BR112012004864B1

BR112012004864B1 - Processo para produção de uma composição particulada

Info

Publication number: BR112012004864B1
Application number: BR112012004864-3A
Authority: BR
Inventors: Takashi Shibuya; Seisuke Izawa; Tomoyuki Nishimoto; Shigeharu Fukuda; Toshio Miyake
Original assignee: Hayashibara Co., Ltd.
Priority date: 2009-09-03
Filing date: 2010-09-01
Publication date: 2019-06-25
Also published as: ZA201202387B; JP6074405B2; RU2532671C2; EP3081573A1; JP5670547B2; US20110091726A1; WO2011027790A1; JP2018052978A; MY163019A; EP3081573B1; KR101571079B1; JP5667676B2; AU2010214807A1; EP2743276B1; KR20170108915A; AU2010214807B2; CA2714377A1; EP2743276A1; BR112012004864A2; JP4792534B1

Abstract

processo para produção de uma composição particulada proporciona-se um pó contendo cristais anidros de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, sendo que referido pó é significativamente menos propenso a aglomeração do que pós da classe quase-drogas de uso geral existentes contendo cristais anidros de ácido ascórbico de 2-glicosídeo. proporciona-se também um método para fabricar o pó previamente indicado, e um uso do mesmo. o pó contendo cristais anidrosde ácido ascórbico de 2-glicosídeo proporcionado contém, em termos de teor de anidrido, mais do que 98 % e menos do que 99,9 % de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, em massa. adicionalmente, ou a cristalinidade dos cristais anidros do ácido ascórbico de 2-glicosídeo é de pelo menos 90 %, como calculado com base em um perfil de difração de raios-x, ou após a umidade livre ter sido removida do pó poprocionado em um fluxo de nitrogênio, a quantidade dinâmica de umidade absorvida por referido pó após 12 horas a uma temperatura de 25ºc e uma umidade relativa de 35 % não é maior do que 0,01 % em massa.

Description

"PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO PARTICULADA" Fundamentos da Invenção Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a uma composição particulada contendo ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino, processo para produzir a mesma, e usos da mesma, mais particularmente, a uma composição particulada dificilmente solidificável contendo ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino, processo para produzir a mesma, e usos da mesma como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, e farmacêuticos.

Descrição do estado da técnica [002] Devido a suas atividades fisiológicas vantajosas e à ação an- tioxidante vantajosa, o ácido L-ascórbico tem sido usado para vários fins, incluindo aqueles para produtos alimentícios e cosméticos. No entanto, o ácido L-ascórbico é instável devido a sua redutibilidade direta, e por ser suscetível a receber degradação oxidativa e perder sua atividade fisiológica como o defeito crucial. Para superar o defeito, o presente requerente, como um dos co-aplicantes da Literatura de Patentes 1, revelou o ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico que é constituído de uma molécula de D-glicose ligada ao grupo hidroxila na posição C-2 do ácido L-ascórbico (a seguir abreviado como “ácido ascórbico de 2-glico-sídeo”, em toda a descrição). Como características marcantes o ácido ascórbico de 2-glicosídeo não apresenta redutibilidade direta, mas tem estabilidade satisfatória, e exerce as atividades fisiológicas inerentes ao ácido L-ascórbico após ser decomposto em corpos vivos a ácido L-as-córbico e D-glicose por uma enzima in vivo existente inerentemente nos corpos vivos. De acordo com o processo divulgado na Literatura de Patentes 1, ácido ascórbico de 2-glicosídeo é formado ao ser permitir que uma enzima transferidora de sacarídeos, como ciclo- maltodextri na glucanotransferase (abreviado a seguir como “CGTase”) ou α-glucosidase atue sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e composto de sacarídeo de a-glucosila.

[003] Na Literatura de Patentes 2, o presente requerente obteve êxito em cristalizar ácido ascórbico de 2-glicosídeo de uma solução saturada de ácido ascórbico de 2-glicosídeo e revelou ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino e uma composição particulada contendo o mesmo. Até aqui, ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino tem sido conhecido por existir meramente em uma forma cristalina anidra. Literaturas Não-Patentes 1 e 2 reportaram dados relativos à análise de estrutura por raios-X para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino.

[004] Nas Literaturas de Patentes 3 e 4, o mesmo requerente da presente invenção revelou um processo para coletar uma fração com alto teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, compreendendo submeter uma solução contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo formada por uma reação enzimática a cromatografia em coluna usando uma resina de troca catiônica de ácido forte, e coletar a fração. Na Literatura de Patentes 5, o mesmo requerente revelou um processo para produzir um produto com alto teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, compreendendo submeter uma solução contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo formada por meio de uma reação enzimática a electrodiálise usando uma membrana de troca aniônica para remover impurezas, como ácido L-ascórbico e sacarídeos, da solução; e na Literatura de Patentes 6, o mesmo requerente revelou um processo para produzir um produto com alto teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, compreendendo submeter uma solução contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo a uma resina de troca aniônica e dessorver seletivamente os ingredientes adsorvidos na resina para se obter uma fração rica em ácido ascórbico de 2-glicosídeo.

[005] Na Literatura de Patentes 7, o mesmo requerente da pre- sente invenção revelou um processo para produzir ácido ascórbico de 2-glicosídeo, compreendendo deixando que enzima formadora de glicossacarídeo de α-isomaltosila ou enzima formadora de glicossacarídeo de α-isomaltosila em combinação com CGTase atue sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e composto de sacarídeo de a-glicosila para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo. Literaturas de Patentes 8 e 9 requeridas pelo mesmo requerente da presente invenção revelam que a enzima formadora de glicossacarídeo de a-isomaltosila e enzima transferidora de α-isomaltosila catalisam sacarídeo transferindo a ácido L-ascórbico para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo.

[006] Referindo aos usos de ácido ascórbico de 2-glicosídeo foram realizadas várias propostas como mostrado, por exemplo, nas Literaturas de Patentes de 10 a 29. Dependendo de suas características vantajosas, o ácido ascórbico de 2-glicosídeo tem sido usado convencionalmente como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, ou farmacêuticos; e foi usado extensivamente em outros usos em que o ácido L-ascórbico não pôde ser usado devido a sua instabilidade, sem mencionar usos convencionais do ácido L-ascórbico.

[007] Como descrito acima, o ácido ascórbico de 2-glicosídeo é conhecido agora como sendo produzido usando-se ácido L-ascórbico e substâncias amiláceas como materiais e várias enzimas transferido-ras de sacarídeos. De acordo com as verificações já obtidas pelo presente requerente até aqui, o método de permitir que CGTase, como uma enzima transferidora de sacarídeos, atue sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea é um método industrialmente vantajoso devido a seu alto rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo. Com base nesta verificação, o presente requerente tem produzido composições particuladas contendo ácido as- córbico de 2-glicosídeo cristalino anidro por meio do método de permitir que CGTase atue sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea, e comercializar as composições particuladas como materiais para cosméticos/quase-drogas e para produtos alimentícios, que são comercializados respectivamente como “AA2G” e “AS-COFRESH”, nomes de produtos de referidas composições particuladas e comercializados por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, e Hayashibara Shoji Inc., Okayama, Japão, respectivamente (estas composições particuladas convencionais contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro que foram comercializadas como materiais para cosméticos/quase-drogas e para produtos alimentícios são abreviadas a seguir como “pós de classe quase-droga”.) [008] Embora pós de classe quase-droga apresentem, como um padrão de qualidade, uma pureza relativamente elevada, tão alta quanto 98,0 % em peso ou maior em termos da pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo e conservem uma capacidade de fluxo livre satisfatória como um pó (em toda a descrição, “pó(s)” significa “composição particulada ou composições particuladas”, exceto se especificado de outra forma”) imediatamente após a produção, elas têm o defeito de que podem solidificar-se devido a sua carga morta ou absorbância de umidade, quando deixadas descansar sob uma temperatura relativamente alta e condições úmidas durante um período de tempo relativamente longo. Considerando este efeito, pós de classe quase-droga convencionais têm sido comercializados embalados em bolsas de po-lietileno com frações de 10 kg dos mesmos e colocados, juntamente com dessecantes, em latas de aço com coberturas. Mesmo com a forma de referida forma de produto, pós de classe quase-droga, contudo, ainda têm o problema de que podem solidificar-se ocasionalmente e perder sua utilidade como pós, quando armazenados durante um período de tempo relativamente longo. A solidificação de composições particuladas, que contêm ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro a ser usado como um material para cosméticos, quase-drogas, ou produtos alimentícios, usualmente podem causar evento problemático nas etapas de, por exemplo, transportar, peneirar, ou misturar materiais, quando uma planta de produção é projetada com a premissa de se usar materiais com capacidade satisfatória de fluxo livre. Literatura do estado da técnica i)Literatura de Patentes [Literatura de Patentes 1] Patente Japonesa Kokai n° 139288/91 [Literatura de Patentes 2] Patente Japonesa Kokai n° 135992/91 [Literatura de Patentes 3] Patente Japonesa Kokai n° 183492/91 [Literatura de Patentes 4] Patente Japonesa Kokai n° 117290/93 [Literatura de Patentes 5] Patente Japonesa Kokai n° 208991/93 [Literatura de Patentes 6] Patente Japonesa Kokai n° 2002- 088095 [Literatura de Patentes 7] Patente Japonesa Kokai n° 2004- 065098 [Literatura de Patentes 8] Publicação de Patente Internacional n° WO 02010361 [Literatura de Patentes 9] Publicação de Patente Internacional n° WO 01090338 [Literatura de Patentes 10] Publicação de Patente Internacional n° WO 05087182 [Literatura de Patentes 11] Patente Japonesa Kokai n° 046112/92 [Literatura de Patentes 12] Patente Japonesa Kokai n° 182412/92 [Literatura de Patentes 13] Patente Japonesa Kokai n° 182413/92 [Literatura de Patentes 14] Patente Japonesa Kokai n° 182419/92 [Literatura de Patentes 15] Patente Japonesa Kokai n° 182415/92 [Literatura de Patentes 16] Patente Japonesa Kokai n° 182414/92 [Literatura de Patentes 17] Patente Japonesa Kokai n° 333260/96 [Literatura de Patentes 18] Patente Japonesa Kokai n° 2005- 239653 [Literatura de Patentes 19] Publicação de Patente Internacional n° WO 06033412 [Literatura de Patentes 20] Patente Japonesa Kokai n° 2002-326924 [Literatura de Patentes 21] Patente Japonesa Kokai n° 2003- 171290 [Literatura de Patentes 22] Patente Japonesa Kokai n° 2004- 217597 [Literatura de Patentes 23] Publicação de Patente Internacional n° WO 05034938 [Literatura de Patentes 24] Patente Japonesa Kokai n° 2006-225327 [Literatura de Patentes 25] Publicação de Patente Internacional n° WO 06137129 [Literatura de Patentes 26] Publicação de Patente Internacional n° WO 06022174 [Literatura de Patentes 27] Patente Japonesa Kokai n° 2007-063177 [Literatura de Patentes 28] Publicação de Patente Internacional n° WO 06132310 [Literatura de Patentes 29] Publicação de Patente Internacional n° WO 07086327 ii) Literatura Não-Patentes [Literatura Não-Patentes 1] Carbohydrate Research, Takahiko MANDAI et ai, vol. 232, pp. 197-205, 1992 [Literatura Não-Patentes 2] International Journal of Pharmaceutics, Yutaka INOUE et ai., vol. 331, pp. 38-45, 2007 Sumário da Invenção [009] A presente invenção, que foi realizada para resolver o defeito acima, objetiva proporcionar uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro que é dificilmente solidificável, de forma mais significante, do que composições particuladas convencionais contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro em uma classe para uso em quase-drogas; e proporcionar um processo para produzir a mesma e usos da mesma.

[0010] Para superar os objetos acima, os presentes inventores continuaram estudando a solidificação de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e verificaram que o “ASCORBIC ACID 2-GLICOSÍDEO 999”, um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro para uso como um reagente padrão para análise, código n° AG124, comercializado por Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japão (abreviado a seguir como “pó de classe reagente”), não solidifica mesmo nas condições em que um pó de classe quase-droga solidifica, e conserva propriedades como um pó. Como um pó de classe quase-droga, o pó de classe reagente acima é aquele produzido purificando-se uma solução contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo obtida por meio de uma etapa de permitir que CGTase atue sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea, concentrando a solução purificada, e cristalizando ácido ascórbico de 2-glicosídeo para se obter ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. O pó de classe reagente acima, contudo, difere do pó de classe quase-droga pelo fato de que, adicionalmente às etapas de produção ordinárias, requer uma etapa de recristalização que envolve dissolver cristais uma vez obtidos e, então, cristalizar novamente os mesmos, e uma etapa de lavagem que envolve lavar repetidamente os cristais recristalizados com água refinada, etc., para au- mentar a pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo a um nível de 99,9 % em peso ou maior. Assim, mesmo o pó de classe quase-droga, pode ser preparado em uma composição particulada dificilmente solidificável contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro quando a pureza pode ser incrementada a 99,9 % em peso ou maior.

[0011] Para aumentar a pureza do ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro a um nível de pureza maior, tão alto quanto de pelo menos 99,9 % em peso, contudo, como mencionado acima, serão necessárias etapas opcionais de uma etapa de recristalização e uma etapa de lavagem com água refinada ou análogos, adicionalmente às etapas de produção ordinárias, resultando desfavoravelmente no aumento do tempo e de trabalho requerido para sua produção, causando perda de ácido ascórbico de 2-glicosídeo nas etapas de recristalização e lavagem, diminuindo o rendimento de produção, e aumentando o custo de produção por uma grande margem. Portanto, não é uma seleção realista aumentar simplesmente a pureza do ácido ascórbico de 2-glicosídeo a um nível de 99,9 % em peso ou maior para se obter uma composição particulada dificilmente solidificável contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro do que o pó de classe quase-droga.

[0012] Os presentes inventores continuaram estudando a solidificação de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e pesquisaram repetidamente, na base de tentativa e erro, e verificaram, em comparação com pós de classe quase-droga convencionais, uma composição particulada dificilmente solidificável significativa contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro que apresenta, ou um grau incrementado de cristalinidade, de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, ou um nível diminuído de sorção dinâmica de vapor da composição particulada, de 0,01 % em peso ou menor, embora a composição particulada tenha o mesmo nível de pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo como aquela de pós de classe quase-droga convencionais ou tenha uma pureza menor do que aquela em um pó de classe reagente.

[0013] Os presentes inventores continuaram estudando um processo para produzir uma composição particulada, contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro com o grau de cristalinidade identificado acima e apresentando o acima indicado nível de sorção dinâmica de vapor, numa escala industrial, verificando que uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro preparada por meio das etapas a seguir pode ser preparada de maneira relativamente fácil a partir de um pó, contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro cristalizado da solução a seguir, em uma composição particulada com um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e um nível de sorção dinâmica de vapor da composição particulada de 0,01 % em peso ou menor: Permitir que CGTase e glucoamilase, nesta ordem, atuem sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um alto rendimento de produção, de 35 % em peso ou maior, purificar a solução resultante para aumentar o teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo até acima de 86 % em peso, numa base de sólidos secos (b.s.s. [base de sólidos secos]).

[0014] Os presente inventores verificaram que uma composição particulada, apresentando um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro ou apresentando um nível sorção dinâmica de vapor de 0,01 % em peso ou menor, é significantemente de difícil solidificação em comparação com pós de classe quase-droga convencionais; é de fácil manuseio como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, e farma- cêuticos; e possui um valor e significância notáveis. Assim, eles completaram esta invenção.

Breve Descrição dos Desenhos Anexos [0015] A FIG. 1 é um exemplo de padrão de difração de raios-X em pó com um raio-X característico para uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que consiste substancial mente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro.

[0016] A FIG. 2 é um exemplo de padrão de difração de raios-X em pó com um raio-X característico para uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo, que consiste substancialmente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo amorfo.

[0017] A FIG. 3 é um exemplo de padrão de difração de raios-X em pó com uma radiação de sincrotron para uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que consiste substancial mente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro.

[0018] A FIG. 4 é um exemplo de padrão de difração de raios-X em pó com uma radiação de sincrotron para uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo, que consiste substancialmente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo amorfo.

[0019] A FIG. 5 é um diagrama esquemático de estrutura de ordem superior de CGTase derivada de um microrganismo do gênero Geobacillus.

[0020] A FIG. 6 é um diagrama esquemático de radicais catalíticos de regiões conservadas de CGTase derivada de um microrganismo do gênero Geobacillus.

[0021] A FIG. 7 é uma figura da estrutura e do sítio de reconhecimento de enzima de restrição de um DNA recombinante “pRSET-ÍBTC12”, contendo gene CGTase derivado de um microrganismo do gênero Geobacillus, usado na presente invenção.

Explicação dos símbolos [0022] Nas FIGs. 5 e 6, os símbolos de “A” a “D” significam Domínio A de CGTase, Domínio B de CGTase, Domínio C de CGTase, e Domínio D de CGTase, respectivamente.

[0023] Na FIG. 5, “hélice” significa uma estrutura em hélice a; “seta semelhante a placa”, estrutura de folha β; e “rosca fina”, estrutura de alça.

[0024] Na FIG. 6, os símbolos de [1] a [4] significam regiões conservadas de 1 a 4, comumente presentes na família de α-amilase, respectivamente; o símbolo “·”, um radical catalítico; “D225”, 225° radical de ácido aspártico como um dos radicais catalíticos de CGTase; “D253”, 253° radical de ácido glutâmico como um dos radicais catalíticos de CGTase; e “D324”, 324° radical de ácido aspártico como um dos radicais catalíticos de CGTase.

[0025] Na FIG. 7, o símbolo “pUC ori” significa origem de replica-ção de plasmídio pUC; “T7”, promotor T7; “seta branca (Amp)”, gene de resistência à ampicilina; e “seta preta”, gene CGTase.

Descrição Detalhada da Invenção [0026] A presente invenção resolve os objetos acima ao proporcionar uma composição particulada que contém ácido ascórbico de 2-glicosídeo em uma quantidade acima de 98,0 % em peso, porém inferior a 99,9 % em peso, b.s.s., e apresenta um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, quando calculado com base em um perfil de análise de difração de raios-X em pó da composição particulada.

[0027] A presente invenção resolve os objetos acima ao proporcionar uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo em uma quantidade acima de 98,0 % em peso, porém inferior a 99,9 % em peso, b.s.s., e um nível de sorção dinâmica de vapor da composição particulada de 0,01 % em peso ou menor, quando mantido a 25°C sob uma umidade relativa de 35 % durante 12 horas após a remoção de água sob corrente de gás nitrogênio.

[0028] Como uma concretização preferida de acordo com a presente invenção, a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção contém partículas com um tamanho de partículas inferior a 150 pm em uma quantidade de 70 % em peso ou mais com relação ao todo da composição particulada e aquelas com um tamanho de partícula de pelo menos 53 pm porém menor do que 150 pm em uma quantidade de 40 a 60 % em peso com relação à composição particulada como um todo. Como outra concretização preferida, a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção contém ácido L-ascórbico e/ou D-glicose e apresenta um potência de redução da composição particulada total menor do que um porcento em peso. Em uma concretização mais preferida, a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção contém ácido L-ascórbico em uma quantidade de 0,1 % em peso ou menor, b.s.s.

[0029] A composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção como mencionado acima é tipicamente uma composição particulada produzida de uma solução contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo obtida por meio de uma etap de permitir que CGTase atue sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea.

[0030] A presente invenção resolve os objetos acima ao proporcionar um processo para produzir uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, caracterizado por conter as etapas de permitir que CGTase e glucoamilase, nesta ordem, atuem sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e subs- tância amilácea para se obter uma solução contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um rendimento de produção de 35 % em peso ou maior de ácido ascórbico de 2-glicosídeo; purificar a solução resultante para aumentar o teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo a um nível acima de 86 % em peso, b.s.s.; cristalizar ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro na solução purificada; coletar o ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro cristalizado; e envelhecer e secar os cristais coletados; e opcionalmente pulverizar os cristais resultantes.

[0031] Exemplos da CGTase usada no processo da presente invenção incluem quaisquer das enzimas CGTase naturais e aquelas que são preparadas por meio de tecnologia de DNA recombinante independentemente de suas origens e fontes, desde que formem ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um rendimento de produção de 35 % em peso ou maior, quando CGTase e glucoamilase, nesta ordem, são deixadas atuar sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea. No entanto, considerando o rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, prefere-se as CGTases mais adiante descritas derivadas da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-62 e da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-27, e CGTases mutantes obtidas mutando-se a CGTase derivada da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91 por meio de tecnologia de DNA recombinante. Entre estas, a CGTase da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-62 é usada com maior preferência devido a seu rendimento de produção relativamente elevado de ácido ascórbico de 2-glicosídeo.

[0032] A glucoamilase usada na presente invenção não deveria restringir-se necessariamente, e qualquer das enzimas naturalmente ocorrentes e recombinantes pode ser usada independentemente de suas origens e fontes, desde que formem ácido ascórbico de 2- glicosídeo com um rendimento de produção de 35 % em peso ou maior, quando CGTase e glucoamilase, nesta ordem, são deixadas atuarem sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea.

[0033] Variando dependendo do tipo de substância amilácea usada como um material, quando CGTase é deixada atuar sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea, o rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo pode ser incrementado deixando-se atuar sobre a solução uma enzima desramificadora de amido, como isoamilase e pululanase, juntamente com CGTase.

[0034] Em uma concretização preferida do processo de acordo com a presente invenção, a etapa para purificar a solução acima contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo para aumentar o teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo a mais de 86 % em peso, b.s.s., é efetuada deixando-se uma solução de reação enzimática, após filtração e des-salinização, contactar uma resina de troca aniônica para adsorver sobre si ácido ascórbico de 2-glicosídeo e ácido L-ascórbico, remover sacarídeos, como D-glicose com água refinada, introduzir, como um eluente, uma solução aquosa com concentração inferior a 0,5 N de ácido clorídrico ou sal/sais para eluir ácido ascórbico de 2-glicosídeo e ácido L-ascórbico, concentrar o eluado resultante, introduzir o eluado concentrado na cromatografia em coluna usando uma resina de troca catiônica ou uma resina sintética porosa, e introduzir um eluente para efetuar a eluição. Particularmente, como no caso da cromatografia em coluna com resina de troca catiônica, aquela de sistema de leito móvel simulado usa uma resina de troca catiônica de ácido forte como um material de empacotamento é preferível porque uma fração desejada com um teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo acima de 86 % em peso é obtida, de preferência, com um rendimento satisfatório de eficiência e produção.

[0035] A presente invenção resolve os objetos acima ao proporcionar um material poroso para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, e farmacêuticos, que consiste da composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção.

[0036] Exemplos dos materiais para produtos alimentícios usados vantajosamente na presente invenção incluem agentes enriquecedo-res de vitamina C, acentuadores da produção de colágeno, agentes branqueadores da pele, agentes acentuadores de sabor, agentes me-Ihoradores da qualidade, agentes de prevenção de acastanhamento, acidulantes, cargas, agentes conferidores de corpo, e antioxidantes. Exemplos dos materiais para cosméticos usados vantajosamente na presente invenção incluem agentes branqueadores da pele, agentes ativadores de células, acentuadores da produção de colágeno, agentes enriquecedores de vitamina C, agentes acentuadores de sabor, agentes melhoradores da qualidade, agentes de prevenção de acastanhamento, acidulantes, cargas, agentes conferidores de corpo, estabilizadores, e antioxidantes. Exemplos dos materiais para quase-drogas usados vantajosamente na presente invenção incluem agentes branqueadores da pele, agentes ativadores de células, acentuadores da produção de colágeno, agentes enriquecedores de vitamina C, agentes acentuadores de sabor, agentes melhoradores da qualidade, agentes de prevenção de acastanhamento, acidulantes, cargas, agentes conferidores de corpo, estabilizadores, e antioxidantes. Adicionalmente, exemplos dos materiais para farmacêuticos usados vantajosamente na presente invenção incluem agentes branqueadores da pele, agentes ativadores de células, acentuadores da produção de colágeno, agentes para conservar órgãos, agentes inibidores de desordem de radicais, agentes enriquecedores de vitamina C, agentes de prevenção de acastanhamento, cargas, adjuvantes, estabilizadores, e antioxidan- tes.

[0037] A seguir encontram-se explicações detalhadas da presente invenção: 1. Definição de termos [0038] Em toda a descrição, os termos a seguir significam o seguinte: Grau de cristalinidade [0039] O termo “um grau de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro” como referido na descrição significa um valor definido pela Fórmula [1] a seguir. Fórmula UI: [0040] H100: Um valor analítico para um grau de cristalinidade, de- terminado com base no perfil de difração de raios-X em pó para uma amostra padrão pulverulenta contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, sendo que a amostra padrão pulverulenta consiste substancial mente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. [0041] Ho: Um valor analítico para um grau de cristalinidade, determinado com base no perfil de difração de raios-X em pó para uma amostra padrão pulverulenta contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo, sendo que a amostra padrão pulverulenta consiste substancialmente de forma amorfa de ácido ascórbico de 2-glicosídeo. [0042] Hs: Um valor analítico para um grau de cristalinidade, determinado com base no perfil de difração de raios-X em pó para, como uma amostra de teste, um pó contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo.

[0043] Na Fórmula [1], o perfil de difração de raios-X em pós para a base de determinar valores analíticos H100, Ho e Hs podem ser de- terminados usualmente por meio de um analisador de difração de rai-os-X em pó equipado com um sistema óptico refletivo ou transmissivo. O perfil de difração de raios-X em pós contém dados para ângulos de difração e intensidades de difração de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro contido em uma amostra de teste ou padrão. Exemplos de métodos para determinar os dados analíticos para os graus de cristalinidade de referidas amostras incluem o método de Harmans, método de Vonk, etc. Entre estes o método de Harmans é preferível devido a sua facilidade e precisão. Como estes métodos analíticos foram proporcionados agora como programas de computador, quaisquer analisadores de difração de raios-X em pó, equipados com um aparelho analítico instalado com qualquer um dos programas de computador acima, podem ser usados vantajosamente.

[0044] Como “uma amostra padrão pulverulenta contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, sendo que a amostra padrão pulverulenta consiste substancialmente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro”, para determinar o valor analítico H100, é preciso usar um ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro em forma de uma composição particulada ou cristal simples, que tem uma pureza de 99,9 % em peso ou maior (em toda a descrição, “% em peso” é abreviado como “%”, exceto se especificado de outra forma, porém o “%” afixado ao grau de cristalinidade não deveria ser limitado ao mesmo), apresenta picos de difração característicos inerentes a ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e consiste substancialmente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. Exemplos daqueles em forma de uma composição particulada ou cristal simples incluem aqueles em forma de uma composição particulada de qualquer um dos pós de classe reagente identificados acima, composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro obtido por meio de recristalização do pó de classe reagente, ou ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro em forma de um cristal simples. Para referência, quando analisado com um programa de computador para o método de Harmans, um perfil de difração de raios-X em pó da acima identificada amostra padrão pulverulenta da composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que consiste substancial mente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, dá um valor analítico H100, usualmente, compreendendo de cerca de 70,2 % a cerca de 70,5 %.

[0045] Como “uma amostra padrão pulverulenta contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo, sendo que a amostra padrão pulverulenta consiste substancial mente de forma amorfa de ácido ascórbico de 2-glicosídeo” para determinar o valor analítico Ho, é preciso usar um ácido ascórbico de 2-glicosídeo em forma de uma composição particulada, que tem uma pureza de 99,1 % ou maior, apresenta um padrão de difração de raios-X em pó de apenas halo inerente a sua forma amorfa, e não apresenta substancialmente qualquer pico de difração de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. Exemplos de uma composição particulada do tipo referido incluem aqueles que são obtidos dissolvendo-se a acima identificada amostra padrão pulverulenta para determinar o valor analítico Hwo em uma quantidade apropriada de água refinada, concentrar a solução, secar por congelamento o concentrado, e secar o resultante em vácuo até se obter um teor de umidade de 2,0 % ou menor, quando determinado com o método de Karl Fischer. Com estes tratamento[]s, sabe-se por experiência que uma composição particulada consistindo substancialmente de uma forma amorfa é obtida. Para referência, quando analisado com um programa de computador para o método de Harmans, um perfil de difração de raios-X em pó da acima identificada amostra padrão pulverulenta da composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo, que consiste substancialmente da forma amorfa de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, dá um valor analítico Ho, usualmente, compreendendo de cerca de 7,3 % a cerca de 7,6 %.

[0046] Como uma amostra padrão para determinar o valor analítico Ho é desnecessário dizer que um ácido ascórbico de 2-glicosídeo com uma pureza maior é preferível, contudo a pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo de uma amostra padrão usada para determinar o valor analítico Ho, preparada da amostra padrão usada para determinar o valor analítico H100 como mencionado acima, é limitada em até 99,1 %, embora a pureza da amostra padrão usada para determinar o valor analítico H100 seja distintamente tão alta quanto 99,9 % ou maior, como mostrado no Experimento 1-1 descrito mais adiante. Assim, a pureza de “uma amostra padrão pulverulenta contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo, sendo que a amostra padrão pulverulenta consiste substancial mente da forma amorfa de ácido ascórbico de 2-glicosídeo” é ajustada em 99,1 % ou maior como mencionado acima. Nível de sorção dinâmica de vapor [0047] O termo “nível de sorção dinâmica de vapor” como referido na descrição significa um valor calculado pela Fórmula [2] a seguir baseado em dois valores ponderais determinados em um analisador de sorção/dessorção de umidade de tal modo a remover água livre de uma amostra via deixando-se a mesma descansar a 25°C e uma umidade relativa de 0 % sob corrente de gás nitrogênio durante 12 horas, e pesando-se a amostra resultante; e via deixando-se a amostra descansar a 25°C e uma umidade relativa de 35 % sob corrente de gás nitrogênio durante 12 horas, e imediatamente pesando-se novamente a amostra: Fórmula Í2]: [0048] Wo%: Peso de uma amostra de teste medido imediatamente após descansar a 25°C e uma umidade relativa de 0 % sob corrente de gás nitrogênio durante 12 horas.

[0049] W35%: Peso de uma amostra de teste medido imediatamen- te após a amostra de teste, que fora medido para Wo %, ser deixada descansar a 25°C e uma umidade relativa de 35 % sob corrente de gás nitrogênio durante 12 horas.

Potência de redução [0050] O termo “Potência de redução da composição particular como um todo” como referido na descrição significa um percentual (%) do teor de sacarídeos redutores relativamente ao teor de açúcar total em uma amostra de teste, calculado pela Fórmula [3] a seguir, baseado o teor de açúcar redutor e no teor total de açúcar em termos de D-glicose determinado com o método de Somogyi-Nelson e o método da antrona-ácido sulfúrico largamente usado na arte, em que D-glicose é usada como uma substância padrão. Fórmula Í3]: Distribuição dos tamanhos de partículas [0051] Na descrição, a distribuição dos tamanhos de partículas de uma composição particulada é determinada como a seguir: Peneiras de metal com tamanhos de aberturas de 425, 300, 212, 150, 106, 75 e 53 pm, produzidas pela Kabushiki Gaisha lida Seisaku-sho, que são de acordo com Padrões Industriais Japoneses (JIS Z 8801-1), são pesadas precisamente, empacotadas na ordem identificada acima, e montadas sobre “R-1”, um agitador de peneiração ro-tap, produzido pela Kabushiki Gaisha Tanaka Kagaku Kikai Seisaku-sho. Uma quan- tidade prescrita de amostra pesada é colocada sobre a peneira mais ao alto (apresentando um tamanho de aberturas de 425 pm) entre as peneiras empilhadas, seguido de agitaçaõ das peneiras durante 15 min enquanto se conserva as condições empacotadas. Em seguida, cada uma das peneiras empacotadas foi pesada precisamente, e o peso da amostra coletada em cada uma das peneiras foi determinado subtraindo-se o peso de cada uma das peneiras antes do carregamento da amostra, do peso da peneira correspondente após a agitação. A distribuição dos tamanhos de partículas é expressa calculando-se o percentual (%) em peso da composição particulada coletada em cada uma das peneiras com relação àquele da amostra carregada. Rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo [0052] O termo “rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo” como referido na descrição significa um conteúdo (%) de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, b.s.s., em uma solução de reação enzimática obtida deixando-se que uma enzima, como CGTase, atue sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea. Teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, b.s.s.

[0053] O termo teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, b.s.s., significa um percentual (%) em peso de 2-glicosídeo de ácido ascórbico relativamente ao peso total de uma amostra contendo o mesmo quando calculado excluindo-se a água. Por exemplo, o significado do teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, b.s.s., em uma solução é um percentual (%) em peso de ácido ascórbico de 2-glicosídeo relativamente aos teores totais de sólidos, excluindo-se a água contida na solução. Embora o significado do teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, b.s.s., em uma composição particulada é um percentual (%) em peso do peso de ácido ascórbico de 2-glicosídeo relativamente ao peso total da composição particulada, quando calculado considerando-se o peso total da composição particulada como aquele que exclui água contida na composição particulada.

Atividade de CGTase [0054] O termo “CGTase atividade” como referido na descrição é definido como a seguir: A cinco mililitros de uma solução de substrato aquoso contendo 0,3 % (peso/volume) de um amido solúvel, 20 mM de tamponador de acetato (pH 5,5), e 1 mM de cloreto de cálcio, adiciona-se 0,2 ml de uma solução de enzima diluída apropriadamente, e a solução resultante é mantida a 40°C, e verificada por coleta de amostra a 0 min e 10 min após o início da reação enzimática em quantidades respectivas de 0,5 ml, seguido de adição imediata de 15 ml de solução de ácido sulfúrico 0,02 N a cada amostra para suspender a reação enzimática. Cada uma das soluções resultantes é misturada com 0,2 ml de solução de iodo 0,2 N para desenvolver cores, e, após 10 min, as soluções coloridas são medidas respectivamente quanto à absorbân-cia em um comprimento de onda de 660 nm com um espectrofotôme-tro, seguido do cálculo da atividade de CGTase usando a Fórmula [4] a seguir como uma atividade para hidrólise de amido. Uma unidade de atividade de CGTase é definida como a quantidade de enzima que diminui completamente a cor de iodo de uma solução contendo 15 mg de amido. Fórmula [41: [0055] Nota: “Aa” significa a absorbância a um comprimento de onda de 660 nm de uma solução de reação a 0 min após iniciar a reação enzimática.

[0056] “Ab” significa a absorbância a um comprimento de onda de 660 nm de uma solução de reação a 10 min após iniciar a reação enzimática.

Atividade de isoamilase [0057] O termo “atividade de isoamilase” como referido na descrição é definido como a seguir: [0058] A três mililitros de uma solução de substrato aquoso contendo 0,83 % (peso/volume) de amido de milho ceroso solúvel Lintner e 0,1 M de tamponador de acetato (pH 3,5) adiciona-se 0,5 ml de uma solução de enzima apropriadamente diluída, e a solução resultante é mantida a 40°C e verificada por coleta de amostra a 0,5 min e 30,5 min após a iniciação da reação enzimática em quantidades respectivas de 0,5 ml, seguido imediatamente de adição de 15 ml de solução de ácido sulfúrico 0,02 N a cada amostra para suspender a reação enzimática. Cada uma das soluções resultantes é misturada com 0,5 ml de solução de iodo 0,01 N para desenvolver cores a 25°C durante 15 min, e então as soluções colorias são medidas respectivamente quanto à ab-sorbância a um comprimento de onda de 610 nm com um medidor de absorção, seguido do cálculo da atividade de isoamilase usando-se a Fórmula [5] a seguir como uma atividade para hidrólise do amido. Uma unidade de atividade de isoamilase é definida como uma quantidade de enzima que aumenta a absorbância em 0,004 a um comprimento de onda de 610 nm nas condições de medição acima. Fórmula Í51: [0059] Nota: “Aa” significa a absorbância de uma solução de reações a um comprimento de onda de 610 nm.

[0060] “Ab” significa a absorbância de uma solução de controle a um comprimento de onda de 610 nm.

[0061] 2. Composição particulada contendo ácido ascórbico de 2- glicosídeo cristalino anidro da presente invenção [0062] Grau de cristalinidade e nível de sorção dinâmica de vapor [0063] Como descrito acima, a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção contém mais do que 98,0 % porém menos do que 99,9 %, b.s.s., de ácido ascórbico de 2-glicosídeo; e apresenta um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, quando calculado com base em um perfil de análise de difração de raios-X em pó; ou apresenta um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor. Como explicado pelos Experimentos a seguir, a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção, apresentando o grau de cristalinidade acima ou o nível de sorção dinâmica de vapor, é significantemente de difícil solidificação em comparação com pós de classe quase-droga, embora apresente substancialmente o mesmo nível de pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo que aqueles de pós de classe quase-droga ou apresente uma menor pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo do que a de um pó de classe reagente.

[0064] Adicional mente, como mostrado nos Experimentos a seguir, entre as composições particuladas contendo mais de 98,0 % porém menos de 99,9 %, b.s.s., de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, aquelas com um grau de cristalinidade dentro da faixa acima apresentam um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor, enquanto que aquelas com um nível de sorção dinâmica de vapor dentro da faixa acima apresentam um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. Assim, a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção pode ser definida, ou pelo grau de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro ou pelo nível de sorção dinâmica de vapor da composição particulada, e, se necessário, ela pode ser definido por ambos.

[0065] O significado de sorção dinâmica de vapor é um fenômeno em que o nível de vapor contido em uma amostra altera-se à medida que a umidade em torno da amostra é alterada a uma temperatura constante. No entanto, diferentemente do grau de cristalinidade, o nível de sorção dinâmica de vapor como um índice representativo para suscetibilidade da sorção de vapor não é um índice que depende diretamente da estrutura cristalina de um pó como uma mostra, pode-se especular que o fenômeno de absorção de umidade se refere à solidificação da composição particulada e pode alterar-se significativamente, dependendo da composição do sacarídeo, e também da pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo e do tamanho de partículas da composição particulada. Assim, considera-se que o nível de sorção dinâmica de vapor poderia ser um índice potente para se avaliar a solidificação de composição particulada por absorção de umidade.

[0066] Como verificado nos Experimentos a seguir, uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro com um nível de sorção dinâmica de vapor acima de 0,05 % so-lidifica-se de maneira relativamente fácil nas condições Experimentais testadas, enquanto que aquelas com um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor não se solidificam substancialmente nas mesmas condições. O fato indica que o nível de sorção dinâmica de vapor, juntamente com o grau de cristalinidade, são índices potentes para realizar substancial mente uma composição particulada dificilmente solidificável contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro.

[0067] A amostra padrão usada para determinar o valor analítico Ho na obtenção do grau de cristalinidade, i.e., “uma amostra padrão pulverulenta contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo, que consiste substancial mente de forma amorfa de ácido ascórbico de 2-glicosídeo” apresentou um nível de sorção dinâmica de vapor de 1,7 % como mostrado no Experimento 3 descrito mais adiante; embora a amostra padrão usada para determinar o valor analítico H100 na obtenção do grau de cristalinidade, i.e., “uma amostra padrão pulverulenta contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que consiste substancialmente de forma cristalina anidra de ácido ascórbico de 2-glicosídeo” apresentou um nível de sorção dinâmica de vapor menor do que o limite de detecção e não apresenteou substancialmente qualquer sorção dinâmica de vapor, como mostrado semelhantemente no Experimento 3.

Distribuição dos tamanhos de partículas [0068] Em uma concretização preferida da composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção, ela contém partículas com um tamanho de partículas inferior a 150 pm em uma quantidade de 70 % ou mais da composição particulada como um todo, e contém aquelas com um tamanho de partícula de 53 pm ou mais porém menor do que 150 pm em uma quantidade de 40 a 60 % da composição particulada como um todo. Como a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção pode ser, por exemplo, facilmente controlada dentro da distribuição dos tamanhos de partículas identificada acima requerida em materiais para produtos alimentícios, ela tem o mérito de que pode ser usada como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, ou farmacêuticos de forma similar àqueles convencionais sem alterar quaisquer etapas de produção convencionais ou regulações de materiais.

Impurezas de reação e Potência de redução [0069] Em uma concretização preferida da composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção, ela contém ácido L-ascórbico e/ou D-glicose e apresenta um potência de redução da composição particulada como um todo sendo menor do que um porcento. Como é de conhecimento geral, ácido L-ascórbico e D-glicose apresentam redutibilidade direta e induzem coloração castanha quando aquecidos na coexistência de um composto apresentando intramolecularmente grupo amino, como aminoácidos e proteínas, e, portanto, de preferência, eles não deveríam estar presentes em uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro como um produto. No entanto, por exemplo, na produção de uma composição particulada, contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, obtida por meio de uma etapa de permitir que uma enzima, como CGTase, atue sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea, impurezas de reação, como ácido L-ascórbico intacto e D-glicose derivados do material de substância amilácea coexistirão inevitavelmente na composição particulada assim produzida em qualquer taxa. Por exemplo, em pós convencionais de classe quase-droga, as quantidades de ácido L-ascórbico e D-glicose ali contidas poderiam atingir cerca de um porcento, b.s.s., ao todo, e isto pode induzir reação impredizível de acastanhamento quando usadas como materiais para produtos alimentícios, etc.

[0070] Assim, na presente invenção, embora se permite incorporação inevitável de ácido L-ascórbico e/ou D-glicose, a Potência de redução da composição particulada como um todo da composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro é controlada em menos de um porcento. Como mostrado nos Experimentos descritos mais adiante, na produção da composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção por meio do processo de acordo com a presente invenção, a Potência de redução da composição particulada como um todo pode ser facilmente ajustada em menos de um porcento. Desde que a Potência de redução da composição particulada como um todo seja inferior a um porcento, composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que ainda contêm ácido L-ascórbico e/ou D-glicose, não induzem substancialmente coloração castanha mesmo quando aquecidas na presença de um composto com grupo amino intramolecularmente, como aminoácidos e proteínas. Assim, quaisquer composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que contêm ácido L-ascórbico e/ou D-glicose e apresentam uma Potência de redução de cada composição particulada como um todo que é menor do que um porcento, têm o mérito de que elas podem ser incorporadas em produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, e farmacêuticos em geral sem receio de causar coloração e alteração de cor. Em conexão a isto, quando a Potência de redução da composição particulada como um todo é menor do que um porcento, o teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose é de 0,2 % ou menor, b.s.s., com relação à composição particulada.

[0071] Em uma concretização mais preferida, a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção tem um teor de ácido L-ascórbico de 0,1 % ou menor, b.s.s. Como usado em produtos alimentícios ou análogos como um antioxidante ou aglutinador de oxigênio, o ácido L-ascórbico tem elevada reatividade com oxigênio. Em virtude disso, considera-se que o ácido L-ascórbico não só induz coloração castanha quando aquecido na presença de compostos apresentando grupos amino intramolecularmente, mas também refere-se distintamente à coloração de composições particuladas per se. Efetivamente, como mostrado no Experimento descrito mais adiante, de acordo com a verificação obtida pelos presentes inventores, pós de classe quase-droga que contêm cerca de 0,2 % de ácido L-ascórbico induzem ocasional mente um fenômeno que eles por si só passam a mostrar uma coloração castanha clara, quando armazenados na forma mencionada acima durante um período de tempo relativamente longo. Em contraste, no caso em que uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro tem um teor de ácido L-ascórbico de 0,1 % ou menor, ela é, por si só, livre de causar receio de [gerar] coloração castanha clara, mesmo quando armazenada na mesma forma de produto que os pós de classe quase-droga. Para referência, de acordo com o processo de produção da presente invenção, o teor de ácido L-ascórbico na composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção pode ser ajustado de maneira relativamente fácil em 0,1 % ou menos sem aumentar o custo de produção, por meio da etapa de purificação de, conduzir sucessivamente cromatografia em coluna usando resina de troca aniônica para remover sacarídeos, como D-glicose, etc., e então cromatografia em coluna usando resina de troca catiônica ou resina porosa, particularmente, aplicando-se cromatografia em coluna de leito móvel simultâneo usando resina de troca catiônica como a cromatografia em coluna usando resina de troca catiônica.

[0072] 3. Processo para produzir a composição particulada con- tendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção [0073] A composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção pode ser aquela preparada por meio de qualquer processo de produção e não deveria ser restrita a uma específica produzida por meio de um processo particular de produção, desde que seja uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que contém ácido ascórbico de 2-glicosídeo em uma quantidade acima de 98,0 % porém menor do que 99,9 %, b.s.s., e apresente, ou um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, ou um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor.

[0074] No entanto, de acordo com o processo da presente invenção a seguir, a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção é produzida de maneira relativamente fácil; o processo contém basicamente as seguintes etapas de (1) a (5): (1) Permitir que CGTase e glucoamilase, nesta ordem, atuem sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea para obter uma solução contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um rendimento de produção de 35 % ou maior; (2) purificar a solução resultante contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo para aumentar o teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo a mais de 86 %, b.s.s.; (3) submeter a solução purificada resultante com um teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo acima de 86 %, b.s.s., para cristalizar ácido ascórbico de 2-glicosídeo para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro; (4) coletar o ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro formado; e (5) envelhecer, secar, e opcional mente, pulverizar o ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro coletado.

[0075] As etapas acima são explicadas respectivamente abaixo: Etapa (1) [0076] A Etapa (1) é para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo a partir de ácido L-ascórbico e substância amilácea por meio de uma reação enzimática. Os materiais e enzimas usados e a reação enzimática usada são explicados sucessivamente. A. Materiais e enzimas usados Ácido L-ascórbico [0077] Exemplos do ácido L-ascórbico usado na presente invenção incluem qualquer um daqueles em forma de um hidróxi ácido ou um sal metálico do mesmo, como sais de metal alcalino e sais de metal alcalino-terrosos, e até mesmo misturas dos mesmos podem ser usadas sem dificuldade.

Substância amilácea [0078] Exemplos da substância amilácea usada na presente invenção incluem amido de batata, amido de batata doce, amido de tapioca, amido de milho, amido de trigo, etc. Entre esses, aqueles que não apresentam substancialmente qualquer estrutura ramificada intramolecularmente, mas que apresentam um grau uniforme de polime-rização de glicose, são preferíveis; ciclomaltodextrinas, cicloamiloses, amiloses sintetizadas, etc., são particularmente preferíveis porque todos eles apresentam um grau de polimerização de glicose de 6 a 100 e apresentam uma estrutura de cadeia reta ou uma estrutura cíclica de cadeia reta. Quando amidos liquefeitos em geral e hidrolisados de amido parciais são usados como a substância amilácea, eles têm, de preferência, seus graus de polimerização de glicose controlados via hidrolisação dos sítios ramificados de referidos amidos com o uso de CGTase em combinação com, por exemplo, uma enzima(s) desramifi-cadora de amido, como isoamilase (EC 3.2.1.68) e pululanase (EC 3.3.1.41). A isoamilase é particularmente preferível porque referidas enzimas desramificadoras de amido são facilmente manuseáveis dependendo de sua atividade enzimática, especificidade de substrato, etc. CGTase [0079] Exemplos da CGTase (EC 2.4.1.19) usada na presente invenção incluem qualquer uma daquelas com origens naturais ou aquelas que são obtidas por meio de tecnologia recombinante sem restrin-gir-se particularmente a suas origens e fontes, desde que formem ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um rendimento de produção tão alto quanto de cerca de 35 % ou maior, quando deixadas atuar sucessiva- mente com glucoamilase, nesta ordem, sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea. Exemplos de referidas enzimas de origens naturais incluem CGTases derivadas da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-62 e da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-27 são preferíveis devido a seu rendimento de produção relativamente elevado de ácido ascórbico de 2-glicosídeo; entre os quais, a CGTase anterior derivada da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-62 é a mais preferível em termos do rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo.

[0080] Exemplos de CGTase obtida por meio de tecnologia de DNA recombinante incluem, por exemplo, aquela apresentando uma sequência de aminoácidos, sendo que o 228° radical lisina na sequência de aminoácidos de CGTase produzida pela cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91, i.e., a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, foi substituída por radical ácido glutâmico. Para se obter referida CGTase mutante, como é de conhecimento geral, um gene que codifica a sequência de aminoácidos, sendo que o 228° radical lisina na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 foi substituído por radical ácido glutâmico, é introduzido em um hospedeiro apropriado, como E. coli, Bacillus subtilis, etc., para transformar o hospedeiro, seguido de expressão do gene no transformante.

[0081] As cepas de Geobacillus stearothermophilus Tc-27, Tc-62 e Tc-91 identificadas acima são os microrganismos revelados na Patente Japonesa Kokai n° 63189/75 (Publicação de Patente Japonesa n° 27791/78) requerida pelo mesmo requerente da presente invenção, e elas foram depositadas no National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-1-1, Chuo-6, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japão, sob os números de acesso FERM BP-11142, FERM BP-11143, e FERM P-2225 (sob procedimento de transferência para o Depósito Internacional sob o número de acesso FERM ABP-11273), quando confirmado no dia 14 de julho de 2009. Microrganismos que foram uma vez classificados em um grupo sob o nome daqueles das espécies de Bacillus stearothermophilus foram transferidos agora para um grupo sob o nome de microrganismos das espécies de “Geobacillus stearothermophilus”, contudo, o nome de microrganismos do gênero “Bacillus” ainda tem sido usado assim para denominar os microrganismos de um gênero independente. Nestas circunstâncias, para evitar confusão, os microrganismos das espécies “Bacillus stearothermophilus” e “Geobacillus stearothermophilus” são descritos como aqueles das espécies “Geobacillus stearothermophilus” em toda a descrição.

Glucoamilase [0082] Quaisquer glucoamilases (EC 3.2.1.3) podem ser usadas sem restrição específica independentemente de suas origens e fontes, e elas incluem aquelas em forma de uma enzima natural e aquelas obtidas por meio de tecnologia de DNA recombinante, desde que CGTase e glucoamilase, quando deixadas atuar, nesta ordem, sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea, formem ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um rendimento de produção tão alto quanto de 35 % ou maior.

[0083] Como a glucoamilase é usualmente adicionada a uma solução de reação enzimática após a solução ser aquecida para suspender a reação de transferência-de-sacarídeo por meio de CGTase, aquelas que podem exercer uma atividade enzimática desejada vantajosa para uso efetivo a uma temperatura relativamente elevada, por exemplo, de cerca de 40 a cerca de 60°C, de forma a economizar energia e tempo necessários para resfriar a reação enzimática após o aquecimento. No uso, quando a glucoamilase contém α-glucosidase, o ácido ascórbico de 2-glicosídeo resultante será assim hidrolisado, e usa-se desejável mente glucoamilase substancial mente livre de a- glucosidase. Quaisquer glucoamilases podem ser usadas independentemente de suas origens e fontes desde que preencham as exigências acima, por exemplo, comercializadas [como] uma preparação de glucoamilase derivada de um microrganismo do gênero Rhizopus, um nome de produto de “GLUCOZYME #20000”, uma enzima comercializada pela Nagase ChemteX, Corp., Osaka, Japão; e é possível usar outras derivadas de um microrganismo do gênero Aspergillus, um nome de produto de “GLUCZYME AF6” comercializado pela Amano Enzyme Inc., Aichi, Japão. B. Reação enzimática [0084] A seguir explica-se a reação de transferência de sacarídeo a ácido L-ascórbico. A CGTase é deixada atuar sobre uma solução, usualmente uma solução aquosa contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea. Quando a CGTase atua sobre uma solução aquosa do tipo referido, um ou mais radicais D-glicose são transferidos para o grupo hidroxila na posição C-2 do ácido L-ascórbico, resultando na formação de ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um radical D-glicose ligado ao grupo hidroxila na posição C-2 acima, e outros ácidos a-glicosil-L-ascórbicos, como ácido 2-O-a-maltosil-L-ascórbico, ácido 2-Ο-α-maltotriosil-L-ascórbico, e ácido 2-O-a-maltotetraosil-L-ascórbico, que apresentam pelo menos dois radicais D-glicose ligados ao grupo hidroxila na posição C-2 acima.

[0085] A CGTase é usualmente deixada atuar sobre uma solução aquosa, previamente preparada para dissolver ácido L-ascórbico e substância amilácea dando uma concentração de substrato de 1 a 40 %, em uma quantidade de 1 a 500 unidades/g de substância amilácea, seguido de uma reação enzimática a um pH de cerca de 3 a cerca de 10 e uma temperatura de 30 a 70°C durante pelo menos seis horas, de preferência, cerca de 12 a cerca de 96 horas. Como o ácido L-ascórbico é suscetível à oxidação, a solução deveria ser mantida, de preferência, em condições anaeróbicas ou redutoras durante a reação enzimática, ao mesmo tempo que protegendo-se a mesma da luz e, opcionalmente, coexistindo, por exemplo, [com] um agente redutor, como tiouréia ou sulfeto de hidrogênio.

[0086] A relação em peso, b.s.s., da substância amilácea e ácido L-ascórbico na solução deveria ser, de preferência, de 8:2 a 3:7. Quando a relação de substância amilácea excede a faixa acima [então] prossegue efetivamente a transferência de sacarídeo para ácido L-ascórbico; no entanto, o rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo é restrito pela concentração inicial de ácido L-ascórbico, resultando em um nível relativamente baixo. No entanto, enquanto a relação de ácido L-ascórbico excede a faixa acima, ácido L-ascórbico intacto permanecerá numa quantidade considerável e isto não é preferível em uma produção em escala industrial. Assim, a relação identificada acima é considerada a melhor.

[0087] Adicional mente à CGTase, no caso de se usar isoamilase como uma enzima desramificadora de enzima, de preferência, referida isoamilase deveria ser deixada atuar sobre substância amilácea na coexistência com CGTase em uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea, sendo que a quantidade de isoamilase a ser adicionada é usualmente de 200 a 2.500 unidades/g de substância amilácea e a enzima é reagida enzimaticamente a uma temperatura de 55°C ou menor, variando em dependência da temperatura ótima e do pH da isoamilase usada. Quando se usa pululanase como uma enzima desramificadora de enzima, ela pode ser usada de acordo com o caso da isoamilase.

[0088] Após uma reação enzimática com CGTase apenas ou juntamente com uma enzima desramificadora de enzima ser completada como um todo, a solução de reação enzimática resultante é aquecida instantaneamente para inativar a CGTase apenas ou em combinação com a enzima desramificadora de amido e para suspender a reação enzimática, seguido de deixar-se a glucoamilase atuar na solução resultante. Pela ação da glucoamilase, uma cadeia de dois ou mais radicais D-glicose ligados ao grupo hidroxila na posição C2 do ácido L-ascórbico é clivada para transformar ácido α-glicosil-L-ascórbico, como ácido 2-O-a-maltosil-L-ascórbico, ácido 2-O-a-maltotriosil-L-ascórbico, e ácido 2-O-a-maltotetraosil-L-ascórbico em ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um rendimento incrementado de produção tão alto quanto de 35 % ou maior, de preferência, de 37 a 45 % de ácido ascórbico de 2-glicosídeo.

[0089] No caso de o rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo ser de 35 % ou maior, de preferência, de 37 a 45 %, ele facilita obter uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro apresentando um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, ou um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor da composição particulada por meio das etapas de (2) a (5) a seguir. A razão porque o limite superior do rendimento de produção preferível é ajustado em 45 % é como a seguir: É substancial mente difícil exceder o limite superior considerando o nível tecnológico hodierno da manipulação de enzimas, enquanto que, mesmo se o rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo for incrementado em mais de 45 %, o grau de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro na composição particulada resultante e o nível de sorção dinâmica de vapor da mesma não seriam tão incrementados.

[0090] No caso de o rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo ser menor do que 35 %, é difícil obter uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro apresentando um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, ou um nível de sorção di- nâmica de vapor de 0,01 % ou menor da composição particulada mesmo se preparado por meio das etapas de (2) a (5) seguir. Embora a razão seja indeterminada, pode-se especular que a dificuldade acima poderia ser dependente de uma quantidade relativa de ácido 5-O-a-glucosil-L-ascórbico e ácido 6-O-a-glucosil-L-ascórbico como subprodutos que são formados inevitavelmente quando a CGTase é deixada atuar sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea.

[0091] De uma forma geral, o ácido 5-O-a-glucosil-L-ascórbico e ácido 6-O-a-glucosil-L-ascórbico, onde radical D-glicose se liga ao grupo hidroxila na posição C-5 ou C-6 do ácido L-ascórbico, são reconhecidos como substâncias inibidoras de cristalização que inibem a cristalização de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, e este ácido 5-O-a-glucosil-L-ascórbico e ácido 6-O-a-glucosil-L-ascórbico são formados inevitavelmente como subprodutos juntamente com ácido ascórbico de 2-glicosídeo e os acima indicados ácidos α-glicosil-L-ascórbicos. O teor dos subprodutos acima é usual mente tão baixo quanto de cerca de um porcento, b.s.s., no total; no entanto, sua remoção é geralmente difícil porque estes produtos transferidos de sacarídeos são eluídos substancial mente na mesma posição que a do ácido ascórbico de 2-glicosídeo em etapa de purificação convencional com um coluna. No entanto, quando ácido ascórbico de 2-glicosídeo é formado com um rendimento de produção tão alto quanto de 35 % ou maior, de preferência, de 37 a 45 % deixando-se a CGTase natural ou recombinante previamente indicada atue sobre uma solução contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea, o rendimento de produção de ácido 5-O-a-glucosil-L-ascórbico e ácido 6-O-a-glucosil-L-ascórbico não excede 0,5 %, b.s.s., no total. Como um resultado, especula-se que a cristalização subsequente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo em uma composição particulada de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro prosseguirá mais desimpedidamente.

[0092] Adicional mente, pode-se especular também que o seguinte relaciona-se com a teoria acima; quando CGTase é usada como uma enzima transferidora de sacarídeo, o modo de ligação entre radicais D-glicose no ácido α-glicosil-L-ascórbico, como ácido 2-O-a-maltosil-L-ascórbico, ácido 2-O-a-maltotriosil-L-ascórbico, etc., é a ligação a-1,4, mesmo quando dois ou mais radicais D-glicose são transferidos para o grupo hidroxila na posição C2 do ácido L-ascórbico. Portanto, a ligação entre os radicais D-glicose acima é facilmente clivada pela ação subsequente da glucoamilase em converter o ácido glicosil-L-ascórbico em ácido ascórbico de 2-glicosídeo; e, por exemplo, não há receio de permanecerem substâncias inibidoras de cristalização, como ácido α-glicosil-L-ascórbico apresentando uma estrutura ramificada, como a ligação a-1,6, mesmo após o tratamento com glucoamilase, como quando se usa enzima formadora de glicossacarídeo de a-isomaltosila, por exemplo.

Etapa (2) [0093] A Etapa (2) é para purificar uma solução contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo obtida na Etapa (1) acima para aumentar o teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo a mais de 86 %, b.s.s.; a solução contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo obtida na Etapa (1) é descolorida e filtrada com um carvão ativado, etc., seguido de dessalinização do filtrado resultante com uma resina de troca catiônica e aplicação da solução dessalinizada a cromatografia em coluna para purificar a solução dando um teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo acima de 86 %, de preferência, 88 % ou maior, b.s.s. Como a cromatografia em coluna usada para purificação é possível usar basicamente croma-tografias em coluna desde que elas aumentem o teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo em uma solução a mais de 86 %, b.s.s., contudo, exemplos preferidos disso são a cromatografia em coluna usando uma resina de troca catiônica ou resina porosa, que se segue a cromatografia em coluna usando-se uma resina de troca aniônica para remover sacarídeos, como D-glicose. Exemplos das resinas de troca aniônicas desejadas para remover sacarídeos, como D-glicose, incluem “AMBERLITE IRA411S” e “AMBERLITE IRA478RF” (ambas comercializadas pela Rohm & Hass Company, Philadelphia, E.U.A.); e “DIAION WA30” (comercializada pela Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Japão). Exemplos das resinas de troca catiônicas desejadas para separar ácido ascórbico de 2-glicosídeo de ácido L-ascórbico incluem “DOWEX 50WX8” (comercializado pela Dow Chemical Co., Midland, USA); “AMBERLITE CG120” (comercializado pela Rohm & Hass Company, Philadelphia, USA); “XT-1022E” (comercializada pela Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japão); e “DIAION SK104” e “DIAION UBK 550” (ambas comercializadas pela Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Japão). Exemplos das resinas porosas desejadas incluem “TOYOPEARL HW-40” (comercializada pela Tosoh Corp., Tokyo, Japão); e “CELLFINE GH-25” (comercializada pela Chico Corp., Tokyo, Japão). No caso de se conduzir cromatografia em coluna usando resina de troca catiônicas ou resinas porosas, condições preferíveis são como a seguir: A concentração de sólidos de uma solução de material a ser introduzida na coluna é de cerca de 10 % a cerca de 50 %, o volume de carregamento em uma resina é de cerca de 1/1.000 a 1/20 vezes um volume de resina úmida, e água refinada numa quantidade grosseiramente igual ao volume de resina úmida é introduzida a uma velocidade linear de 0,5 a 5 m/hora. Entre estes, no caso de se usar uma cromatografia em coluna de leito móvel simulado como a cromatografia em coluna que usa uma resina de troca catiônica, referida cromatografia em coluna é preferível porque aumenta a pureza do ácido ascórbico de 2-glicosídeo no produto purificado resultante e porque reduz concomitantes, como ácido L-ascórbico e D-glicose, particular- mente, reduz o teor de ácido L-ascórbico e forma uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro com um teor de ácido L-ascórbico de 0,1 % ou menor, b.s.s.. Para referência, variando-se, dependendo de uma temperatura de opera-ção/taxa de fluxo da instalação, condições de eluição preferíveis para cromatografia em coluna de leito móvel simulado, em que uma resina de troca catiônica é usada como um material de empacotamento, são como a seguir: A concentração de uma solução, contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo introduzido na cromatografia em coluna acima, é de 60 % ou menor, o volume de carregamento da solução contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo é de 1/20 vezes em volume, ou menor, do volume de resina úmida, e o volume de água refinada usado como um eluente não é maior do que 30 vezes em volume, usualmente, de 5 a 20 vezes em volume do volume de carregamento acima.

[0094] Quando o teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo na solução é 86 % ou menor, b.s.s., é difícil obter uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro apresentando, ou um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro ou um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor da composição particulada, mesmo quando tratada com as Etapas sucessivas de (3) a (5). Especula-se que a razão é que quando o teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo na solução é 86 % ou menor, b.s.s., a pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo na composição particulada resultante contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro obtido através da etapas subsequentes é relativamente baixa e isto prejudica a sua cristalização homogênea.

[0095] A solução purificada até dar um teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo acima de 86 %, de preferência, 88 % ou maior, b.s.s., é concentrada dando uma concentração prescrita, usualmente, uma concentração de cerca de 65 a cerca de 85 % de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, antes da etapa de cristalização do ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. O concentrado é usualmente controlado de modo a apresentar uma temperatura de cerca de 30 a cerca de 45°C. O concentrado, apresentando a concentração e a temperatura, corresponde ao ácido ascórbico de 2-glicosídeo contendo solução com um grau de saturação de 1,05 a 1,50.

Etapa (3) [0096] A Etapa (3) é para cristalizar ácido ascórbico de 2-glicosídeo de uma solução contendo acima de 86 %, de preferência, 88 % ou mais, b.s.s., de ácido ascórbico de 2-glicosídeo em ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro; a solução contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo, previamente purificada e concentrada para dar uma pureza e concentração prescritas e controlada a uma temperatura prescrita na Etapa (2), é transferida para um cristalizador, misturada com de 0,1 a 5 % de um cristal de semeadura de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e agitada cuidadosamente, seguido de resfriamento gradual da temperatura da solução para de 5 a 20°C ao longo de 6 a 48 horas para cristalizar ácido ascórbico de 2-glicosídeo para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. Quando um cristal de semeadura de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro já está presente no cristalizador, etc., não há necessidade de adicionar particularmente um cristal de semeadura do tipo referido. Em todos os casos, a cristalização de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro a partir do concentrado acima é efetuada, de preferência, na presença de referido cristal de semeadura. Se necessário, a concentração do solução purificada e cristalização de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro na solução pode ser realizada simultaneamente em modo de processo de fervura.

Etapa (4) [0097] A Etapa (4) é para recolher o ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro cristalizado; a massa cozida [massecuite] é recolhida do cristalizador e, depois, coleta-se o ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro por meio de centrifugação.

Etapa (5) [0098] A Etapa (5) é para envelhecer o ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro recolhido e secar o produto seco resultante e opcionalmente pulverizável; o ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro recolhido por meio de centrifugação é lavado com uma pequena quantidade de água refinada, como água deionizada e água destilada, para remover por lavagem as impurezas sobre as superfícies de cristais. A quantidade de água usada para lavagem não deveria ser restrita especificamente, contudo, uma quantidade excessiva da mesma dissolve os cristais per se, e também as impurezas, resultando em uma redução do rendimento de produção e em um incremento do custo de lavagem. Portanto, as superfícies dos cristais são lavadas usualmente, de preferência, com água em uma quantidade de até 30 %, de preferência, de 15 a 25 % do peso dos cristais. A lavagem é conduzida, de preferência, sob uma força centrífuga de modo que os cristais se depositam em uma centrífuga tipo cesto. Os cristais assim recolhidos e lavados são envelhecidos e secados conservando-se os mesmos em uma atmosfera com uma temperatura e umidade predeterminadas, durante um período prescrito para tornar os cristais resultantes em uma composição particulada com um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro ou um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor. Embora a temperatura de produto da composição particulada contendo cristais nas etapas de envelhecimento e secagem, a umidade relativa da atmosfera, e o tempo para envelhecer e secar não deveríam ser restritos especificamente desde que se obtenha a composição par- ticulada com o desejado grau de cristalinidade ou nível de sorção dinâmica de vapor. No entanto, de preferência, a temperatura de produto e a atmosfera deveriam ser mantidas respectivamente a uma temperatura de 20 a 55°C e a uma umidade relativa de 60 a 90 % nas etapas de envelhecimento e secagem. O tempo total para as etapas de envelhecimento e secagem é, de preferência, de cerca de 5 a cerca de 24 horas. A composição particulada contendo cristais, obtida por meio das etapas de envelhecimento e secagem, é resfriada de maneira não forçada a uma temperatura ambiente em uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro com um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro ou um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor. A composição particulada cristalina assim obtida é tornada em um produto final com ou sem pulverização opcional. [0099] Exceto quanto ao rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo na Etapa (1) acima e o teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo de qualquer uma das soluções nas Etapas (2) e (3) acima, as Etapas de (1) a (5) acima são basicamente as mesmas que as etapas de produção para pós de classe quase-droga e são livres de quaisquer etapas para recristalização e para lavagem repetida dos cristais, que são, ambas, indispensáveis no processo de produção de pós de classe reagente.

[00100] A composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro assim obtida é preparada de forma bastante rápida em uma composição particulada substancialmente não-higroscópica com uma capacidade aperfeiçoada de fluxo livre por meio de resfriamento não-forçado após etapas de envelhecimento e secagem, contudo, o grau de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro não aumenta para 90 % ou mais e o nível de sorção dinâmica de vapor da composição particulada não diminui para 0,01 % ou menos, quando o tempo de resfriamento não-forçado é curto demais. Quando uma composição particulada, preparada com tempo curto de resfriamento não-forçado, é preparada diretamente a um produto final, obtém-se apenas uma composição particulada que possivelmente se solidifica em condições normais de armazenamento de forma semelhante a pós de classe quase-droga. Sendo influenciado pela temperatura e umidade atmosféricas, e também variando dependendo da escala e da estrutura de apareihos/instalações usadas para secagem, o tempo mais curto possível requerido para resfriamento não-forçado para a obtenção da composição particulada dificilmente solidificável da presente invenção é considerado como sendo quase constante em condições constantes. Assim, quando a relação entre (i) o tempo requerido de resfriamento não-forçado para ajuste do grau de cristalinidade a 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e ajuste da sorção dinâmica de vapor quando apresenta um nível de sorção homogêneo de uma composição particulada do mesmo a 0,01 % ou menos, e (ii) a temperatura e umidade atmosféricas é, uma vez examinada com aparelhos e instalações específicas para uso efetivo, não há necessidade, em cada caso, de se examinar o grau de cristalinidade e o nível de sorção dinâmica de vapor de uma composição particulada em cada momento de produção, porém a composição particulada da presente invenção pode ser obtida usando-se o tempo de resfriamento não-forçado acima como o índice.

[00101] Os presentes inventores verificaram adicionalmente que, em lugar de resfriamento não-forçado da composição particulada contendo cristais, após o envelhecimento e secagem identificados acima, por exemplo, um resfriamento forçado por meio de sopragem de um ar limpo com uma temperatura de aproximadamente a temperatura ambiente da composição particulada para diminuir a temperatura a aproximadamente a temperatura ambiente prossegue desimpedidamente a cristalização de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro em uma composição particulada com um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor em um período de tempo relativamente curto. O ar soprado tem, de preferência, uma temperatura compreendendo de cerca de 15 a cerca de 30°C, mais preferivelmente, de 18 a 28°C. Adicionalmente, o tempo de sopragem é usualmente, de preferência, de cerca de 5 a cerca de 60 min, mais preferivelmente, de 10 a 30 min. Variando dependendo da temperatura do ar soprado, o efeito de resfriamento forçado não é observado tão claramente com um tempo de sopragem inferior a cinco minutos, enquanto que um incremento aperfeiçoado do grau de cristalinidade não é esperado mesmo com um tempo de sopragem acima de 60 min, e, assim, referido tempo de sopragem não é preferível. No caso de ar soprado, o efeito de resfriamento deveria ser exercido, de preferência, em toda a composição particulada contendo cristais seja por meio de agitação ou de vibração apropriada da composição particulada.

[00102] A composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro assim obtida é da presente invenção, que contém ácido ascórbico de 2-glicosídeo em uma quantidade acima de 98,0 % porém menor do que 99,9 %, b.s.s., e, ou apresenta um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, quando calculado com base em um perfil de análise de difração de raios-X em pó da composição particulada, ou apresenta um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor, quando mantida a 25°G sob uma umidade relativa de 35 % durante 12 horas após a remoção da água livre da composição particulada sob corrente de gás nitrogênio. Comparando com pós de classe quase-droga convencionais, a composição particulada é uma composição particulada significativamente e dificilmente solidificável contendo áci- do ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, mesmo nas condições em que os pós convencionais se solidificarão.

[00103] Em parênteses, a solidificação de materiais apresenta [n.t.: suscita] um receio de afetar diversamente plantas de produção. Por exemplo, no campo de uma produção de alimento em que se usa materiais pulverulentos, referidos materiais são frequentemente pulverizados finamente por rolos esmagadores, transportados pneumaticamente para linhas de produção por meio de sopragem de ar, e transportados por meio de transportadores de espiral em zigue-zague. Em tais ocasiões, se os materiais porosos se solidificarem, os seguintes eventos problemáticos serão induzidos: Os rolos dos rolos esmagadores podem ser danificados ou queimados, ou peneiras e tubos de transporte instalados em linhas de produção podem tornar-se bloqueados. Materiais porosos também solidificados apresentam um alto risco de causar eventos operacionais problemáticos em sua dissolução e em sua misturação ou amassamento com outros materiais. Problemas nas etapas de produção causados por solidificação de referidos pós são descritos detalhadamente, por exemplo, em “Funryutai-Trouble-Shooting” (Detecção de problemas de partículas porosas), editado por Tsutomu Shibata, publicado por Kogyo Chosakai Publishing Co., Ltd., Tokyo, Japão, pp. 15-19, 2006.

[00104] Como a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção é significante-mente de difícil solidificação em comparação com pós de classe quase-droga convencionais, ela apresenta um mérito vantajoso pelo fato de que pode ser incorporada em um ou mais outros materiais pulverulentos para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, e farmacêuticos no campo das manufaturas de produtos alimentícios incluindo bebidas, e também de cosméticos, quase-drogas, e farmacêuticos, que são produzidos em plantas de produção que são projetadas onde materiais com capacidade de fluxo livre satisfatória serão usadas nas instalações.

[00105] Exemplos dos materiais pulverulentos identificados acima para produtos alimentícios incluem farinhas de grãos, amidos, açúcares em pó, temperos em pó, condimentos em pó, sucos em pó, gorduras e óleos em pó, peptídios em pó, gemas de ovos em pó, leite em pó, pós de leite desnatado, cafés em pó, cacau em pó, miso em pó, e vegetais em pó. Exemplos de materiais pulverulentos para cosméticos incluem pós para a face, talco, caulim, mica, sericita, amidos, bentoni-ta, pós de seda, pós de celulose, pós de nylon, sais de banho, cavacos de sabão, dióxido de titânio, dióxido de silício (sílica), e óxido de zinco. Exemplos de materiais pulverulentos para quase-drogas incluem sais de aminoácidos, preparações de vitamina, preparações de cálcio, ex-cipientes, cargas, fungicidas, e preparações de enzimas. Exemplos de materiais pulverulentos para farmacêuticos incluem ingredientes efetivos pulverulentos; excipientes e cargas, como oligossacarídeos, lacto-se, amidos, dextrinas, açúcares brancos, celuloses cristalinas, ésteres de sacarose, e ésteres de ácido graxo; e agentes de revestimento, como shellac [laca natural].

[00106] As composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro assim obtidas contêm usualmente ácido L-ascórbico e/ou D-glicose e apresentam uma Potência de redução da composição particulada como um todo que é menor do que um porcento. Em detalhe, elas são composições particuladas satisfatórias pelo fato de que, embora contendo usualmente um ou ambos de ácido L-ascórbico e D-glicose em um nível detectável por meio de métodos analíticos, como cromatografia líquida de alto desempenho, especificamente, em uma quantidade de 0,01 % ou maior, porém não maior do que 0,2 %, b.s.s., elas apresentam uma Potência de redução da composição particulada como um todo que é inferior a um porcento, e, portanto, como mostrado no Experimento descrito mais adiante, elas são substancial mente livres de causar o receio descoloração (acastanhamento) mesmo quando aquecidas na presença de um composto(s) com grupo amino intramoleclularmente, como aminoácidos e proteínas. De preferência, as composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro assim obtidas contêm ácido L-ascórbico em uma quantidade de 0,1 % ou menos. Quando uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro tem um teor de ácido L-ascórbico tão baixo quanto 0,1 % ou menor, não há receio de descoloração na composição particulada per se, mesmo quando armazenada durante um período de tempo relativamente longo na mesma forma de produto que pós de classe quase-droga convencionais.

[00107] Adicionalmente, as composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro assim obtidas podem ser preparadas sozinhas em produtos de composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro porque elas contêm usualmente partículas com um tamanho de partículas inferior a 150 pm em uma quantidade de 70 % ou mais para cada uma das composições particuladas como um todo e aquelas com um tamanho de partícula de pelo menos 53 pm porém menor do que 150 pm em uma quantidade de 40 a 60 % para cada uma das composições particuladas como um todo. No caso de conterem uma quantidade relativamente grande de partículas pulverulentas com um tamanho de partículas maior do que as partículas identificadas acima ou apresentando uma distribuição de partículas diferente dos níveis desejados, elas são pulverizadas apropriadamente para reduzir seu tamanho de partículas ou são classificadas por meio de peneiração ou análogo para controlar seu tamanho de partículas.

[00108] Os experimentos a seguir explicam concretamente a pre- sente invenção: Experimento 1: Influência do grau de cristalinidade sobre a solidificação de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro [00109] Composições particuladas, contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro com diferentes graus de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro na faixa de 0 a 100 %, foram preparadas e testadas quanto à solidificação para examinar a relação entre o grau de cristalinidade e a capacidade de solidificação. Os detalhes são como a seguir: Experimento 1-1: Preparação de amostras Amostra de teste n° 1 [00110] “ácido ascórbico de 2-glicosídeo 999” (código n° AG124, uma pureza de 99,9 % ou maior), uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, como uma amostra padrão consistindo substancialmente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, foi usada como amostra de teste n° 1. Amostra de teste n° 2 [00111] Uma composição particulada, preparada dissolvendo-se a amostra de teste n° 1 em uma quantidade adequada de água refinada, secando-se por congelamento a solução resultante durante três dias, e secando o resultante in vacuo sob uma temperatura de 40X3 ou menor de um dia para o outro, foi usada como outra amostra padrão consistindo substancial mente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo amorfo e foi denominada “amostra de teste n° 2”. A amostra de teste n° 2 apresentou um teor de umidade de 2,0 % quando medida com o método de Karl Fischer.

Amostra de teste números 3 e 4 [00112] Como amostras de teste números 3 e 4 com um grau de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro sendo entre aqueles das amostras de teste números 1 e 2, preparou-se as seguintes amostras como a seguir: Uma composição particulada que consiste de ácido ascórbico de 2-glicosídeo amorfo preparada semelhantemente como o método para a amostra de teste n° 2 foi espalhada no interior de uma bandeja metálica e foi parcialmente cristalizada mantendo-se a mesma em uma câmara com uma temperatura e umidade constantes controladas a uma temperatura de 25Ό e uma umidade relativa de 90 % durante 24 ou 72 horas para acelerar a cristalização. Sucessivamente, a bandeja metálica foi retirada da câmara, secada in vacuo a 38X3 de um dia para o outro para se obter dois t ipos de composições particuladas, sendo que aquela uma com um tempo de tempo de aguardo de 24 horas na câmara com temperatura e umidade controladas foi denominada “amostra de teste n° 3”, enquanto que a outra com um tempo de aguardo de 72 horas foi denominada “amostra de teste n° 4”. Amostras de teste números 3 e 4 foram encerradas respectivamente em um frasco fechado hermeticamente com uma tampa e preservado com um dessecante em um dessecador numa condição hermética até imediatamente antes de se submeter a teste para análise.

Experimento 1-2: Purezas de ácido ascórbico de 2-glicosídeo e graus de cristalinidade de amostra de teste números de 1 a 4 Pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo [00113] As purezas do ácido ascórbico de 2-glicosídeo das amostras de teste números de 1 a 4 foram determinadas como a seguir: Usando água refinada, cada uma das amostras de teste foi tornada uma solução aquosa a 2 %, que então foi filtrada com um filtro de membrana de 0,45 pm. O filtrado foi submetido a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC, high-performance liquid chromatography) nas condições a seguir, seguido do cálculo da pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, b.s.s., de cada uma das amostras de teste com base na área de pico de cada cromatograma do índice refrativo. Os resultados encontram-se na Tabela 1.

Condições analíticas: sistem de HPLC: “LC-10AD”, comercializado pela Shi- madzu Corp., Kyoto, Japão;

Desgaseificador: “DGU-12AM”, comercializado pela Shi- madzu Corp., Kyoto, Japão;

Coluna: “WAKOPAK WAKOBEADS T-330”, forma H+, comercializada pela Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japão;

Volume da injeção de amostra: 10 pl;

Eluente: 0,01 % (vol./vol.) solução aquosa de áci- do nítrico;

Taxa de fluxo: 0,5 ml/min;

Temperatura: 25Ό;

Detector do índice refrativo: “RID-10A”, comercializado pela Shi- madzu Corp., Kyoto, Japão;

Dispositivo de processamento de dados: “CHROMATOPAK C-R7A”, comercializado pela Shimadzu Corp., Kyoto, Japão;

Grau de cristalinidade [00114] Os graus de cristalinidade de amostra de teste números de 1 a 4 para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro foram determinados: submetendo-se cada amostra de teste à análise usando “X’ Pert PRO MPD”, um nome de produto de um difratômetro de raios X em pó de luz refletiva comercialmente obtenível comercializado pela Spectris Co., Ltd., Tokyo, Japão; irradiando um raio de CuKa (corrente elétrica de raio-X: 40 mA, voltagem elétrica: 45 kV, comprimento de onda: 1,5405 Â), como um raio-X característico irradiado de um alvo de Cu, para a amostra para se obter um perfil de difração de raios-X em pó; e determinando o valor analítico para o grau de cristalinidade de cada uma das amostras de teste números de 1 a 4 por meio do método de Harmans usando um programa de computador do método Harmans exclusivamente instalado no difratômetro. Antes da análise acima, o grau de partículas e o fator de flexão pré-ajustado no software foram ajustados respectivamente em níveis apropriados para a obtenção de uma linha-de-base avaliada como sendo a mais preferível, enquanto se considera picos mutuamente superpostos, intensidade de difração, e intensidade de espalhamento em respectivos padrões de difração de raios-X em pó. O método de Harmans é descrito detalhadamente por P. H. Harmans e A. Weidinger, “Journal of Applied Physics, vol. 19, pp. 491-506 (1948) e P. H. Harmans e A. Weidinger, “Journal of Polymer Science”, vol. 4, pp. 135-144 (1949).

[00115] O grau de cristalinidade de cada amostra de teste foi calculado substituindo-se os dados a seguir na Fórmula 1 acima: Hs como o valor do grau de cristalinidade de cada amostra de teste; H100, o valor analítico da amostra de teste n° 1; e Ho, o valor analítico da amostra de teste n° 2. Quando analisado pelo método de Harmans, o valor analítico do grau de cristalinidade de amostra de teste n° 1 (valor analítico H100) e aquele da amostra de teste n° 2 (valor analítico Ho) foram respectivamente de 70,23 % e 7,57 %. Os resultados também se encontram na Tabela 1. Os padrões de difração de raios-X em pó das amostras de teste números 1 e 2, como amostras padrão, são mostrados respectivamente nas FIGs. 1 e 2.

[00116] Como mostrado na FIG. 1, picos de difração claros e acentuados específicos para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro foram encontrados na faixa de ângulos de difração (20) de 4 a 65° no padrão de difração de raios-X em pó da amostra de teste n° 1, mas não se encontrou qualquer halo específico para ácido ascórbico de 2-glicosídeo amorfo. No entanto, como mostrado na FIG. 2, diferente- mente do padrão de difração de raios-X em pó da FIG. 1, halo específico para ácido ascórbico de 2-glicosídeo amorfo foi encontrado claramente como uma linha-de-base acumulada no padrão de difração de raios-X em pó da amostra de teste n° 2, mas não se encontrou qualquer pico de difração específico para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro.

Experimento 1-3: Análises de difração de raios-X em pó das amostras de teste números 1 e 2 usando uma radiação de sincrotron [00117] Este experimento foi realizado para confirmar adicionalmente que as amostras de teste Nos. 1 e 2 foram amostras padrão apropriadas para se determinar os valores analíticos H100 e Ho- Estas amostras foram submetidas a uma difratometria de raios-X em pó de luz transmitida, que detecta uma fraca difração e espalhamento, usando uma radiação de sincrotron (denominada a seguir “radiação”), como uma fonte de radiação de raios-X. As condições analíticas foram como a seguir.

Condições analíticas [00118] Difratômetro de raios-X em pó: Modelo “PDS-16”, um difra-tômetro de raios-X em pó de alta velocidade (modo Debye Scherrer, comprimento da câmara: 497,2 mm) comercializado pela Kohzu Preci-sion Co., Ltd., Kanagawa, Japão;

[00119] Fonte de radiação de raios-X: “Beam line of Hyogo Prefec-ture (BL08B2)”, radiação de eletroímã defeituoso;

Comprimento de onda: 0,7717Â (16,066 keV);

Intensidade: 109fótons/s; Ângulo de medição: de 2 a 40* Tempo de exposição: 600 s;

Gravação de imagem: “IMAGING PLATE BAS-2040”, uma placa de formação de imagem comercializada pela Fujifilm Corp., Tokyo, Japão; e Analisador de imagem: “BIO-IMAGE ANALYZER BAS-2500”, comercializado pela Fujifilm Corp., Tokyo, Japão. A medição foi conduzida usando o “Beam line of Hyogo Prefecture (BL08B2)” colocado em “SPring-8”, uma instalação de radiação de sincrotron, 1-1-1 Koto, Sayo-cho, Sayo, Hyogo, Japão.

[00120] Antes da análise de difração de raios-X em pó, amostras de teste Nos. 1 e 2 foram cominuídas respectivamente em um almofariz e peneiradas com uma peneira com abertura de malha de 53 pm mesh. Então, cada uma das composições particuladas resultantes passadas através da peneira foi injetada homogeneamente em “MARKTUBE n° 14”, um nome de produto de um capilar de vidro para difração de raios-X em pó (diâmetro: 0,6 mm, vidro Lindeman), comercializado pela Toho KK, Tokyo, Japão, para dar um comprimento de amostra injetada de cerca de 30 mm. Sucessivamente, o capilar foi cortado na extremidade terminal da amostra injetada, e a extremidade aberta foi selada com um adesivo. Em seguida, o capilar foi fixado em um suporte de amostra com argila, e o suporte de amostra foi ajustado ao difratôme-tro de raios-X em pó para dar a direção longitudinal do capilar perpendicular contra o eixo óptico do difratômetro de raios-X em pó.

[00121] Para remover o efeito adverso da orientação do ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro sobre o perfil de difração de raios-X em pó, a medição da difração de raios-X em pó foi realizada deixando-se o suporte de amostra reciprocar a uma velocidade uniforme no sentido da direção longitudinal do capilar em uma largura de ± 1,5 mm e a um ciclo de tempo de uma vez a cada 60 s, e simultaneamente deixando o suporte de amostra girar a uma velocidade uniforme em torno do eixo rotacional no sentido longitudinal do capilar a um ciclo de tempo de duas vezes por segundo.

[00122] Nos processos de analisar o perfil de difração de raios-X em pós e preparar os padrões de difração de raios-X em pó de amos- tras de teste números 1 e 2, sinais de fundo inerentes ao difratômetro de raios-X em pó foram eliminados de cada perfil de difração de raios-X em pó de acordo com a maneira convencional para aperfeiçoar a precisão da medição. Os padrões de difração de raios-X em pó resultantes das amostras de teste números 1 e 2 são mostrados nas FIGs. 3 e 4, respectivamente.

[00123] Como mostrado na FIG. 3, os picos de difração específicos para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro apareceram claramente e agudamente na faixa de ângulos de difração (20) de 2 a 40° para o padrão de difração de raios-X em pó da amostra de teste n° 1, medido usando a radiação de sincrotron. Como o comprimento de onda da radiação de sincrotron (0,7717 Â) foi diferente daquela do raio-X característico (1,5405 Â), cada pico de difração na FIG. 3 ocorreu a cerca de um meio ângulo de difração (20) de cada um dos picos correspondentes na FIG. 1. No entanto, os padrões de difração de raios-X em pó nas FIGs. 1 e 3 coincidiram extremamente bem entre si. No entanto, a largura do pico a meia altura de cada pico de difração na FIG. 3 foi evidentemente mais estreito do que o na FIG. 1, e cada pico de difração na FIG. 3 apresentou resolução maior do que na FIG. 1, embora a intensidade do pico na FIG. 3 fosse maior em quase 100 vezes do que na FIG. 1. O padrão de difração de raios-X em pó na FIG. 3 não apresentou halo específico para ácido ascórbico de 2-glicosídeo amorfo, como mostrado na FIG. 4 a seguir. O resultado indica que o grau de cristalinidade de amostra de teste n° 1 para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro é extremamente alta, e a amostra de teste n° 1 substancial mente consiste de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro.

[00124] Como mostrado na FIG. 4, o padrão de difração de raios-X em pó da amostra de teste n° 2, obtida com uso da radiação de sincrotron, apresentou um halo notável específico para ácido ascórbico de 2- glicosídeo amorfo como uma linha-de-base acumulada, mas não qualquer pico de difração específico para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. Este resultado indica que a amostra de teste n° 2 consiste substancial mente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo amorfo. Os resultados acima, obtidos usando a radiação de sincrotron como uma fonte de raios-X, corroboram o fato de que amostras de teste números 1 e 2 são amostras padrão apropriadas para definir os valores analíticos H100 e Ho, respectivamente, para uso na Fórmula 1. Experimento 1-4 Teste de solidificação [00125] O experimento a seguir consistiu em investigar a propriedade de solidificação das respectivas amostras de teste números de 1 a 4: Um grama de cada uma das amostras de teste números de 1 a 4, preparadas no Experimento 1-1, foi colocada separadamente em “FALCON TUBE 2059”, um nome de produto de um tubo cilíndrico em polipropileno de 14 ml (1,7 cm de diâmetro, 10 cm de altura) apresentando um fundo de forma hemisférica e uma tampa, comercializado pela Becton, Dickinson e Company, New Jersey, E.U.A. Os tubos foram ajustados em um suporte de tubos na vertical e deixados descansar durante 24 horas, após o que o suporte de tubos foi colocado em “IC-410”, um nome de produto de um incubador comercializado pela Advantec Toyo Kaisha, Ltd., Tokyo, Japão, controlada em 500. Após a incubação, os tubos foram retirados do incubador, seguido da retirada de cada amostra de cada tubo para colocá-la sobre uma placa plana de plástico preto virando-se os tubos lentamente de cabeça para baixo, e observando macroscopicamente as condições das amostras. [00126] O grau de solidificação de cada amostra de teste foi avaliado com base nos critérios a seguir: [00127] “Solidificada”, (+): A amostra manteve claramente a forma hemisférica do fundo do tubo, mesmo sobre a placa;

[00128] “Ligeiramente solidificada”, (±): A amostra mostrou ligeiramente a forma hemisférica do fundo do tubo;

[00129] “Não solidificada”, (-): A amostra deformou-se e não apresentou a forma hemisférica do fundo do tubo. Os resultados foram mostrados na coluna de “Capacidade de solidificação” da Tabela 1. Tabela 1 [00130] Como mostrado na Tabela 1, a amostra de teste n° 1, como uma amostra padrão para define o valor analítico H100 (grau de cristalinidade: 100,0 %), foi avaliada como sendo “Não solidificado” (-) porque colapsou facilmente e não manteve a forma hemisférica do fundo do tubo, quando retirada do tubo e colocada em uma placa plana. Em contraste, a amostra de teste n° 2 como outro amostra padrão para definir o valor analítico Ho (grau de cristalinidade: 0,0 %) foi avaliada como sendo “solidificada” (+) porque ainda manteve a forma hemisférica do fundo do tubo quando retirada do tubo e colocada sobre a placa. A forma hemisférica da amostra de teste n° 2 não colapsou mesmo quando se aplicou uma ligeira vibração à placa.

[00131] A amostra de teste n° 3 com um grau de cristalinidade de 88,3 % conservou a forma hemisférica do fundo do tubo, mesmo quando retirada do tubo e colocada sobre a placa, e foi avaliada claramente como sendo “solidificada” (+), de maneira similar à amostra de teste n° 2. A amostra de teste n° 4 com um grau de cristalinidade de 93,1 % colapsou de maneira idêntica à amostra de teste n° 1, contudo, perdeu sua forma e colapsou imediatamente após ter sido retirada do tubo e colocada sobre a placa e avaliada como sendo “Não solidifica- da” (-).

[00132] Como descrito acima, embora as amostras de teste números de 2 a 4 houvessem sido preparadas da amostra de teste n° 1 com um ácido ascórbico de 2-glicosídeo pureza de 99,9 %, a análise de HPLC mencionada acima mostrou que suas purezas de ácido ascórbico de 2-glicosídeo não haviam incrementado a um nível maior do que 99,1 %. A razão para isto não está clara, mas pode-se especular que uma ligeira quantidade de ácido ascórbico de 2-glicosídeo poderia perder-se por degradação ou análogo durante a preparação.

[00133] Dos resultados acima, no caso de composições particuladas contendo 99,1 % ou maior, b.s.s., de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, aqueles com um grau de cristalinidade maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro tendem a apresentar uma menor capacidade de solidificação; e os fatos de que a amostra de teste n° 3 com um grau de cristalinidade de 88,3 % foi avaliada como sendo “Solidificada” (+) e a amostra de teste n° 4 com um grau de cristalinidade de 93,1 % foi avaliada como sendo “Não solidificada” (-) indicam que um limiar de alteração da avaliação de “Solidificada” (+) para aquela de “Não solidificada” (-) no teste de solidificação acima situa-se entre um grau de cristalinidade de 88,3 % e 93,1 %.

Experimento 2 Relação entre a solidificação e o grau de cristalinidade de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro [00134] Neste experimento, com base nos resultados do Experimento 1, sete tipos de composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, apresentando um grau de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro na faixa de 0 a 100 % e uma pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo na faixa de 99,1 a 99,9 %, foram usados e testados guanto à capaci- dade de solidificação de maneira semelhante ao Experimento 1 para investigar a relação entre a solidificação e o grau de cristalinidade em maior detalhe.

Experimento 2-1 Preparação of amostra de teste [00135] Composições particuladas de amostras de teste números de 5 a 9 na Tabela 2 foram preparadas pesando-se amostras de teste números 1 e 2, que haviam sido preparadas no Experimento 1-1, em quantidades apropriadas, respectivamente, e misturando-se as mesmas até a homogeneidade. A Tabela 2 mostra as purezas de ácido ascórbico de 2-glicosídeo e os graus de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro de amostras de teste números de 5 a 9, determinado por meio do método revelado no Experimento 1-2. Os resultados de amostras de teste números 1 e 2 na Tabela 2 foram copiados da Tabela 1.

Experimento 2-2 Teste de solidificação [00136] As amostras de teste números de 5 a 9 foram submetidas ao teste de solidificação no Experimento 1-4. Os resultados são mostrados na coluna de “solidificação” na Tabela 2. Os resultados da solidificação de amostras de teste números 1 e 2 na Tabela 2 foram copiados da Tabela 1.

Tabela 2 [00137] Como encontrado nos resultados da Tabela 2, a amostra de teste n° 9 com um grau de cristalinidade de 29,9 % foi avaliada como sendo “solidificada” (+) e a amostra de teste n° 8 com um grau de cristalinidade de 89,2 % foi avaliada como sendo “ligeiramente solidificada” (±). Em contraste, as amostras de teste números 7, 6 e 5 com graus de cristalinidade respectivos de 91,5 %, 92,6 %, e 99,8 % foram avaliadas como sendo “não solidificadas” (-) de maneira similar à amostra de teste n° 1. Estes resultados indicam que, entre as composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que contém ácido ascórbico de 2-glicosídeo em uma quantidade de 99,1 % ou maior porém menor do que 99,9 %, b.s.s., aquelas com um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro não solidificam nas condições deste experimento.

Experimento 3 Influência do nível de sorção dinâmica de vapor sobre a solidificação de composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro [00138] Como a higroscopicidade de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro é estimada como estando envolvida na solidificação da composição particulada, neste experimento, o nível de sorção dinâmica de vapor, que é presumido como sendo um índice útil para estimar a higroscopicidade das amostras de teste números 1 e 2 e amostras de teste números de 5 a 9 foram medidas e o efeito do nível de sorção dinâmica de vapor sobre a solidificação de composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro foi investigada verificando-se os resultados do teste de solidificação no Experimento 2-2.

Experimento 3-1 Medição do nível de sorção dinâmica de vapor [00139] Frações de cerca de 50 mg de respectivas amostras de teste números 1 e 2, preparadas no Experimento 1-1, e amostras de teste números de 5 a 9, preparadas no Experimento 2-1, foram colocadas respectivamente em um recipiente de amostragem em tela e deixadas descansar em “IGA SORP”, um aparelho de sorção dinâmica de vapor comercializado pela Hiden Isocheme Corp., enquanto que os recipientes de amostragem em tela foram ajustados em suportes de amostras (confeccionados em aço inoxidável). As amostras de testes foram desidratadas mantendo-se a uma temperatura de 25X3 e uma umidade relativa de 0 % durante 12 horas sob corrente de gás nitrogênio a uma taxa de fluxo de 200 ml/min e prontamente pesadas. Adicionalmente, as amostras de teste foram mantidas a uma temperatura de 25X3 e uma umidade relativa de 35 % durante 12 horas sob corrente de gás nitrogênio e novamente pesadas. O nível de sorção dinâmica de vapor (%) de cada amostra de teste foi calculado substituindo-se na previamente indicada Fórmula 2 o peso de cada amostra de teste cuja umidade foi eliminada e o peso da mesma amostra imediatamente após ser hidratada a uma temperatura de 25X3 e uma umida de relativa de 35 % durante 12 horas. Os dados dos níveis de sorção dinâmica de vapor das amostras de teste números 1 e 2 e também das amostras de teste números de 5 a 9, obtidos neste experimento, são mostrados na Tabela 3. Em paralelo, as purezas do ácido ascórbico de 2-glicosídeo, obtido no Experimento 2-1, e os resultados de teste sobre sua solidificação, obtidos no Experimento 2-2, são mostradas na Tabela 3.

Tabela 3 [00140] Como mostrado na Tabela 3, os níveis de sorção dinâmica de vapor de amostras de teste números 2 e de 5 a 9 foram variados de menos de 0,01 % (correspondendo a “<0,01” na Tabela 3 e isto aplica-se em seguida), i.e., um valor menor do que o limite de detecção, a 1,70 %, e isto indica que mesmo composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que contêm ácido ascórbico de 2-glicosídeo em uma quantidade de 99,1 % ou maior porém menor do que 99,9 %, b.s.s., podem apresentar níveis de sorção dinâmica de vapor significativamente diferentes. Cada uma das amostras de teste números 1, 5 e 6 apresentou um nível de sorção dinâmica de vapor inferior ao limite de detecção. Ao contrário, as amostras de teste números 2, 8 e 9 apresentaram um nível de sorção dinâmica de vapor acima de 0,05 %, particularmente, a amostra de teste n° 2 apresentou um nível de sorção dinâmica de vapor de 1,70 %, um nível de sorção dinâmica de vapor 10 vezes maior do que aqueles das amostras de teste números 8 e 9.

[00141] Comparando os resultados acima e os resultados da coluna de “solidificação” na Tabela 3, existe uma correlação clara entre a solidificação de composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e seus níveis de sorção dinâmica de vapor; as amostras de teste números 1, 5, 6 e 7, apresentando um nível de sorção dinâmica de vapor menor do que o limite de detecção ou tão baixo quanto 0,01 %, foram avaliados como sendo “não solidificado” (-), enquanto que amostras de teste números 2, 8 e 9, apresentando um nível de sorção dinâmica de vapor atingindo de 0,05 a 1,70 %, foram avaliadas como sendo “solidificadas” (+) ou “ligeiramente solidificadas” (±). Os resultados deste experimento indicam que, adicionalmente ao grau de cristalinidade, o nível de sorção dinâmica de vapor de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro precisa ser um índice útil para realizar uma dificilmente solidificável. Os resultados acima também indicam que uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro com um teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo de 99,1 % ou maior porém menor do que 99,9 %, b.s.s., e com um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor, não é solidificada nas condições deste experimento.

[00142] O fato de que a amostra de teste n° 2 mostrou um nível de sorção dinâmica de vapor distintamente elevado, tão alto quanto de 1,70 % neste experimento sugere que a sorção de vapor é induzida principal mente por ácido ascórbico de 2-glicosídeo amorfo. Por outro lado, o fato de que a amostra de teste n° 1 mostrou um nível de sorção dinâmica de vapor inferior ao limite de detecção sugere que a amostra não contém substancial mente ácido ascórbico de 2-glicosídeo amorfo como a amostra de teste n° 2. Estes resultados coincidiram bem com os padrões de difração de raios-X em pó da amostra de teste n° 1 mostrados nas FIGs. 1 e 3 e eles corroboram que a amostra de teste n° 1 é uma amostra padrão apropriada para definir o valor analítico H100 para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, como uma base para calcular o grau de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro de acordo com Fórmula 1.

Experimento 4 Influência do resfriamento forçado sobre o grau de cristalinidade, nível de sorção dinâmica de vapor, e solidificação de composição particulada [00143] A partir dos resultados dos experimentos precedentes reve-lou-se que, em um composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, tanto o grau de cristalinidade e o nível de sorção dinâmica de vapor da composição particulada relacionam-se estreitamente com sua solidificação. Assim, neste experimento, examinou-se o que se segue; a influência do resfriamento forçado de uma composição particulada contendo cristais após as etapas de envelhecimento e secagem em sua produção sobre o grau de cristalinidade, o nível de sorção dinâmica de vapor, e a solidificação de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro.

Experimento 4-1 Preparação da amostra de teste [00144] Composições particuladas, preparadas De maneira análoga como na amostra de teste n° 2 no Experimento 1-1, foram espalhadas respectivamente em uma bandeja metálica e mantidas em uma câmara com temperatura e umidade constantes, controlada em 25X3 e uma umidade relativa de 90 % durante 16 horas para acelerar cristalização e cristalizar parcialmente a composição particulada resultante. Em seguida, a bandeja metálica foi retirada da câmara, secada a 40X3 durante oito horas, e resfriada sucessivamente de maneira não forçada durante cerca de duas horas para se obter a amostra de teste n° 10 ou resfriada forçadamente após secagem e, então, sopragem com ar a 20X3 durante 15 ou 40 min a uma composição particul ada na bandeja para se obter as amostras de teste números 11 e 12, respectivamente. As amostras de teste números de 10 a 12 foram encerradas respectivamente hermeticamente em um frasco com uma tampa e armazenadas em um dessecador com um dessecante até imediatamente antes de serem submetidas a testes analíticos.

Experimento 4-2 Medição da pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo [00145] As purezas do ácido ascórbico de 2-glicosídeo das amos- tras de teste números de 10 a 12 foram medidas por meio do método descrito no Experimento 1-2 e os resultados encontram-se na Tabela 4. A pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo da amostra de teste n° 1 foi copiada da Tabela 1.

Experimento 4-3 Medição do grau de cristalinidade e do nível de sorção dinâmica de vapor [00146] O grau de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e os níveis de sorção dinâmica de vapor das composições particuladas das amostras de teste números de 10 a 12 foram medidos por meio dos métodos descritos nos Experimentos 1 e 3, respectivamente. Os resultados encontram-se na Tabela 4. Os resultados para a amostra de teste n° 1 na Tabela 4 foram copiados das Tabelas 1 e 3.

Experimento 4-4 Teste de solidificação [00147] As amostras de teste números de 10 a 12 foram submetidas ao teste de solidificação como no Experimento 1-4. Os resultados são mostrados na coluna “solidificação” na Tabela 4 juntamente com o resultado da amostra de teste n° 1 descrita na Tabela 1.

Tabela 4 [00148] Como é evidente da Tabela 4, a amostra de teste n° 10, preparada por meio de resfriamento não-forçado após etapas de envelhecimento e secagem de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro obtido por meio de cristalização, apresentou um grau de cristalinidade de 88,1 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,06 %, e foi avaliada como sendo “solidificada” (+) por meio do teste de solidificação. Ao contrário, a amostra de teste n° 11, preparada por meio de resfriamento forçado por sopragem de ar a 20Ό durante 15 min após o envelhecimento e secagem de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, apresentou um grau de cristalinidade 91,5 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e um nível de sorção dinâmica de vapor inferior ao limite de detecção, e foi avaliada como sendo “Não solidificada” (-) por meio do teste de solidificação. De maneira análoga, amostra de teste n° 12, preparada por meio de resfriamento forçado por sopragem de ar a 20Ό durante 40 min após envel hecimento e secagem de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, apresentou um grau de cristalinidade de 94,1 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e um nível de sorção dinâmica de vapor inferior ao limite de detecção, e foi avaliada como sendo “Não solidificada” (-) por meio do teste de solidificação. Estes resultados indicam que a cristalização de uma composição particulada pode ser promovida por meio de resfriamento forçado ao invés de resfriamento não-forçado conduzido após etapas de enve- Ihecimento e secagem de uma composição particulada, significando que o resfriamento forçado é mais vantajoso do que o resfriamento não-forçado na preparação de uma composição particulada com um grau mais alto de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e um nível menor de sorção dinâmica de vapor, i.e., uma composição particulada dificilmente solidificável.

Experimento 5 Influência da pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo sobre a solidificação de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro [00149] A partir dos Experimentos acima revelou-se que, em uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro com uma pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo tão alta quanto 99,1 % ou maior, tanto o grau de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e o nível de sorção dinâmica de vapor respectivamente, relacionam-se estreitamente com a solidificação da composição particulada. Neste experimento, a relação entre a solidificação da composição particulada e a sua pureza de ácido L-ascórbico foi ainda mais investigada.

Experimento 5-1 Preparação da amostra de teste [00150] Amostras de teste números de 13 a 18, mostradas na Tabela 5, apresentando diferentes purezas de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, foram preparadas a partir de soluções aquosas contendo ácido L-ascórbico e dextrina, um tipo de substância amilácea, como descrito abaixo; e submetidas ao teste de solidificação de maneira semelhante ao Experimento 1-4.

[00151] Quatro partes em peso de “PINEDEX #100”, uma dextrina comercializada pela Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japão, foram dissolvidas em 15 partes em peso de água por meio de aquecimento. Em seguida, três partes em peso de ácido L-ascórbico foram misturadas com a solução. Sucessivamente, 100 unidades/g de dextrina de CGTase da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-62 e 250 unidades/g de dextrina de isoamilase, comercializada pela Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japão, foram misturadas com a solução acima e submetidas a uma reação enzimática enquanto se mantinha a solução resultante a um pH de 5,5 e uma temperatura de 55Ό durante 50 horas para formar ác ido ascórbico de 2-glicosídeo. É possível especular que ácidos a-glicosil-L-ascórbicos, como ácido 2-O-a-maltosil-L-ascórbico, ácido 2-O-a-maltotriosil-L-ascórbico, ácido 2-O-a-maltotetraosil-L-ascórbico, etc., precisam ser formados na solução de reação.

[00152] Após inativar as enzimas por meio de aquecimento, a solução de reação foi ajustada em pH 4,5, misturada com 50 unidades/g de dextrina de “GLUCZYME AF6”, um nome de produto de uma amostra de glucoamilase comercializada pela Amano Enzymes Inc., Aichi, Japão, e submetida a uma reação enzimática durante 24 horas para hidrolisar os acima indicados ácidos α-glicosil-L-ascórbico em ácido ascórbico de 2-glicosídeo e hidrolisar os oligossacarídeos concomitantes remanescentes em D-glicose. Após a reação, a solução de reação continha ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um rendimento de produção de 39 %.

[00153] A solução de reação foi aquecida para inativar glucoamilase, descolorida e filtrada com um carvão ativado, submetida a uma coluna de resina de troca catiônica (forma H+) para dessalinização e, então, submetida a uma resina de troca aniônica (forma OH-) para absorver ácido L-ascórbico e ácido ascórbico de 2-glicosídeo, seguido de lavagem da resina com água para remover D-glicose e alimentação de solução de ácido clorídrico 0,5 N para efetuar a eluição. O eluado foi concentrado para dar um teor de sólidos de cerca de 50 % e então submetido a cromatografia em coluna usando “DOWEX 50WX4” (forma Ca2+), um nome de produto de a resina de troca catiônica de ácido forte comercializada pela Dow Chemical Company. O eluado concentrado para dar um teor de sólidos de cerca de 50 % foi carregado na coluna em um volume de cerca de 1/50 vezes do volume de resina úmida na coluna, e introduzida com água refinada em um volume de 50 vezes do volume de carregamento do eluado a uma velocidade linear de 1 m/hora, seguido de fracionamento do eluado resultante em frações de 0,05 volume do volume da coluna. Em seguida, a composição de cada fração foi medida com HPLC descrita no Experimento 1-1, e coletou-se seis frações com um teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo de 80 %, b.s.s., ou maior, e foram concentradas in vacuo dando uma concentração de sólidos de cerca de 76 %. O concentrado resultante foi colocado em um cristalizador, misturado com amostra de teste n° 1, obtida no Experimento 1-1, como uma semente, em uma quantidade de dois porcento do teor de sólidos, b.s.s., seguido de resfriamento da temperatura da solução de 40“C a 15Ό ao longo de dois dias em condições delicadas de agitação para cristalizar o ácido ascórbico de 2-glicosídeo para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro.

[00154] Em seguida, de maneira convencional, amostras de teste números de 13 a 18, mostradas na Tabela 5, foram preparadas cole-tando-se cristais da massa cozida [massecuite] com uma centrífuga de tipo cesto mediante coleta de cristais da massa cozida por meio de uma centrífuga tipo cesto, lavagem dos cristais com uma pequena quantidade de água destilada, envelhecimento e secagem dos cristais lavados, sopragem com ar a 25Ό durante 30 min dos cristais envelhecidos e secos para resfriamento, e pulverização do resultante.

Tabela 5 [00155] Amostras de teste números 1 e 2 na Tabela 5 foram as mesmas que aquelas no Experimento 1-1, e as purezas do ácido ascórbico de 2-glicosídeo, os graus de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e os seus níveis de sorção dinâmica de vapor foram copiados dos resultados experimentais antecedentes. Adicionalmente, “AA2G”, um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, comercializada pela Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, que é um pó de classe quase-droga convencional, foi usado como amostra de teste n° 19. De acordo com os métodos descritos nos Experimentos precedentes, as purezas do ácido ascórbico de 2-glicosídeo, os graus de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e os níveis de sorção dinâmica de vapor das amostras de teste números de 13 a 19 foram medidas, e os resultados encontram-se na Tabela 5.

Experimento 5-2 Teste de solidificação [00156] As amostras de teste números de 13 a 19, obtidas no Experimento 5-1, foram testadas quanto a sua solidificação por meio do mé- todo similar ao do Experimento 1-4. Os resultados são mostrados na Tabela 5. Os resultados dos testes de solidificação para amostras de teste números 1 e 2 na Tabela 5 foram copiados da Tabela 1. Experimento 5-3 Teste da estabilidade ao armazenamento [00157] Para confirmar que o teste de solidificação conduzido no Experimento 1-4, etc., é um teste apropriado para avaliar a capacidade de solidificação de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro em condições práticas de armazenamento, a amostra de teste n° 1 obtida no Experimento 1-1, as amostras de teste números de 13 a 18 obtidas no Experimento 5-1, e a amostra de teste n° 19 foram submetidas a um teste de estabilidade ao armazenamento que é projetado considerando as condições, ambiente, e período de tempo de armazenamento efetivo de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. Frações de dez quilogramas de qualquer uma das amostras de teste números 1 e de 13 a 19 foram colocadas respectivamente em uma bolsa dupla de polietileno (80 mm por 600 mm). Em seguida, cada bolsa foi colocada em um recipiente em aço de 18 litros de tal modo a permitir que a parte aberta da bolsa se mantenha na vertical e seja aberta, permitindo-lhe permancer em pé sem fechar o recipiente de aço, e armazenada durante 45 dias nas condições de temperatura ambiente e livres de controle de umidade. Após armazenamento de 45 dias, cada bolsa de polietileno com qualquer uma das amostras de teste foi retirada do recipiente, e as amostras de teste foram retiradas das bolsas e colocadas em uma placa plana de plástico preto para observação macroscópica de suas capacidades de fluxo livre e graus de solidificação.

[00158] As amostras de teste foram avaliadas relativamente a sua solidificação por meio dos critérios a seguir: “Solidificada” (+); torta(s) é/são detectadas em uma amostra de teste e a capacidade de fluxo livre da amostra de teste diminuiu em comparação com aquela no início do teste. “Não solidificada” (-); nenhuma torta é detectada em uma amostra de teste e a capacidade de fluxo livre da amostra de teste não se modificou em comparação com aquela no início do teste. A forma de armazenamento de cada amostra de teste no teste de estabilidade ao armazenamento é a mesma que aquelas de pós de classe quase-droga, quando eles são distribuídos comercial mente e armazenados, exceto por não se fechar a abertura da bolsa com uma tira de elástico, não se introduzir qualquer dessecante, e não se armazenar em um recipiente de aço com uma tampa colocada sobre o mesmo. As três diferenças acima foram proporcionadas com o objetivo de determinar os ambientes para o teste de armazenamento ligeiramente mais severo do que aqueles das condições práticas comerciais de distribuição e armazenamento das composições particuladas. Os resultados também se encontram na Tabela 5.

[00159] Como mostrado na Tabela 5, exceto quanto à amostra de teste n° 2 consistindo substancialmente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo amorfo e amostra de teste n° 19, um pó de classe quase-droga, as amostras de teste remanescentes números 1ede13a18 tendem a aumentar seus graus de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro à medida que aumentam suas purezas de ácido ascórbico de 2-glicosídeo. No teste de solidificação, as amostras de teste números 13 e 14 com respectivas purezas de ácido ascórbico de 2-glicosídeo de 97,4 % e 98,0 % foram avaliadas como sendo “Solidificadas” (+) ou “Ligeiramente solidificadas” (±). Ao contrário, as amostras de teste números de 15 a 18 com uma pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo de 98,6 a 99,7 % foram avaliadas como sendo “Não solidificadas” (-). Estes resultados indicam que o valor de limiar da pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo que influencia a capacidade de solidificação situa-se em torno de 98,0 % e isto conclui que a pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo superior a 98,0 % é necessária para se obter uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro que é avaliada como sendo “Não solidificada” (-) pelo teste de solidificação.

[00160] Não se observou solidificação em amostras de teste números de 15 a 18 de maneira similar como na amostra de teste 1, embora as purezas do ácido ascórbico de 2-glicosídeo das amostras de teste números de 15 a 18 foram de 98,6 % a 99,7 %, que foram quase os mesmos níveis que aqueles da amostra de teste n° 19, um pó de classe quase-droga, com uma pureza de 98,9 %, e significativamente menor do que aqueles da amostra de teste n° 1, um pó de classe reagente consistindo substancialmente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. Para referência, os graus de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro das amostras de teste números de 15 a 18 foram de 91,6 % a 99,5 %, e a amostra de teste n° 19, um pó de classe quase-droga, apresentou 88,9 % até menos de 90 %. A partir destes resultados, foi possível concluir que o grau de cristalinidade para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro deveria ser tornado 90 % ou maior para se obter uma composição particulada desejada, contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro que é significativamente [mais] solidificável do que a amostra de teste n° 19, um pó de classe quase-droga.

[00161] Nas amostras de teste números 1 e de 13 a 18, verificou-se uma tendência de que seus níveis de sorção dinâmica de vapor diminuem à medida que aumentam suas purezas do ácido ascórbico de 2-glicosídeo. A amostra de teste n° 13 com um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,07 % foi avaliada como sendo “Solidificada” (+), e a amostra 14 e 19 com respectivos níveis de sorção dinâmica de vapor de 0,04 % e 0,03 % foram avaliadas como sendo “Ligeiramente solidi- ficadas” (±). Ao contrário, a amostra de teste n° 15 com um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % e amostras de teste números de 16 a 18 com níveis de sorção dinâmica de vapor inferiores ao limite de detecção foram avaliadas como sendo “Não solidificadas” (-). Estes resultados indicam que o nível de sorção dinâmica de vapor de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro deveria ser tornado 0,01 % ou menor para se obter uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro que apresenta uma capacidade de solidificação significativamente menor do que a amostra de teste n° 19, um pó de classe quase-droga.

[00162] Como mostrado na coluna inferior da Tabela 5, as amostras de teste números 13 e 14 com respectivas purezas do ácido ascórbico de 2-glicosídeo de 97,4 % e 98,0 % foram avaliadas como sendo “Solidificadas” (+) no teste de estabilidade ao armazenamento, em que elas foram armazenadas durante 45 dias em bolsas em quantidades respectivas de 10 kg/bolsa ao longo das linhas de sua forma de produtos efetivamente comercializados. Ao contrário, as amostras de teste números de 15 a 18 com uma pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo de 98,6 % a 99,7 % foram avaliadas como sendo “Não solidificadas” (-) similares aos resultados em seus testes de solidificação. Estes fatos indicam que o teste de solidificação como mostrado no Experimento 1-4, etc., é um teste apropriado para avaliar a solidificação de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro em circunstâncias práticas de armazenamento.

Experimento 6 Relação entre o grau de cristalinidade e o tamanho dos cristalitos da composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro [00163] De uma maneira geral, uma partícula pulverulenta de um pó contendo cristais é considerada como sendo construída por vários cristais simples, i.e., construída por cristalitos. Especula-se que quanto mais alto o grau de cristalinidade de um pó, tanto maior se torna o tamanho (diâmetro) de cada cristalito. Diz-se que o tamanho dos cristalitos acima é calculado com base na “fórmula Scherrer” mostrada na Fórmula [6] a seguir usando uma meia-largura de um pico de difração e um ângulo de difração, que são calculados com base nos perfis de difração de raios-X em pó. Um programa de computador para calcular referido tamanho de cristalitos é instalado em um analisador geral de difração de raios-X em pó. A amostra de teste n° 1, consistindo substancialmente de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, preparada no Experimento 1; amostra de teste n° 15, uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro preparada no Experimento 5 e apresentando uma pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo e um grau de cristalinidade para sua forma cristalina anidra, que se encontram relativamente próximos daqueles de pós de classe quase-droga convencionais; e a amostra de teste n° 19 usada no Experimento 5, um pó de classe quase-droga convencional, foram selecionadas e calculadas para determinação do tamanho dos cristalitos de uma única partícula porosa por meio do método a seguir: Fórmula [6]: D: Tamanho do cristalito ( ) λ: Comprimento de onda do raio-X ( ) β: Largura da linha de difração (rad) Θ: Ângulo de difração (°) K: Constante (0,9 quando se usa para β uma meia-largura (uma largu- ra plena a metade do máximo)) Método para calcular o tamanho do cristalito do ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro [00164] Os perfis de difração de raios-X em pó, que haviam sido usados para determinar os valores analíticos para os 2-glicosídeos de ácido ascórbico cristalino anidro nas respectivas amostras de teste números 1, de 15 e 19 no Experimento 1 ou 5, foram usados como perfis de difração de raios-X em pó para a base de calcular o tamanho do cristalito. A partir dos padrões de difração, mediante análise dos perfis de difração de raios-X em pó acima indicados, picos de difração com ângulos de difração (2Θ) em torno de 10,4°, 13,2°, 18,3°, 21,9° e 22,6°foram selecionados como picos de difração que são usados para calcular o tamanho do cristalito de um ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e são separáveis um do outro em uma região, a um ângulo relativamente menor que é reconhecido como apresentando uma influência menor sobre a largura do pico de difração originada da cepa não-uniforme de cristalito em uma partícula porosa. Usando “X’ pert Highscore Plus”, um programa de computador de processamento analítico instalado em um analisador de difração de raios-X em pó, os perfis de difração de raios-X em pó das respectivas amostras de teste foram processados para determinar as meias-larguras e ângulos de difração (2Θ) dos cinco picos de difração selecionados, que foram então calibrados com base nas medições obtidas com, como um padrão, silício (“SÍ640C”, uma amostra padrão de difração de raiox-X, proporcionado pelo National Institute of Standards and Technology (NIST) nos E.U.A.. Com as meias-larguras calibradas e ângulos de difração (2θ), o tamanho do cristalito do ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro em cada amostra de teste foi calculado com o programa da fórmula “Scherrer” no programa [software] de computador. Os resultados encontram-se na Tabela 6. O tamanho do cristalito de cada amos- tra de teste foi uma média dos dados calculados dos cinco picos de difração selecionados, respectivamente. A pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo e o grau de cristalinidade de seu cristal anidro somente são copiados daqueles na Tabela 5. Para referência, como os padrões de difração de raios-X em pó das amostras de teste números 15 e 19 foram, ambos detectados em ângulos de difração (20) na faixa de 4° a 65° como picos de difração claros e agudos caracter ísticos do ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e os padrões de difração coincidiram bem com o padrão de difração de raios-X em pó (FIG. 1) da amostra de teste n° 1, sendo que isto foi avaliado como sendo razoável para comparar as amostras de teste, cada uma baseada em seus dados calculados para o tamanho de cristalito do ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro contido em cada amostra de teste, baseado nos padrões de difração de raios-X em pó destas amostras de teste.

Tabela 6 [00165] Como verificado na Tabela 6, o tamanho do cristalito do ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da amostra de teste n° 1 com um grau de cristalização de 100 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro foi calculado como sendo de 1.770 À. O tamanho do cristalito do ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da amostra de teste n° 15 com um grau de cristalização de 91,6 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro foi calculado como sendo de 1.440 Â. Adicionalmente, o tamanho do cristalito do ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da amostra de teste n° 19 com um grau de cristalização de 88,9 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro foi calculado como sendo de 1.380 Â. Quanto maior o grau de cristalinidade do ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, tanto maior se torna o tamanho do cristali-to, e isto revela que, entre estes três tipos de amostras de teste, há uma relação entre o grau de cristalinidade e o tamanho do cristalito. Experimento 7 Relação entre a potência de redução e o acastanhamento da composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro [00166] As amostras de teste usadas nos Experimentos acima foram, todas, composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro preparadas de soluções contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo obtido através da etapa de permitir que CGTase atue sobre soluções contendo ácido L-ascórbico e substância amilácea. Quando se usa referido processo de produção, as composições particuladas resultantes conterão ácido L-ascórbico e D-glicose como concomitantes específicos para o processo de produção independentemente da quantidade de referidos concomitantes. Como ambos, o ácido L-ascórbico e a D-glicose, apresentam redutibilidade, composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, variando dependendo da quantidade de ácido L-ascórbico e D-glicose, possivelmente podem causar acastanhamento (coloração) desvantajoso nos produtos finais quando usados em produtos contendo compostos com um grupo amino, como proteínas e aminoácidos. Em particular, como o ácido L-ascórbico apresenta uma reatividade relativamente alta com o oxigênio, especula-se que o ácido L-ascórbico precisa ser causativo de induzir não só coloração desfavorável em produtos contendo o mesmo, mas também um causativo da coloração de pós de classe quase-droga convencionais em si mes- mos, que ocasional mente foram observados convencionalmente quando os pós de classe quase-droga convencionais foram armazenados durante um período de tempo relativamente longo.

[00167] Assim, neste experimento, amostras de teste números 1 e de 15 a 19, que haviam sido usadas nos Experimentos precedentes, foram examinadas quanto à relação entre o teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose, teor de ácido L-ascórbico, e a Potência de redução da composição particulada como um todo, e a coloração por um teste acelerado de tratamento com calor de acordo com os procedimentos a seguir: [00168] Cento e cinquenta miligramas de cada amostra de teste foram pesados e colocados em um tubo de ensaio de 10 ml com uma tampa rosqueada, e os tubos de ensaio, em uma condição fechada, com a tampa rosqueada foram colocados em [forno de secagem] “DRYING-OVEN SA310”, um nome de produto de um forno comercializado pela Masuda Corp., Osaka, Japão, e aquecidos a 80Ό durante três dias. Subsequentemente, após remoção das tampas rosqueadas dos tubos de ensaio, adicionou-se três mililitros de água deionizada em cada um dos tubos para dissolver as amostras. As soluções resultantes foram medidas quanto à absorbância a 400 nm usando “UV-2400PC”, um nome de produto de um espectrofotômetro comercializado pela Shimadzu Corp., Kyoto, Japão. O grau de coloração causado foi avaliado por meio de aquecimento com base nos dois critérios a seguir: Quando uma absorbância em um comprimento de onda de 400 nm é menor do que 0,50, avalia-se como sendo “não acastanhada ou substancial mente não acastanhada” (-); e absorbância em um comprimento de onda de 400 nm sendo de 0,50 ou maior, “acastanhada” (+). Os resultados encontram-se na Tabela 7.

[00169] O teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose em cada amostra de teste foi determinado com HPLC descrita no Experimento 1-1. A Potência de redução da composição particulada como um todo de cada amostra de teste foi determinada medindo-se as quantidades de açúcares redutores e o total de açúcares por meio do método de Somogyi-Nelson e o método da antrona-ácido sulfúrico geralmente usados na arte, respectivamente, usando D-glicose como uma substância padrão; e calculando-se a Potência de redução por meio de substituição dos dados na Fórmula 3 previamente indicada. O teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose, o teor de ácido L-ascórbico, e a Potência de redução da composição particulada como um todo para cada amostra são mostrados na Tabela 7.

Tabela 7 [00170] Como mostrado na Tabela 7, em composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, os teores de ácido L-ascórbico e D-glicose na amostra de teste n° 1, um pó de classe reagente substancialmente consistindo de ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro foram, todos, tão baixos ou mais baixos do que seus limites de detecção. Ao contrário, ácido L-ascórbico e/ou D-glicose foram detectados em quaisquer das amostras de teste números de 12 a 18 como as composições particuladas contendo ácido as- córbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção, e amostra de teste n° 19, um pó de classe quase-droga convencional. Em referidos pós, como evidente das amostras de teste números de 15 a 18, aqueles com um teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose não superior a 0,2 %, b.s.s., foram avaliados como sendo “não acastanhados ou substancial mente não acastanhados” (-); enquanto que, como evidente da amostra de teste n° 19, aquele com um teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose atingindo 0,3 %, b.s.s., foi avaliado como sendo “acastanhado” (+). Quanto ao ácido L-ascórbico que é considerado como sendo mais fortemente relacionado com a coloração de pós, como evidente das amostras de teste números de 15 a 18, quando o teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose é de 0,2 % ou menor, b.s.s., eles foram avaliados como sendo “não acastanhados ou substancialmente não acastanhados” (-); enquanto que, como é evidente da amostra de teste n° 19, quando o teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose atinge 0,3 %, b.s.s., isto foi avaliado como sendo “acastanhado” (+). Para referência, como já mencionado, como o ácido L-ascórbico apresenta uma reatividade relativamente elevada com o oxigênio e refere-se à coloração de composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, aquelas com um teor de ácido L-ascórbico não superior a 0,1 %, b.s.s., encontram-se além da preocupação de causar coloração mesmo quando armazenados durante um período de tempo relativamente longo na forma de produto de pós de classe quase-droga convencionais.

[00171] Do ponto de vista da Potência de redução, como evidente das amostras de teste números de 15 a 18, aqueles com uma Potência de redução da composição particulada, como um todo, menor do que um porcento foram avaliados como sendo “não acastanhados ou substancial mente não acastanhados” (-). Ao contrário, como evidente da amostra de teste n° 19, amostras de teste com uma Potência de re- dução da composição particulada, como um todo, acima de um porcento foram avaliados como sendo “acastanhados” (+). Estes resultados foram bem coincidentes com os resultados acima obtidos por meio de avaliação com um índice do teor total de ácido L-ascórbico e D-glicose.

[00172] Os resultados acima indicam que composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro livres da preocupação de causar coloração podem ser obtidas controlando-se as potências de redução de todas as suas composições particuladas a um nível inferior a um porcento ainda que elas contenham inevitavelmente ácido L-ascórbico e/ou D-glicose em um nível detectável em virtude de seus processos de produção. Considerando ambos os aspectos da coloração, não só dos produtos finais preparados com composições particuladas, mas também das composições particuladas per se, os resultados acima mostram que o teor de ácido L-ascórbico em composições particuladas deveria ser, de preferência, de 0,1 %, b.s.s., ou menor.

[00173] Os exemplos a seguir explicam a presente invenção em maior detalhe, mas a presente invenção jamais deveria restringir-se aos mesmos.

Exemplo 1 Preparação de solução bruta de CGTase [00174] A cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-62 (FERM BP-11143, um número de depósito no National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology) foi cultivada com [agar nutriente] “NUTRIENT AGAR”, um meio de cultura inclinado, comercializado pela Difco Laboratories, Inc., a 50Ό durante dois dias. Uma alça das células cultivadas, coletadas do meio de cultura inclinado, foi inoculada em um meio líquido de semeadura, contendo 2 % do amido solúvel, 0,5 % de cloreto de amônio, 0,05 % de hidrogeniofosfato de potássio, 0,025 % de sulfato de magnésio, e 0,5 % de carbonato de cálcio, cultivado a 50X3 para trê s dias com agitação. A cultura de sementes resultante foi inoculada em um meio de cultura principal apresentando a mesma composição que o meio de cultura de sementes, exceto quanto à substituição do amido solúvel por dextrina, e cultivado adicionalmente a 50X3 durante três dias com agitação. As células foram removidas da cultura resultante por meio de centrifugação, e o sobrenadante resultante foi concentrado com uma membrana de UF até dar um volume de cerca de 1/18 do mesmo para se obter uma solução bruta de CGTase.

Preparação de composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro [00175] Quatro partes em peso de amido de batata liquefeito foram dissolvidas em 20 partes em peso de água por meio de aquecimento, e a solução foi misturada com três partes em peso de ácido L-ascórbico e ajustada em pH 5,5 para uso como uma solução de substrato. A solução de substrato foi misturada com a solução de enzima CGTase bruta indicada acima em uma quantidade de 100 unidades/g de sólidos do amido de batata liquefeito e isoamilase produzida pela Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japão, em uma quantidade de 250 unidades/g de sólidos do amido de batata liquefeito, e isto foi reagido enzimaticamente a 55X3 durante 40 horas para formar, juntamente com o ácido ascórbico de 2-glicosídeo, ácidos a-glicosil-L-ascórbicos, como ácido 2-O-a-maltosil-L-ascórbico, ácido 2-O-a-maltotriosil-L-ascórbico, e ácido 2-O-a-maltotetraosil-L-ascórbico.

[00176] Após inativar a enzima por meio de aquecimento, a solução foi ajustada em pH 4,5, misturada com “GLUCZYME AF6”, um nome de produto de uma amostra de glucoamilase (6.000 unidades/g), comercializada pela Amano Enzyme, Inc., Aichi, Japão, em uma quantidade de 50 unidades/g de sólidos do amido de batata liquefeito, e rea- gida a 55Ό durante 24 horas para degradar ácidos a-glicosil-L-ascórbico em ácido ascórbico de 2-glicosídeo e para degradar os sacarídeos concomitantes em D-glicose. O rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo na solução de reação foi de cerca de 39 %. A solução de reação continha ácido 5-O-a-glucosil-L-ascórbico e ácido 6-O-a-glucosil-L-ascórbico em um teor total de cerca de 0,1 %, b.s.s.

[00177] Após inativar a enzima por meio de aquecimento, a solução foi descolorida e filtrada com um carvão ativado, e o filtrado foi dessalinizado com uma resina de troca catiônica (forma H+). Em seguida, o ácido L-ascórbico e ácido ascórbico de 2-glicosídeo na solução dessa-linizada foram deixados adsorver sobre uma resina de troca aniônica (forma OH ), lavados com água para remover a D-glicose, e eluídos com solução de ácido clorídrico 0,5 N. O eluado foi concentrado dando uma concentração de conteúdo sólido de cerca de 50 % e submetido a uma cromatografia em coluna de leito móvel simulado usando 10 colunas empacotadas com “DIAION UBK550” (forma Na+), um nome de produto de uma resina de troca catiônica de ácido forte comercializada pela Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Japão. O eluado, que havia sido concentrado dando uma concentração de conteúdo sólido de cerca de 50 %, foi introduzido na coluna em uma quantidade de cerca de 1/40 vezes o volume da resina úmida, e introduzido com um eluente em uma quantidade de cerca de 15 vezes em volume do volume introduzido para eluir o ácido ascórbico de 2-glicosídeo, seguido de coleta de uma fração rica em ácido ascórbico de 2-glicosídeo mas deficiente de ácido L-ascórbico. A fração continha 92,2 % do ácido ascórbico de 2-glicosídeo, b.s.s.

[00178] Após a fração ser concentrada sob uma pressão reduzida a cerca de 72 % do concentrado, que então foi colocada em um cristalizador e misturada com “2-GLICOSÍDEO DE ÁCIDO ASCÓRBICO 999” (código n°: AG124, uma pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo de 99,9 % ou maior), um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, comercializada como um reagente analítico padrão pela Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, como uma semente, em uma quantidade de dois porcento dos teores sólidos. Em seguida, a solução de mistura foi ajustada em 40*0 e resfriada gradualmente a 15Ό ao longo de dois dias em condições de agitação delicada para cristalizar ácido ascórbico de 2-glicosídeo de modo a formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro.

[00179] Os cristais foram recolhidos com um centrífuga de tipo cesto, lavados por meio de pulverização de uma pequena quantidade de água refinada fria, envelhecidos e secados a 38Ό d urante três horas, resfriados por meio de sopragem de ar a 25Ό durante 45 min, e pulverizados para se obter uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que apresentou uma pureza de 99,5 % de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, uma quantidade total de 0,1 % de ácido L-ascórbico e D-glicose, um conteúdo inferior a 0,1 % de ácido L-ascórbico, um grau de cristalinidade de 97,0 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e uma Potência de redução total da composição particulada como um todo sendo de 0,25 %. O nível de sorção dinâmica de vapor da composição particulada foi menor do que o limite de detecção. Quando medida quanto à distribuição de partículas, a composição particulada continha partículas com um tamanho de partículas inferior a 150 pm em uma quantidade de 91,2 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 pm ou mais, porém menor do que 150 pm em uma quantidade de 50,2 %. Quando submetida ao mesmo teste de solidificação e teste de acastanhamento como nos Experimentos 1-4 e 7, respectivamente, a composição particulada foi avaliada como sendo “Não solidificada” (-) no teste de solidi- ficação e “não acastanhada ou substancial mente não acastanhada” (-) no teste de acastanhamento.

[00180] A composição particulada é facilmente manuseável porque dificilmente se solidifica e apresenta uma colorabilidade menor em comparação com “AA2G”, um nome de produto de um pó de classe quase-droga convencional comercializado pela Hayashibara Bioche-mical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, comercializado convencionalmente como um ingrediente branqueador da pele em um grau para uso em quase-drogas, etc. Como a composição particulada não difere dos pós de classe quase-droga convencionais pelo fato de que é uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, de maneira semelhante aos pós convencionais indicados acima, ela pode ser usada sozinha ou em combinação com outros ingredientes como um material poroso para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, farmacêuticos, etc. Como ela apresenta um teor de ácido L-ascórbico de 0,1 % ou menor, não há receio de causar coloração na composição particulada per se mesmo quando a composição é armazenada durante um período de tempo relativamente longo na mesma forma de produto que pós de classe quase-droga convencionais.

Exemplo 2 Preparação de solução bruta de CGTase [00181] Uma solução bruta de CGTase foi preparada de maneira semelhante ao Exemplo 1 exceto quanto ao uso da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-27 (FERM BP-11142, um número de depósito no National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology) em lugar da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-62.

Preparação de composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-qlicosídeo cristalino anidro [00182] Cinco partes em peso de amido de milho foram adicionados a 15 partes em peso de água e então dissolvidos ali por meio de aquecimento após a adição de uma enzima liquefaciente comercializada. A solução resultante foi misturada com três partes em peso de ácido L-ascórbico e ajustada em pH 5,5 dando uma solução de substrato. À solução de substrato adicionou-se a solução bruta de CGTase acima e isoamilase produzida pela Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, em quantidades respectivas de 100 unidades e 1.000 unidades/g de sólido do amido de milho, seguido de uma reação enzimática a 55X3 durante 50 horas para form ar ácido ascórbico de 2-glicosídeo e outros ácidos a-glicosil-L-ascórbicos.

[00183] Após inativar a enzima por aquecimento, a solução de reação foi ajustada em pH 4,5, misturada com “GLUCOZYME #20000”, um nome de produto de uma amostra de glucoamilase com uma atividade de 20.000 unidades/g, comercializada pela Nagase ChemteX Corp., Osaka, Japão) em uma quantidade de 50 unidades/g de sólido do amido de milho, e reagida a 55X3 durante 24 horas para degradar ácidos α-glicosil-L-ascórbicos, como ácido 2-O-a-maltosil-L-ascórbico, ácido 2-O-a-maltotriosil-L-ascórbico, e ácido 2-O-a-maltotetraosil-L-ascórbico em ácido ascórbico de 2-glicosídeo; e para degradar os sa-carídeos concomitantes em D-glicose. A solução de reação resultante continha ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um rendimento de produção de cerca de 37 %. Da mesma forma, a solução de reação continha ácido 5-O-a-glucosil-L-ascórbico ácido 6-O-a-glucosil-L-ascórbico numa quantidade total de cerca de 0,2 %.

[00184] Após inativar a enzima por meio de aquecimento, a solução de reação foi descolorida e filtrada com um carvão ativado. O filtrado foi dessalinizado com uma resina de troca catiônica (forma H+), e introduzido em uma resina de troca aniônica (forma OH ) para adsorver sobre si ácido L-ascórbico e ácido ascórbico de 2-glicosídeo, seguido de lavagem da resina de troca aniônica com água para remover D-glicose, e introdução da solução de ácido clorídrico 0,5 N à resina para eluição. O eluado foi conduzido à cromatografia em coluna usando “TOYOPEARL HW-40”, um nome de produto de uma resina porosa da Tosoh Corp., Tokyo, Japão, para coletar uma fração rica em ácido ascórbico de 2-glicosídeo, mas deficiente de ácido L-ascórbico. A fração coletada continha 89,5 %, b.s.s., de ácido ascórbico de 2-glicosídeo. [00185] A fração foi concentrada numa pressão reduzida em um concentrado a aproximadamente 76 %, que então foi colocado em um cristalizador e misturado com a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro preparado no Exemplo 1, como uma semente, em uma quantidade de dois porcento dos teores sólidos. Em seguida, a mistura resultante foi aquecida a 40Ό e então resfriada gradual mente a 15Ό ao longo de dois dias com agitação cuidadosa para cristalizar ácido ascórbico de 2-glicosídeo para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro.

[00186] Os cristais foram coletados com o uso de uma centrífuga do tipo cesto, lavados pulverizando-se uma pequena quantidade de água destilada, envelhecendo-se e secando o resultante a 35Ώ durante oito horas, resfriando-se por meio de sopragem com ar a 25Ό durante 15 min ao produto resultante, e pulverizando o produto resfriado para obter uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que apresentou uma pureza de 99,2 % de ácido ascórbico de 2-glicosídeo, uma quantidade total inferior a 0,1 % de ácido L-ascórbico e D-glicose, um teor inferior a 0,1 % de ácido L-ascórbico, um grau de cristalinidade de 94,4 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e uma Potência de redução total da composição particulada como um todo sendo de 0,15 %. A composição particulada apresentou um nível de sorção dinâmica de vapor inferior ao limite de detecção. Medição da distribuição das partículas da composição particulada revelou que ela continha partículas com tamanhos de partículas inferiores a 150 pm em uma quantidade de 83,2 % e aquelas com tamanhos de partículas de 53 pm ou maior, porém menor do que 150 pm em uma quantidade de 57,1 %. Quando submetida ao mesmo teste de solidificação e teste de acastanhamento como nos Experimentos 1-4 e 7, respectivamente, a composição particulada foi avaliada como sendo “Não solidificada” (-) no teste de solidificação e “não acastanhada ou substancialmente não acastanhada” (-) no teste de acastanhamento.

[00187] A composição particulada é facilmente manuseável porque ela dificilmente solidifica e apresenta uma menor colorabilidade em comparação com “AA2G” convencional, um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro comercializada pela Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, em uma classe para uso em quase-drogas como um ingrediente para branqueamento da pele, etc. Como a composição particulada não difere de pós de classe quase-droga convencionais pelo fato de que ela é uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, ela pode ser usada sozinha ou em combinação com outros ingredientes como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, farmacêuticos, etc., de maneira semelhante aos pós convencionais acima. Como a composição particulada apresenta um teor de ácido L-ascórbico de 0,1 % ou menor, não há receio de causar coloração na composição particulada per se mesmo quando a composição é armazenada durante um período de tempo relativamente longo na mesma forma de produto que pós de classe quase-droga convencionais.

Exemplo 3 Preparação de mutante de CGTase [00188] A CGTase da cepa de Geobacillus stearothermophilus (co- nhecida como Bacillus stearothermophilus na classificação precedente) Tc-91 foi clonada [] seu gene e determinou-se a sua sequência de aminoácidos de CGTase madura (SEQ ID NO: 1) com base na sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 2). A CGTase madura tem sido conhecida como possuindo, em sua sequência de aminoácidos, quatro regiões conservadas que haviam sido reconhecidas como existindo comumente nas enzimas classificadas na família de α-amilase. A estrutura estérica da proteína de CGTase já foi determinada por meio de análise cristalográfica de raios-X e revelou possui quatro domínios, A, B, C e D como mostrado na FIG. 5 (ver “Kogyo-yo-Toshitsu-Koso-Handbook", pp. 56-63, Kodansha Scientific K.K. Ed., Tokyo, Japão (1999)). Três grupos catalíticos da CGTase, i.e. 225° ácido aspártico (D225), 253° ácido glutâmico (E253), e 324° ácido aspártico (D324) da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 foram identificados (ver “Kogyo-yo-Toushitsu-Koso-Handbook”, pp. 56-63, Kodansha Scientific K.K. Ed., Tokyo, Japão (1999)). A FIG. 6 é um diagrama esquemático da estrutura primária da CGTase. Induzindo uma mutação no DNA do gene da CGTase por meio dos procedimentos a seguir obteve-se um mutante de CGTase, que apresenta uma maior produtividade de ácido ascórbico de 2-glicosídeo do que a CGTase do tipo selvagem.

[00189] O gene CGTase da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91 (depositada sob o número de acesso FERM P-2225 e, sob procedimento de transferência ao Depósito Internacional sob o número de acesso FERM ABP-11273 no Repositório de Organismos de Patentes Internacionais no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology), mantido pelos presentes inventores, foi mutado por indução ou deleção de sítios de divagem de enzimas de restrição sem alterar a sequência de aminoácidos da CGTase e recombinado com um vetor plasmídico para torná-lo um DNA recombinante contendo o gene codificando a CGTase de tipo selvagem. A estrutura do DNA re- combinante, “pRSET-iBTC12”, como mostrado na FIG. 7. Fragmentos de gene (fragmentos de Nde l-EcoT22l), contendo uma região que codifica sítio ativo da CGTase de tipo selvagem no DNA recombinante acima, foram obtidos por meio de digestão do DNA recombinante, e mutando-se aleatoriamente os resultantes in vitro usando o kit “Gene-Morph PCR Mutagenesis Kit” (um nome de produto de um kit de mutação de PCR comercializado pela Stratagene Company). Os fragmentos mutados foram inseridos no DNA recombinante original para preparar misturas de genes, que codificam variantes de CGTase com várias substituições de aminoácidos. DNAs recombinantes foram obtidos por meio de recombinação dos genes variantes com um vetor de expressão plasmídico. Com os DNAs recombinantes, células coliformes foram transformadas para obter uma biblioteca gênica das variantes de CGTase.

[00190] Mais de 13.000 cepas de transformantes foram isoladas da biblioteca gênica e cultivadas para obter células, e das quais preparou-se soluções de lise como enzimas brutas contendo variantes de CGTase. As enzimas brutas foram deixadas atuarem sobre uma solução aquosa contendo ácido L-ascórbico e hidrolisados de amido parciais para formar ácidos α-glicosil-L-ascórbicos, que foram então tratados com glucoamilase para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo. Comparando-se os rendimentos de produção de ácidos a-glicosil-L-ascórbicos com aqueles da CGTase de tipo selvagem, selecionou-se transformantes capazes de produzir um mutante de CGTase apresentando maior produtividade de ácido ascórbico de 2-glicosídeo. Consequentemente obteve-se um transformante desejado apresentando um gene do mutante de CGTase desejado. A sequência de nucleotídeos do gene mutante de CGTase do transformante foi decodificada e revelou que o 228° radical lisina na sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 foi substituída com radical de ácido glutâmico.

[00191] O transformante contendo o gene ou o DNA que codifica o mutante de CGTase acima foi cultivado com meio T contendo 100 μΙ/ml de ampicilina de sódio (contendo 12 g de Bacto-Trypton, 24 g de extrato de levedura Bacto, 5 ml de glicerol, 17 mM de fosfato de mo-nopotássio, e 72 mM de fosfato de dipotássio por litro do meio) a 370 durante 24 horas em uma condição aeróbica. As células coletadas da cultura por centrifugação foram disrompidas com o “ULTRA SONIC HOMOGENIZER UH-600” (um disruptor ultrassônico produzido pela SMT Co., Ltd.), e o sobrenadante foi tratado com aquecimento a 600 durante 30 min para inativar ou desnaturar as proteínas não-resistentes ao calor inerentes às células hospedeiras. O sobrenadante tratado com calor foi centrifugado adicionalmente para preparar uma amostra parcial mente purificada do mutante de CGTase.

Preparação de composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-qlicosídeo cristalino anidro [00192] Cinco partes em peso de amido de batata foram misturadas com 15 partes em peso de água e então dissolvidas ali por meio de aquecimento após a adição de uma enzima liquefaciente de amido comercializada. A solução foi misturada com três partes em peso de ácido L-ascórbico e ajustada em pH 5,5 dando uma solução de substrato. A solução de substrato foi misturada com o mutante de CGTase parcialmente purificado obtido por meio do método acima em uma quantidade de 20 unidades/g de amido de batata e reagida a 650 durante 72 horas para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo e ácidos a-glicosil-L-ascórbicos. Em seguida, a reação foi aquecida para inativar o mutante de CGTase remanescente. À solução adicionou-se “GLUCOZYME #20000” (um nome de produto de uma glucoamilase com uma atividade de 20.000 unidades/g comercializada pela Nagase ChemteX Corp., Osaka, Japão) em uma quantidade de 100 unidades/g de amido de batata, seguido de uma reação enzimática a pH 5,0 e 40Ό durante cerca de 18 horas para degradar ácidos a-glicosil-L-ascórbicos em ácido ascórbico de 2-glicosídeo e para degradar os sacarídeos concomitantes em D-glicose. A solução de reação continha ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um rendimento de produção de cerca de 40 %, e continha ácido 5-O-a-glucosil-L-ascórbico e ácido 6-Ο-α-glucosil-L-ascórbico numa quantidade total de cerca de 0,3 %. [00193] Após inativar a glucoamilase remanescente por aquecimento, a solução de reação foi descolorida e filtrada com um carvão ativado, e o filtrado foi concentrado, e introduzida em uma resina de troca aniônica (forma OH ) para adsorver sobre si ácido L-ascórbico e ácido ascórbico de 2-glicosídeo, seguido de lavagem da resina com água para remover D-glicose e permitir a realização de eluição com solução de ácido clorídrico 0,5 N. De maneira análoga ao Exemplo 1, o eluado resultante foi conduzido à cromatografia em coluna de leito móvel simulado usando uma resina de troca catiônica de ácido forte para coletar uma fração rica em ácido ascórbico de 2-glicosídeo, mas deficiente de ácido L-ascórbico. A fração coletada continha 90,4 %, b.s.s., de ácido ascórbico de 2-glicosídeo.

[00194] Após dessalinizar com uma resina de troca catiônica (forma H+), a fração foi concentrada sob pressão reduzida a um concentrado de aproximadamente 75 %, que então foi colocado em um cristalizador e misturado com a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo preparado no Exemplo 1, como uma semente, em uma quantidade de dois porcento do teor de sólidos. Em seguida, o concentrado foi ajustado em 45Ό e gradualmente resfriado a 10Ό ao longo de dois dias em condições de agitação delicada para cristalizar ácido ascórbico de 2-glicosídeo para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. Os cristais foram recolhidos, lavados por meio de pulverização de uma pequena quantidade de água deionizada fria, envelhecidos e secados a 38Ό durante três horas, resfriados de maneira não forçada de um dia para o outro, e pulverizados para obter uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que apresentou uma pureza de cerca de 98,8 %, continha menos de 0,1 % de ácido L-ascórbico e D-glicose no total, continham menos de 0,1 % de ácido L-ascórbico, apresentaram um grau de cristalinidade de 93,5 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e apresentaram uma Potência de redução total da composição particulada como um todo sendo de 0,31 %. O nível de sorção dinâmica de vapor da composição particulada foi inferior ao limite de detecção. A medição da distribuição das partículas da composição particulada revelou que ela continha partículas com tamanhos de partículas menores que 150 pm em uma quantidade de 93,1 % e com tamanhos de partículas de 53 pm ou mais porém menores do que 150 pm em uma quantidade de 48,2 %. Quando submetida ao mesmo teste de solidificação e teste de acastanhamento como nos Experimentos 1-4 e 7, respectivamente, a composição particulada foi avaliada como sendo “Não solidificada” (-) no teste de solidificação e “não acastanhada ou substancial mente não acastanhada” (-) no teste de acastanhamento. [00195] A composição particulada é facilmente manuseável porque dificilmente solidifica e menos cores são comparadas com “AA2G” convencional, um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro comercializada pela Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, em um grau para uso em quase-drogas como um ingrediente para branqueamento da pele, etc. Como a composição particulada não difere dos pós de classe quase-droga convencionais pelo fato de que é uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, ela pode ser usada sozinha ou em combinação com outros ingredientes como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, farmacêuticos, etc., de maneira semelhan- te aos pós convencionais acima. Como a composição particulada apresenta um teor de ácido L-ascórbico de 0,1 % ou menor, a composição particulada per se é livre de receio de causar coloração mesmo quando armazenada durante um período de tempo relativamente longo na mesma forma de produto que pós convencionais em uma classe para quase-drogas. Como a composição particulada têm um teor de ácido L-ascórbico de 0,1 % ou menor, não há receio de causar coloração na composição particulada per se mesmo que a composição seja armazenada durante um período de tempo relativamente longo na mesma forma de produto como pós de classe quase-droga convencionais.

Exemplo 4 Preparação de composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro [00196] Uma reação enzimática foi realizada por meio do método de maneira semelhante ao Exemplo 3 exceto por permitir que 500 uni-dades/g de sólidos de amido de isoamilase (produzido pela Hayashibara Co., Ltd., Okayama, Japão) atuem sobre o amido a 55X3 juntamente com a CGTase. Após o tratamento de glucoamilase, a solução de reação continha ácido ascórbico de 2-glicosídeo com um rendimento de produção de cerca de 45 %. A solução de reação continha ácido 5-O-a-glucosil-L-ascórbico e ácido 6-O-a-glucosil-L-ascórbico numa quantidade total de cerca de 0,2 %. A solução de reação foi purificada de maneira semelhante ao Exemplo 3 para coletar uma fração com um teor de ácido ascórbico de 2-glicosídeo de 91,8 %, b.s.s.

[00197] Após cristalização conduzida de maneira semelhante ao Exemplo 3, os cristais resultantes foram coletados, lavados por meio de pulverização de uma pequena quantidade de água deionizada fria, envelhecidos e secados a 38X3 durante três horas, resfriados de maneira não forçada de um dia para o outro, e pulverizados para obter uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, que apresentou uma pureza de 99,2 %, continha menos de 0,1 % de ácido L-ascórbico e D-glicose no total, continha menos de 0,1 % de ácido L-ascórbico, apresentou um grau de cristalinidade de 95,6 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e apresentou uma Potência de redução total de 0,25 %. O nível de sorção dinâmica de vapor da composição particulada foi inferior ao limite de detecção. A medição da distribuição das partículas da composição particulada revelou que ela continha partículas com tamanhos de partículas inferiores a 150 pm em uma quantidade de 92,7 % e aquelas com tamanhos de partículas de 53 pm ou mais, porém menores do que 150 pm em uma quantidade de 44,2 %. Quando submetida ao mesmo teste de solidificação e teste de acastanhamento como nos Experimentos 1-4 e 7, respectivamente, a composição particulada foi avaliada como sendo “Não solidificada” (-) no teste de solidificação e “não acastanhada ou substancialmente não acastanhada” (-) no teste de acastanhamento.

[00198] A composição particulada é facilmente manuseável porque dificilmente solidifica e [] menos cores em comparação com “AA2G” convencional, um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro comercializada pela Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, em uma classe para uso em quase-drogas como um ingrediente para branqueamento da pele, etc. Como a composição particulada não difere dos pós de classe quase-droga convencionais pelo fato de que é uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, ela pode ser usada sozinha ou em combinação com outros ingredientes como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, farmacêuticos, etc., de maneira semelhante aos pós convencionais. Como a composição particulada apresenta um teor de ácido L-ascórbico de 0,1 % ou menor, não há receio de causar coloração na composição particulada per se mesmo que a composição seja armazenada durante um período de tempo relativamente longo na mesma forma de produto que pós de classe quase-droga convencionais.

Exemplo 5 Preparação de composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-qlicosídeo cristalino anidro [00199] Cinco partes em peso de amido de batata foram adicionadas a 15 partes em peso de água e então dissolvidas ali por meio de aquecimento após a adição de uma enzima liquefaciente de amido comercializada. A solução foi misturada com três partes em peso de ácido L-ascórbico e ajustada em pH 5,5 dando uma solução de substrato. A solução de substrato foi misturada com CGTase (produzida pela Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, derivada da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91 (depositada sob o número de acesso FERM P-2225 e mediante transferência para o Depósito Internacional sob o número de acesso FERM ABP-11273 no Depositório de Organismos de Patente Internacional no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) e isoamilase (produziram pela Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão) em quantidades respectivas de 100 unidades e 1.000 unidades por grama do amido de batata e reagidas a 55°C durante 50 horas para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo e outros ácido a-glicosil-L-ascórbicos. Após inativar as enzimas por meio de aquecimento, a solução de reação foi ajustada em pH 4,5, misturada com “GLUCOZYME #20000”, um nome de produto de uma glucoamilase com uma atividade de 20.000 unidades/g, comercializada pela Nagase ChemteX Corp., Osaka, Japão, por 50 unidades por grama do amido de batata, reagida a 55Ό durante 24 horas para deg radar ácidos a- glicosil-L-ascórbicos em ácido ascórbico de 2-glicosídeo e para degradar os sacarídeos concomitantes em D-glicose. O rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo foi de cerca de 38 %, b.s.s. A solução de reação continha ácido 5-O-a-glucosil-L-ascórbico e ácido 6-O-a-glucosil-L-ascórbico numa quantidade total de cerca de 0,4 %, b.s.s.

[00200] Após inativar a enzima por meio de aquecimento, a solução de reação foi descolorida e filtrada com um carvão ativado. O filtrado foi dessalinizado com uma resina de troca catiônica (forma H+) e submetido a uma resina de troca aniônica (forma OH') para adsorver sobre si ácido L-ascórbico e ácido ascórbico de 2-glicosídeo, seguido de lavagem da resina com água para remover D-glicose e eluir os ingredientes adsorvidos com ácido clorídrico 0,5 N. O eluente foi conduzido à cromatografia em coluna usando “TOYOPEARL HW-40”, um nome de produto de uma resina porosa da Tosoh Corp., Tokyo, Japão, para coletar uma fração rica em ácido ascórbico de 2-glicosídeo, porém deficiente de ácido L-ascórbico. A fração coletada continha ácido ascórbico de 2-glicosídeo em uma quantidade de 87,6 %, b.s.s.

[00201] Após a fração ser concentrada sob pressão reduzida para dar uma concentração de cerca de 76 %, o concentrado foi colocado em um cristalizador, misturado com a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro preparado no Exemplo 1, como uma semente, em uma quantidade de dois porcento dos teores sólidos, ajustado a 40Ό, gradualmente resfriado a 15Ό ao longo de dois dias em condições de agitação delicada para cristalizar ácido ascórbico de 2-glicosídeo para formar ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. Os cristais foram coletados com uma centrífuga de tipo cesto, lavados por meio de pulverização de uma pequena quantidade de água destilada, envelhecidos e secados a 35Ό durante oito horas, resfriados por meio de sopragem com ar a 20*0 du- rante 10 minutos, e pulverizados para obter uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro. A composição particulada apresentou uma pureza de 98,5 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo, continha menos de 0,1 % de ácido L-ascórbico e D-glicose no total, continha menos de 0,1 % de ácido L-ascórbico, apresentou um grau de cristalinidade de 94,8 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e apresentou uma Potência de redução total da composição particulada como um todo sendo de 0,15 %. O nível de sorção dinâmica de vapor da composição particulada foi inferior ao limite de detecção. A medição da distribuição das partículas da composição particulada revelou que ela continha partículas com tamanhos de partículas menores que 150 pm em uma quantidade de 83,0 % e aquelas com tamanhos de partículas de 53 pm ou mais, porém menores do que 150 pm em uma quantidade de 57,7 %. Quando submetida ao mesmo teste de solidificação e teste de acastanhamento como nos Experimentos 1-4 e 7, respectivamente, a composição particulada foi avaliada como sendo “Não solidificada” (-) no teste de solidificação e “não acastanhada ou substancialmente não acastanhada” (-) no teste de acastanhamento.

[00202] A composição particulada é facilmente manuseável porque dificilmente solidifica e menos cores [] em comparação com “AA2G” convencional, um nome de produto de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro comercializado pela Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão, em uma classe para uso em quase-drogas como um ingrediente para branqueamento da pele, etc. Como a composição particulada não difere de pós de classe quase-droga convencionais pelo fato de que é uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, ela pode ser usada sozinha ou em combinação com outros ingredientes como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, farmacêuticos, etc., de maneira semelhante aos pós convencionais acima. Como a composição particulada apresenta um teor de ácido L-ascórbico de 0,1 % ou menor, não há receio de causar coloração na composição particulada per se mesmo quando a composição é armazenada durante um período de tempo relativamente longo na mesma forma de produto que pós de classe quase-droga convencionais.

Exemplo Comparativo 1 Preparação de composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro [00203] Exceto por não se usar isoamilase, uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro foi preparada por meio do mesmo método que no Exemplo 5 usando CGTase da cepa de Geobacillus stearothermophilus Tc-91 (depositada sob o número de acesso FERM P-2225 e com procedimento de transferência para o Depósito Internacional sob o número de acesso ABP-11273 no Depositório de Organismos de Patente Internacional no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) produzida pela Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japão. O rendimento de produção de ácido ascórbico de 2-glicosídeo após tratamento de glucoamilase foi de cerca de 28 %. A solução de reação continha ácido 5-O-a-glucosil L-ascórbico e ácido 6-O-a-glucosil L-ascórbico numa quantidade total de cerca de 1,0 %, b.s.s. De maneira análoga ao Exemplo 5, a solução de reação foi descolori-da, dessalinizada, e purificada para coletar uma fração rica em ácido ascórbico de 2-glicosídeo. A fração coletada continha ácido ascórbico de 2-glicosídeo em uma quantidade de 87,7 %, b.s.s.

[00204] De maneira análoga ao Exemplo 5, a fração rica em ácido ascórbico de 2-glicosídeo foi concentrada para cristalizar ácido ascórbico de 2-glicosídeo, e os cristais resultantes foram coletados, enve- Ihecidos, secados, e resfriados para obter uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro que apresentou uma pureza de 98,5 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo, continha 0,4 % de ácido L-ascórbico e D-glicose no total, continha 0,2 % de ácido L-ascórbico, apresentou um grau de cristalinidade de 89,1 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro, e apresentou uma Potência de redução total da composição particulada como um todo sendo de 1,17 %. O nível de sorção dinâmica de vapor da composição particulada foi de 0,04 %. A medição da distribuição das partículas da composição particulada revelou que ela continha partículas com um tamanho de partículas inferior a 150 pm em uma quantidade de 78,1 % e aquelas com um tamanho de partícula de 53 pm ou maior porém menor do que 150 pm em uma quantidade de 50,2 %.

[00205] Quando submetida ao mesmo teste de solidificação e teste de acastanhamento como nos Experimentos 1-4 e 7, respectivamente, a composição particulada foi avaliada como sendo “solidificada” (+) no teste de solidificação e “acastanhada” (+) no teste de acastanhamento. Como a composição particulada apresenta um grau de cristalinidade de inferior a 90 % para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro e um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,04 % como sendo acima 0,01 %, isto pode causar solidificação durante seu período de distribuição e armazenamento, e isto poderia causar inevitavelmente sérios problemas quando usada como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, farmacêuticos, etc. Como a composição particulada contém ácido L-ascórbico até um máximo de 0,2 %, ela não ocasiona o receio de causar coloração durante o período de distribuição e armazenamento comercial.

[00206] Como a composição particulada apresenta um teor de ácido L-ascórbico de até no máximo de 0,2 %, há o receio de causar coloração na composição particulada per se durante o período de distri- buição e armazenamento comercial.

Teste para estabilidade ao armazenamento [00207] As composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro obtidas nos Exemplos de 1 a 5 e Exemplo Comparativo 1, foram testadas quanto a suas capacidades de armazenamento por meio do mesmo método que no Experimento 5-3. Os resultados neste experimento e aqueles dos testes de solidificação confirmados nos Exemplos e Exemplo Comparativo são mostrados na Tabela 8 em paralelo.

Tabela 8 [00208] Como mostrado na Tabela 8, no teste de estabilidade ao armazenamento, em que cada amostra de teste foi armazenada em uma condição empacotada em uma bolsa de 10 kg durante 45 dias de acordo com uma forma de produto efetivamente comercializada, qualquer uma das composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro dos Exemplos de 1 a 5 foi avaliada como sendo “Não solidificada” (-), porém a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro do Exemplo Comparativo 1 foi avaliada como sendo “solidificada” (+). Estes resultados coincidiram bem com aqueles no teste de solidificação.

[00209] Como descrito acima, as composições particuladas contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente inven- ção, como mostrado nos Experimentos de 1 a 7 e Exemplos de 1 a 5, apresentam um grau de cristalinidade de 90 % ou maior para ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro ou apresentam um nível de sorção dinâmica de vapor de 0,01 % ou menor, e portanto, elas são composições particuladas tão manuseáveis de modo a serem avaliadas “Não solidificado” (-) no teste de solidificação, contudo, embora elas contenham ácido L-ascórbico e/ou D-glicose como impurezas características a seus processos de produção em um nível detectável por meio de cromatografia líquida convencional, as purezas de ácido ascórbico de 2-glicosídeo nas composições particuladas são acima de 98,0 % porém menores do que 99,9 %, especificamente, 98,5 % ou acima disto (ver Exemplo 5), porém de 99,8 % ou menores (ver Experimento 2), que é o nível inferior a 99,9 % de ácido ascórbico de 2-glicosídeo no pó de classe reagente e tornando distinguíveis as composições particuladas da presente invenção do pó de classe reagente em termos da pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo.

Exemplo 6 Preparação pulverizada de vitamina C (exemplo de aplicação como um material alimentício) [00210] Vinte partes em peso de uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro obtida por meio de qualquer um dos métodos nos Exemplos de 1 a 5 para uso como um material pulverulento para produtos alimentícios, foram misturadas com 70 partes em peso de sacarose, 10 partes em peso de dextrina, e uma quantidade adequada de um aroma, seguido de misturação da mistura resultante com um misturador a uma preparação pulverizada de vitamina C. O produto pode ser preparado misturando-se facilmente até à homogeneidade uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro com outro pó por meio do uso de um misturador sem causar qualquer evento problemático durante sua etapa de preparação. O produto pode ser facilmente misturado com outros materiais para produtos alimentícios e ele é uma preparação pulverizada de vitamina C substancial mente livre de causar coloração ou solidificação mesmo quando armazenado durante um período de tempo relativamente longo. Como o produto e composições contendo o mesma apresentam as funções fisiológicas da vitamina C, eles podem ser tomados oralmente para manter a saúde ou o branqueamento da pele ou da mucosa.

Exemplo 7 Pó para branqueamento da pele (exemplo de aplicação como um material cosmético) Formulação Ingredientes % α,α-Trealose 59,5 Polietileno glicol 6000 20 Sílica 5 Composição particulada contendo ácido 15 ascórbico de 2-glicosídeo anidro crista- lino obtido por meio de qualquer um dos métodos dos Exemplos de 1 a 5 Aroma Quantidade adequada Cor Quantidade adequada Antiséptico Quantidade adequada volume qsp 100 % Método de preparação [00211] A α,α-trealose acima, polietileno glicol 6000, sílica, aroma, cor, e antisséptico foram colocados em um misturador e misturados com o mesmo até formar uma enzima pulverizada homogênea. À mistura adicionou-se a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro obtido por meio de qualquer um dos métodos nos Exemplos de 1 a 5, seguido de agitação e misturação da mistura à homogeneidade para se obter um pó para branqueamento da pele. O produto facilita misturar uma composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro com outros ingredientes até formar uma mistura homogênea com o uso de um misturador, sem causar qualquer evento problemático durante sua etapa de preparação. Como o produto pode ser facilmente misturado com outros materiais para cosméticos e ele é um pó para branqueamento da pele substancial mente livre de causar coloração ou solidificação mesmo quando armazenado durante um período de tempo relativamente longo. O produto e composições contendo o mesmo podem ser usados como um agente dermatológico externo para o branqueamento da pele.

[00212] Como descrito acima, como a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção é significantemente de difícil solidificação em comparação com pós de classe quase-droga comercializados convencionalmente como materiais para cosméticos, quase-drogas, e produtos alimentícios, a composição particulada tem o mérito de que é facilmente manuseável e substancial mente livre de perder sua capacidade satisfatória de fluxo livre como uma composição particulada durante seu armazenamento, preservação ou transporte. Apesar do fato de que a composição particulada contendo 2-glicosídeo anidro cristalino da presente invenção é significantemente de difícil solidificação em comparação com pós de classe quase-droga convencionais, não é necessário aumentar sua pureza de ácido ascórbico de 2-glicosídeo ao nível de pós de classe reagente e, portanto, não há necessidade de etapas adicionais no processo de produção, como recristalização e/ou repetição dos cristais de lavagem. Em virtude disso, a composição particulada da presente invenção tem a vantagem de que o rendimento de produção não diminui em ampla margem, e que pode ser produzida a um custo menor. [00213] De acordo com o processo da presente invenção, a composição particulada da presente invenção pode ser produzida de ácido L-ascórbico e substância amilácea como materiais por meio do processo de produção que não difere do processo de produção para produzir pós de classe quase-droga convencionais nas etapas aqui compreendidas. Portanto, o processo de produção da presente invenção tem o mérito vantajoso de que produz uma composição particulada significativamente e dificilmente solidificável contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro em comparação com os pós de classe quase-droga convencionais, com substancialmente o mesmo período de tempo, trabalho, instalações de produção, e custo que aqueles requeridos para produzir referidos pós convencionais.

[00214] De acordo com os materiais pulverulentos para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, e farmacêuticos da presente invenção, devido ao fato de consistirem da composição particulada apresentando a propriedade significante de difícil solidificação, é possível obter o mérito vantajoso a seguir: Não há receio de causar perturbação durante o transporte do material, peneiração, e misturação mesmo quando usada em plantas de produção que são projetadas de modo a, em princípio, se usar materiais apresentando capacidade satisfatória de fluxo livre.

[00215] Adicionalmente, como a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção pode ser facilmente preparada na uma apresentando tanto partículas com um tamanho de partículas inferior a 150 pm em uma quantidade de 70 % em peso ou mais com relação ao todo da composição particulada, como aquelas com um tamanho de partícula de pelo menos 53 pm porém menor do que 150 pm em uma quantidade de 40 a 60 % em peso, ela pode ser usada convencionalmente sem se alterar as etapas de produção convencionais e padrões de material mesmo quando usados como materiais para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, e farmacêuticos. Quando a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção é de uma [n.t.: de um tipo] que contém ácido L-ascórbico e/ou D-glicose e apresenta um potência de redução da composição particulada como um todo sendo menor do que um porcento, ela alcança o mérito de, apesar de ser uma composição particulada produzida de ácido L-ascórbico e substância amilácea como materiais, ela é livre do receio de causar deterioração da qualidade, como acastanhamento mesmo quando misturada com outros ingredientes apresentando grupo amino intramolecularmente, como aminoácidos e proteínas. Em particular, quando o teor de ácido L-ascórbico na composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção é 0,1 % em peso [ou] menor, b.s.s., a composição particulada per se é livre do receio de ser descolorida com cor castanha clara mesmo quando armazenada sozinha durante um período de tempo relativamente longo, e ela pode ser usada como um material pulverulento branco, substancialmente não-colorido, para alimentos, cosméticos, quase-drogas, e farmacêuticos.

[00216] Adicionalmente, como a composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção é significamente de difícil solidificação em comparação com pós de classe quase-droga convencionais, ele pode ser mais facilmente ma-nuseável do que aquelas e usada como um material para produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, ou farmacêuticos nos campos dos produtos alimentícios, cosméticos, quase-drogas, farmacêuticos, rações, iscas, produtos químicos, e produtos industriais. O método de produção da composição particulada contendo ácido ascórbico de 2-glicosídeo cristalino anidro da presente invenção pode ser usado como um método de produzir a mesma a partir das substâncias amiláceas e ácido L-ascórbico, como materiais naturais, em uma quantidade desejada e com menor custo nos campos da produção de produtos sacari-ficados com amido ou derivados de vitamina.

[00217] Embora se tenha descrito o que presentemente se considera como sendo as concretizações preferidas da invenção, deve-se compreender que é possível realizar várias modificações na mesma, e pretende-se que compreenda, nas reivindicações anexas, todas essas modificações como enquadradas no verdadeiro espírito e escopo da invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Processo para produção de uma composição particulada compreendendo ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) permitir que uma ciclomaltodextrina glucanotransferase a partir de Geobacillus stearothermophilus Tc-27 ou Tc-62 atue sobre uma solução compreendendo substância amilácea e ácido L-ascórbico, e permitir sucessivamente que a glucoamilase atue na solução para se obter uma solução compreendendo ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico com um rendimento de produção de 35 % em peso ou maior de ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico; (ii) purificar a solução resultante para aumentar o teor de ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico a um nível acima de 86 % em peso, em uma base de sólidos secos; (iii) cristalizar ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino da solução purificada resultante; (iv) coletar o ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino precipitado resultante sem qualquer etapa de recristalização; e (v) envelhecer e secar o ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino recolhido e opcionalmente pulverizar o cristal resultante; em que a referida composição particulada apresenta as seguintes características: (a) compreende ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico em uma quantidade superior a 98,0% em peso, mas inferior a 99,9% em peso, em uma base de sólidos secos; e (b) apresenta um grau de cristalinidade de 90% ou maior para o ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino, quando calculado com base em um perfil de análise de difração de raios-X da referida composição particulada; e o referido rendimento de produção significa um teor (%) de ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico em uma base de sólidos secos em uma solução reacional enzimática.

2. Processo para produção de uma composição particulada compreendendo ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) permitir que uma ciclomaltodextrina glucanotransferase mutante atue sobre uma solução compreendendo substância amilácea e ácido L-ascórbico, e permitir sucessivamente que a glucoamilase atue na solução para se obter uma solução compreendendo ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico com um rendimento de produção de 35 % em peso ou maior de ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico; (ii) purificar a solução resultante para aumentar o teor de ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico a um nível acima de 86 % em peso, em uma base de sólidos secos; (iii) cristalizar ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino da solução purificada resultante; (iv) coletar o ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino precipitado resultante sem qualquer etapa de recristalização; e (v) envelhecer e secar o ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino recolhido e opcionalmente pulverizar o cristal resultante; em que a referida composição particulada apresenta as seguintes características: (a) compreende ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico em uma quantidade superior a 98,0% em peso, mas inferior a 99,9% em peso, em uma base de sólidos secos; e (b) apresenta um grau de cristalinidade de 90% ou maior para o ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino, quando cal- culado com base em um perfil de análise de difração de raios-X da referida composição particulada; a referida ciclomaltodextrina glucanotransferase mutante apresentando uma sequência de aminoácidos, em que o 228° radical lisina na sequência de aminoácidos da SEQID NO: 1 é substituído por resíduo de ácido glutâmico; e o referido rendimento de produção significa um teor (%) de ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico em uma base de sólidos secos em uma solução reacional enzimática.

3. Processo para produção de uma composição particulada compreendendo ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) permitir que uma ciclomaltodextrina glucanotransferase a partir de GeobacilIusstearothermophilusTc-QI com uma enzima desra-mificadora de amido na solução sobre uma solução compreendendo substância amilácea e ácido L-ascórbico, e permitir sucessivamente que a glucoamilase atue na solução para se obter uma solução compreendendo ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico com um rendimento de produção de 35 % em peso ou maior de ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascór-bico; (ii) purificar a solução resultante para aumentar o teor de ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico a um nível acima de 86 % em peso, em uma base de sólidos secos; (iii) cristalizar ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino da solução purificada resultante; (iv) coletar o ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino precipitado resultante sem qualquer etapa de recristalização; e (v) envelhecer e secar o ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino recolhido e opcionalmente pulverizar o cristal resultante; em que a referida composição particulada apresenta as seguintes características: (a) compreende ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico em uma quantidade superior a 98,0% em peso, mas inferior a 99,9% em peso, em uma base de sólidos secos; e (b) apresenta um grau de cristalinidade de 90% ou maior para o ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico anidro cristalino, quando calculado com base em um perfil de análise de difração de raios-X da referida composição particulada; e o referido rendimento de produção significa um teor (%) de ácido 2-O-a-D-glucosil-L-ascórbico em uma base de sólidos secos em uma solução reacional enzimática.