＧ−ＡＡ以外のα−グリコシル−Ｌ−アス
コルビン酸に結合したα−Ｄ−グルコシル残基を加水分
解してαＧ−ＡＡを生成、蓄積させるのが望ましい。
移酵素とグルコアミラーゼとを併用してαＧ−ＡＡの生
成率を高めることもできる。一般的には、糖転移反応効
率を高めるために、予め、Ｌ−アスコルビン酸とα−グ
ルコシル糖化合物に糖転移酵素を作用させて、Ｌ−アス
コルビン酸にα−Ｄ−グルコシル残基を等モル以上転移
させてαＧ−ＡＡを含むα−グリコシル−Ｌ−アスコル
ビン酸を生成せしめ、次いでこれにグルコアミラーゼを
作用させてαＧ−ＡＡ以外のα−グリコシル−Ｌ−アス
コルビン酸に結合したα−Ｄ−グルコシル残基を加水分
解してαＧ−ＡＡを生成、蓄積させるのが望ましい。
【００２４】グルコアミラーゼとしては、微生物、植
物、動物など各種起源のものが利用できる。通常、アス
ペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する細菌由来の市販のグル
コアミラーゼが有利に利用できる。又、グルコアミラー
ゼと共にβ−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）を併
用することも随意である。
物、動物など各種起源のものが利用できる。通常、アス
ペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、リゾプス
（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する細菌由来の市販のグル
コアミラーゼが有利に利用できる。又、グルコアミラー
ゼと共にβ−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）を併
用することも随意である。
【００２５】本発明で用いる陰イオン交換樹脂について
説明するに、その母体構造は、ゲル形、巨大網目構造型
（ＭＲ形）、或いは多孔型の何れのものでもよく、その
基材は、強塩基性又は弱塩基性のスチレン系（スチレン
−ジビニルベゼン共重合体）、アクリル系の陰イオン交
換樹脂の何れのものも用いることができる。又、陰イオ
ン交換樹脂の交換基は、陰イオン吸着能を有するもので
ある限り使用でき、強塩基性（Ｉ型、ＩＩ型）、中塩基
性、弱塩基性のいずれの陰イオン交換樹脂も用いること
ができる。市販品としては、例えば、ローム・アンド・
ハース社製の商品名『アンバーライトＩＲＡ６７』、
『アンバーライトＩＲＡ９６ＳＢ』、『アンバーライト
ＩＲＡ４００』、『アンバーライトＩＲＡ４０１Ｂ』、
『アンバーライトＩＲＡ４０２』、『アンバーライトＩ
ＲＡ４０２ＢＬ』、『アンバーライトＩＲＡ４１０』、
『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ』、『アンバーライト
ＩＲＡ４４０Ｂ』、『アンバーライトＩＲＡ４５８Ｒ
Ｆ』、『アンバーライトＩＲＡ４７３』、『アンバーラ
イトＩＲＡ４７８ＲＦ』、『アンバーライトＩＲＡ９０
０』、『アンバーライトＩＲＡ９０４』、『アンバーラ
イトＩＲＡ９１０ＣＴ』、『アンバーライトＩＲＡ９５
８』、『アンバーライトＸＴ５００７』、『アンバーラ
イトＸＴ６０５０ＲＦ』、『アンバーライトＸＥ５８
３』及び『アンバーライトＣＧ４００』、三菱化学社製
造の商品名『ダイヤイオンＳＡ１０Ａ』、『ダイヤイオ
ンＳＡ１１Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ１２Ａ』、『ダイ
ヤイオンＳＡ２０Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ２１Ａ』、
『ダイヤイオンＮＳＡ１００』、『ダイヤイオンＰＡ３
０８』、『ダイヤイオンＰＡ３１２』、『ダイヤイオン
ＰＡ３１６』、『ダイヤイオンＰＡ４０８』、『ダイヤ
イオンＰＡ４１２』、『ダイヤイオンＰＡ４１８』、
『ダイヤイオンＨＰＡ２５』、『ダイヤイオンＨＰＡ７
５』、『ダイヤイオンＷＡ１０』、『ダイヤイオンＷＡ
２０』、『ダイヤイオンＷＡ２１Ｊ』、『ダイヤイオン
ＷＡ３０』及び『ダイヤイオンＤＣＡ１１』、ダウケミ
カル社製造の商品名『ダウエックスＳＢＲ』、『ダウエ
ックスＳＢＲ−Ｐ−Ｃ』、『ダウエックスＳＡＲ』、
『ダウエックスＭＳＡ−１』、『ダウエックスＭＳＡ−
２』、『ダウエックスＭＳＡ−２２』、『ダウエックス
ＭＳＡ−６６』、『ダウエックスＭＷＡ−１』、『ダウ
エックスモノスフィアー５５０Ａ』、『ダウエックスマ
ラソンＡ』、『ダウエックスマラソンＡ２』、『ダウエ
ックス１×２』、『ダウエックス１×４』、『ダウエッ
クス１×８』及び『ダウエックス２×８』などの陰イオ
ン交換樹脂を例示できる。これら陰イオン交換樹脂の
内、『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ』、『ダイヤイオ
ンＷＡ３０』、『アンバーライトＩＲＡ４７８ＲＦ』及
び『アンバーライトＩＲＡ９１０ＣＴ』は、αＧ−ＡＡ
及びＬ−アスコルビン酸の吸着量が大で、それらの分離
能も良好であり、本発明に於いては好適に用いることが
できる。陰イオン交換樹脂のイオン形としては、ＯＨ形
に加えて、Ｃｌ形やＣＨ３ＣＯＯ形のものも適宜使用で
きる。本発明に於いては、吸着量の点で、ＯＨ形のもの
が優れており有利に用いられる。
説明するに、その母体構造は、ゲル形、巨大網目構造型
（ＭＲ形）、或いは多孔型の何れのものでもよく、その
基材は、強塩基性又は弱塩基性のスチレン系（スチレン
−ジビニルベゼン共重合体）、アクリル系の陰イオン交
換樹脂の何れのものも用いることができる。又、陰イオ
ン交換樹脂の交換基は、陰イオン吸着能を有するもので
ある限り使用でき、強塩基性（Ｉ型、ＩＩ型）、中塩基
性、弱塩基性のいずれの陰イオン交換樹脂も用いること
ができる。市販品としては、例えば、ローム・アンド・
ハース社製の商品名『アンバーライトＩＲＡ６７』、
『アンバーライトＩＲＡ９６ＳＢ』、『アンバーライト
ＩＲＡ４００』、『アンバーライトＩＲＡ４０１Ｂ』、
『アンバーライトＩＲＡ４０２』、『アンバーライトＩ
ＲＡ４０２ＢＬ』、『アンバーライトＩＲＡ４１０』、
『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ』、『アンバーライト
ＩＲＡ４４０Ｂ』、『アンバーライトＩＲＡ４５８Ｒ
Ｆ』、『アンバーライトＩＲＡ４７３』、『アンバーラ
イトＩＲＡ４７８ＲＦ』、『アンバーライトＩＲＡ９０
０』、『アンバーライトＩＲＡ９０４』、『アンバーラ
イトＩＲＡ９１０ＣＴ』、『アンバーライトＩＲＡ９５
８』、『アンバーライトＸＴ５００７』、『アンバーラ
イトＸＴ６０５０ＲＦ』、『アンバーライトＸＥ５８
３』及び『アンバーライトＣＧ４００』、三菱化学社製
造の商品名『ダイヤイオンＳＡ１０Ａ』、『ダイヤイオ
ンＳＡ１１Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ１２Ａ』、『ダイ
ヤイオンＳＡ２０Ａ』、『ダイヤイオンＳＡ２１Ａ』、
『ダイヤイオンＮＳＡ１００』、『ダイヤイオンＰＡ３
０８』、『ダイヤイオンＰＡ３１２』、『ダイヤイオン
ＰＡ３１６』、『ダイヤイオンＰＡ４０８』、『ダイヤ
イオンＰＡ４１２』、『ダイヤイオンＰＡ４１８』、
『ダイヤイオンＨＰＡ２５』、『ダイヤイオンＨＰＡ７
５』、『ダイヤイオンＷＡ１０』、『ダイヤイオンＷＡ
２０』、『ダイヤイオンＷＡ２１Ｊ』、『ダイヤイオン
ＷＡ３０』及び『ダイヤイオンＤＣＡ１１』、ダウケミ
カル社製造の商品名『ダウエックスＳＢＲ』、『ダウエ
ックスＳＢＲ−Ｐ−Ｃ』、『ダウエックスＳＡＲ』、
『ダウエックスＭＳＡ−１』、『ダウエックスＭＳＡ−
２』、『ダウエックスＭＳＡ−２２』、『ダウエックス
ＭＳＡ−６６』、『ダウエックスＭＷＡ−１』、『ダウ
エックスモノスフィアー５５０Ａ』、『ダウエックスマ
ラソンＡ』、『ダウエックスマラソンＡ２』、『ダウエ
ックス１×２』、『ダウエックス１×４』、『ダウエッ
クス１×８』及び『ダウエックス２×８』などの陰イオ
ン交換樹脂を例示できる。これら陰イオン交換樹脂の
内、『アンバーライトＩＲＡ４１１Ｓ』、『ダイヤイオ
ンＷＡ３０』、『アンバーライトＩＲＡ４７８ＲＦ』及
び『アンバーライトＩＲＡ９１０ＣＴ』は、αＧ−ＡＡ
及びＬ−アスコルビン酸の吸着量が大で、それらの分離
能も良好であり、本発明に於いては好適に用いることが
できる。陰イオン交換樹脂のイオン形としては、ＯＨ形
に加えて、Ｃｌ形やＣＨ３ＣＯＯ形のものも適宜使用で
きる。本発明に於いては、吸着量の点で、ＯＨ形のもの
が優れており有利に用いられる。
【００２６】本発明で用いる溶離液としては、塩酸、硫
酸、硝酸、クエン酸などの１種又は２種以上の酸の水溶
液や、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウ
ム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、クエン酸ナトリウ
ム、クエン酸カリウム等の１種又は２種以上の塩類の水
溶液を用いることができる。又、これら１種又は２種以
上の酸及び塩類を適宜組み合わせて用いることも可能で
ある。溶離液として、塩類の水溶液を用いる場合には、
カラムに充填した陰イオン交換樹脂から脱着し、溶出し
た溶出液中に含まれるαＧ−ＡＡは、通常、塩形であ
る。この塩形のαＧ−ＡＡは、必要ならば、Ｈ形陽イオ
ン交換樹脂を用いて脱ミネラルして遊離の酸形のαＧ−
ＡＡとすることができる。又、溶離液として、酸の水溶
液を用いる場合には、カラムに充填した陰イオン交換樹
脂から脱着し、溶出した溶出液中に含まれるαＧ−ＡＡ
は、通常、遊離の酸形のαＧ−ＡＡである。本発明に於
いては、溶離液として用いる酸の水溶液の内、経済性と
陰イオン交換樹脂の再生のし易さの観点から塩酸の水溶
液が好適に用いられる。又、溶離液として用いる酸又は
塩類の水溶液濃度は必ずしも一定である必要はなく、目
的に応じて、段階的に変更したり、グラジエント溶出す
ることも可能である。又、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビ
ン酸の脱着、溶出に使用した溶離液は、製造コスト低減
の目的で、回収して再利用することもできる。
酸、硝酸、クエン酸などの１種又は２種以上の酸の水溶
液や、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウ
ム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、クエン酸ナトリウ
ム、クエン酸カリウム等の１種又は２種以上の塩類の水
溶液を用いることができる。又、これら１種又は２種以
上の酸及び塩類を適宜組み合わせて用いることも可能で
ある。溶離液として、塩類の水溶液を用いる場合には、
カラムに充填した陰イオン交換樹脂から脱着し、溶出し
た溶出液中に含まれるαＧ−ＡＡは、通常、塩形であ
る。この塩形のαＧ−ＡＡは、必要ならば、Ｈ形陽イオ
ン交換樹脂を用いて脱ミネラルして遊離の酸形のαＧ−
ＡＡとすることができる。又、溶離液として、酸の水溶
液を用いる場合には、カラムに充填した陰イオン交換樹
脂から脱着し、溶出した溶出液中に含まれるαＧ−ＡＡ
は、通常、遊離の酸形のαＧ−ＡＡである。本発明に於
いては、溶離液として用いる酸の水溶液の内、経済性と
陰イオン交換樹脂の再生のし易さの観点から塩酸の水溶
液が好適に用いられる。又、溶離液として用いる酸又は
塩類の水溶液濃度は必ずしも一定である必要はなく、目
的に応じて、段階的に変更したり、グラジエント溶出す
ることも可能である。又、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビ
ン酸の脱着、溶出に使用した溶離液は、製造コスト低減
の目的で、回収して再利用することもできる。
【００２７】次に、前記した原料溶液、陰イオン交換樹
脂、及び溶離液を用いて、αＧ−ＡＡ高含有物を得る方
法について述べる。前記したように、本発明で用いる原
料溶液は、通常、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸と共
に、α−グルコシル糖化合物、このα−グルコシル糖化
合物由来のＤ−グルコースやα−グルコシル糖化合物の
分解物などの糖類、更には、塩類を含有している。した
がって、本発明に於いては、原料溶液を先ず濾過し、Ｈ
形陽イオン交換樹脂又は活性炭処理とＨ形陽イオン交換
樹脂により脱ミネラル処理を行う。次いで、脱ミネラル
処理液をカラムに充填した陰イオン交換樹脂と接触させ
て、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを吸着せしめ、
次いで水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５
Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給し
て、αＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有
画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を採取す
る。この際、分離された未反応のＬ−アスコルビン酸及
びα−グルコシル糖化合物は、経済性を考慮して、再
度、次の糖転移反応の原料として用いることもできる。
脂、及び溶離液を用いて、αＧ−ＡＡ高含有物を得る方
法について述べる。前記したように、本発明で用いる原
料溶液は、通常、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸と共
に、α−グルコシル糖化合物、このα−グルコシル糖化
合物由来のＤ−グルコースやα−グルコシル糖化合物の
分解物などの糖類、更には、塩類を含有している。した
がって、本発明に於いては、原料溶液を先ず濾過し、Ｈ
形陽イオン交換樹脂又は活性炭処理とＨ形陽イオン交換
樹脂により脱ミネラル処理を行う。次いで、脱ミネラル
処理液をカラムに充填した陰イオン交換樹脂と接触させ
て、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを吸着せしめ、
次いで水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５
Ｎ未満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給し
て、αＧ−ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有
画分とに分画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を採取す
る。この際、分離された未反応のＬ−アスコルビン酸及
びα−グルコシル糖化合物は、経済性を考慮して、再
度、次の糖転移反応の原料として用いることもできる。
【００２８】本発明に於いて用いるカラムは、適宜形
状、大きさ、長さの１乃至複数のカラムを直列又は並列
に配置して用いればよい。複数のカラムを用いる場合、
適宜の樹脂層長となるように、カラムを直列接続して用
いることができる。原料溶液を陰イオン交換樹脂に通液
するときの流速は、ＳＶ５以下が望ましく、より望まし
くは、ＳＶ１乃至３の範囲が望ましい。又、溶離液を陰
イオン交換樹脂に供給するときの流速は、ＳＶ１以下が
望ましく、より望ましくは、ＳＶ０．３乃至０．７の範
囲が望ましい。カラムから脱着し、溶出してくるαＧ−
ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含画分の溶出順
序は、使用する陰イオン交換樹脂の種類、殊に、陰イオ
ン交換樹脂の母体構造や官能基の種類により変えること
ができる。カラム操作時の温度は、αＧ−ＡＡやＬ−ア
スコルビン酸の温度による分解の影響を考慮して、通
常、０乃至８０℃、望ましくは、１０乃至４０℃、更に
望ましくは、１５乃至２５℃の範囲が望ましい。又、使
用する酸及び／又は塩類の水溶液に関し、０．５Ｎ以上
の酸及び／又は塩類の水溶液を用いる場合、αＧ−ＡＡ
を陰イオン交換樹脂から迅速かつ容易に脱着し、溶出さ
せることができるものの、αＧ−ＡＡと共にＬ−アスコ
ルビン酸も脱着し、溶出してくることから、両者の分離
が不十分となり、高純度のαＧ−ＡＡ高含有画分を高収
率で得ることは困難となる。ところが、酸及び／又は塩
類の水溶液濃度が全体で０．５Ｎ未満、望ましくは、
０．１乃至０．４５Ｎ、更に望ましくは、０．２乃至
０．３Ｎのとき、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸は、
カラムに充填した陰イオン交換樹脂からそれぞれの高含
有画分として脱着し、溶出してくることから、両者を効
率よく分離でき、両者の高含有画分を高収率で採取する
ことができる。尚、酸及び／又は塩類の水溶液濃度を
０．１Ｎ未満とした場合でも、αＧ−ＡＡ高含有画分と
Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を採取することは可能で
ある。しかしながら、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸
の陰イオン交換樹脂からの脱着、溶出時間が長くなると
共に、得られるαＧ−ＡＡの濃度が低くなる傾向にあ
る。
状、大きさ、長さの１乃至複数のカラムを直列又は並列
に配置して用いればよい。複数のカラムを用いる場合、
適宜の樹脂層長となるように、カラムを直列接続して用
いることができる。原料溶液を陰イオン交換樹脂に通液
するときの流速は、ＳＶ５以下が望ましく、より望まし
くは、ＳＶ１乃至３の範囲が望ましい。又、溶離液を陰
イオン交換樹脂に供給するときの流速は、ＳＶ１以下が
望ましく、より望ましくは、ＳＶ０．３乃至０．７の範
囲が望ましい。カラムから脱着し、溶出してくるαＧ−
ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含画分の溶出順
序は、使用する陰イオン交換樹脂の種類、殊に、陰イオ
ン交換樹脂の母体構造や官能基の種類により変えること
ができる。カラム操作時の温度は、αＧ−ＡＡやＬ−ア
スコルビン酸の温度による分解の影響を考慮して、通
常、０乃至８０℃、望ましくは、１０乃至４０℃、更に
望ましくは、１５乃至２５℃の範囲が望ましい。又、使
用する酸及び／又は塩類の水溶液に関し、０．５Ｎ以上
の酸及び／又は塩類の水溶液を用いる場合、αＧ−ＡＡ
を陰イオン交換樹脂から迅速かつ容易に脱着し、溶出さ
せることができるものの、αＧ−ＡＡと共にＬ−アスコ
ルビン酸も脱着し、溶出してくることから、両者の分離
が不十分となり、高純度のαＧ−ＡＡ高含有画分を高収
率で得ることは困難となる。ところが、酸及び／又は塩
類の水溶液濃度が全体で０．５Ｎ未満、望ましくは、
０．１乃至０．４５Ｎ、更に望ましくは、０．２乃至
０．３Ｎのとき、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸は、
カラムに充填した陰イオン交換樹脂からそれぞれの高含
有画分として脱着し、溶出してくることから、両者を効
率よく分離でき、両者の高含有画分を高収率で採取する
ことができる。尚、酸及び／又は塩類の水溶液濃度を
０．１Ｎ未満とした場合でも、αＧ−ＡＡ高含有画分と
Ｌ−アスコルビン酸高含有画分を採取することは可能で
ある。しかしながら、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸
の陰イオン交換樹脂からの脱着、溶出時間が長くなると
共に、得られるαＧ−ＡＡの濃度が低くなる傾向にあ
る。
【００２９】カラムに充填した陰イオン交換樹脂から脱
着し、溶出してきたαＧ−ＡＡ高含有画分は、必要によ
り、精製した後、濃縮して過飽和溶液にすれば、容易に
結晶形態のαＧ−ＡＡが析出してくるので、結晶形態の
αＧ−ＡＡ高含有物として採取することも随意である。
一方、Ｌ−アスコルビン酸高含有画分は、αＧ−ＡＡを
得るための酵素反応の原料として再利用することも可能
である。又、前記αＧ−ＡＡ高含画分、又はＬ−アスコ
ルビン酸高含有画分以外の画分である。しかしながら、
αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離が不完全な両
者の混合画分を、再度、本発明の原料溶液として用いる
と、より高純度のαＧ−ＡＡ高含有物とＬ−アスコルビ
ン酸高含有物を高収率で容易に得ることができる利点が
ある。
着し、溶出してきたαＧ−ＡＡ高含有画分は、必要によ
り、精製した後、濃縮して過飽和溶液にすれば、容易に
結晶形態のαＧ−ＡＡが析出してくるので、結晶形態の
αＧ−ＡＡ高含有物として採取することも随意である。
一方、Ｌ−アスコルビン酸高含有画分は、αＧ−ＡＡを
得るための酵素反応の原料として再利用することも可能
である。又、前記αＧ−ＡＡ高含画分、又はＬ−アスコ
ルビン酸高含有画分以外の画分である。しかしながら、
αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離が不完全な両
者の混合画分を、再度、本発明の原料溶液として用いる
と、より高純度のαＧ−ＡＡ高含有物とＬ−アスコルビ
ン酸高含有物を高収率で容易に得ることができる利点が
ある。
【００３０】このように、本発明のαＧ−ＡＡの製造方
法は、操作性、製造コストの点で優れているだけでな
く、固形分当たりの純度が約９０％以上の高品質のαＧ
−ＡＡ高含有物を、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するα
Ｇ−ＡＡの収率約８５％以上、より好ましくは、９０％
以上で得ることを可能にしたものである。
法は、操作性、製造コストの点で優れているだけでな
く、固形分当たりの純度が約９０％以上の高品質のαＧ
−ＡＡ高含有物を、原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するα
Ｇ−ＡＡの収率約８５％以上、より好ましくは、９０％
以上で得ることを可能にしたものである。
【００３１】斯くして得られた本発明のαＧ−ＡＡ高含
有物は、安定型Ｌ−アスコルビン酸高含有物として、ビ
タミンＣ強化剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理
活性剤、紫外線吸収剤などとして、各種食品、化粧品、
医薬品、飼料、餌料、工業用原料などの広範な用途に有
利に用いることができる。
有物は、安定型Ｌ−アスコルビン酸高含有物として、ビ
タミンＣ強化剤、安定剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理
活性剤、紫外線吸収剤などとして、各種食品、化粧品、
医薬品、飼料、餌料、工業用原料などの広範な用途に有
利に用いることができる。
【００３２】以下、実験により本発明を更に詳細に説明
する。
する。
【００３３】
【実験】＜陰イオン交換樹脂に吸着したαＧ−ＡＡとＬ
−アスコルビン酸の分離と溶出に及ぼす溶離液の濃度の
影響＞デキストリン（ＤＥ約６）２重量部を水６重量部
に加熱溶解し、これを還元下に保って、Ｌ−アスコルビ
ン酸１重量部を加え、ｐＨ５．５、６０℃に維持しつ
つ、これにシクロマルトデキストリン・グルカノトラン
スフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）をデキ
ストリングラム当り４００単位加えて２４時間反応させ
た。本反応液をＵＦ膜で濾過して酵素を除去した後、濾
液を５５℃、ｐＨ５．０に調整し、これにグルコアミラ
ーゼ（生化学工業株式会社製）を前記デキストリングラ
ム当り１０単位加えて２４時間反応させた。本反応液を
加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、得られ
た濾液を固形分濃度約４０％に濃縮した。この濃縮液中
の固形分組成は、高速液体クロマトグラフィーにより分
析した（高速液体クロマトグラフィーで用いた装置は、
島津製作所製『ＬＣ−６Ａ』；カラムは、島津テクノリ
サーチ株式会社製『ＳＴＲカラム ＯＤＳ−ＩＩ』；溶
離液は、０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ３ＰＯ４（ｐ
Ｈ２．０）；流速は、０．５ｍｌ／ｍｉｎ；検出に用い
た示差屈折計は、東ソー株式会社製『ＲＩ−８０２
０』。）。その結果、濃縮液中の固形分組成は、αＧ−
ＡＡ約３１％、Ｌ−アスコルビン酸約２１％、Ｄ−グル
コース約３１％、及びα−グルコシル糖化合物約１７％
であった。前記活性炭で脱色濾過して得た濾液を強酸性
陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ
形）』、三菱化学株式会社製）１００ｍｌを充填したカ
ラム（内径２０ｍｍ、長さ３５０ｍｍ、カラム内温度２
５℃）にＳＶ２で通液して脱ミネラルした。得られた固
形分濃度３０％の溶液を３３０ｇずつ、２００ｍｌの陰
イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１
Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）を充填
した７本のカラム（それぞれ内径２０ｍｍ、長さ６５０
ｍｍ、カラム内温度２５℃）にそれぞれＳＶ２で通液
し、その後、各カラムに水約１，０００ｍｌをＳＶ２で
通液して陰イオン交換樹脂を水洗し、非吸着成分を溶出
させた。次いで、７本のカラムにそれぞれ０．１Ｎ、
０．１５Ｎ、０．２Ｎ、０．３Ｎ、０．４Ｎ、０．４５
Ｎ又は０．５Ｎの塩酸水溶液をＳＶ０．５で通液し、カ
ラム出口の固形分濃度が０．２％以上となった時点から
溶出液の回収を始め、カラム出口の溶出液がそれぞれ
０．１Ｎ、０．１５Ｎ、０．２Ｎ、０．３Ｎ、０．４
Ｎ、０．４５Ｎ又は０．５Ｎの塩酸水溶液に置換される
まで分画を続けた。分画はフラクションコレクターを用
いて、２０分毎に分画してサンプリングし、各サンプル
中の固形分組成を上記したと同様にして高速液体クロマ
トグラフィーで分析した。その分析結果に基づいて、溶
離液として０．１Ｎ及び０．５Ｎの塩酸水溶液を用いた
ときの溶出液中の固形分当たりの各成分の濃度をプロッ
トして得られた濃度分布を示す溶出曲線を図３、図４に
それぞれ示す。尚、図３、図４に於いて、縦軸は溶出液
中の固形分当たりの各成分の濃度（％（ｗ／ｗ））を、
横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−
〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン
酸を、又「−△−」は糖類を示す。図３から、塩酸の水
溶液濃度０．１Ｎの条件下では、αＧ−ＡＡとＬ−アス
コルビン酸との分離は良好である。しかしながら、塩酸
の水溶液濃度が高い場合と比較して、αＧ−ＡＡとＬ−
アスコルビン酸の溶出は遅くなり、得られるαＧ−ＡＡ
高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分の濃度が若
干低くなる傾向を示した。又、図４から、脱着剤として
用いる塩酸の水溶液濃度が０．５Ｎの条件下では、塩酸
の水溶液濃度が低い場合と比較して、αＧ−ＡＡとＬ−
アスコルビン酸の溶出が早くなり、両者の分離が不十分
となり、αＧ−ＡＡ高含有画分の収率が低くなることが
判明した。又、図３、図４から明らかなように、糖類の
大部分は陰イオン交換樹脂に吸着しないものの、僅かな
がら陰イオン交換樹脂に吸着し、溶離液で溶離されるこ
とが判明した。
−アスコルビン酸の分離と溶出に及ぼす溶離液の濃度の
影響＞デキストリン（ＤＥ約６）２重量部を水６重量部
に加熱溶解し、これを還元下に保って、Ｌ−アスコルビ
ン酸１重量部を加え、ｐＨ５．５、６０℃に維持しつ
つ、これにシクロマルトデキストリン・グルカノトラン
スフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所製）をデキ
ストリングラム当り４００単位加えて２４時間反応させ
た。本反応液をＵＦ膜で濾過して酵素を除去した後、濾
液を５５℃、ｐＨ５．０に調整し、これにグルコアミラ
ーゼ（生化学工業株式会社製）を前記デキストリングラ
ム当り１０単位加えて２４時間反応させた。本反応液を
加熱して酵素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、得られ
た濾液を固形分濃度約４０％に濃縮した。この濃縮液中
の固形分組成は、高速液体クロマトグラフィーにより分
析した（高速液体クロマトグラフィーで用いた装置は、
島津製作所製『ＬＣ−６Ａ』；カラムは、島津テクノリ
サーチ株式会社製『ＳＴＲカラム ＯＤＳ−ＩＩ』；溶
離液は、０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ３ＰＯ４（ｐ
Ｈ２．０）；流速は、０．５ｍｌ／ｍｉｎ；検出に用い
た示差屈折計は、東ソー株式会社製『ＲＩ−８０２
０』。）。その結果、濃縮液中の固形分組成は、αＧ−
ＡＡ約３１％、Ｌ−アスコルビン酸約２１％、Ｄ−グル
コース約３１％、及びα−グルコシル糖化合物約１７％
であった。前記活性炭で脱色濾過して得た濾液を強酸性
陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ
形）』、三菱化学株式会社製）１００ｍｌを充填したカ
ラム（内径２０ｍｍ、長さ３５０ｍｍ、カラム内温度２
５℃）にＳＶ２で通液して脱ミネラルした。得られた固
形分濃度３０％の溶液を３３０ｇずつ、２００ｍｌの陰
イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１
Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）を充填
した７本のカラム（それぞれ内径２０ｍｍ、長さ６５０
ｍｍ、カラム内温度２５℃）にそれぞれＳＶ２で通液
し、その後、各カラムに水約１，０００ｍｌをＳＶ２で
通液して陰イオン交換樹脂を水洗し、非吸着成分を溶出
させた。次いで、７本のカラムにそれぞれ０．１Ｎ、
０．１５Ｎ、０．２Ｎ、０．３Ｎ、０．４Ｎ、０．４５
Ｎ又は０．５Ｎの塩酸水溶液をＳＶ０．５で通液し、カ
ラム出口の固形分濃度が０．２％以上となった時点から
溶出液の回収を始め、カラム出口の溶出液がそれぞれ
０．１Ｎ、０．１５Ｎ、０．２Ｎ、０．３Ｎ、０．４
Ｎ、０．４５Ｎ又は０．５Ｎの塩酸水溶液に置換される
まで分画を続けた。分画はフラクションコレクターを用
いて、２０分毎に分画してサンプリングし、各サンプル
中の固形分組成を上記したと同様にして高速液体クロマ
トグラフィーで分析した。その分析結果に基づいて、溶
離液として０．１Ｎ及び０．５Ｎの塩酸水溶液を用いた
ときの溶出液中の固形分当たりの各成分の濃度をプロッ
トして得られた濃度分布を示す溶出曲線を図３、図４に
それぞれ示す。尚、図３、図４に於いて、縦軸は溶出液
中の固形分当たりの各成分の濃度（％（ｗ／ｗ））を、
横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−
〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン
酸を、又「−△−」は糖類を示す。図３から、塩酸の水
溶液濃度０．１Ｎの条件下では、αＧ−ＡＡとＬ−アス
コルビン酸との分離は良好である。しかしながら、塩酸
の水溶液濃度が高い場合と比較して、αＧ−ＡＡとＬ−
アスコルビン酸の溶出は遅くなり、得られるαＧ−ＡＡ
高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分の濃度が若
干低くなる傾向を示した。又、図４から、脱着剤として
用いる塩酸の水溶液濃度が０．５Ｎの条件下では、塩酸
の水溶液濃度が低い場合と比較して、αＧ−ＡＡとＬ−
アスコルビン酸の溶出が早くなり、両者の分離が不十分
となり、αＧ−ＡＡ高含有画分の収率が低くなることが
判明した。又、図３、図４から明らかなように、糖類の
大部分は陰イオン交換樹脂に吸着しないものの、僅かな
がら陰イオン交換樹脂に吸着し、溶離液で溶離されるこ
とが判明した。
【００３４】更に、具体的には図示しないものの、脱着
剤として用いる塩酸の水溶液濃度が０．１乃至０．４５
Ｎの条件下では、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の分
離、溶出が良好で、殊に、脱着剤として用いる塩酸の水
溶液濃度が０．２乃至０．３Ｎの条件下での溶出が好適
であることが判明した。又、溶離液として、これら塩酸
の水溶液を用いて得られた結果は、塩酸の水溶液に代え
て他の種類の酸又は塩類、及び各種酸及び塩類を併用す
る水溶液を溶離液として用いた場合、更に、陰イオン交
換樹脂の種類を変えた場合にも同様に当てはまる結果で
ある。
剤として用いる塩酸の水溶液濃度が０．１乃至０．４５
Ｎの条件下では、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸の分
離、溶出が良好で、殊に、脱着剤として用いる塩酸の水
溶液濃度が０．２乃至０．３Ｎの条件下での溶出が好適
であることが判明した。又、溶離液として、これら塩酸
の水溶液を用いて得られた結果は、塩酸の水溶液に代え
て他の種類の酸又は塩類、及び各種酸及び塩類を併用す
る水溶液を溶離液として用いた場合、更に、陰イオン交
換樹脂の種類を変えた場合にも同様に当てはまる結果で
ある。
【００３５】以下、本発明のαＧ−ＡＡ高含有物の製造
方法を実施例により詳細に説明する。
方法を実施例により詳細に説明する。
【００３６】
【実施例１】＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞溶離液
として、０．２５Ｎ塩酸水溶液を使用した以外は実験と
同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。本実施例に
於ける、陰イオン交換樹脂から溶出してくる溶出液を前
記実験と同様にして分画してサンプリングし、各サンプ
ル中の固形分組成を高速液体クロマトグラフィーで分析
した。その分析結果に基づいて溶出液中の各成分の固形
分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線
を図５に示す。尚、図５に於いて、縦軸は溶出液中の固
形分当たりの各成分の固形分濃度（％（ｗ／ｗ））を、
横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−
〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン
酸を、「−△−」は糖類を示す。本品は固形分当たり純
度約９３％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中のαＧ−
ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９２％であった。
尚、図５から明らかなように、糖類の大部分は陰イオン
交換樹脂に吸着しないものの、僅かながら陰イオン交換
樹脂に吸着し、溶離液で溶出されることが判明した。
として、０．２５Ｎ塩酸水溶液を使用した以外は実験と
同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。本実施例に
於ける、陰イオン交換樹脂から溶出してくる溶出液を前
記実験と同様にして分画してサンプリングし、各サンプ
ル中の固形分組成を高速液体クロマトグラフィーで分析
した。その分析結果に基づいて溶出液中の各成分の固形
分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線
を図５に示す。尚、図５に於いて、縦軸は溶出液中の固
形分当たりの各成分の固形分濃度（％（ｗ／ｗ））を、
横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−
〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン
酸を、「−△−」は糖類を示す。本品は固形分当たり純
度約９３％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中のαＧ−
ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９２％であった。
尚、図５から明らかなように、糖類の大部分は陰イオン
交換樹脂に吸着しないものの、僅かながら陰イオン交換
樹脂に吸着し、溶離液で溶出されることが判明した。
【００３７】
【実施例２】＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞デキス
トリン（ＤＥ約６）２重量部を水６重量部に加熱溶解
し、これを還元下に保って、Ｌ−アスコルビン酸１重量
部を加え、ｐＨ５．５、６０℃に維持しつつ、これにシ
クロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ
（株式会社林原生物化学研究所製）をデキストリングラ
ム当り４００単位加えて２４時間反応させた。本反応液
をＵＦ膜で濾過して酵素を除去した後、濾液を５５℃、
ｐＨ５．０に調整し、これにグルコアミラーゼ（生化学
工業株式会社販売）を前記デキストリングラム当り１０
単位加えて２４時間反応させた。本反応液を加熱して酵
素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、得られる濾液を固
形分濃度約４０％に濃縮した。この濃縮液中の固形分組
成を前記実験で用いたのと同じ高速液体クロマトグラフ
ィー条件で分析したところ、αＧ−ＡＡ約３１％、Ｌ−
アスコルビン酸約２１％、Ｄ−グルコース約３１％、及
びα−グルコシル糖化合物約１７％であった。前記活性
炭で脱色濾過して得た濾液を強酸性陽イオン交換樹脂
（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ形）』、三菱化学
株式会社製）を１００ｍｌ充填したカラム（内径２０ｍ
ｍ、長さ３５０ｍｍ、カラム内温度２５℃）にＳＶ２で
通液して脱ミネラルした。得られた濃度３０％の溶液３
３０ｇを２００ｍｌの陰イオン交換樹脂（商品名『ダイ
ヤイオンＷＡ３０（ＯＨ形）』、三菱化学株式会社製）
を充填したカラム（内径２０ｍｍ、長さ６５０ｍｍ、カ
ラム内温度２５℃）にＳＶ２で通液し、その後、水約
１，０００ｍｌをＳＶ２で通液して水洗し、非吸着成分
を溶離させた。次いで、溶離液として０．２５Ｎ塩酸水
溶液をＳＶ０．５で通液し、カラム出口の固形分濃度が
０．２％以上となった時点から溶出液の回収を始め、カ
ラム出口の溶出液が０．２５Ｎの塩酸水溶液に置換され
るまで分画を続けた。この分画は、フラクションコレク
ターを用いて２０分毎に行い、得られた各画分の一部を
サンプリングし、各サンプル中の固形分組成を前記実験
と同様にして高速液体クロマトグラフィーで分析した。
溶出液中の各成分の固形物濃度をプロットして得られた
濃度分布を示す溶出曲線を図６に示す。図６から明らか
なように、本実施例に於いては、実施例１とは異なる陰
イオン交換樹脂を用いたことから、αＧ−ＡＡとＬ−ア
スコルビン酸の溶出順序が逆転したけれども、実施例１
と同様に、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離は
良好で、所望のαＧ−ＡＡ高含有画分を回収してαＧ−
ＡＡ高含有物を得た。尚、図６に於いて、縦軸は溶出液
中の固形分当たりの各成分の濃度（％（ｗ／ｗ））を、
横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−
〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン
酸を、「−△−」は糖類を示す。図６から明らかなよう
に、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸は陰イオン交換樹
脂から良好に脱着、溶離し、所望のαＧ−ＡＡ高含有画
分を回収してαＧ−ＡＡ高含有物を得た。本品は固形分
当たり純度約９３％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中
のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９０％であ
った。尚、図６から明らかなように、糖類の大部分は陰
イオン交換樹脂に吸着しないものの、僅かながら陰イオ
ン交換樹脂に吸着し、溶離液で溶離されることが判明し
た。
トリン（ＤＥ約６）２重量部を水６重量部に加熱溶解
し、これを還元下に保って、Ｌ−アスコルビン酸１重量
部を加え、ｐＨ５．５、６０℃に維持しつつ、これにシ
クロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ
（株式会社林原生物化学研究所製）をデキストリングラ
ム当り４００単位加えて２４時間反応させた。本反応液
をＵＦ膜で濾過して酵素を除去した後、濾液を５５℃、
ｐＨ５．０に調整し、これにグルコアミラーゼ（生化学
工業株式会社販売）を前記デキストリングラム当り１０
単位加えて２４時間反応させた。本反応液を加熱して酵
素を失活させ、活性炭で脱色濾過し、得られる濾液を固
形分濃度約４０％に濃縮した。この濃縮液中の固形分組
成を前記実験で用いたのと同じ高速液体クロマトグラフ
ィー条件で分析したところ、αＧ−ＡＡ約３１％、Ｌ−
アスコルビン酸約２１％、Ｄ−グルコース約３１％、及
びα−グルコシル糖化合物約１７％であった。前記活性
炭で脱色濾過して得た濾液を強酸性陽イオン交換樹脂
（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ形）』、三菱化学
株式会社製）を１００ｍｌ充填したカラム（内径２０ｍ
ｍ、長さ３５０ｍｍ、カラム内温度２５℃）にＳＶ２で
通液して脱ミネラルした。得られた濃度３０％の溶液３
３０ｇを２００ｍｌの陰イオン交換樹脂（商品名『ダイ
ヤイオンＷＡ３０（ＯＨ形）』、三菱化学株式会社製）
を充填したカラム（内径２０ｍｍ、長さ６５０ｍｍ、カ
ラム内温度２５℃）にＳＶ２で通液し、その後、水約
１，０００ｍｌをＳＶ２で通液して水洗し、非吸着成分
を溶離させた。次いで、溶離液として０．２５Ｎ塩酸水
溶液をＳＶ０．５で通液し、カラム出口の固形分濃度が
０．２％以上となった時点から溶出液の回収を始め、カ
ラム出口の溶出液が０．２５Ｎの塩酸水溶液に置換され
るまで分画を続けた。この分画は、フラクションコレク
ターを用いて２０分毎に行い、得られた各画分の一部を
サンプリングし、各サンプル中の固形分組成を前記実験
と同様にして高速液体クロマトグラフィーで分析した。
溶出液中の各成分の固形物濃度をプロットして得られた
濃度分布を示す溶出曲線を図６に示す。図６から明らか
なように、本実施例に於いては、実施例１とは異なる陰
イオン交換樹脂を用いたことから、αＧ−ＡＡとＬ−ア
スコルビン酸の溶出順序が逆転したけれども、実施例１
と同様に、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離は
良好で、所望のαＧ−ＡＡ高含有画分を回収してαＧ−
ＡＡ高含有物を得た。尚、図６に於いて、縦軸は溶出液
中の固形分当たりの各成分の濃度（％（ｗ／ｗ））を、
横軸はカラムからの溶出液量（ｍｌ）を示し、符号「−
〇−」はαＧ−ＡＡを、「−●−」はＬ−アスコルビン
酸を、「−△−」は糖類を示す。図６から明らかなよう
に、αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸は陰イオン交換樹
脂から良好に脱着、溶離し、所望のαＧ−ＡＡ高含有画
分を回収してαＧ−ＡＡ高含有物を得た。本品は固形分
当たり純度約９３％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中
のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９０％であ
った。尚、図６から明らかなように、糖類の大部分は陰
イオン交換樹脂に吸着しないものの、僅かながら陰イオ
ン交換樹脂に吸着し、溶離液で溶離されることが判明し
た。
【００３８】
【実施例３】＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞強酸性
陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ
形）』、三菱化学株式会社製）を充填したカラム（内径
４００ｍｍ、長さ１，０００ｍｍ）を用いて脱ミネラル
し、陰イオン交換樹脂として、ローム・アンド・ハース
社製の陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲ
Ａ９１０ＣＴ（ＯＨ形）』）を充填したカラム（内径５
６０ｍｍ、長さ１，０００ｍｍ、カラム内温度２５℃）
を使用し、溶離液として０．３Ｎ硝酸水溶液を用いた以
外は実施例２と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造し
た。本品は、液状αＧ−ＡＡ高含有物で、固形分当たり
純度約９２％のαＧ−ＡＡ高含有物で、原料溶液中のα
Ｇ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９０％であっ
た。次いで、この液状αＧ−ＡＡ高含有物を固形分濃度
約７６％になるまで減圧濃縮し、得られた濃縮液を助晶
缶にとり、結晶αＧ−ＡＡを種晶として１％加えて４０
℃に保ち、ゆっくり攪拌しつつ徐冷して２日間かけて２
５℃まで下げ、次いで、バスケット型遠心分離機で分蜜
し、得られた結晶に少量の水をスプレーして洗浄し、結
晶形態のαＧ−ＡＡを採取して、αＧ−ＡＡ高含有物を
得た。本品は固形分当たり、純度約９９％のαＧ−ＡＡ
高含有物であった。
陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ
形）』、三菱化学株式会社製）を充填したカラム（内径
４００ｍｍ、長さ１，０００ｍｍ）を用いて脱ミネラル
し、陰イオン交換樹脂として、ローム・アンド・ハース
社製の陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲ
Ａ９１０ＣＴ（ＯＨ形）』）を充填したカラム（内径５
６０ｍｍ、長さ１，０００ｍｍ、カラム内温度２５℃）
を使用し、溶離液として０．３Ｎ硝酸水溶液を用いた以
外は実施例２と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造し
た。本品は、液状αＧ−ＡＡ高含有物で、固形分当たり
純度約９２％のαＧ−ＡＡ高含有物で、原料溶液中のα
Ｇ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９０％であっ
た。次いで、この液状αＧ−ＡＡ高含有物を固形分濃度
約７６％になるまで減圧濃縮し、得られた濃縮液を助晶
缶にとり、結晶αＧ−ＡＡを種晶として１％加えて４０
℃に保ち、ゆっくり攪拌しつつ徐冷して２日間かけて２
５℃まで下げ、次いで、バスケット型遠心分離機で分蜜
し、得られた結晶に少量の水をスプレーして洗浄し、結
晶形態のαＧ−ＡＡを採取して、αＧ−ＡＡ高含有物を
得た。本品は固形分当たり、純度約９９％のαＧ−ＡＡ
高含有物であった。
【００３９】
【実施例４】＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞溶離液
として、０．４５Ｎの塩酸水溶液を用いた以外は実施例
２と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。実施例
２同様、カラムに充填した陰イオン交換樹脂からのαＧ
−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離は良好であった。
本実施例で得られたαＧ−ＡＡ高含有物は、固形分当た
り純度約９０％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中のα
Ｇ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９１％であっ
た。
として、０．４５Ｎの塩酸水溶液を用いた以外は実施例
２と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。実施例
２同様、カラムに充填した陰イオン交換樹脂からのαＧ
−ＡＡとＬ−アスコルビン酸との分離は良好であった。
本実施例で得られたαＧ−ＡＡ高含有物は、固形分当た
り純度約９０％のαＧ−ＡＡを含有し、原料溶液中のα
Ｇ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率は約９１％であっ
た。
【００４０】
【実施例５】＜αＧ−ＡＡ高含有物の製造方法＞強酸性
陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ
形）』、三菱化学株式会社製）を充填したカラム（内径
８００ｍｍ、長さ１，６００ｍｍ）を用いて脱ミネラル
し、陰イオン交換樹脂として、『アンバーライトＩＲＡ
４７８ＲＦ（ＯＨ形）』（ローム・アンド・ハース社
製）を充填したカラム（内径１，２００ｍｍ、長さ１，
６００ｍｍ、カラム内温度２５℃）を使用し、溶離液と
して０．２Ｎ ＮａＣｌ水溶液を用いた以外は実施例２
と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。本品は、
αＧ−ＡＡのナトリウム塩で（αＧ−ＡＡ−Ｎａ）、固
形分当たり純度約９０％のαＧ−ＡＡ−Ｎａを含有し、
原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡ−Ｎａの収
率はモル比で約９０％であった。
陽イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ
形）』、三菱化学株式会社製）を充填したカラム（内径
８００ｍｍ、長さ１，６００ｍｍ）を用いて脱ミネラル
し、陰イオン交換樹脂として、『アンバーライトＩＲＡ
４７８ＲＦ（ＯＨ形）』（ローム・アンド・ハース社
製）を充填したカラム（内径１，２００ｍｍ、長さ１，
６００ｍｍ、カラム内温度２５℃）を使用し、溶離液と
して０．２Ｎ ＮａＣｌ水溶液を用いた以外は実施例２
と同じ条件でαＧ−ＡＡ高含有物を製造した。本品は、
αＧ−ＡＡのナトリウム塩で（αＧ−ＡＡ−Ｎａ）、固
形分当たり純度約９０％のαＧ−ＡＡ−Ｎａを含有し、
原料溶液中のαＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡ−Ｎａの収
率はモル比で約９０％であった。
【００４１】
【発明の効果】上記したように、本発明によれば、原料
溶液として、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類
を含有する溶液を、カラムに充填した陰イオン交換樹脂
と接触させてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰イ
オン交換樹脂に吸着せしめ、次いで陰イオン交換樹脂を
水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５Ｎ未満
の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給してαＧ−
ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分
画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を採取することによ
り、αＧ−ＡＡ高含有物とＬ−アスコルビン酸高含有物
を高収率で得ることができるようになった。即ち、本発
明によれば、従来のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法に於
いて、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフ
ィー後に必要不可欠とされていた強酸性陽イオン交換樹
脂を用いるカラムクロマトグラフィーと、その処理前に
必要とされていた濃縮工程とを省略できることから、そ
の分、αＧ−ＡＡ高含有物の製造工程が簡略化され、製
造コストが低減され、加えて高収率で高純度αＧ−ＡＡ
を得ることができることとなった。本発明の製造方法
は、従来の製造方法とは違って、強酸性陽イオン交換樹
脂を用いるカラムクロマトグラフィーを経由する必要が
ないことから、従来の製造方法に於いて、原料溶液中の
αＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率が約７５乃至８０
％どまりであったものを約８５％以上、より好ましく
は、９０％以上にまで高めることが可能となった。
溶液として、αＧ−ＡＡ、Ｌ−アスコルビン酸及び糖類
を含有する溶液を、カラムに充填した陰イオン交換樹脂
と接触させてαＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを陰イ
オン交換樹脂に吸着せしめ、次いで陰イオン交換樹脂を
水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５Ｎ未満
の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給してαＧ−
ＡＡ高含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分
画し、このαＧ−ＡＡ高含有画分を採取することによ
り、αＧ−ＡＡ高含有物とＬ−アスコルビン酸高含有物
を高収率で得ることができるようになった。即ち、本発
明によれば、従来のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法に於
いて、陰イオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフ
ィー後に必要不可欠とされていた強酸性陽イオン交換樹
脂を用いるカラムクロマトグラフィーと、その処理前に
必要とされていた濃縮工程とを省略できることから、そ
の分、αＧ−ＡＡ高含有物の製造工程が簡略化され、製
造コストが低減され、加えて高収率で高純度αＧ−ＡＡ
を得ることができることとなった。本発明の製造方法
は、従来の製造方法とは違って、強酸性陽イオン交換樹
脂を用いるカラムクロマトグラフィーを経由する必要が
ないことから、従来の製造方法に於いて、原料溶液中の
αＧ−ＡＡに対するαＧ−ＡＡの収率が約７５乃至８０
％どまりであったものを約８５％以上、より好ましく
は、９０％以上にまで高めることが可能となった。
【００４２】このように、本発明は、操作性、製造コス
ト、及び収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物の製
造方法を可能としたものである。又、本発明の製造方法
により得られるαＧ−ＡＡ高含有物は、安定型Ｌ−アス
コルビン酸高含有物として、ビタミンＣ強化剤、安定
剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤
などとして、各種食品、化粧品、医薬品、飼料、餌料、
工業用原料などの広範な用途に有利に用いることができ
る。
ト、及び収率の優れた高品質のαＧ−ＡＡ高含有物の製
造方法を可能としたものである。又、本発明の製造方法
により得られるαＧ−ＡＡ高含有物は、安定型Ｌ−アス
コルビン酸高含有物として、ビタミンＣ強化剤、安定
剤、品質改良剤、抗酸化剤、生理活性剤、紫外線吸収剤
などとして、各種食品、化粧品、医薬品、飼料、餌料、
工業用原料などの広範な用途に有利に用いることができ
る。
【００４３】本発明は斯くも顕著なる作用効果を奏する
発明であり、斯界に与える影響は誠に多大なものがあ
る。
発明であり、斯界に与える影響は誠に多大なものがあ
る。
【図１】図１は、従来のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方法
に於ける製造工程の流れ図である。
に於ける製造工程の流れ図である。
【図２】図２は、本発明のαＧ−ＡＡ高含有物の製造方
法に於ける製造工程の流れ図である。
法に於ける製造工程の流れ図である。
【図３】図３は、溶離液として０．１Ｎ塩酸を用いて陰
イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１
Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）からα
Ｇ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成
分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す
溶出曲線を示す図である。
イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１
Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）からα
Ｇ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成
分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す
溶出曲線を示す図である。
【図４】図４は、溶離液として０．５Ｎ塩酸を用いて陰
イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１
Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）からα
Ｇ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成
分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す
溶出曲線を示す図である。
イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１１
Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）からα
Ｇ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各成
分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示す
溶出曲線を示す図である。
【図５】図５は、溶離液として０．２５Ｎ塩酸を用いて
陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１
１Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）から
αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各
成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示
す溶出曲線を示す図である。
陰イオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＩＲＡ４１
１Ｓ（ＯＨ形）』、ローム・アンド・ハース社製）から
αＧ−ＡＡとＬ−アスコルビン酸とを溶出したときの各
成分の固形分濃度をプロットして得られた濃度分布を示
す溶出曲線を示す図である。
【図６】図６は、溶離液として０．２５Ｎ塩酸を用いて
陰イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＷＡ３０（Ｏ
Ｈ形）』、三菱化学株式会社製）からαＧ−ＡＡとＬ−
アスコルビン酸とを溶出したときの各成分の固形分濃度
をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を示す
図である。
陰イオン交換樹脂（商品名『ダイヤイオンＷＡ３０（Ｏ
Ｈ形）』、三菱化学株式会社製）からαＧ−ＡＡとＬ−
アスコルビン酸とを溶出したときの各成分の固形分濃度
をプロットして得られた濃度分布を示す溶出曲線を示す
図である。
−〇−．．．．αＧ−ＡＡ −●−．．．．Ｌ−アスコルビン酸 −△−．．．．糖類
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｂ０１Ｊ 20/34 Ｂ０１Ｊ 20/34 Ｇ Ｃ１２Ｐ 19/00 Ｃ１２Ｐ 19/00 Ｆターム(参考） 2B150 DC13 4B064 AF41 CA21 CB30 DA01 DA10 DA11 4C057 BB02 DD01 KK02 4D017 AA01 BA04 CA13 CA17 CB01 DA03 DB01 EA10 EB01 4G066 AC11A AC11C AE10B CA19 CA56 DA10 EA01 GA11 GA37
Claims (9)
- 【請求項１】 原料溶液として、２−Ｏ−α−Ｄ−グル
コピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン
酸及び糖類を含有する溶液を、カラムに充填した陰イオ
ン交換樹脂と接触させて２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノ
シル−Ｌ−アスコルビン酸とＬ−アスコルビン酸とを陰
イオン交換樹脂に吸着せしめ、次いで陰イオン交換樹脂
を水洗して糖類を除去した後、溶離液として０．５Ｎ未
満の酸及び／又は塩類の水溶液をカラムに供給して２−
Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高
含有画分とＬ−アスコルビン酸高含有画分とに分画し、
この２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコル
ビン酸高含有画分を採取することを特徴とする２−Ｏ−
α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有
物の製造方法。 - 【請求項２】 原料溶液が、Ｌ−アスコルビン酸とα−
グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素又
は糖転移酵素とグルコアミラーゼとを作用させて得られ
たものであることを特徴とする請求項１記載の２−Ｏ−
α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有
物の製造方法。 - 【請求項３】 原料溶液が、カラムに充填したＨ形陽イ
オン交換樹脂と接触させて脱ミネラルしたものである請
求項１又は２記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル
−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法。 - 【請求項４】 陰イオン交換樹脂が、ＯＨ形陰イオン交
換樹脂であることを特徴とする請求項１、２又は３記載
の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビ
ン酸高含有物の製造方法。 - 【請求項５】 酸が、塩酸、硫酸、硝酸及びクエン酸か
ら選ばれる１種又は２種以上の酸であることを特徴とす
る請求項１乃至４のいずれかに記載の２−Ｏ−α−Ｄ−
グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造
方法。 - 【請求項６】 塩類が、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、
クエン酸ナトリウム、及びクエン酸カリウムから選ばれ
る１種又は２種以上の塩類であることを特徴とする請求
項１乃至４のいずれかに記載の記載の２−Ｏ−α−Ｄ−
グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造
方法。 - 【請求項７】 酸及び／又は塩類の水溶液濃度が、０．
１乃至０．４５Ｎであることを特徴とする請求項１乃至
６のいずれかに記載の２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシ
ル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法。 - 【請求項８】 酸及び／又は塩類の水溶液濃度が、０．
２乃至０．３Ｎであることを特徴とする請求項７記載の
２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン
酸高含有物の製造方法。 - 【請求項９】 更に濃縮工程及び晶出工程を含むことを
特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の２−Ｏ−
α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有
物の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001173894A JP4697697B2 (ja) | 2000-06-08 | 2001-06-08 | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000172643 | 2000-06-08 | ||
| JP2000-172643 | 2000-06-08 | ||
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| JP2001173894A JP4697697B2 (ja) | 2000-06-08 | 2001-06-08 | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002088095A true JP2002088095A (ja) | 2002-03-27 |
| JP4697697B2 JP4697697B2 (ja) | 2011-06-08 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001173894A Expired - Fee Related JP4697697B2 (ja) | 2000-06-08 | 2001-06-08 | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸高含有物の製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006022174A1 (ja) * | 2004-08-24 | 2006-03-02 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | アスコルビン酸２－グルコシドを有効成分とする褐変抑制剤とこれを利用する褐変抑制方法 |
| WO2011027790A1 (ja) * | 2009-09-03 | 2011-03-10 | 株式会社林原生物化学研究所 | ２－Ｏ－α－Ｄ－グルコシル－Ｌ－アスコルビン酸無水結晶含有粉末とその製造方法並びに用途 |
| WO2012033218A1 (ja) | 2010-09-07 | 2012-03-15 | 株式会社林原生物化学研究所 | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸含水結晶及び２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸含水結晶含有粉末とそれらの製造方法並びに用途 |
| WO2012121297A1 (ja) | 2011-03-07 | 2012-09-13 | 株式会社林原 | ２－Ｏ－α－Ｄ－グルコシル－Ｌ－アスコルビン酸無水結晶含有粉末の製造方法 |
| WO2014103475A1 (ja) * | 2012-12-27 | 2014-07-03 | 株式会社林原 | アンチエイジング用皮膚外用組成物及びその製造方法 |
| WO2018021542A1 (ja) * | 2016-07-29 | 2018-02-01 | カーリットホールディングス株式会社 | ２－Ｏ－α－Ｄ－グリコシル－Ｌ－アスコルビン酸金属塩、その酸化防止剤としての用途及びその粉末の製造方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03135992A (ja) * | 1989-10-21 | 1991-06-10 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 結晶２―Ｏ―α―Ｄ―グルコピラノシル―Ｌ―アスコルビン酸とその製造方法並びに用途 |
| JPH05112594A (ja) * | 1991-10-21 | 1993-05-07 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とその製造方法並びに用途 |
-
2001
- 2001-06-08 JP JP2001173894A patent/JP4697697B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03135992A (ja) * | 1989-10-21 | 1991-06-10 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 結晶２―Ｏ―α―Ｄ―グルコピラノシル―Ｌ―アスコルビン酸とその製造方法並びに用途 |
| JPH03183492A (ja) * | 1989-10-21 | 1991-08-09 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ２―Ｏ―α―Ｄ―グルコピラノシル―Ｌ―アスコルビン酸高含有物の製造方法 |
| JPH05112594A (ja) * | 1991-10-21 | 1993-05-07 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ５−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸とその製造方法並びに用途 |
Cited By (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006022174A1 (ja) * | 2004-08-24 | 2006-03-02 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | アスコルビン酸２－グルコシドを有効成分とする褐変抑制剤とこれを利用する褐変抑制方法 |
| JPWO2006022174A1 (ja) * | 2004-08-24 | 2008-05-08 | 株式会社林原生物化学研究所 | アスコルビン酸２−グルコシドを有効成分とする褐変抑制剤とこれを利用する褐変抑制方法 |
| JP2018052978A (ja) * | 2009-09-03 | 2018-04-05 | 株式会社林原 | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末とその製造方法並びに用途 |
| EP3081573A1 (en) | 2009-09-03 | 2016-10-19 | Hayashibara Co., Ltd. | Particulate composition containing anhydrous crystalline 2-o-alpha -d-glucosyl-l-ascorbic acid, process for producing the same, and uses thereof |
| JP4792534B1 (ja) * | 2009-09-03 | 2011-10-12 | 株式会社林原生物化学研究所 | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末とその製造方法並びに用途 |
| JP4850302B1 (ja) * | 2009-09-03 | 2012-01-11 | 株式会社林原生物化学研究所 | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末とその製造方法並びに用途 |
| US10603333B2 (en) | 2009-09-03 | 2020-03-31 | Hayashibara Co., Ltd. | Process for producing a particulate composition comprising an hydrous crystalline 2-o-alpha-d-glucosyl-ascorbic acid |
| JP2012067013A (ja) * | 2009-09-03 | 2012-04-05 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末とその製造方法並びに用途 |
| JP2015061871A (ja) * | 2009-09-03 | 2015-04-02 | 株式会社林原 | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末とその製造方法並びに用途 |
| US9872872B2 (en) | 2009-09-03 | 2018-01-23 | Hayashibara Co., Ltd. | Process for producing a particulate composition comprising an hydrous crystalline 2-O-α-D-glucosyl-L-ascorbic acid |
| JP2017048246A (ja) * | 2009-09-03 | 2017-03-09 | 株式会社林原 | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末とその製造方法並びに用途 |
| EP2301944A1 (en) | 2009-09-03 | 2011-03-30 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Particulate composition containing anhydrous crystalline 2-O-alpha -D-glucosyl-L-ascorbic acid, process for producing the same, and uses thereof |
| JP2014015469A (ja) * | 2009-09-03 | 2014-01-30 | Hayashibara Co Ltd | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末とその製造方法並びに用途 |
| US9265781B2 (en) | 2009-09-03 | 2016-02-23 | Hayashibara Co., Ltd. | Process for producing a particulate composition comprising anhydrous crystalline 2-O-alpha-D-glucosyl-L-ascorbic acid |
| JP2014058565A (ja) * | 2009-09-03 | 2014-04-03 | Hayashibara Co Ltd | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末とその製造方法並びに用途 |
| EP2743276A1 (en) | 2009-09-03 | 2014-06-18 | Hayashibara Co., Ltd. | Particulate composition containing anhydrous crystalline 2-O-alpha -D-glucosyl-L-ascorbic acid, process for producing the same, and uses thereof |
| US8765416B2 (en) | 2009-09-03 | 2014-07-01 | Hayashibara Co., Ltd. | Particulate composition containing anhydrous crystalline 2-O-alpha-D-glucosyl-L-ascorbic acid, process for producing the same, and uses thereof |
| WO2011027790A1 (ja) * | 2009-09-03 | 2011-03-10 | 株式会社林原生物化学研究所 | ２－Ｏ－α－Ｄ－グルコシル－Ｌ－アスコルビン酸無水結晶含有粉末とその製造方法並びに用途 |
| US9186368B2 (en) | 2009-09-03 | 2015-11-17 | Hayashibara Co., Ltd. | Process for producing a particulate composition comprising an hydrous crystalline 2-O-α-D-glucosyl-L-ascorbic acid |
| JP5856963B2 (ja) * | 2010-09-07 | 2016-02-10 | 株式会社林原 | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸含水結晶及び２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸含水結晶含有粉末とそれらの製造方法並びに用途 |
| JPWO2012033218A1 (ja) * | 2010-09-07 | 2014-01-20 | 株式会社林原 | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸含水結晶及び２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸含水結晶含有粉末とそれらの製造方法並びに用途 |
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| US9206215B2 (en) | 2010-09-07 | 2015-12-08 | Hayashibara Co., Ltd. | Hydrous crystalline 2-O-α-D-glucosyl-L-ascorbic acid, particulate composition comprising the same, their preparation and uses |
| KR20140039177A (ko) | 2011-03-07 | 2014-04-01 | 가부시기가이샤하야시바라 | 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법 |
| JP2014139236A (ja) * | 2011-03-07 | 2014-07-31 | Hayashibara Co Ltd | ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸無水結晶含有粉末の製造方法 |
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| WO2014104171A1 (ja) * | 2012-12-27 | 2014-07-03 | 株式会社林原 | アンチエイジング用皮膚外用組成物及びその製造方法 |
| WO2014103475A1 (ja) * | 2012-12-27 | 2014-07-03 | 株式会社林原 | アンチエイジング用皮膚外用組成物及びその製造方法 |
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| CN104918603A (zh) * | 2012-12-27 | 2015-09-16 | 株式会社林原 | 抗老化用的皮肤外用组合物及其制造方法 |
| WO2018021542A1 (ja) * | 2016-07-29 | 2018-02-01 | カーリットホールディングス株式会社 | ２－Ｏ－α－Ｄ－グリコシル－Ｌ－アスコルビン酸金属塩、その酸化防止剤としての用途及びその粉末の製造方法 |
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