CN105342870B - 含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末及其制造方法和用途 - Google Patents
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Abstract
含有2‑O‑α‑D‑葡萄糖基‑L‑抗坏血酸无水结晶的粉末及其制造方法和用途【课题】本发明的课题是提供一种比之前常用的准药品级的含有抗坏血酸2‑葡萄糖苷无水结晶的粉末更难以固结的含有抗坏血酸2‑葡萄糖苷无水结晶的粉末及其制造方法，以及用途。【解决手段】提供了一种含有抗坏血酸2‑葡萄糖苷无水结晶的粉末，该粉末按无水物换算含有超过98.0质量％不足99.9质量％的抗坏血酸2‑葡萄糖苷，基于粉末X射线衍射曲线算出抗坏血酸2‑葡萄糖苷无水结晶的结晶度为90％以上，或氮气流下除去粉末中的水分后，在温度25℃、相对湿度35％的条件下保持12小时时其动态水分吸附量为0.01质量％以下，还提供了它的制造方法以及用途。
Description
技术领域
本发明涉及含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末及其制造方法和用途，更具体地，涉及与已有物相比显著更难以固结的含有2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末及其制造方法，以及以其作为食品原料、化妆品原料、准药品原料、药品原料的用途。
背景技术
由于L-抗坏血酸具有优异的生理活性及抗氧化作用，一直以来用于包括食品、化妆品等的多种用途中。但是，L-抗坏血酸则由于具有直接还原性的原因而不稳定，存在易于氧化分解、易于丧失生理活性的较大的缺点。为了消除L-抗坏血酸的缺点，本申请人作为共同申请人中的一人在专利文件1中公开了在L-抗坏血酸的2位羟基上结合了1分子的D-葡萄糖得到2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(以下在本说明书中简称为“抗坏血酸2-葡萄糖苷”)。这种抗坏血酸2-葡萄糖苷不具有直接还原性，很稳定，并且，具有在生物体内原本存在的酶的作用下分解为L-抗坏血酸和D-葡萄糖，发挥L-抗坏血酸原本的生理活性的划时代的特性。根据专利文献1公开的制造方法，含有L-抗坏血酸和α-葡萄糖基糖化合物的溶液在环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(以下简称为“CGT酶”)或α-葡萄糖苷酶等的糖转移酶作用下生成抗坏血酸2-葡萄糖苷。
此外，本申请人在专利文献2中公开了从抗坏血酸2-葡萄糖苷的过饱和溶液中成功析出抗坏血酸2-葡萄糖苷的晶体，得到抗坏血酸2-葡萄糖苷以及包含抗坏血酸2-葡萄糖苷的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷结晶的粉末。并且，现阶段认为抗坏血酸2-葡萄糖苷结晶仅存在无水结晶物。因此，在非专利文献1及2中，报道了用X射线解析抗坏血酸2-葡萄糖苷结晶的结构的结果。
此外，本申请人在专利文献3及4中公开了一种高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的物质的制造方法，其将含有酶反应生成的抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液进行使用强酸性阳离子交换树脂的柱层析获得高喊抗坏血酸2-葡萄糖苷的级分。此外，本申请人在专利文献5中公开了一种高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的物质的制造方法，将含有酶反应生成的抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液中用阴离子交换膜的电透析法除去L-抗坏血酸或糖类等夹杂物；在专利文献6中公开了一种高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的物质的制造方法，将含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液接触阴离子交换树脂，可选择性除去阴离子交换树脂吸附的成分，得到高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的级分。
此外，本申请人在专利文献7中公开了一种抗坏血酸2-葡萄糖苷的制造方法，含有L-抗坏血酸与α-葡萄糖基糖化合物的溶液在α-异麦芽糖基葡萄糖(异麦芽糖基葡萄糖)生成酶、或α-异麦芽糖基葡萄糖生成酶与CGT酶的作用下生成抗坏血酸2-葡萄糖苷。此外，本申请人在专利文献8及9中还分别公开了α-异麦芽糖基葡萄糖生成酶及α-异麦芽糖基转移酶催化向L-抗坏血酸的糖转移，生成抗坏血酸2-葡萄糖苷。
同时，关于抗坏血酸2-葡萄糖苷的用途，例如专利文献10～29中示出了多种建议。由于抗坏血酸2-葡萄糖苷具有的这些优异的特性，可用作食品原料、化妆品原料、准药品原料或药品原料，与之前的L-抗坏血酸的用途相比，广泛使用在以往由于L-抗坏血酸不稳定而不能将L-抗坏血酸进行使用的其它用途。
由上述内容可知，目前已知以L-抗坏血酸和淀粉为原料利用多种糖转移酶可制得抗坏血酸2-葡萄糖苷。然而，如果本申请人根据目前已知的知识，将认为用作为糖转移酶的CGT酶来作用含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液的方法是抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率最高、可以成为工业上优选的方法。基于这种认识，本申请人根据用CGT酶作用于含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液的方法制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，将其作为化妆品·准药品原料以及食品原料，分别以商品名“AA2G”(株式会社林原生物化学研究所出售)以及商品名“アスコフレッシュ”(株式会社林原商社出售)进行出售(下文中，这些作为化妆品·准药品原料以及食品原料出出售的现有的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末简称为“准药品级的粉末”)。
然而，准药品级的粉末是在制品规格上，抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度在98.0质量％以上的较高纯度的产品，尽管刚制得的粉末具有良好的流动性，但长期搁置于高温、高湿度的环境下时将由于自重以及吸湿出现固结的缺点。鉴于这种缺点，将准药品级的粉末各10kg装入聚乙烯制的袋子中，与干燥剂一起装入附有盖子的钢制罐中作为商品形态进行销售。但根据本发明人随后得到的认识，即使是这种商品形态的准药品级粉末在长期的保存期间也通常出现固结，出现损坏粉末有效性的问题。一旦用作化妆品原料及准药品原料或食品原料的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末出现固结，对原来以原材料是具有流动性的粉末为前提设计的制造设备来说将在原材料输送、筛分、混合等步骤上出现障碍。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】特开平3-139288号公报
【专利文献2】特开平3-135992号公报
【专利文献3】特开平3-183492号公报
【专利文献4】特开平5-117290号公报
【专利文献5】特开平5-208991号公报
【专利文献6】特开2002-088095号公报
【专利文献7】特开2004-065098号公报
【专利文献8】国际公开WO02010361号单行本
【专利文献9】国际公开WO01090338号单行本
【专利文献10】国际公开WO05087182号单行本
【专利文献11】特开平4-046112号公报
【专利文献12】特开平4-182412号公报
【专利文献13】特开平4-182413号公报
【专利文献14】特开平4-182419号公报
【专利文献15】特开平4-182415号公报
【专利文献16】特开平4-182414号公报
【专利文献17】特开平8-333260号公报
【专利文献18】特开2005-239653号公报
【专利文献19】国际公开WO06033412号单行本
【专利文献20】特开2002-326924号公报
【专利文献21】特开2003-171290号公报
【专利文献22】特开2004-217597号公报
【专利文献23】国际公开WO05034938号单行本
【专利文献24】特开2006-225327号公报
【专利文献25】国际公开WO06137129号单行本
【专利文献26】国际公开WO06022174号单行本
【专利文献27】特开2007-063177号公报
【专利文献28】国际公开WO06132310号单行本
【专利文献29】国际公开WO07086327号单行本
【非专利文献】
【非专利文献1】マンダイ·タカヒコ等，「カーボハイドレート·リサーチ」(碳水化合物研究)，第232卷，197-205页(1992年)
【非专利文献2】イノウエ·ユタカ等，「インターナショナル·ジャーナル·オブ·ファーマシューティクス」(国际制药学期刊)，第331卷，38-45页(2007年)
发明内容
发明解决的课题
为了解决上述缺点，本发明的要解决的技术问题是提供一种含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末及其制造方法和用途，该粉末要比常用的准药品级的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末显著更难以固结。
解决课题的技术手段
为了解决上述课题，本发明人反复研究含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的固结性，本申请人发现作为分析用标准试剂销售的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末(商品名“抗坏血酸2-葡萄糖苷999”，代码编号：AG124，株式会社林原生物化学研究所销售)(以下简称“试剂级的粉末”)即使在准药品级的粉末固结的条件下仍不固结，得以保持粉末的形状。这种试剂级的粉末与准药品级的粉末相同，均是经过CGT酶作用于含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液的步骤、纯化得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液、浓缩、析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶、收集结晶制得的粉末，但与准药品级的粉末所不同的，在通常的步骤中还加入了将一次得到的结晶溶解后再次析出晶体的再结晶步骤、以及将再结晶步骤得到的结晶用经纯化水等反复洗净的洗净步骤，由此可以得到抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度在99.9质量％以上的纯度极高级水平的粉末。因此，推测如果准药品级的粉末中抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度提高至99.9质量％以上，是否也可以得到难以固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。
然而，为了使抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度达到为99.9质量％以上的高纯度，如上所述，在常规的制造步骤中必须加入再结晶步骤以及反复用经纯化水等洗净的步骤，这样不仅将增加制造所花费的时间和劳力，并且在再结晶步骤及洗净步骤中还无法避免抗坏血酸2-葡萄糖苷的损失，导致出现制品成品率低下、制造成本大幅上升的缺点。因此，为了得到比准药品级的粉末更难以固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的目的，单纯地将抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度提高到99.9质量％以上的选择项是不现实的。
因而，本发明人着重研究了含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的固结性，重复了多种尝试错误的结果，发现尽管含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶的粉末中抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度与之前的准药品级的粉末水平相同；或者，即使没有达到试剂级的纯度水平，只要使含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度也达到90％以上；或者，粉末的动态水分吸附量为0.01质量％以下，则该粉末就比准药品级的粉末显著更难以固结。
此外，本发明人进一步研究了结晶度及动态水分吸附量达到上述水平的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的工业规模的制造方法，结果发现，含有L-抗坏血酸与淀粉的溶液在CGT酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用下，溶液中能按35质量％以上的高生成率生成抗坏血酸2-葡萄糖苷，纯化该溶液，直至溶液中抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量按无水物换算时超过86质量％时，从该溶液中析出含抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，可以较为容易地获得结晶度在90％以上、粉末的动态水分吸附量为0.01质量％以下的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶。
此外，本发明人发现，含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度90％以上或动态水分吸附量0.01质量％以下的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末与之前的准药品级粉末相比显著更难以固结，易于用作食品原料、化妆品原料、准药品原料以及药品原料，具有重大意义和价值，由此完成本发明。
即，本发明提供了一种含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其特征是：按无水物换算含有超过98.0质量％不足99.9质量％的抗坏血酸2-葡萄糖苷，且基于粉末X射线衍射曲线算出的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为90％以上，由此解决了上述课题。
此外，本发明提供了一种含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其特征是：按无水物换算含有超过98.0质量％不足99.9质量％的抗坏血酸2-葡萄糖苷，且氮气流下除去粉末中的水分后，在温度25℃、相对湿度35质量％的条件下保持12小时时其动态水分吸附量为0.01质量％以下，由此解决了上述课题。
在优选的一种情况中，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末含有占粉末全体70质量％以上的粒径不足150μm的粒子以及占粉末全体40～60质量％的粒径53μm以上不足150μm的粒子。此外，在优选的一种情况中，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末含有L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖，且粉末全体的还原能力不足1质量％。此外，在更优选的一种情况中，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中L-抗坏血酸量按无水物换算为0.1质量％以下。
如上所述的本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，典型的是从经过CGT酶作用于含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液的步骤得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液制得的粉末。
此外，本发明还提供了一种含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法，其特征是包括：含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液经CGT酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用，得到抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率35质量％以上的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液的步骤；纯化得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液，使抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量按无水物换算超过86质量％的步骤；从按无水物换算含有超过86质量％的抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液中析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的步骤；收集析出的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的步骤；对收集的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶老化、干燥、根据需要而粉碎的步骤。
在本发明的制造方法中使用的CGT酶只要能使含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液在CGT酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用下能按照生成率35质量％以上的高生产率生成抗坏血酸2-葡萄糖苷的酶，其起源和来源没有特别限制，可以是天然的酶，也可以是基因重组得到的酶。但是，从抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率观点出发，优选下述的经基因重组技术变异的来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearother mophilus)Tc-62株的CGT酶、来自嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-27株的CGT酶、或来自嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-91株的CGT酶得到的变异CGT酶，其中，嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-62株产生的CGT酶由于能获得较高的抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率，因此最为优选。
使用的葡萄糖淀粉酶没有特别限制，只要能使含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液在CGT酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用下能按照生成率35质量％以上的高生产率生成抗坏血酸2-葡萄糖苷的酶即可，其起源和来源没有特别限制，可以是天然的酶，也可以是基因重组得到的酶。
也依赖于作为原料使用的淀粉的种类，也可以在含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液经CGT酶作用时，使异淀粉酶或支链淀粉酶等淀粉脱支酶与CGT酶一同作用来提高抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率。
且，在本发明的制造方法的优选的一种情况中，上述纯化含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液至抗坏血酸2-葡萄糖苷含量按无水物换算超过86质量％的步骤中，将经过滤、脱盐的酶反应液接触阴离子交换树脂，使其吸附抗坏血酸2-葡萄糖苷和L-抗坏血酸，用经纯化水洗脱除去D-葡萄糖等糖类后，向层析柱中加入不足0.5N的盐酸或盐类的水溶液作为洗脱液，洗脱抗坏血酸2-葡萄糖苷和L-抗坏血酸，浓缩洗脱液，进行使用阳离子交换树脂或多孔性合成树脂的柱层析，用洗脱液洗脱的方法。特别地，在用强酸性阳离子交换树脂为填充剂的模拟移动床式作为使用阳离子交换树脂的柱层析时，能高效地、较好收率地获得目的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量超过86质量％的级分，因此优选这种情况。
在此之上，本发明还提供了包含本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的粉末状的食品原料、化妆品原料、准药品原料或药品原料，由此解决了上述课题。
本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末可有利地用于食品原料，所述食品原料例如可分别举出：维生素C强化剂、胶原产生强化剂、美白剂、味道改善剂、品质改善剂、防止黑变剂、酸味剂、赋形剂、增量剂、抗氧化剂等；可有利地用于化妆品原料，所述例如化妆品原料可分别举出：美白剂、细胞赋活剂、胶原产生强化剂、维生素C强化剂、味道改善剂、品质改善剂、防止黑变剂、酸味剂、赋形剂、增量剂、稳定剂、抗氧化剂等；可有利地用于准药品原料，所述准药品原料例如可分别举出：美白剂、细胞赋活剂、胶原产生强化剂、维生素C强化剂、味道改善剂、品质改善剂、防止黑变剂、酸味剂、赋形剂、增量剂、稳定剂、抗氧化剂等；以及，可有利地用于药品原料，所述药品原料例如可分别举出：美白剂、细胞赋活剂、胶原产生强化剂、脏器保护剂、自由基障碍抑制剂、维生素C强化剂、防止黑变剂、赋形剂、增量剂、稳定剂、抗氧化剂等。
发明的效果
由于与之前作为化妆品原料、准药品原料、食品原料等市售的准药品级粉末相比，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末显著更难以固结，因此在保存、保管时及流通时粉末的流动性不容易收到影响，具有容易处置的优点。此外，尽管本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末比之前的准药品级粉末显著更难以固结，但由于抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度也没必要高至试剂级粉末的水平，因此制造时没必要增加再结晶步骤和重复洗净结晶的步骤。因此，不会大幅降低制品的成品率，还具有可廉价地进行制造的优点。
同时，本发明的制造方法具有以下优点：通过使用本发明的制造方法，以L-抗坏血酸和淀粉为原料，根据与之前的准药品级粉末的制造方法的步骤不发生变化的制造方法也可制得本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，只需要花费与之前准药品级粉末的制造所必需的时间、劳动力、制造设备及成本相差不大的时间、劳动力、制造设备及成本，即可制得比准药品级粉末显著更难以固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。
此外，由本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末构成的粉末状的食品原料、化妆品原料、准药品原料以及药品原料具有以下优点：由于构成粉末状原料的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末显著更难以固结，因此在保存、保管方面容易处置些，可使用以流动性粉末为原料为前提制作的制造设备，在原料的输送、筛分、混合等步骤中不会出现障碍。
同时，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末具有以下优点：由于容易调整为食品原料等所希望的粒度分布，即，粒径不足150μm的粒子占粉末全体的70质量％以上，且粒径53μm以上不足150μm的粒径占粉末全体的40～60质量％的粒径分布，因此将其用作食品原料、化妆品原料、准药品原料或药品原料无需改变之前的制造过程和原料规格，可直接使用从前的方法。此外，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末还具有以下优点：当含有L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖且粉末全体的还原能力不足1质量％时，尽管是以L-抗坏血酸和淀粉为原料制得的粉末，但即使混合氨基酸及蛋白质等分子内具有氨基的其他成分也不会出现变色等品质降低的现象。更具体地，当本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中L-抗坏血酸含量按无水物换算为0.1质量％以下时，即使将本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末作为单独粉末长时间保存，粉末自身也不会出现淡褐色的着色，可作为实质上无着色的白色粉末用作食品原料、化妆品原料、准药品原料及药品原料。
附图说明
【图1】依据基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的特性X射线得到的粉末X射线衍射曲线的一个例子。
【图2】依据基本上由无定形部分构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末的特性X射线得到的粉末X射线衍射曲线的一个例子。
【图3】依据基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的同步加速器辐射得到的粉末X射线衍射曲线的一个例子。
【图4】依据基本上由无定形部分构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的同步加速器辐射得到的粉末X射线衍射曲线的一个例子。
【图5】示出了来自属于土芽孢杆菌属的微生物的CGT酶的高级结构的模式图。
【图6】示出了来自属于土芽孢杆菌属的微生物的CGT酶的催化剂残基及保守区域的模式图。
【图7】示出了本发明使用的包含来自属于土芽孢杆菌属的微生物的CGT酶基因的重组DNA“pRSET-iBTC12”的结构及限制性切酶位点的图。
具体实施方式
1.措辞的定义
本说明书中下述措辞具有以下含义。
<结晶度>
本说明书中的“关于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度”指的是下式【1】定义的数值。
式【1】
【数1】
H100：根据基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末标准样品的粉末X射线衍射曲线计算的结晶度的解析值
H0：根据基本上由无定形部分构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末标准样品的粉末X射线衍射曲线计算的结晶度的解析值
HS：根据作为被检样品的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末的粉末X射线衍射曲线计算的结晶度的解析值。
在式【1】中，作为计算H100、H0、HS的基础的粉末X射线衍射曲线(profile)通常可用配备了反射式或透射式的光学系统的粉末X射线衍射装置测得。粉末X射线衍射曲线中涵盖了被检样品或标准样品中包含的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的衍射角和衍射强度，从粉末X射线衍射曲线确定结晶度的解析值的方法例如可举出Harmans法、フォンク法等。这些解析方法中，用Harmans法更为简便和精确。目前，这些解析方法都已经计算机软件化，因此配备搭载了任一种计算机软件的解析装置的粉末X射线衍射装置都是很适宜的。
此外，计算解析值H100的“基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的标准样品”使用的是抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度在99.9质量％以上(以下，如果没有特别限制，本说明书中质量％将略写为“％”。然而，本说明书中结晶度所使用的％不限于此。)的粉末或单结晶，在粉末X射线衍射曲线中示出了抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶特有的衍射峰，基本上为由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成的物质。这种粉末或单结晶可举出上述试剂级的粉末或将其再结晶化得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，或抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的单结晶。因此，基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成的上述含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的标准样品的粉末X射线衍射曲线根据Harmans法用计算机软件解析时的解析值H100通常为70.2～70.5％。
另一方面，计算解析值H0的“基本上由无定形部分构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末的标准样品”使用的是抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度在99.1％以上的粉末，该粉末X射线衍射曲线中仅由来自无定形部分的ハロー构成，而且基本上不示出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶特有的衍射峰。这种粉末例如可举出将上述计算解析值H100的标准样品溶解在适量经纯化水中、浓缩后、冻干，经卡尔费休法确定水分含量至2.0％以下再经真空干燥得到的粉末。实施这种处理时，经验上可知能够得到基本上由无定形部分构成的粉末。因此，基本上由无定形部分构成的上述含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末的标准样品的粉末X射线衍射曲线根据Harmans法用计算机软件解析时的解析值H0通常为7.3～7.6％。
且，对计算解析值H0的标准样品来说，虽然优选抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度高，但在自计算解析值H100的标准样品按如上所述制备计算解析值H0的标准样品中，如后述实验1-1所示，计算解析值H100的标准样品中抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度可以高至99.9％的极高，也可低至99.1％。因此，“基本上由无定形部分构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的标准样品”的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度，如上所述，为99.1％以上。
<动态水分吸附量>
本说明书中的“动态水分吸附量”指的是：用水分吸附解吸测定装置，在温度25℃、相对湿度0％的条件下，在氮气流中保持12小时，除去样品中游离的水分，称量除去后的样品后，将样品在温度25℃、相对湿度35％的条件下相同的氮气流下保持12小时，立刻再度称量，基于得到的两个称量值根据下式【2】算出的值。
【式2】：
【数2】
W0％：在氮气流下、25℃、相对湿度0％的条件下保持12小时后立刻测定的被检样品的质量
W35％：测定W0％的质量后的被检样品在氮气流下、25℃、相对湿度35％的条件下保持12小时后测定的被检样品的质量
<还原能力>
本说明书中的“粉末全体的还原能力”指的是，用D-葡萄糖作为标准物质，根据本领域常用的索莫吉-纳尔逊法(ソモジーネルソン法)及蒽酮硫酸法，计算基于各D-葡萄糖换算还原糖量及全糖量，可用下式【3】计算，其含义为相对于所含全糖量的还原糖量百分比(％)。
式【2】：
【数3】
<粒度分布>
在本说明书中，粉末的粒度分布由下述方式确定。即根据日本工业规格(JIS Z8801-1)，正确称量网孔425、300、212、150、106、75及53μm的金属制网筛(株式会社饭田制作所制)后，按此顺序重叠地装入ロータップ型筛网振荡机(株式会社田中化学机械制造所制，商品名“R-1”)，接着，称取一定量的样品装载在最上端的筛网(网孔425μm)上，筛网在重叠的状态下振荡15分钟后，再度正确称量个筛网，该质量减去装载样品前的质量，可计算出各筛网收集的粉末的质量。随后，相对于装载在筛网上的样品的质量，计算各筛网收集的具有各种粒度的粉末的质量的百分率(％)，即为粒度分布。
<抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率>
本说明书中的“抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率”指的是含L-抗坏血酸和淀粉的溶液在CGT酶等酶作用下得到的酶反应液中，按无水物换算的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量(％)。
<按无水物换算的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量>
按无水物换算的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量指的是抗坏血酸2-葡萄糖苷在不含水分的情况下计算的所占全质量中的质量百分率(％)。例如，溶液中按无水物换算的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量指的是溶液中不含水分的情况下，抗坏血酸2-葡萄糖苷相对于剩余的全部固形物的质量百分率。以及，粉末中按无水物换算的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量指的是粉末中按照不含水分计算剩余部分的全体粉末质量时，抗坏血酸2-葡萄糖苷相对于全体粉末质量的质量百分率。
<CGT酶的活性>
本说明书中“CGT酶的活性”如以下所定义。即，在包含0.3％(W/V)可溶性淀粉、20mM醋酸缓冲液(pH5.5)、1mM氯化钙的基质水溶液5ml中加入适当稀释的酶液0.2ml，将基质溶液保持在40℃，在反应第0分钟和反应第10分钟时分别从基质溶液中抽出0.5ml，立即加入0.02N硫酸溶液15ml中使反应停止后，向各硫酸溶液中分别加入0.2N碘溶液0.2ml使之显色，10分钟后，分别用吸光光度计测定波长660nm处的吸光度，根据下式【4】可算出淀粉分解活性。CGT酶的1个活性单位定义为在这种测定条件下能使溶液中淀粉15mg的碘显色完全消失的酶的量。
式【4】
【数4】
<异淀粉酶的活性>
本说明书中的“异淀粉酶的活性”如下所定义。即，在含有0.83％(W/V)リントナー(Lintner)可融化蜡状玉米淀粉、0.1M醋酸缓冲液(pH3.5)的基质水溶液3ml中加入适当稀释的酶液0.5ml，将基质溶液保持在40℃，在反应30秒和反应30分30秒时分别从基质溶液中抽出0.5ml，立即加入0.02N硫酸溶液15ml中使反应停止，向各硫酸溶液中分别加入0.01N碘液0.5ml，25℃下放置15分钟显色后，分别用吸光光度计测定波长610nm处的吸光度，根据下式【5】可算出淀粉分解活性。异淀粉酶的1个活性单位定义为在这种测定条件下能使波长610nm的吸光度增加0.004的酶的量。
式【5】
【数5】
2.本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末
<结晶度及动态水分吸附量>
如上所述，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末是按无水物换算含有超过98.0％但不足99.9％的抗坏血酸2-葡萄糖苷，且基于粉末X射线衍射曲线计算的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为90％以上，或动态水分吸附量为0.01％以下的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。如以下实验所示，结晶度或动态水分吸附量为上述水平的本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中，尽管抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度，即，按无水物换算的抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量是与准药品级的粉末大约相同的级别，或，达不到试剂级的粉末中抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度，但还是比准药品级的粉末显著更难以固结。
同时，如以下实验所示，在按无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷含量超98.0％但不足99.9％的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中，对抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶来说结晶度在上述范围内的粉末，动态水分吸附量即为0.01％以下，反过来说，动态水分吸附量在上述范围内的粉末，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度即为90％以上。因此，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末可以限定抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度或粉末的动态水分吸附量任一个即可，而根据需要，可以对两者均进行限定。
且，动态水分吸附是在一定温度下样品周围的湿度发生变化时样品含有的水分量发生变化的现象，虽然不如结晶度般属于直接来自作为样品的粉末的结晶结构的指标，但由于粉末的固结与吸湿现象相关，表现水分吸附难易程度的动态水分吸附量可根据粉末的糖成分、抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度、粉末粒子的尺寸等的显著变化进行推测，因此其被认为是在与吸湿相关的粉末固结性的评价上非常有力的指标。
如后述的实验所示，含有动态水分吸附量超过大约0.05％的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末在所采用的实验环境下相对较为容易固结，与此相比，动态水分吸附量大约0.01％以下的成分在相同环境下基本上不出现固结。这个事实显示为了实现难以固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，如同结晶度，动态水分吸附量是有力的指标。
因此，为了计算结晶度，如后述实验3所示，用计算解析值H0的标准样品，即，“基本上由无定形部分构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末标准样品”示出了1.7％的动态水分吸附量；与此相比，如实验3所示的，用计算H100的标准样品，即，“基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末标准样品”示出了检测界限之下的动态水分吸附量，也就是说基本上并未出现动态水分吸附。
<粒度分布>
在一个优选的情况中，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末含有占粉末全体70％以上的粒径不足150μm的粒子，以及占粉末全体40～60％的粒径53μm以上不足150μm的粒子。由于本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末可以很容易地调整为例如食品原料等所需要的上述粒度分布，因此，具有在不改变制造方法及原料规格的前提下照旧用作食品原料、化妆品原料、准药品原料或药品原料的优点。
<反应夹杂物及还原能力>
在一个优选的情况中，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末含有L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖，并且粉末全体的还原能力不足1％。本领域公知，L-抗坏血酸及D-葡萄糖具有直接还原性，在与氨基酸及蛋白质等分子内具有氨基的化合物共存下加热会引起褐色的着色，含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末制品中优选不含有这些物质。然而，例如，在含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液经CGT酶等酶的作用的步骤制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末时，无论量的多少，未反应的L-抗坏血酸以及来源于原料淀粉的D-葡萄糖等均不可避免地成为混入含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末制品的反应夹杂物。例如，在之前的准药品级粉末中，含有的L-抗坏血酸与D-葡萄糖的量按无水物换算两者的总量达到约1％，在用作食品原料时预期会引起褐色着色。
因而，在本发明中，允许混入不可避免的L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖，但限于在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中粉末全体的还原能力不足1％。如后述实验所示，当依据本发明的制造方法制造本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末时，粉末全体的还原能力很容易不超过1％。如果即使含有L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖，粉末全体的还原能力也不超过1％的话，与氨基酸及蛋白质等分子内具有氨基的化合物共存时加热也不会出现实质上的褐色着色。因此，含有L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖，且粉末全体的还原能力不足1％的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末具有不需要担心着色及变色、可配合用于食品、化妆品、准药品、药品的优点。因此，粉末全体的还原能力不足1％时，含有的L-抗坏血酸和D-葡萄糖的量按无水物换算为是总量0.2％以下。
又，在优选的一种情况中，本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中L-抗坏血酸含量按无水物换算为0.1％以下。L-抗坏血酸可用作抗氧化剂和脱氧剂用于食品等，具有很高的酶反应性。因此，L-抗坏血酸不仅会在与分子内具有氨基的化合物共存时加热引起褐色着色，而且也会使含有L-抗坏血酸的粉末本身出现很深的着色。现在，如后述实验所示，准药品级的粉末中含有0.2％的L-抗坏血酸，本发明人发现，如果准药品级的粉末以之前所述的商品形态较长时间地保存，通常粉末自身出现淡褐色的着色现象。与此相对的，在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中，L-抗坏血酸的含量为0.1％以下时，这种粉末即使以与准药品级的粉末相同的商品形态进行较长时间地保存，也不必担心粉末自身出现淡褐色着色。因此，依据本发明的制造方法，在纯化步骤中，在为了除去D-葡萄糖等的糖类进行使用阴离子交换树脂的柱层析之后进行使用阳离子交换树脂或多孔性树脂的柱层析，更具体地，在使用阳离子交换树脂的柱层析的模拟移动床时，比较不容易增加制造成本，且能实现本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中L-抗坏血酸的含量在0.1％以下。
3.本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法
本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末是只要按无水物换算含有超过98.0％、不足99.9％的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为90％以上或者动态水分吸附量在0.01％以下，根据任意方法制得的粉末均可，并不限于特定的制造方法制得的成分。
然而，在如下所示的本发明的制造方法中，可较为容易地制得本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。即本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法基本上包含以下(1)～(5)步骤：
(1)含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液在CGT酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用下，抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率达到35质量％以上的得到含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液的步骤；
(2)纯化得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液，至抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量按无水物换算时超过86质量％的步骤；
(3)从按无水物换算超过86％的抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液中析出抗坏血酸2-葡萄糖苷的无水结晶的步骤；
(4)收集析出的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的步骤；
(5)老化、干燥以及根据需要而粉碎收集的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的步骤。
以下将说明各个步骤。
<(1)步骤>
(1)步骤是L-抗坏血酸和淀粉进行酶反应生成抗坏血酸2-葡萄糖苷的步骤。首先，说明使用的原料及酶，接着说明进行的酶反应。
A.使用的原料及酶
(L-抗坏血酸)
使用的L-抗坏血酸可以是羟基酸形态的物质，也可以是碱金属盐、碱土类金属盐等金属盐形态的物质，还可以是它们的混合物，这之间并无差异。
(淀粉)
又，使用的淀粉可举出马铃薯淀粉、甘薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉等。淀粉优选分子内基本上没有支链的结构以及葡萄糖聚合度一致的淀粉，例如，环麦芽糖糊精、环糊精、合成直链淀粉等，任意一个的葡萄糖聚合度是6～100的范围内、优选具有直链结构或直链的环状结构的成分。又，当淀粉使用常规的液状淀粉、糊精等淀粉部分水解物时，使用CGT酶的同时，优选合并使用例如异淀粉酶(EC 3. 2. 1. 68)、支链淀粉酶(EC 3.3. 1. 41)等的淀粉脱支酶，切断淀粉的分支部分调整其葡萄糖聚合度。且，淀粉脱支酶优选酶活性及机制特异性等方面容易处理的异淀粉酶。
(CGT酶)
如上所述，使用的CGT酶(EC2. 4. 1. 19)只要当含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液在CGT酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用时能按35％以上的高生成率生成抗坏血酸2-葡萄糖苷的成分，其起源和来源没有特别限制，可以是天然的酶，也可以是经基因重组得到的酶。天然的酶例如来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearother mophilus)Tc-62株的CGT酶以及来自嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-27株的CGT酶，优选抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率较高的酶，其中，从抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率的观点出发，嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-62株产生的CGT酶最为优选。
如后述实施例3所示，基因重组得到的CGT酶例如可举出具有将来自嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-91株的CGT酶的氨基酸序列的CGT酶，即序列表上SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列中第228位的赖氨酸残基置换为谷氨酰胺残基的氨基酸序列的CGT酶。要得到这种变异的CGT酶，众所周知，优选将编码序列表中SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列第228位的赖氨酸残基被谷氨酰胺残基置换的氨基酸序列的基因导入例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等适宜宿主中，通过转化，在该转化体中表达这种基因。
且，嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)Tc-27株、相同的Tc-62株及相同的Tc-91株任一个均是公开在相同申请人提出的特开昭50-63189号公报(特公昭53-27791号公报)中的微生物，于平成21年7月14日分别以保藏号FERM BP-11142、FERMBP-11143及于1973年7月30日以国内保藏号FERM P-2225(移交国际保藏：国际保藏号FERMBP-11273，国际保藏日：2010年8月6日)保藏在日本茨城县筑波市1丁目1番地1中央第6所在的独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心。且，之前分类为“嗜热脂肪芽孢杆菌”种名的微生物现在一律变更为“嗜热脂肪土芽孢杆菌”种名，另一方面，“杆菌”的属名仍然用作独立称呼微生物的属的名称，为了避免混乱，本说明书中将“嗜热脂肪芽孢杆菌”和“嗜热脂肪土芽孢杆菌”一律称为“嗜热脂肪土芽孢杆菌”。
(葡萄糖淀粉酶)
使用的葡萄糖淀粉酶(EC 3. 2. 1. 3)没有特别限制，只要其为当含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液在CGT酶和葡萄糖淀粉酶的依次作用时能按35％以上的高生成率生成抗坏血酸2-葡萄糖苷的成分，其起源和来源没有特别限制，可以是天然的酶，也可以是经基因重组得到的酶。
葡萄糖淀粉酶通常是在加热酶反应液使CGT酶导致的糖转移反应停止后加入，因此为了节约加热后的酶反应液冷却需要的能量和时间，优选在较高的温度，例如40～60℃的温度下能实用地发挥充足的酶活性的酶成分。又，使用的葡萄糖淀粉酶包含α-葡萄糖苷酶时，生成的抗坏血酸2-葡萄糖苷将出现水解，因此，葡萄糖淀粉酶优选使用基本上不含有α-葡萄糖苷酶的成分。只要满足这种条件，使用的葡萄糖淀粉酶的来源、纯度均没有特殊限制，例如，葡萄糖淀粉酶剂优选使用是市售的来自根霉属的微生物的酶剂(商品名“グルコチーム#20000”ナガセケムテックス株式会社出售)或来自曲霉属的微生物的酶剂(商品名“グルクザイムAF6”天野酶株式会社出售)。
B.酶反应
随后，将说明L-抗坏血酸的糖转移反应。首先含有L-抗坏血酸和淀粉质的溶液，通常是在水溶液中作用CGT酶。含有L-抗坏血酸和淀粉的水溶液经CGT酶的作用，在CGT酶的酶作用下，L-抗坏血酸的2位羟基上转移了1个或2个以上的D-葡萄糖，生成上述2位的羟基上结合了1个D-葡萄糖的抗坏血酸2-葡萄糖苷的同时，生成上述2位的羟基上也结合了2个以上的D-葡萄糖的2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽四糖基-L-抗坏血酸等α-葡萄糖基-L-抗坏血酸。
通常，在溶解了淀粉浓度1～40％的淀粉与L-抗坏血酸的水溶液中，按照1g淀粉1～500单位的比例加入CGT酶，将该溶液在pH约3～10、温度30～70℃保持6小时以上，优选保持约12～96小时进行反应。由于L-抗坏血酸容易受到氧化分解，因此，反应中，溶液一方面要隔离空气或保持还原状态，另外还希望与光隔绝，根据需要，在反应溶液中同时加入例如硫脲、硫化氢等还原剂。
溶液中的淀粉与L-抗坏血酸的质量比按无水物换算优选设定为8:2～3:7。一旦淀粉的比例超过这个范围，向L-抗坏血酸的糖转移效率将增大，抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率将受到L-抗坏血酸的初始浓度的限制，出现较低水平。相反，一旦L-抗坏血酸的比例超过上述范围，未反应的L-抗坏血酸大量残余，不利于工业生产。因此，优选上述比例范围。
且，在加入CGT酶时合用作为淀粉脱支酶的异淀粉酶的情况中，异淀粉酶与CGT酶共存于含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液中一起作用于淀粉，对添加量来说，如果是异淀粉酶的最适合温度、最适合pH等，通常按照淀粉1g添加200～2500单位的酶，在55℃以下进行反应。又，当使用支链淀粉酶作为淀粉脱支酶时，也优选以异淀粉酶为准进行使用。
CGT酶或CGT酶和淀粉脱支酶引起的酶反应大致完成后，加热酶反应液，使CGT酶或CGT酶和淀粉脱支酶失活，停止酶反应，接着，用葡萄糖淀粉酶作用该酶反应液。在葡萄糖淀粉酶的作用下，L-抗坏血酸的2位羟基上结合了2个以上的D-葡萄糖链将断裂，2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸等α-葡萄糖基-L-抗坏血酸将转化成抗坏血酸2-葡萄糖苷，抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是35％以上，优选达到37～45％。
当抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率是35％以上，优选为37～45％时，根据后续的(2)～(5)步骤，能较为容易地得到含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度能达到90％以上或粉末动态水分吸附量为0.01％以下。且，优选的生成率上限为45％，现在的酶工业上的技术水平基本上很难以使抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率超过45％，并且，即使花费时间和劳力使抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率超过45％，所得到的粉末中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度或粉末动态水分吸附量也不会有太大的改善。
因此，当抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率不足35％时，即使经过后续的(2)-(5)的步骤，也很难以得到含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度能达到90％以上或粉末动态水分吸附量为0.01％以下。这个原因并不清楚，但推测是含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液在CGT酶的作用下将不可避免地生成的副反应物5-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸或6-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸的相对量将可能带来一定影响。
即L-抗坏血酸的5位或6位羟基上结合了D-葡萄糖的5-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸及6-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸通常被认为是阻碍抗坏血酸2-葡萄糖苷结晶化的结晶化阻碍物质，但在之前的抗坏血酸2-葡萄糖苷制造方法中，含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液在CGT酶的作用下，抗坏血酸2-葡萄糖苷与上述α-葡萄糖基-L-抗坏血酸共同存在，将不可避免地同时生成5-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸和6-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸。按无水物换算，5-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸及6-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸的总量通常为约1％，这些糖转移物在柱纯化步骤中与抗坏血酸2-葡萄糖苷在几乎相同的位置洗脱，因此通常很难以除去它们。因此，含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液首先经天然型或基因重组型的CGT酶的作用，当酶反应液中抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率达到35％以上，优选达到37～45％时，这些5-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸及6-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸按无水物换算时的总量将不超过0.5％。认为这个结果将使经过其后步骤得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中抗坏血酸2-葡萄糖苷的结晶化得以顺利进行。
又，使用糖转移酶CGT酶时，L-抗坏血酸的2位羟基上转移了2个以上D-葡萄糖时，由于2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸等α-葡萄糖基-L-抗坏血酸中D-葡萄糖间的键为α-1,4键，因此在其后葡萄糖淀粉酶的作用下，D-葡萄糖间的键断裂，能较为容易地转化为抗坏血酸2-葡萄糖苷，例如，认为与使用α-异麦芽糖基葡萄糖生成酶的情况相同，经葡萄糖淀粉酶处理后，将无需担心出现包含α-1,6键等分支结构的α-葡萄糖基-L-抗坏血酸等结晶化阻碍物质的残余。
<(2)步骤>
(2)步骤是纯化上述(1)步骤得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液，使抗坏血酸2-葡萄糖苷含量按无水物换算超过86％的步骤。换句话说，(1)步骤得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液经活性炭等脱色过滤，滤液经阳离子交换树脂脱盐，进一步地，经过柱层析，纯化至溶液中抗坏血酸2-葡萄糖苷含量按无水物换算超过86％，优选在88％以上。纯化中使用的柱层析只要将溶液中抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量按无水物换算超过86％即可，原则上可以使用任意柱层析，优选的例子是，为了除去D-葡萄糖等糖类进行使用阴离子交换树脂的柱层析，之后再进行使用阳离子交换树脂或多孔性树脂的柱层析。为了除去D-葡萄糖等糖类使用的阴离子交换树脂可举出“アンバーライトIRA411S”、“アンバーライトIRA478RF”(以上ローム·アンド·ハース社制)、“ダイヤイオンWA30”(三菱化学社制)等。为了分离抗坏血酸2-葡萄糖苷和L-抗坏血酸使用的阳离子交换树脂可举出“ダウエツクス50WX8”(ダウケミカル社制)、“アンバーライトCG120”(ローム·アンド·ハース社制)、“XT-1022E”(东京有机化学工业社制)、“ダイヤイオンSK104”、“ダイヤイオンUBK550”(以上三菱化学社制)等。多孔性树脂可举出“トヨパールHW-40”(东ソー社制)、“セルファインGH-25”(チッソ社制)等。当使用阳离子交换树脂或多孔性树脂时，层析柱负载的原料液体的浓度为固形物的约10～50％，树脂的负荷量是湿润树脂容积的约1/1000～1/20，与湿润树脂容积几乎等量的经纯化水以0.5～5m/小时的线速度通过。其中，使用阳离子交换树脂的柱层析的模拟移动床时，得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其中纯化得到的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度升高，L-抗坏血酸或D-葡萄糖等的夹杂物尤其是L-抗坏血酸含量降低，L-抗坏血酸含量按无水物换算低于0.1％。因此，在用阳离子交换树脂作为填充剂的模拟移动床式的柱层析中，对作为分离条件的操作温度、设定流速等来说，提供给模拟移动床式的柱层析的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液浓度按无水物换算应为60％以下，含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液的负荷量与湿润树脂溶剂的容积比应为1/20以下，用作分离液的经纯化水量应是不超过上述容积比中上述负荷量的30倍，通常优选5～20倍。
当溶液中抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量按无水物换算为86％以下时，经过后续(3)～(5)步骤，很难以得到抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度达到90％以上，或，粉末的动态水分吸附量为0.01％以下的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。其原因认为是，当溶液中抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量按无水物换算86％以下时，经过其后的步骤得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度低，无法进行顺利的结晶。
经过纯化使抗坏血酸2-葡萄糖苷含量按无水物换算超过86％，优选超过88％的溶液首先进行析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的步骤，设定的浓度通常是浓缩至抗坏血酸2-葡萄糖苷浓度的约65～85％。浓缩液的温度通常调节至大约30～45℃。这种浓度和温度相当于抗坏血酸2-葡萄糖苷的过饱和度为1.05～1.50。
<(3)步骤>
(3)步骤为从按无水物换算含有超过86％、优选超过88％的抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液中析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的步骤。换句话说，(2)步骤中纯化至设定的纯度和浓度、浓缩、调整至设定的温度的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液移入辅助结晶罐中，其内含有0.1～5％的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的籽晶，缓慢搅拌，6～48小时将液温缓慢冷却至5～20℃度，析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶。且，在辅助结晶罐等已经存在抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的籽晶时，不必再特别添加抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶籽晶。总之，优选在籽晶存在下从浓缩液中析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶。又，根据需要，优选浓缩纯化液和从浓缩液中析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶以煎糖方式同时进行。
<(4)步骤>
(4)步骤是收集析出的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的步骤。即，可从辅助结晶罐中收集マスキット，然后用常规方法从该マスキット中离心分离出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶。
<(5)步骤>
(5)步骤是对收集的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶进行老化、干燥以及根据需要而粉碎的步骤。即，用少量去离子水、蒸馏水等经纯化水洗涤离心分离收集的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶，洗去附着在结晶表面上的杂质。虽然洗涤用水的量没有特别限制，但由于不仅溶解附着在表面的杂质还溶解结晶自身将降低成品率以及洗涤水的成本也相应增大，因此通常至多使用结晶质量的30％、优选15～25％的量的洗涤用水洗涤结晶表面。且，这种洗涤过程还可将结晶装入筐式离心分离器中在离心力下进行。将如此收集、洗净的结晶，保持在设定的温度和湿度的气氛下一段时间，老化、干燥、将成为对抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶来说结晶度90％以上或动态水分吸附量为0.01％以下的粉末。
老化、干燥步骤中含有结晶的粉末的成品温度及气氛的相对湿度、以及老化、干燥的时间只要能得到预期的结晶度或动态水分吸附量的粉末即可，没有特别限制。在老化、干燥步骤中，优选含有结晶的粉末的成品温度是20～55℃、气氛的相对湿度保持60～90％。又，老化、干燥时间两者合计优选大约5～24小时。随后，经过老化、干燥步骤的含有结晶的粉末自然冷却至室温。这样可得到对抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶来说结晶度90％以上或动态水分吸附量为0.01％以下的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。得到的结晶粉末可以直接成为制品，或者根据需要经粉碎成为制品。
上述(1)～(5)步骤除了上述(1)步骤中抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率以及上述(2)、(3)步骤中溶液中抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量之外，与准药品级粉末的制造步骤基本相同，不包括试剂级粉末的制造方法中必需的再结晶步骤、重复洗涤结晶的步骤。
因此，如上述制得的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末经老化、干燥步骤后通过自然冷却，成为具有极高速度流动性且几乎不具有吸湿性的粉末，但一旦自然冷却时间缩短，对抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶来说将无法实现结晶度90％以上，或粉末动态水分吸附量0.01％以下。因此，直接由这种粉末构成制品时，与准药品级的粉末相同，在通常的保存环境下只能得到具有固结可能性的粉末。得到难以固结的本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的必需的最短自然冷却时间受到气氛的温度和湿度等的影响，也将根据使用的干燥用装置、设备的规模以及结构等的变化而变化，但在一定条件下也几乎没有变化。因此，对实际使用的装置、设备来说，一旦调整好能使抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶实现结晶度90％以上，或粉末动态水分吸附量0.01％以下时必需的自然冷却时间以及气氛的温度和湿度的关系，其后将无需调整其比例、含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的结晶度及动态水分吸附量，达到自然冷却时间的标准，即可制得本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。
又，本发明人发现，在上述老化、干燥后，不仅将含有结晶的粉末自然放冷，此外例如在室温的清洁空气吹下强制冷却至室温程度的制品温度，能加速抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶化，在较短时间内实现抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度达90％以上、粉末动态水分吸附量达到0.01％以下。吹的空气温度优选大约15℃～30℃，更优选18℃～28℃。又，吹时间通常优选5～60分钟，更优选10～30分钟。在一定的吹的空气温度下，吹时间不足5分钟时几乎不出现强制冷却的效果，吹超过60分钟时也没有发现上述的结晶度有所提高，因此不优选。又，在吹空气时，优选适当地搅拌含有结晶的粉末或者适当地振动含有结晶的粉末，能使吹的冷却效果达到粉末全体。
如上得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末是按无水物换算含有超过98.0％不足99.9％的抗坏血酸2-葡萄糖苷，根据粉末X射线衍射曲线计算，粉末中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为90％以上，且，氮气流下除去粉末中的游离水分后，在温度25℃、相对湿度35％下保持12小时后动态水分吸附量为0.01％以下的本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，在之前的准药品级粉末出现固结的条件下不出现固结，是比准药品级的粉末显著更难以固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。
因此，粉末原料出现固结将给制造装置带来多种不好的影响。例如，在食品制造领域中，处理粉末状原料时，用辊粉碎机进一步粉碎粉末原料，向制造装置的空气吹风口中输送空气以及用蛇状弯曲的输送机进行多次输送。这时，万一粉末原料出现固结，将出现辊粉碎机的辊损坏、烧结等故障，又，还可能出现堵塞设置在生产线上的筛子、输送管等麻烦。又，固结的粉末原料自身的溶解以及与其他原料的混合，在混合处理时恐怕出现操作上的障碍。这种粉末固结是制造步骤中许多问题的原因，例如，在柴田力著的《粉粒体トラブルシューティング》、株式会社工业调查会发行，2006年，15～19页中详细记载了这种情况。
由于本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末与之前的准药品级的粉末相比更难以固结，因此具有以下优点：在使用以处理粉末原料为前提设计的制造设备进行包括饮料的食品制造、化妆品制造、准药品制造甚至药品制造的各领域中，可放心地将其包含在其他的单独的或多种粉末状的食品原料、化妆品原料、准药品原料、药品原料等中。
上述的其他粉末状的食品原料可举出例如谷粉、淀粉、糖粉、粉末调味料、粉末香辛料、粉末果汁、粉末油脂、粉末肽、粉末蛋黄、乳粉、脱脂乳粉、粉末咖啡、粉末可可、粉末酱、粉末酱油、蔬菜粉末等；化妆品原料可举出例如白粉(白粉)、滑石粉、高岭土、云母、绢云母、淀粉、膨润土、蚕丝粉、纤维素粉末、尼龙粉末、浴盐、ソープチップ、二氧化钛、二氧化硅(硅石)、氧化锌等；准药品原料可举出例如氨基酸盐、维生素剂、钙剂、赋形剂、增量剂、杀菌剂、酶剂等，此外，药品原料可举出例如粉末状有效成分、寡糖、乳糖、淀粉、糊精、白糖、结晶纤维素、蔗糖酯、脂肪酸酯等赋形剂、增量剂、虫胶等包被剂等。
又，如上所述制得的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末通常含有L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖，且粉末全体的还原能力不足1％。换句话说，如上所述制得的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中，虽然通常用高效液相色谱等分析方法检测得到的L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖水平具体来说是按无水物换算含有0.01％以上0.2％以下，但粉末全体的还原能力不足1％，如后述实验所示，该粉末是即使与氨基酸及蛋白质等分子内具有氨基的化合物的存在下共同加热，也基本不会变色的优质的粉末。上述得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末优选L-抗坏血酸含量在0.1％以下。这种L-抗坏血酸含量低于0.1％的本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末是，即使将其以与准药品级的粉末相同的商品形态进行较长时间的保存，粉末自身也不会出现着色的优质的粉末。
此外，如上所示制得的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末通常含有占粉末全体70％以上的粒径不足150μm的粒子并且含占粉末全体40～60％的粒径53μm以上不足150μm的粒子，可以直接作为含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末制品。如果包含较多粒径较大的粉末粒子或粒度分布与预期的粒度分布不同时，优选通过适当粉碎减小粒径或通过筛等进行分级，来调整粒度制得粉末制品。
以下，将根据实验具体说明本发明。
<实验1：结晶度对含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的固结性的影响>
制备抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为0～100％范围的多种含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，进行这种固结性的实验，调查含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中结晶度与固结性的关联性。以下将进行详细介绍。
<实验1-1：被检样品的制备>
<被检样品1>
基本上由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成的标准样品使用试剂级的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末(商品名“抗坏血酸2-葡萄糖苷999”、编号：AG124，纯度99.9％以上)，将其作为被检样品1。
<被检样品2>
基本上由无定形部分构成的标准样品使用的是将被检样品1溶解在适量经纯化水中3日后，冻干后，在40℃以下真空干燥1晚得到的基本上由无定形部分构成的粉末，将其作为被检样品2。同时，用卡尔费休滴定法测定被检样品2的水分含量为2.0％。
<被检样品3、4>
被检样品3、4是按以下顺序制备的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度在被检样品1和被检样品2之间的样品。换句话说，将与被检样品2相同地制备的由无定形部分构成的粉末在金属制盘内延展，调整至温度25℃、相对湿度90％，在恒温、恒湿的隔室内容纳24小时或72小时，促进结晶化，使粉末部分结晶化。其后，将金属制盘从隔室内取出，38℃下真空干燥一晚，由此制得2种粉末。恒温、恒湿的隔室内的容纳时间为24小时的样品作为被检样品3，72小时的样品作为被检样品4。同时，被检样品3和4在分析实验进行前都密封在有盖玻璃管药瓶内，与干燥剂一起密封在干燥器中。
<实验1-2：被检样品1～4的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度与结晶度>
<抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度>
如下所述计算被检样品1～4的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度。即，将被检样品1～4任一种用经纯化水制成2％的溶液，用0.45μm的滤膜过滤后，进行下述条件的高效液相色谱(HPLC)分析，用示差折光检测计的层析谱出现的峰面积计算，换算成无水物。表1示出了结果。
·分析条件
HPLC装置：“LC-10AD”(株式会社岛津制作所制)
脱气装置：“DGU-12AM”(株式会社岛津制作所制)
层析柱：“Wakopak Wakobeads T-330”(和光纯药工业株式会社出售H+型)
样品注入量：10μl
洗脱液：0.01％(容积/容积)硝酸水溶液
流速：0.5ml/分钟
温度：25℃
示差折光检测计：“RID-10A”(株式会社岛津制作所制)
数据处理装置：“クロマトパックC-R7A”(株式会社岛津制作所制)
<结晶度>
如下所述计算被检样品1～4中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度。即，用市售的依据反射光方式的粉末X射线衍射装置(スペクトリス株式会社制，商品名“X’Pert PROMPD”)，基于从Cu对阴极放射出的特性X射线的CuKα线(X射线管电流40mA，X射线管电压45kV，波长)形成的粉末X射线衍生曲线，使用同一个粉末X射线衍射装置搭载的专用解析计算机软件，计算被检样品1～4各个的依据Harmans法的结晶度的解析值。首先进行依据Harmans法的结晶度的解析，在考虑各粉末X射线衍射图中峰之间的重叠、衍射强度、散射强度等的同时，与找到最适合判断的基线相同的，将软件设定的粒状度及弯曲因素分别保持在适当的水平上。同时，在P.H.Harmans和A.Weidinger的《Journal of AppliedPhysics》、第19卷第491-506页(1948年)以及P.H.Harmans和A.Weidinger的《Journal ofPolymer Science》、第4卷，第135-144页(1949年)中详细记载了Harmans法。
被检样品1的结晶度的解析值为H100、被检样品2的结晶度的解析值为H0，各被检样品的结晶度的解析值为HS，代入上述式【1】中计算结晶度。因此，被检样品1根据Harmans法计算的结晶度的解析值(解析值H100)以及被检样品2的相同解析值(解析值H0)分别是70.23％及7.57％。表1一同示出了结果。同时，分别在图1和图2中示出了作为标准样品的被检样品1和2的粉末X射线衍射图。
从图1可见，在被检样品1的粉末X射线衍射图中，在衍射角(2θ)4～65□的范围能明显且尖锐地出现抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶特有的衍射峰，无定形部分整体未发现特有的光环。另一方面，从图2可见，在被检样品2的粉末X射线衍射图中，与图1的粉末X射线衍射图不同的，明显出现从基线处耸起的无定形部分特有的光环，整体无发现抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶特有的衍射峰。
<试验1-3：依据被检样品1及2的同步加速放射光的粉末X射线衍射>
为了证明被检样品1及2可分别作为确定解析值H100及H0的标准样品的适当成分，本实验将这些被检样品用X射线源发出的同步加速放射光(以下称为“放射光”)照射，用透过光方式的粉末X射线衍射检测微弱的衍射或散射信号。同时，下文给出了测定条件。
<测定条件>
粉末X射线衍射装置：高速粉末X射线衍射装置(神津精机社出售、型号“PDS-16”、德拜谢勒模式、摄像机长度：497.2mm
X射线源：偏向电磁石发出的放射光(兵库县ビームライン(BL08B2))
测定波长：0.7717埃(16.066keV)
测定强度：109光子/秒
测定角：2～40□
曝光时间：600秒
图像摄像：成像板(富士フイルム社制，商品名“イメージングプレートBAS-2040”)
图像读取装置：图像分析仪(富士フイルム社制，商品名“バイオイメージアナライザーBAS-2500”)
用内设了大型放射光设施“SPring-8(兵库县佐用郡佐用町光都1-1-1)的“兵库县ビームライン(BL08B2)”进行测定。
首先进行粉末X射线衍射的测定，被检样品1及2在乳钵中碾碎后，用53μm的筛进行筛分，将过筛的粉末按填充长度大约30mm均匀地填充至X射线结晶衍射用毛细管(株式会社トーホー出售，商品名“マークチューブ”，No.14(直径0.6mm、リンデマンガラス制)内。接着，在样品填充末端切断毛细管，用粘合剂密封开口部分后，将样品支架与毛细管用粘土固定，使毛细管的长轴方向相对于粉末X射线衍射装置的光轴垂直，样品支架附着在粉末X射线衍射装置上。
为了消除抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的取向对粉末X射线衍射曲线的影响，测定中，在毛细管的长轴方向上以1次/60秒的周期、1.5mm的幅度等速往返地振动样品支架，使毛细管的长轴方向以样品支架为旋转轴按2圈/秒的周期等速旋转。
解析被检样品1及2得到的粉末X射线衍射曲线，在制作粉末X射线衍射图的过程中，为了提高测定精度，常规做法是从各粉末X射线衍射曲线中除去来自粉末X射线衍射装置的背景噪声信号。图3及图4分别示出了如此得到的被检样品1及2的粉末X射线衍射图。
从图3可见，在使用放射光进行粉末X射线衍射的被检样品1的粉末X射线衍射图中，在衍射角(2θ)2～40°的范围内可以清楚且尖锐地出现抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶特有的衍射峰。将图3与图1进行比较，放射光的波长(0.7717埃)与特性X射线的波长(1.5405埃)不同，虽然对图3来说，图1中大约二分之一的衍射角(2θ)上出现的各衍射峰有所不同，但图1及图3的衍射图极为一致。又，尽管图3中各衍射峰的强度比图1中的衍射峰的强度强大约100倍，但各衍射峰的半高宽比图1中的明显狭窄，分离度更高。又，在图3的粉末X射线衍射图中，与后述图4类似，均未发现无定形部分特有的光环。这教导被检样品1中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度极高，被检样品1基本由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成。
另一方面，从图4可见，在使用放射光进行粉末X射线衍射的被检样品2的粉末X射线衍射图中，明显地从基线耸起了无定形部分特有的光环，但没有发现抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶特有的衍射峰。这示出被检样品2基本上由无定形部分构成。
用放射光作为X射线源得到的上述结果是能将被检样品1及被检样品2用作确定式【1】中解析值H100及解析值H0的标准样品的适当的成分的证据。
<实验1-4：固结性实验>
为了调查被检样品1～4各自的固结性，进行以下实验。即，称取实验1-1制备的被检样品1～4各1g，分别装入内底部为半球状的14ml有盖的聚丙烯制圆筒管(ベクトン·ディッキンソン社出售，商品名“ファルコンチューブ2059”，直径1.7cm，高10cm)中，将该管以被检管直立的状态放入50℃的保温箱(アドバンテック东洋株式会社出售，商品名“CI-410”)内部，静置24小时后，将该管取出保温箱外，将管盖打开，缓慢倾倒管，使被检样品倾出置于黑色塑料制平板上，肉眼观察取出的被检样品的状态。
固结的有无用下述标准进行判断：被检样品在平板上明显保持了管内底部的半球状时认为是“固结”(+)；被检样品可识别出一点点管内底部的形状认为是“稍有固结”(±)；被检样品溃散，无法保持管内底部的形状认为是“无固结”(－)。表1的“固结性”一栏中示出了结果。
【表1】
| 被检样品 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度(％) | 99.9 | 99.1 | 99.1 | 99.1 |
| 结晶度(％) | 100.0 | 0.0 | 88.3 | 93.1 |
| 固结性 | － | + | + | － |
如表1所示，作为确定解析值H100的标准样品的被检样品1(结晶度100.0％)取出至平板上时出现溃散，无法保持管内底部的形状，判定为“无固结”。与之相对的，作为确定解析值H0的标准样品的被检样品2(结晶度0.0％)即使从管取出至平板上仍明确保持了管内底部的半球状，很明显地判定为“固结”(+)。平板上取出的被检样品2保持的管内底部的半球状的形态在平板轻轻振动的情况下也不出现崩散。
结晶度88.3％的被检样品3与被检样品2相同，即使从管中取出至平板上，也明确保持了管内底部的半球状，明显判定为“固结”(+)，结晶度为93.1％的被检样品4与被检样品1相同，取出至平板上的时候崩坏，判定为“无固结”(－)。
且，如上所述，虽然被检样品2～4是基于抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度99.9％的被检样品1制备得到的样品，但依据上述HPLC的分析，它们的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度均为99.1％。虽然这个原因尚未明确，但推测是制备过程中由于某些原因极少量的抗坏血酸2-葡萄糖苷由于分解等损失导致。
上述结果示出在按无水物换算含有99.1％以上抗坏血酸2-葡萄糖苷的粉末中，抗坏血酸2-葡萄糖苷结晶度较高将倾向于出现较低的固结性。结晶度88.3％的被检样品3判定为“固结”(+)、结晶度93.1％的被检样品4判定为“无固结”(－)的事实表明在上述固结性实验中，从“固结”(+)至“无固结”(－)的变化的临界点是结晶度88.3％和93.1％之间。
<实验2：含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的固结性和结晶度的关系>
本实验是基于实验1的结果，为了进一步详细地调查固结性和结晶度的关系，使用抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度0～100％范围内抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度为99.1～99.9％的7种含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，进行与实验1相同的固结性实验。
<实验2-1：被检样品的制备>
分别取适量实验1-1制备的被检样品1和被检样品2，均匀混合，制备表2示出的被检样品5～9的粉末。表2还示出了根据实验1-2记载的方法算得的被检样品5～9的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度、以及抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度。且，表2中还从转记了来自表1的被检样品1及2的结果。
<实验2-2：固结性实验>
被检样品5～9用于实验1-4的固结性实验。表2的“固结性”一栏中示出了结果。且，表2中被检样品1和2的“固结性”一栏中转载了表1记记的被检样品1和2的固结性实验结果。
【表2】
| 被检样品 | 1 | 2 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度(％) | 99.9 | 99.1 | 99.8 | 99.7 | 99.6 | 99.5 | 99.4 |
| 结晶度(％) | 100.0 | 0.0 | 99.8 | 92.6 | 91.5 | 89.2 | 29.9 |
| 固结性 | － | + | － | － | － | ± | + |
从表2的结果可见，结晶度为29.9％的被检样品9判定为“固结”(+)、结晶度89.2％的被检样品8判定为“稍有固结”(±)。与此相对的，结晶度91.5％的被检样品7、结晶度92.6％的被检样品6以及结晶度99.8％的被检样品5均与被检样品1相同，判定为“无固结”(－)。这些结果显示，对按无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷99.1％以上不足99.9％的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末来说，当抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为90％以上时在本实验的条件下不出现固结。
<实验3：动态水分吸附量对含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的固结性的
影响>
由于推测粉末的吸湿性与含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的固结有关，因此，在本实验中，对被检样品1及2及被检样品5～9，测定作为判定吸湿性多寡的一个有用指标考量的动态水分吸附量，对照实验2-2得到的固结性的实验结果，讨论动态水分吸附量对含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的固结性的影响。
<实验3-1：动态水分吸附量的测定>
分别称取大约50mg实验1-1制备的被检样品1及2、以及实验2-1制备的被检样品5～9，将其分别装入网眼戽斗中，在设置好戽斗架(SUS制)的状态下静置于水分吸附解吸测定装置(Hiden Isocheme社出售，商品名“IGA SORP”)内部，在200ml/分钟的氮气流下、温度25℃、相对湿度0％的条件下保持12小时，除去被检样品中的水分，马上称量被检样品。其后，再次在氮气流下、温度25℃、相对湿度35％的条件下保持12小时，再次称量。将一旦除去水分的被检样品的质量与被检样品在氮气流下、温度25℃、相对湿度35％的条件下加湿12小时后即刻的质量代入上述式【2】中，计算动态水分吸附量(％)。表3中示出了被检样品1及2以及被检样品5～9经本实验得到的动态水分吸附量的结果。表3合并示出了实验2-1得到的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度以及实验2-2得到的固结性的实验结果。
【表3】
| 被检样品 | 1 | 2 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度(％) | 99.9 | 99.1 | 99.8 | 99.7 | 99.6 | 99.5 | 99.4 |
| 动态水分吸附量(％) | ＜0.01 | 1.70 | ＜0.01 | ＜0.01 | 0.01 | 0.05 | 0.13 |
| 固结性 | － | + | － | － | － | ± | + |
从表3可见，被检样品2、5～9的动态水分吸附量在作为检测限度的不足0.01(即对应于表中的“＜0.01”。以下相同)至1.70％的范围中，即使均是按无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷99.1％以上不足99.9％的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其动态水分吸附量的数值也存在明显差异。即，被检样品1、5、6的动态水分吸附量均为检测限度以下的低值，被检样品2、8、9均示出了超过0.05％的动态水分吸附量，被检样品2的动态水分吸附量为1.70％，是被检样品8、9的10倍以上。
这些结果与表3“固结性”一栏示出的结果相比，可以看出在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中，粉末的固结性与动态水分吸附量之间存在明确的相关性。即，动态水分吸附量示出在检测限度以下的低于0.01％的值的被检样品1、5、6、7均为“无固结”(－)；与此相对应，动态水分吸附量达到0.05～1.70％的被检样品2、8、9均为“固结”(+)或“稍有固结”(±)。本实验的结果表明为了得到难以固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，动态水分吸附量是与结晶度相同的有力指标。又，按无水物换算含有抗坏血酸2-葡萄糖苷99.1％以上不足99.9％的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末只要动态水分吸附量低于0.01％即可判定为在本实验条件下为无固结的。
且，在本实验中，被检样品2示出了1.70％的极高的动态水分吸附量，显示被检样品2中水分吸附的主体是无定形部分。另一方面，被检样品1的动态水分吸附量为检测限度以下的极低值，显示被检样品1实际上不含有被检样品2中的无定形部分。这些内容为图1及图3示出的被检样品1的粉末X射线衍射图得以良好的对应、以及被检样品1用作以基于式【1】计算的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为基础的确定解析值H100的标准样品提供了完备的证据。
<实验4：强制冷却对粉末的结晶度、动态水分吸附量以及固结性的影响>
根据之前进行的实验可以看出，在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度与粉末的动态水分吸附量分别与粉末的固结性有密切的关系。在本实验中，调查粉末制造时老化、干燥步骤后含有结晶的粉末的强制冷却对含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的结晶度、动态水分吸附量及固结性的影响。
<实验4-1：被检样品的制备>
与实验1-1中的被检样品2相同的方法制备的粉末在金属制盘内延展，在调节至温度25℃、相对湿度90％时恒温恒湿的隔室内放置16小时促进结晶，使粉末部分结晶。其后，从隔室内取出金属制盘，40℃时干燥8小时，随后，自然放冷约2小时得到的粉末作为被检样品10，干燥后向金属制盘内的粉末吹20℃的空气15分钟或40分钟，强制冷却盘内的粉末，由此得到的粉末分别作为被检样品11及被将样品12。同时，被检样品10～12在分析实验进行前均密封盖在玻璃管药瓶内，与干燥剂一起保存在干燥器中。
<实验4-2：抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度的测定>
根据实验1-2记载的方法，计算被检样品10～12的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度，表4中记载了结果。还转载了表1中被检样品1的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度。
<实验4-3：结晶度及动态水分吸附量的测定>
用实验1及实验3记载的方法分别测定被检样品10～12的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度及粉末动态水分吸附量。表4示出了结果。同时，表4还转载了表1和表3中被检样品1的结果。
<实验4-4：固结性实验>
用被检样品10～12进行实验1-4的固结性实验。结果与表1中记载的被检样品1的固结性实验结果均记载在表4中“固结性”一栏中。
【表4】
| 被检样品 | 1 | 10 | 11 | 12 |
| 抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度(％) | 99.9 | 99.1 | 99.1 | 99.1 |
| 结晶粉末的冷却条件 | － | 自然放冷 | 20℃空气15分钟 | 20℃空气40分钟 |
| 结晶度(％) | 100.0 | 88.1 | 91.5 | 94.1 |
| 动态水分吸附量(％) | ＜0.01 | 0.06 | ＜0.01 | ＜0.01 |
| 固结性 | － | + | － | － |
从表4可以明确看出，含有结晶得到的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末在老化、干燥后，经自然放冷制备的被检样品10中，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为88.1％、动态水分吸附量为0.06％，在固结性实验中属于“固结”(+)的结果。与此相对的，粉末老化、干燥后，经20℃空气吹15分钟强制冷却的被检样品11中，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为91.5％、动态水分吸附量在检测限度之下，在固结性实验中属于“无固结”(－)的结果。同样，粉末老化、干燥后，经20℃空气吹40分钟强制冷却的被检样品12中，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为94.1％、动态水分吸附量在检测限度之下，在固结性实验中属于“无固结”(－)的结果。这些结果显示，粉末在老化、干燥后进行强制冷却与自然放冷相比的做法更能促进粉末的结晶化，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度更高，且，粉末的动态水分吸附量更小，即，更有利于制造难以固结的粉末。
<实验5：抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度对含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶粉末的固
结性的影响>
根据先前的实验，对在抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度99.1％以上的高纯度的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末来说，已经分别明确抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度和粉末的动态水分吸附量与粉末的固结性有着密切的关系。在本实验中，将进一步讨论含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的固结性与抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度的关系。
<实验5-1：被检样品的制备>
如下所述的，从含有L-抗坏血酸和作为淀粉的一种的糊精的水溶液中如表5所示制备抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度各不相同的被检样品13～18，进行实验1-4相同的固结性实验。
即，将4质量份糊精(松谷化学工业株式会社出售，商品名“パインデックス#100”)加热溶解在15质量份水中，加入3质量份L-抗坏血酸，保持pH5.5、液温55℃，按照1g糊精比100单位的比例加入来自嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-62株的CGT酶和1g糊精比250单位的比例加入异淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所出售)，反应50小时，生成抗坏血酸2-葡萄糖苷。同时，也推测在反应液中显然将生成2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽四糖基L-抗坏血酸等α-葡萄糖基-L-抗坏血酸类。
加热反应液使酶失活后，调整至pH4.5，按1g糊精比50单位的比例加入葡萄糖淀粉酶(商品名“グルクザイムAF6”天野酶株式会社出售)，反应24小时，将上述α-葡萄糖基-L-抗坏血酸类分解成抗坏血酸2-葡萄糖苷和将混在的寡糖分解为D-葡萄糖。这时，反应液中抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率为39％。
加热反应液使葡萄糖淀粉酶失活，用活性炭脱色过滤后，滤液通过阳离子交换树脂(H+型)的柱用洗脱液脱盐以后，在阴离子交换树脂(OH-型)上吸附L-抗坏血酸与抗坏血酸2-葡萄糖苷，水洗除去D-葡萄糖后，用0.5N盐酸溶液洗脱。此外，将该洗脱液浓缩至固形物占大约50％，接着，进行使用强酸性阳离子交换树脂(ダウケミカル社制造，商品名“ダウェックス50WX4”，Ca2+型)的柱层析。将该浓缩至固形物约50％的洗脱液上柱，用其湿润树脂容积的大约1/50量负荷、负荷量的50倍经纯化水按线速度1m/小时通过，按柱容积的0.05溶剂量对洗脱液进行分级。随后，用实验1-1所述的HPLC法测定各级分的组成，将按无水物换算抗坏血酸2-葡萄糖苷含量为80％以上的6个级分经减压浓缩，浓缩至浓度的大约76％，将得到的浓缩液置入辅助结晶罐中，分别加入2％的实验1-1的被检样品1作为籽晶，同时缓慢搅拌浓缩液，经2日将液温从40℃降低至15℃，洗脱抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶。
随后，如常规方法，用筐型离心分离机从マスキット中收集结晶，用少量蒸馏水洗净后，老化、干燥，用25℃的空气吹冷却30分钟，粉碎，得到表5示出的被检样品13～18。
【表5】
同时，从表5可见的被检样品1及2是与实验1-1相同的物质，它们的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度、抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度以及动态水分吸附量均是直接转载先前进行的实验中得到的结果。又，被检样品19使用的是现有的准药品级粉末的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末(商品名“AA2G”，株式会社林原生物化学研究所出售)。根据先前进行的实验所述的方法测定被检样品13～19的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度、抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度以及粉末的动态水分吸附量，表5示出了结果。
<实验5-2：固结性实验>
用与实验1-4相同的方法进行实验5-1得到的被检样品13～19的固结性的实验。表5示出了结果。同时，表5可见到的被检样品1及2的固结性实验结果是直接转载表1中的结果。
<实验5-3：保存性实验>
实验1-4等进行的固结性实验，应该可确认是妥当的作为含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末实际保存时的固结性的评价试验，对实验1-1方法得到的被检样品1、实验5-1得到的被检样品13～18以及被检样品19来说，在推定的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末实际保存时的状态、环境、时间等的情况下进行保存性实验。
即，分别取10kg被检样品1及被检样品13～19，将它们分别装入两层的聚乙烯袋(纵80mm×横600mm)中，分别制成1袋的各种被检样品。接着将各聚丙烯袋的开口部向上，将开口不动地装入钢制罐(18升的容积)中，盖上钢制罐静置，在室温下不调节湿度的环境下保存45天。保存45天后，将装有各被检样品的聚乙烯袋从钢制罐中取出，从袋中取出被检样品置于黑色塑料平板上，肉眼观察这时的被检样品的流动性和固结状态。
固结的有无根据以下进行判定：被检样品中发现块状物，与保存开始时相比流动性降低时判定为“固结”(+)；未发现块状物，与保存开始时相比流动性没有变化时判定为“无固结”(－)。同时，在本保存实验中各被检样品的保存形态，除了开口部没有用橡皮筋封闭开口部、没有装入干燥剂以及没有盖上刚制罐的盖子外，为与准药品级的粉末的商品形态相同的、实际在市场上流通、保存时的形态所相同的形态。同时，上述3个不同点，是为了较早得到试验结果，故而使保存试验中的保存环境比实际的保存环境稍微严格些，故意设定的不同点。表5中一并示出了结果。
如表5所示，除了基本由无定形部分构成的被检样品2以及作为准药品级的粉末的被检样品19之外，在剩余的被检样品1及被检样品13～18中，抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度越高，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度也越高。此外，在固结性实验中，相对于被判定为“固结”(+)或“稍有固结”(±)的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度分别为97.4％及98.0％的被检样品13及14，抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度为98.6～99.7％的被检样品15～18被判定为“无固结”(－)。这些结果显示影响固结性的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度的阈值在98.0％附近，因而可得出得到“无固结”(－)的评价的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度必须超过98.0％的结论。
又，尽管被检样品15～18的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度是98.6～99.7％，是与作为准药品级粉末的被检样品19的抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度98.9％之大约相同的水平，均比试剂级的粉末的基本由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成的被检样品1的纯度明显低得多，但与被检样品1相同均无出现固结。因此，被检样品15～18的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为91.6～99.5％，作为准药品级的粉末的被检样品19的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为88.9％，低于90％。从这些结果可以判断，要想得到的比作为准药品级的粉末的被检样品19更难以固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度必须在90％以上。
此外，在被检样品1及被检样品13～18中，具有随着抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度高，动态水分吸附量降低的倾向，与动态水分吸附量为0.07％的被检样品13被判定为“固结”(+)、动态水分吸附量为0.04％的被检样品14以及动态水分吸附量为0.03％的被检样品19被判定为“稍有固结”(±)相对的，动态水分吸附量为0.01％的被检样品15以及动态水分吸附量为检测限度之下的被检样品16～18被判定为“无固结”(－)。这些结果显示：当粉末的动态水分吸附量低于0.01％时，可得到比作为准药品级的粉末的被检样品19更难以固结的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。
同时，如表5最下端所示的，在各被检样品采用实际的商品形态、以10kg入袋的状态保存45天的保存性实验中，与抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度分别为97.4％及98.0％的被检样品13及14被判定为“固结”(+)相对的，抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度为98.6％～99.7％的被检样品15～18被判定为“无固结”(－)，与固结性实验得到同样的结果。这个事实显示：实验1-4等的固结性实验是适当的评价含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末在实际保存环境下的固结性的实验。
<实验6：在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水
结晶的结晶度与结晶粒径的关系>
通常认为，含有结晶的粉末的一个粉末粒子是由多个单结晶、即多个晶粒构成的，如果这种粉末的结晶度高，即认为多个粉末粒子的晶粒尺寸(粒径)较大。这种晶粒的粒径可用基于粉末X射线衍射曲线算出的衍射峰的半高宽和衍射角，代入下式【6】示出的“谢勒公式”中算出，在常规的粉末X射线衍射装置中均搭载了这种计算晶粒粒径的计算机软件。因而，选出实验1制备的基本由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成的被检样品1、作为实验5制备的本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度及其无水结晶的结晶度比以往的准药品级的粉末较为近似的被检样品15、以及实验5使用的作为以往的准药品级的粉末的被检样品19，根据下述方法，算出这些粉末的一个粉末粒子中包含的晶粒的粒径。
式【6】
【数6】
D：晶粒的尺寸
λ：X射线的波长
β：衍射弧度(rad)
θ：衍射角(°)
κ：常数(β使用半高宽时为0.9)
<抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶粒粒径的计算方法>
构成晶粒粒径计算的基础的粉末X射线衍射曲线使用的是实验1或实验5中分别确定被检样品1、15、19的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度的解析值所采用的粉末的X射线衍射曲线。从解析这种粉末X射线衍射曲线制成的衍射图中，考虑到一个粉末粒子内晶粒的不均匀倾斜所导致的衍射峰宽度的影响较小的较低角度的区域中，以及可能对其进行单个的分离，计算抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶粒粒径中使用的衍射峰选择的是衍射角(2θ)为10.4°、13.2°、18.3°、21.9°及22.6°附近的衍射峰。使用粉末X射线衍射装置附带的解析处理用计算机软件(“X’pert Highscore Plus”)，处理各被检样品的粉末X射线衍射曲线，计算选出的5个衍射峰的半高宽和衍射角(2θ)，以将硅(美国国立标准技术研究所(NIST)提供，X射线衍射用标准样品“Si640C”)作为标准品时的测定值为基础进行修正。利用这种修正后的半高宽和衍射角(2θ)，执行相同软件中的“谢勒公式”的程序，算出这些被检样品的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶粒的粒径。表6示出了结果。且，各被检样品的晶粒的粒径示出的是根据分别选出的5个衍射峰算出的它们的平均值。又，还直接地转载了表5中各被检样品的抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度及其无水结晶的结晶度。因此，被检样品15及19的粉末X射线衍射图是均在出现了抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶特有的明确的、且尖锐的衍射峰位于衍射角(2θ)4～65°的范围的衍射峰的图，与被检样品1的粉末X射线衍射图(图1)较为匹配，因此判断，从这些被检样品的粉末X射线衍射曲线中算出各被检样品包含的抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶粒的粒径，进行比较是妥当的。
【表6】
从表6可见，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为100％的被检样品1中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶粒粒径算出是抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为91.6％的被检样品15中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶粒粒径算出是又，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为88.9％的被检样品19中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的晶粒粒径算出是 这3种被检样品之间，抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度越高，其晶粒的粒径越大，由此确认了结晶度与晶粒粒径之间的相关关系。
<实验7：含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的还原能力与着色的关系>
先前实验使用的被检样品任一种均是从含有L-抗坏血酸和淀粉的溶液经过CGT酶作用的步骤得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷的溶液制备的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。在这种制法的情况中，对得到的粉末来说，姑且不论量的多少，将含有制造方法特有的夹杂物L-抗坏血酸及D-葡萄糖。L-抗坏血酸和D-葡萄糖均具有还原性，只要含有这些成分，在用于包含蛋白质、氨基酸等具有氨基的化合物的制品中时，制品恐怕将出现不合适的变色。其中，L-抗坏血酸与酶的反应性较高，将其用于制品时不仅将出现不合适的变色，而且在以往的准药品级的粉末长期保存时这通常被认为是粉末自身着色的原因。
因而，在本实验中，对先前实验使用的被检样品1及被检样品15～19来说，按照下述顺序，进行经加热处理的加速实验，讨论这些粉末中L-抗坏血酸和D-葡萄糖的总量、L-抗坏血酸的量、甚至粉末全体的还原能力与着色性的关系。
称取按无水物换算150mg的各被检样品置入10ml附有旋入的螺旋盖子的试验管内，在堵塞试验管的开口的状态下装入烘箱(增田理化株式会社出售，商品名“DRYING-OVENSA310)内，80℃加温3天。随后，从试验管旋出螺旋盖，向各被检样品中加入3ml去离子水，溶解后，用分光光度计(株式会社岛津制作所出售，商品名“UV-2400PC”)测定波长400nm处的吸光度。伴随着加温出现的着色的程度用波长400nm处吸光度的数值判定，分为不足0.50时的“无着色或基本无着色”(－)、上述吸光度数值为0.50以上时的“着色”(+)的两个阶段。表7示出了结果。
同时，根据实验1-1所述的HPLC法确定各被检样品中L-抗坏血酸和D-葡萄糖的总量。又，对粉末全体的还原能力来说，将D-葡萄糖用作标准物质，根据本领域常用的索莫吉-纳尔逊法以及蒽酮硫酸法，分别测定还原糖量及全糖量，代入上述式【3】中，计算获得。表7中示出了各被检样品的L-抗坏血酸及D-葡萄糖的总量、L-抗坏血酸的量以及粉末全体的还原能力。
【表7】
如表7所示，在含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末中，作为基本由抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶构成的试剂级的粉末的被检样品1的L-抗坏血酸和D-葡萄糖均在检测限度之下。与此相对的，在作为本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的被检样品12～18、以及作为以往的准药品级的粉末的被检样品19中，均检出L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖。此外，在这些粉末中，如在被检样品15～18，L-抗坏血酸和D-葡萄糖的总量按无水物换算为0.2％以下时，被判定为“无着色或基本无着色”(－)，相对的，被检样品19中L-抗坏血酸和D-葡萄糖的总量按无水物换算达到0.3％，被判定为“着色”(+)。此外，对于与这种粉末的着色性最为相关的考虑因素的L-抗坏血酸来说，在被检样品15～18中其含量为按无水物换算0.1％以下时，被判定为“无着色或基本无着色”(－)，相对的，被检样品19中L-抗坏血酸的量按无水物换算达到0.2％，被判定为“着色”(+)。因此，由上述内容可知，由于L-抗坏血酸与氧的反应性较高，在其作为与含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的着色相关的因素进行考虑时，当L-抗坏血酸的量为0.1％以下时，将无需担心这种粉末以以往的准药品级的粉末的商品形态进行长期保存时出现实质性的着色。
另一方面，从还原能力可见，如被检样品15～18，粉末全体的还原能力不足1％时，被判定为“无着色或基本无着色”(－)；与此相对的，如被检样品19，粉末全体的还原能力超过1％时，被判定为“着色”(+)。这个结果与上述L-抗坏血酸和D-葡萄糖的总量为指标进行判定的结果非常一致。
以上结果示出，即使由于制备方法不可避免地包含具有可检测水平的L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖，当使粉末全体的还原能力不足1％时，也可得到无需担心着色的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末。又，使用的制品不仅不会着色和从粉末自身的着色观点显示，L-抗坏血酸的含量按无水物换算优选是0.1％以下。
以下将基于实施例详细说明本发明。然而，本发明并不受到这些实施例的任何限定。
【实施例1】
(CGT酶的粗酶液的制造)
用ニュートリエント·アガー(Difco社出售的)的斜面培养基(スラント培地)在50℃培养嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-62株(独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心，保藏号FERM BP-11143)2天。从斜面培养基中取1白金耳菌体，植入包含可溶性淀粉2％、氯化铵0.5％、磷酸氢钾0.05％、硫酸镁0.025％及碳酸钾0.5％的接种用液体培养基中，50℃培养3天，此外，将种子培养得到的培养液植入除了用糊精替换可溶性淀粉之外与接种培养基相同组成的主要培养用液体培养基中，50℃振摇培养3天。离心分离该培养液除菌，用UF膜浓缩离心上清液至液量的约18分之一，得到CGT酶的粗酶液。
(含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造)
在20质量份水中加入液化马铃薯淀粉4质量份，加热溶解，加入3质量份L-抗坏血酸，调整pH至5.5，得到底物溶液。向其中按液化淀粉的固形物1g对应于100单位的比例加入上述CGT酶的粗酶液，以及按液化淀粉的固形物1g对应于250单位的比例加入异淀粉酶(株式会社林原制造)，55℃反应40小时，在生成抗坏血酸2-葡萄糖苷的同时还生成了2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽四糖基L-抗坏血酸等α-葡萄糖基-L-抗坏血酸。
加热本反应液使酶失活后，调节至pH4.5，向其中按液化淀粉的固形物1g对应于50单位的比例加入葡萄糖淀粉酶(天野酶株式会社出售，商品名“グルクザイムAF6”，6,000单位/g)55℃处理24小时，至α-葡萄糖基-L-抗坏血酸被分解成抗坏血酸2-葡萄糖苷，以及混在的糖被分解为D-葡萄糖。本反应液中抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率为约39％。又，本反应液中按无水物换算含有5-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸与6-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸的总量为约0.1％。
加热本反应液使酶失活，用活性炭脱色过滤，滤液用阳离子交换树脂(H+型)脱盐，随后，用阴离子交换树脂(OH-型)吸附L-抗坏血酸和抗坏血酸2-葡萄糖苷，水洗除去D-葡萄糖后，用0.5N盐酸溶液洗脱。此外，将该洗脱液浓缩至固形物约50％，进行使用具有10根填充了强酸性阳离子交换树脂(商品名“ダイヤイオンUBK550”，Na+型，三菱化学社制)的层析柱的模拟移动床式的柱层析。向层析柱中填充入浓缩至固形物约50％的洗脱液至层析柱的湿润树脂溶剂的约40分之一量，再向层析柱中加入填充量的约15倍的分离液用于洗脱出抗坏血酸2-葡萄糖苷，可收集到L-抗坏血酸含量较少、抗坏血酸2-葡萄糖苷含量较高的级分。收集的级分按无水物换算抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量为92.2％。
将该级分减压浓缩，得到浓度约72％的浓缩液，将其置入辅助结晶罐中，40℃下向其中加入2％作为分析用标准试剂出售的含有L-抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末(株式会社林原生物化学研究所出售，商品名“抗坏血酸2-葡萄糖苷999”，(代码编号：AG124，抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度99.9％以上))作为籽晶，稳定地搅拌并徐徐放冷2天温度降至15℃，析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶。
用筐型离心分离器收集析出的结晶，用少量冷的经纯化水喷雾洗净后，38℃下进行3小时老化、干燥后，用25℃的空气吹45分钟使之冷却，粉碎，得到含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其中抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度为99.5％、L-抗坏血酸和D-葡萄糖的总含量为0.1％、L-抗坏血酸含量不足0.1％、抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为97.0％以及粉末全体的还原能力为0.25％。本粉末的动态水分吸附量在检测限度之下。测定本粉末的粒度分布时发现包含91.2％粒径不足150μm的粒子，包含50.2％粒径53μm以上、不足150μm的粒子。对本粉末来说，用于实验1-4以及实验7分别相同的方法进行固结性实验和着色性实验，本粉末在固结性实验中被判定为“无固结”(－)；在着色性实验中被判定为“无着色或基本无着色”(－)。
本粉末与已用作准药品美白成分等的市售的已有的准药品级的粉末(商品名“AA2G”，株式会社林原生物化学研究所出售)相比，由于难以固结，且着色性均降低了，因此很容易处理。由于本粉末也属于含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，在这点上与已有的准药品级的粉末没有差别，因此与已有的准药品级的粉末相同，它可单独地或与其他成分相混合的，适于用作粉末状的食品原料、化妆品原料、准药品原料、药品原料等。又，由于L-抗坏血酸的含量在0.1％以下，因此将其以与已有的准药品级粉末相同的商品形态进行长时间保存时无需担心粉末自身的着色。
【实施例2】
<CGT酶的粗酶液的制造>
除用嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-27株(独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心，保藏号FERM BP-11142)替换嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-62株之外，用与实施例1相同的方法制备CGT酶的粗酶液。
<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>
在15质量份水中加入玉米淀粉5质量份，加热溶解，加入市售的液化酶后加热溶解，加入3质量份L-抗坏血酸，调整pH至5.5，得到基质溶液。向其中按玉米淀粉的固形物1g对应于100单位及1,000单位的比例分别加入上述CGT酶的粗酶液以及异淀粉酶(株式会社林原制造)，55℃反应50小时，生成抗坏血酸2-葡萄糖苷以及其他α-葡萄糖基-L-抗坏血酸。
加热本反应液使酶失活后，调节至pH4.5，向其中按液化淀粉的固形物1g对应于50单位的比例加入葡萄糖淀粉酶(ナガセケムテックス株式会社出售，商品名“グルコチーム#20000”，20,000单位/g)55℃反应24小时，至2-O-α-麦芽糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽三糖基-L-抗坏血酸、2-O-α-麦芽四糖基L-抗坏血酸等α-葡萄糖基-L-抗坏血酸被分解成抗坏血酸2-葡萄糖苷，以及混在的糖被分解为D-葡萄糖。本反应液中抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率为约37％。又，本反应液中按无水物换算含有5-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸与6-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸的总量为约0.2％。
加热本反应液使酶失活，用活性炭脱色过滤，滤液用阳离子交换树脂(H+型)脱盐，随后，用阴离子交换树脂(OH-型)吸附L-抗坏血酸和抗坏血酸2-葡萄糖苷，水洗除去D-葡萄糖后，用0.5N盐酸溶液洗脱。此外，进行使用多孔性树脂(商品名“トヨパールHW-40”，东ソー社制)的柱层析，收集高含抗坏血酸2-葡萄糖苷且L-抗坏血酸含量较少的级分。收集的级分按无水物换算抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量为89.5％。
将该级分减压浓缩，得到浓度约76％的浓缩液，将其置入辅助结晶罐中，40℃下向其中加入2％实施例1制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末作为籽晶，稳定地搅拌并徐徐放冷2天温度降至15℃，析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶。
用筐型离心分离器回收结晶，将结晶用少量的蒸馏水喷雾洗净后，35℃下进行8小时老化、干燥后，用25℃的空气吹15分钟使之冷却，粉碎，得到含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其中抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度为99.2％、L-抗坏血酸和D-葡萄糖的总量不足0.1％、L-抗坏血酸含量不足0.1％、抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为94.4％以及粉末全体的还原能力为0.15％。本粉末的动态水分吸附量在检测限度之下。测定本粉末的粒度分布时发现包含83.2％粒径不足150μm的粒子，包含57.1％粒径53μm以上、不足150μm的粒子。用本粉末根据实验1-4以及实验7相同的方法分别进行固结性实验和着色性实验，本粉末在固结性实验中被判定为“无固结”(－)；在着色性实验中被判定为“无着色或基本无着色”(－)。
本粉末与已用作准药品美白成分等的市售的已有的准药品级的粉末(商品名“AA2G”，株式会社林原生物化学研究所出售)相比，由于难以固结、且着色性均降低了，因此很容易处理。由于本粉末也属于含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，在这点上与已有的准药品级的粉末没有差别，因此与已有的准药品级的粉末相同，它可单独地或与其他成分相混合的，适于用作粉末状的食品原料、化妆品原料、准药品原料、药品原料等。又，由于L-抗坏血酸的含量在0.1％以下，因此将其以与已有的准药品级粉末相同的商品形态进行长时间保存时无需担心粉末自身的着色。
【实施例3】
<变异CGT酶的制备>
对来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(旧分类为嗜热脂肪芽孢杆菌)Tc-91株的CGT酶来说，其基因经克隆，从基因的碱基序列(序列表中SEQ ID NO：2示出的碱基序列)确定得到成熟型CGT酶的氨基酸序列(序列表中SEQ ID NO：1示出的氨基酸序列)，已知在该CGT酶的氨基酸序列上与分类为α-淀粉酶族的酶群共通地存在4个保守区域。又，如图5所示，已通过X射线结晶结构解析清楚了该CGT酶蛋白的立体结构，具有A、B、C及D这4个结构域(参照《工业用糖质酶手册》、讲谈社サイエンティフィク编集，讲谈社发行，第56-63页(1999年))。此外，已确定该CGT酶的3个催化残基，即，序列表中SEQ ID NO：1示出的氨基酸序列中第225位的天冬氨酸(D225)、第253位的谷氨酸(E253)、第324位的天冬氨酸(D324)(参照《工业用糖质酶手册》、讲谈社サイエンティフィク编集，讲谈社发行，第56-63页(1999年))。图6示出了该CGT酶的一级结构的模式图，按下述顺序向该CGT酶的基因DNA中导入变异，获得具有比野生型CGT酶的抗坏血酸2-葡萄糖苷生成性能更有优异的变异CGT酶。
即，本发明人采用持有的来自嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-91株(独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心，国内保藏号FERM P-2225(移交国际保藏：国际保藏号FERM BP-11273))的CGT酶的基因，改变及变异其编码的氨基酸序列，导入或缺失限制性内切酶切割位点等，将其重组入质粒载体，制作包含编码野生型CGT酶的基因的重组DNA。图7示出了该重组DNA“pRSET-iBTC12”的结构。随后，将得到的编码重组DNA中包含野生型CGT酶的活性残基的区域的基因片段(Nde I-EcoT221片段)切分出，用PCR变异试剂盒(商品名“GeneMorph PCR Mutagenesis Kit”，ストラタジーン社出售)在试验管内进行随机变异，经返回到最初的重组DNA，制作编码多种氨基酸置换产生的CGT酶变异体的基因混合物。将该变异基因合并入表达质粒载体中，制作重组DNA。用该重组DNA转化大肠杆菌，制作CGT酶变异体基因文库。
随后，从得到的基因库中分离出超过13,000株转化体(形質転換体)，从培养得到的菌体中制得包含CGT酶变异体的溶菌液作为粗酶液。得到的粗酶液经包含L-抗坏血酸和淀粉部分分解物的水溶液的作用，生成的α-葡萄糖基-L-抗坏血酸经葡萄糖淀粉酶处理，生成抗坏血酸2-葡萄糖苷，将其生成量与野生型CGT酶进行比较，筛选出能产生抗坏血酸2-葡萄糖苷高产量型CGT酶变异体的转化体。通过这个筛选过程，得到保持有变异CGT酶基因的目的转化体。解读该转化体保有的变异CGT酶基因的碱基序列，可发现序列表中SEQ ID NO：1示出的氨基酸序列中第228位的赖氨酸残基被置换为谷氨酸。
37℃下将保有编码上述CGT酶变异体的基因DNA的转化体在包含氨苄西林Na盐100μl/ml的T培养基(每1L培养基含有细菌用胰蛋白胨12g、细菌用酵母提取物24g、甘油5ml、17mM磷酸钾、72mM磷酸二钾)中需氧培养24小时。离心分离培养液得到的菌体经超声波破碎器(商品名“Ultra Sonic Homogenizer UH-600”，エムエステー株式会社制)破碎处理，破碎液上清液在60℃下热处理30分钟，使来自宿主的非耐热性蛋白质变性、失活。进而，离心分离热处理液，制造CGT酶变异体的部分纯化标准物。
<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>
在15质量份水中加入马铃薯淀粉5质量份，加入市售的液化酶加热溶解，加入3质量份L-抗坏血酸，调整pH至5.5，得到底物溶液。向其中按马铃薯淀粉1g对应于20单位的比例加入上述方法得到的CGT酶变异体的部分纯化标准物，65℃反应72小时，生成抗坏血酸2-葡萄糖苷和α-葡萄糖基-L-抗坏血酸。反应后加热反应液，使CGT酶变异体失活。向该反应液中按马铃薯淀粉1g对应100单位的比例加入葡萄糖淀粉酶剂(ナガセケムテックス株式会社出售，商品名“グルコチーム#20000”，20,000单位/g)，pH5.0、40℃下反应约18小时，至α-葡萄糖基-L-抗坏血酸被分解成抗坏血酸2-葡萄糖苷，以及混在的糖被分解为D-葡萄糖。本反应液中抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率为约40％。又，本反应液中按无水物换算含有5-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸与6-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸的总量为约0.3％。
加热本反应液使葡萄糖淀粉酶失活，用活性炭脱色过滤，浓缩滤液，用阴离子交换树脂(OH-型)吸附L-抗坏血酸和抗坏血酸2-葡萄糖苷，水洗除去D-葡萄糖后，用0.5N盐酸溶液洗脱。接着，与实施例1相同，进行使用强酸性阳离子交换树脂的模拟移动床式的柱层析，收集抗坏血酸2-葡萄糖苷含量高、L-抗坏血酸含量少的级分。收集的级分按无水物换算抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量为90.4％。
将其用阳离子交换树脂(H+型)脱盐后，减压浓缩，得到浓度约75％的浓缩液，将其置入辅助结晶罐中，向其中加入2％实施例1制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末作为籽晶，45℃下稳定地搅拌，并徐徐放冷2天温度降至10℃，析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶。回收得到的结晶，用少量冷去离子水喷雾洗净结晶后，38℃下进行3小时老化、干燥后，自然放冷一晚，粉碎，得到含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其中抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度为98.8％、L-抗坏血酸和D-葡萄糖的总量不足0.1％、L-抗坏血酸含量不足0.1％、抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为93.5％以及粉末全体的还原能力为0.31％。又，本粉末的动态水分吸附量在检测限度之下。测定本粉末的粒度分布时发现包含93.1％粒径不足150μm的粒子，包含48.2％粒径53μm以上不足150μm的粒子。用本粉末按实验1-4以及实验7相同的方法分别进行固结性实验和着色性实验，本粉末在固结性实验中被判定为“无固结”(－)；在着色性实验中被判定为“无着色或基本无着色”(－)。
本粉末与已用作准药品美白成分等的市售的已有的准药品级的粉末(商品名“AA2G”，株式会社林原生物化学研究所出售)相比，由于难以固结、且着色性均降低了，因此很容易处理。由于本粉末也属于含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，在这点上与已有的准药品级的粉末没有差别，因此与已有的准药品级的粉末相同，它可单独地或与其他成分相混合的，适于用作粉末状的食品原料、化妆品原料、准药品原料、药品原料等。又，由于L-抗坏血酸的含量在0.1％以下，因此将其以与已有的准药品级粉末相同的商品形态进行长时间保存时无需担心粉末自身的着色。
【实施例4】
<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>
除了与CGT酶一起还按淀粉固形物1g对应500单位的比例加入异淀粉酶(株式会社林原制造)在55℃下进行反应之外，用与实施例3相同的方法进行酶反应。葡萄糖淀粉酶处理后的反应液中L-抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率约为45％。又，本反应液按无水物换算含有5-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸与6-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸的总量为约0.2％。与实施例3相同地进行纯化、收集的级分中抗坏血酸2-葡萄糖苷含量按无水物换算为91.8％。
进行与实施例3相同的结晶化，回收得到的结晶，用少量冷去离子水喷雾洗净结晶后，38℃下进行3小时老化、干燥后，自然放冷一晚，粉碎，得到含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其中抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度为99.2％、L-抗坏血酸和D-葡萄糖的总量不足0.1％、L-抗坏血酸含量不足0.1％、抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为95.6％以及粉末全体的还原能力为0.25％。又，本粉末的动态水分吸附量在检测限度之下。测定本粉末的粒度分布时发现包含92.7％粒径不足150μm的粒子，包含44.2％粒径53μm以上不足150μm的粒子。用本粉末按实验1-4以及实验7相同的方法分别进行固结性实验和着色性实验，本粉末在固结性实验中被判定为“无固结”(－)；在着色性实验中被判定为“无着色或基本无着色”(－)。
本粉末与已用作准药品美白成分等的市售的已有的准药品级的粉末(商品名“AA2G”，株式会社林原生物化学研究所出售)相比，由于难以固结、且着色性均降低了，因此很容易处理。由于本粉末也属于含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，在这点上与已有的准药品级的粉末没有差别，因此与已有的准药品级的粉末相同，它可单独地或与其他成分相混合的，适于用作粉末状的食品原料、化妆品原料、准药品原料、药品原料等。又，由于L-抗坏血酸的含量在0.1％以下，因此将其以与已有的准药品级粉末相同的商品形态进行长时间保存时无需担心粉末自身的着色。
【实施例5】
<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>
在15质量份水中加入马铃薯淀粉5质量份，加入市售的液化酶加热溶解，加入3质量份L-抗坏血酸，调整pH至5.5，得到基质溶液。向其中分别按马铃薯淀粉1g对应于100单位以及1,000单位的比例加入CGT酶(株式会社林原生物化学研究所制造，来自嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-91株(独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心，国内保藏号FERMP-2225(移交国际保藏：国际保藏号FERM BP-11273))和异淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，55℃下反应约50小时，生成抗坏血酸2-葡萄糖苷以及其他的至α-葡萄糖基-L-抗坏血酸。加热该反应液使酶失活后，调节至pH4.5，向其中按马铃薯淀粉的固形物1g对应于50单位的比例加入葡萄糖淀粉酶(ナガセケムテックス株式会社出售，商品名“グルコチーム#20000”，20,000单位/g)，55℃处理24小时，至α-葡萄糖基-L-抗坏血酸被分解成抗坏血酸2-葡萄糖苷，以及混在的糖被分解为D-葡萄糖。本反应液中抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率为约38％。又，本反应液中按无水物换算含有5-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸与6-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸的总量为约0.4％。
加热本反应液使酶失活，用活性炭脱色过滤，滤液用阳离子交换树脂(H+型)脱盐，随后，用阴离子交换树脂(OH-型)吸附L-抗坏血酸和抗坏血酸2-葡萄糖苷，水洗除去D-葡萄糖后，用0.5N盐酸溶液洗脱。此外，进行使用多孔性树脂(商品名“トヨパールHW-40”，东ソー社制)的柱层析，收集高含抗坏血酸2-葡萄糖苷且L-抗坏血酸含量少的级分。收集的级分按无水物换算抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量为87.6％。
将该级分减压浓缩，得到浓度约76％的浓缩液，将其置入辅助结晶罐中，40℃下向其中加入2％实施例1制造的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末作为籽晶，稳定地搅拌并徐徐放冷2天温度降至15℃，析出抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶。用筐型离心分离器回收结晶，用少量冷的蒸馏水喷雾洗净后，35℃下进行8小时老化、干燥后，用20℃的空气吹10分钟使之冷却，粉碎，得到含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其中抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度为98.5％、L-抗坏血酸和葡萄糖的总含量不足0.1％、L-抗坏血酸含量不足0.1％、抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为94.8％以及粉末全体的还原能力为0.15％。本粉末的动态水分吸附量在检测限度之下。测定本粉末的粒度分布时发现包含83.0％粒径不足150μm的粒子，包含57.7％粒径53μm以上不足150μm的粒子。用本粉末根据实验1-4以及实验7相同的方法分别进行固结性实验和着色性实验，本粉末在固结性实验中被判定为“无固结”(－)；在着色性实验中被判定为“无着色或基本无着色”(－)。
本粉末与已用作准药品美白成分等的市售的已有的准药品级的粉末(商品名“AA2G”，株式会社林原生物化学研究所出售)相比，由于固结性和着色性均降低了，因此很容易处理。由于本粉末也属于含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，在这点上与已有的准药品级的粉末没有差别，因此与已有的准药品级的粉末相同，它可单独地或与其他成分相混合的，适于用作粉末状的食品原料、化妆品原料、准药品原料、药品原料等。又，由于L-抗坏血酸的含量在0.1％以下，因此将其以与已有的准药品级粉末相同的商品形态进行长时间保存时无需担心粉末自身的着色。
【比较例1】
<含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造>
除了不使用异淀粉酶之外采取与实施例5相同的方法，使用来自嗜热脂肪土芽孢杆菌Tc-91株(独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心，国内保藏号FERM P-2225(移交国际保藏：国际保藏号FERM BP-11273))的CGT酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，制造含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，在葡萄糖淀粉酶处理后的反应液中抗坏血酸2-葡萄糖苷生成率为约28％。又，本反应液中抗坏血酸2-葡萄糖苷的生成率为约28％。又，本反应液中按无水物换算含有5-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸与6-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸的总量为约1.0％。将该反应液与实施例5相同进行脱色、脱盐、纯化，收集高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的级分，在高含抗坏血酸2-葡萄糖苷的级分中抗坏血酸2-葡萄糖苷的含量按无水物换算为87.7％。
将该高含的级分与实施例5相同地进行浓缩，使抗坏血酸2-葡萄糖苷结晶化，将其收集、老化、干燥后，冷却，得到含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，其中抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度为98.5％、L-抗坏血酸和D-葡萄糖的总量0.4％、L-抗坏血酸含量不足0.2％、抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为89.1％以及粉末全体的还原能力为1.17％。又，本粉末的动态水分吸附量为0.04％。测定本粉末的粒度分布时发现包含78.1％粒径不足150μm的粒子，包含50.2％粒径53μm以上不足150μm的粒子。
用本粉末按实验1-4以及实验7相同的方法分别进行固结性实验和着色性实验，本粉末在固结性实验中被判定为“固结”(+)；在着色性实验中被判定为“着色”(+)。由于本粉末中抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度不足90％，且动态水分吸附量为0.04％，超过0.01％，因此，在商品流动的保存期间恐怕会出现固结，将其用作食品原料、化妆品原料、准药品原料、药品原料等恐怕存在较大障碍。又，L-抗坏血酸的含量高达0.2％，因此在商品流动的保存期间恐怕粉末自身会出现着色。
<保存性实验>
用实施例1～5以及比较例1制得的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末根据与实验5-3相同的方法进行保存性实验。表8中一并示出了本保存性实验得到的结果以及各实施例和比较例中确定的固结性实验的结果。
【表8】
| 被检样品 | 保存性 | 固结性 |
| 实施例1 | － | － |
| 实施例2 | － | － |
| 实施例3 | － | － |
| 实施例4 | － | － |
| 实施例5 | － | － |
| 比较例1 | + | + |
从表8可见，在将各粉末以实际的商品形态放置、按照10kg入袋的状态保存45天的保存性实验中，实施例1～5的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末均被判定为“无固结”(－)，与此相对的，比较例1的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末被判定为“固结“(+)。这个结果与固结性实验的结果具有良好地一致性。
由上可知，上述实验1～7以及实施例1～5示出的本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末由于抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的结晶度为90％以上，且动态水分吸附量为检测界限以下的0.01％以下，因此，通常不含有通常液相色谱可能检测的水平的属于制造方法特有的夹杂物的L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖，并且，抗坏血酸2-葡萄糖苷纯度为超过98.0％不足99.9％，更具体地，纯度为98.5％(参照实施例5)以上99.8％以下(参照实验2)，达不到试剂级的粉末的纯度99.9％，尽管从抗坏血酸2-葡萄糖苷的纯度来看与试剂级的粉末的水平有一定区别，但在固结性实验中被判定为“无固结”(－)，是容易处理的粉末。
【实施例6】
<维生素C粉末制剂(用作食品原料的例子)>
将20质量份用实施例1～5任一种方法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末作为粉末状食品原料使用，向其中加入70质量份蔗糖、10质量份糊精、适量香料，用混合机搅拌混合制造维生素C粉末制剂。本品可将含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末与其他粉末一起用混合机较为容易地混合均匀，因此在制造过程上不存在任何制造障碍。本品是易于与其它食品原料混合的，长时间保存也不难以引起褐变和固结的维生素C粉末制剂。本品或配合了本品的组合物由于具有维生素C的生理功能，因此可出于维持皮肤、粘膜的健康以及美白的目的经口摄取。
【实施例7】
<美白粉(用作化妆品原料的适用例)>
(配合配方)
<制造方法>
在混合机中加入α,α-海藻糖、聚乙二醇6000、硅石、香料、着色剂以及防腐剂，得到均匀混合的粉末，向其中加入实施例1～5任一种方法得到的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末，均匀搅拌，混合，制得美白粉。本品可将含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末与其他粉末一起用混合机较为容易地混合均匀，因此在制造过程上不存在任何制造障碍。本品是易于与其它化妆品原料混合的，长时间保存也不会引起褐变和固结的美白粉。本品或配合了本品的组合物可作为皮肤外用剂出于美白目的使用。
【产业上的利用性】
本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末由于与已有的准药品级的粉末相比更难以固结，因此比已有的准药品级粉末更容易处理，可作为食品原料、化妆品原料、准药品原料或药品原料用于食品、化妆品、准药品、药品、饲料、饵料、化学品、工业品等诸多领域中。又，依据本发明的含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的制造方法是能从属于天然原料的淀粉及L-抗坏血酸获得期望量的这种含有抗坏血酸2-葡萄糖苷无水结晶的粉末的廉价的制造方法，因此可用于淀粉糖化物的制造工业以及维生素衍生物工业中。
【符号说明】
在图5和6中，
A：CGT酶的结构域A
B：CGT酶的结构域B
C：CGT酶的结构域C
D：CGT酶的结构域D
在图5中，
螺旋：α-螺旋结构
板状箭头符号：β-折叠片结构
细小部分：环状结构
在图6中，
【1】：与α-淀粉酶家族共有的保守区域1
【2】：与α-淀粉酶家族共有的保守区域2
【3】：与α-淀粉酶家族共有的保守区域3
【4】：与α-淀粉酶家族共有的保守区域4
●：催化残基
D225：作为CGT酶中的催化残基之一的第225位的天冬氨酸残基
E253：作为CGT酶中的催化残基之一的第253位的谷氨酸残基
D324：作为CGT酶中的催化残基之一的第324位的天冬氨酸残基
在图7中，
pUC ori：质粒pUC的复制原点
T7：T7启动子
白箭头符号(Amp)：氨苄西林抗性基因
黑箭头符号：CGT酶基因
【序列表】
Claims (2)
1.皮肤外用剂，含有粉末作为化妆品原料，所述粉末含有具有如下(a)至(d)的特征的2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶：
(a)按无水物换算含有超过98.0质量％且不足99.9质量％的2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸；
(b)基于粉末X射线衍射曲线算出的2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的结晶度为90％以上99.5％以下；
(c)含有：
占粉末全体70质量％以上的粒径不足150μm的粒子，以及
占粉末全体40～60质量％的粒径53μm以上且不足150μm的粒子；且
(d)粉末全体的还原能力不足1％。
2.权利要求1的皮肤外用剂，其特征是，所述含2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸无水结晶的粉末含有L-抗坏血酸和/或D-葡萄糖，且按无水物换算L-抗坏血酸的量为0.1质量％以下。
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