KR101064941B1 - 2-Ｏ-α-Ｄ-글루코실-Ｌ-아스코르빈산 무수결정 함유 분말과 그의 제조방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
종래로부터 범용되고 있는 의약부외품급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 비해 유의하게 고결하기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말과 그의 제조방법 및 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.
무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를98.0중량% 초과하고 99.9중량% 미만 함유하며, 분말 X선 회절 프로필에 기초하여 산출되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나 질소기류 하에서 분말 중의 유리 수분을 제거한 후, 온도 25℃, 상대습도 35중량%에서 12시간 동안 유지한 때의 동적 수분 흡착량이 0.01중량% 이하인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말, 및 그의 제조방법 및 용도를 제공하는 것에 의해 해결한다.
무수물 환산으로 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르빈산을 98.0중량% 초과하고 99.9중량% 미만 함유하며, 질소기류 하에서 분말 중의 수분을 제거한 후, 온도 25℃, 상대습도 35중량%에서 12시간 동안 유지한 때의 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하이며, D-글루코스 및/또는 L-아스코르빈산을 함유하고, 또한, 분말 전체의 환원력이 1% 미만인 것을 특징으로 하는 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말을 제공한다.
무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를98.0중량% 초과하고 99.9중량% 미만 함유하며, 분말 X선 회절 프로필에 기초하여 산출되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나 질소기류 하에서 분말 중의 유리 수분을 제거한 후, 온도 25℃, 상대습도 35중량%에서 12시간 동안 유지한 때의 동적 수분 흡착량이 0.01중량% 이하인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말, 및 그의 제조방법 및 용도를 제공하는 것에 의해 해결한다.
무수물 환산으로 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르빈산을 98.0중량% 초과하고 99.9중량% 미만 함유하며, 질소기류 하에서 분말 중의 수분을 제거한 후, 온도 25℃, 상대습도 35중량%에서 12시간 동안 유지한 때의 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하이며, D-글루코스 및/또는 L-아스코르빈산을 함유하고, 또한, 분말 전체의 환원력이 1% 미만인 것을 특징으로 하는 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말을 제공한다.
Description
본 발명은 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말과 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이고, 상세하게는 종래품에 비해 유의하게 고결하기 어려운 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말과 그의 제조방법, 및 그의 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재 및 의약품 소재로서의 용도에 관한 것이다.
L-아스코르빈산은 우수한 생리활성이나 항산화작용 때문에 종래부터 음식품, 화장품 등을 포함하여 여러 가지의 용도에 사용되고 있다. 그러나, L-아스코르빈산은 직접 환원성 때문에 불안정하고, 쉽게 산화분해되며, 생리활성을 쉽게 잃는다는 큰 결점을 가지고 있다. 이 L-아스코르빈산의 결점을 해소하기 위하여, 본 출원인은 특허문헌 1에 있어서 공동출원인 중 1인으로서 L-아스코르빈산의 2위치의 수산기에 1분자의 D-글루코스가 결합한 2-0-α-D-글루코실-L-아스코르빈산(이하, 본 명세서에서는 「아스코르빈산 2-글루코시드」로 약칭함)을 개시하였다. 이 아스코르빈산 2-글루코시드는 직접 환원성을 나타내지 않고 안정하며, 또한, 생체내에서는 생체내에 원래 존재하는 효소에 의해 L-아스코르빈산과 D-글루코스에 분해되어 L-아스코르빈산 본래의 생리활성을 발휘한다는 획기적인 특성을 가지고 있다. 특허문헌 1에 개시된 제조방법에 의하면, 아스코르빈산 2-글루코시드는 L-아스코르빈산과 α-글루코실 당화합물을 함유하는 용액에 시클로말토덱스트린·글루카노트랜스퍼라아제(이하, 「CGTase」로 약칭함) 또는α-글루코시다아제 등의 당 전이 효소를 작용시킴으로써 생성된다.
또한, 본 출원인은 특허문헌 2에서 아스코르빈산 2-글루코시드의 과포화 용액으로부터 아스코르빈산 2-글루코시드를 결정화하는 것에 성공하였고, 결정 아스코르빈산 2-글루코시드와 그것을 포함하는 아스코르빈산 2-글루코시드 결정 함유 분말을 개시하였다. 또한, 아스코르빈산 2-글루코시드 결정으로는 현재 무수결정밖에 알려져 있지 않다. 또, 비특허문헌 1 및 2에는 아스코르빈산 2-글루코시드 결정에 대하여 X선에 의한 구조 해석의 결과가 보고되어 있다.
또한, 본 출원인은 특허문헌 3 및 4에서 효소반응에 의해 생성한 아스코르빈산 2-글루코시드를 함유하는 용액을 강산성 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피에 제공하여 아스코르빈산 2-글루코시드의 고함유 분획을 채취하는 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유물의 제조방법을 개시하였다. 또, 본 출원인은 특허문헌 5에서 효소반응에 의해 생성한 아스코르빈산 2-글루코시드를 함유하는 용액으로부터 음이온 교환막을 사용하는 전기투석에 의해 L-아스코르빈산이나 당류 등의 협잡물(impurity)을 제거하는 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유물의 제조방법을 개시하고, 특허문헌 6에서는 아스코르빈산 2-글루코시드를 함유하는 용액을 음이온 교환수지와 접촉시켜서, 음이온 교환수지에 흡착된 성분을 선택적으로 탈착시켜서 아스코르빈산 2-글루코시드의 고함유 분획을 얻는 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유물의 제조방법을 개시하였다.
또한, 본 출원인은 특허문헌 7에서 L-아스코르빈산과 α-글루코실 당화합물을 함유하는 용액에 α-이소말톡실글루코 당질 생성 효소, 또는, α-이소말톡실글루코 당질 생성 효소와 CGTase를 작용시켜서 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시키는 아스코르빈산 2-글루코시드의 제조방법을 개시하였다. 또, 본 출원인에 의한 특허문헌 8 및 9에는 각각 α-이소말톡실글루코 당질 생성 효소 및 α-이소말톡실 전이효소가 L-아스코르빈산에 대한 당 전이를 촉매하여 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성하는 것이 개시되어 있다.
또, 아스코르빈산 2-글루코시드의 용도에 관하여는, 예를 들면, 특허문헌 10 내지 29에 나타낸 바와 같이 다수 제안되어 있다. 아스코르빈산 2-글루코시드는 우수한 특성 때문에 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 또는 의약품 소재로서 종래부터의 L-아스코르빈산의 용도는 물론, L-아스코르빈산이 불안정하기 때문에 종래 L-아스코르빈산을 사용할 수가 없었던 그 이외의 용도에도 넓게 사용되기에 이르고 있다.
상술한 바와 같이, 아스코르빈산 2-글루코시드는 현재 L-아스코르빈산과 전분질을 원료로 하여, 여러 가지의 당 전이 효소를 사용하여 제조할 수 있다는 것이 알려져 있다. 그러나, 본 출원인이 지금까지 얻은 지견에 의하면, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 당 전이 효소로서 CGTase를 작용시키는 방법이 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 가장 높고, 공업적으로 우수한 방법이다. 이 지견에 기초하여, 본 출원인은 L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시키는 방법에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하고, 이것을 화장품·의약부외품 소재 및 식품 소재로서 각각 상품명 「AA2G」(주식회사하야시바라생물화학연구소(Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.) 판매) 및 상품명 「아스코프레쉬(ASCOFRESH)」(주식회사하야시바라상사(Hayashibara Shoji, Inc.) 판매)로 하여 판매하고 있다(이하, 이들 화장품·의약부외품 소재 및 식품 소재로서 판매되고 있는 종래의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 「의약부외품급의 분말」로 약칭함).
그러나, 의약부외품급의 분말은 제품 규격상의 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 98.0중량% 이상으로 비교적 고순도이며, 제조 직후에는 분말로서의 양호한 유동성을 구비하고 있음에도 불구하고, 고온, 고습의 환경 하에 장기간 두면, 자중이나 흡습(moisture absorbency)에 의해 고결한다는 결점을 가지고 있다. 이와 같은 결점을 감안하여, 의약부외품급의 분말은 10kg씩 폴리에틸렌제의 봉지에 담아 건조제와 함께 뚜껑 달린 스틸캔에 넣은 상품형태로 판매되고 있으나, 본 발명자들이 얻은 그 후의 지견에 의하면, 이와 같은 상품형태라도 의약부외품급의 분말은 보존기간이 장기간에 이르면, 때때로 고결하여 분말로서의 유용성이 손상되어 버린다는 문제점을 가지고 있다. 화장품 소재나 의약부외품 소재, 또는 식품 소재로서 사용되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 고결하면, 본래 원료 소재가 유동성을 가지는 분말인 것을 전제로 제조 플랜트가 설계되어 있는 경우에는 원료 소재의 수송이나 체질(seiving), 혼합 등의 공정에 지장을 초래할 우려가 있다.
비특허문헌 1: 만다이 타카히코(Takahiko, MANDAI) 등, 「카보하이드레이트 리서치」(Carbohydrate Research), 제232권, 197~205 페이지(1992년)
비특허문헌 2: 이노우에 유타카(Yutaka, INOUE) 등, 「인터내셔널 저널 오브 파머스틱스」(International Journal of Pharmaceutics), 제331권, 38~45 페이지(2007년)
본 발명은 상기의 결점을 해결하기 위하여 이루어진 것으로, 범용되고 있는 의약부외품급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 비해 유의하게 고결하기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말과 그의 제조방법 및 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.
상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 고결성에 대해 연구를 거듭하여 본 출원인이 분석용의 표준 시약으로 판매하고 있는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(상품명 「아스코르빈산 2-글루코시드 999」, 코드번호: AG124, 주식회사하야시바라생물화학연구소 판매)(이하, 「시약급의 분말」로 약칭함)은 의약부외품급의 분말이 고결하는 조건 하에서도 고결하지 않고, 분말로서의 성상을 유지하고 있는 것을 발견하였다. 이 시약급의 분말은 의약부외품급의 분말과 동일하고, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시키는 공정을 거쳐서 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 정제, 농축하여 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시키고, 이것을 채취함으로써 제조되는 분말이지만, 통상의 공정에 추가하여 일단 얻어진 결정을 용해하여 다시 결정화하는 재결정 공정이나 재결정 공정으로 얻어진 결정을 순수 등을 사용하여 반복 세정하는 세정 공정을 추가함으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도를 99.9중량% 이상이라는 상당히 고순도의 레벨까지 높이고 있다는 점에서 의약부외품급의 분말과는 다르다. 따라서, 의약부외품급의 분말에서도 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도를 99.9중량% 이상까지 높이면 고결하기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 얻어질 수 있을 것으로 추측된다..
그러나, 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도를 99.9중량% 이상이라는 고순도로 하려면, 상술한 바와 같이 통상의 제조공정에 추가하여 재결정 공정이나 순수 등을 사용한 반복의 세정 공정을 추가할 필요가 있고, 제조에 필요로 하는 시간과 노력이 늘어날 뿐만 아니라, 재결정 공정이나 세정 공정에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 손실을 피하지 못하고, 제품의 제조수율이 저하하여 제조비용이 큰 폭으로 상승한다는 문제가 있다. 따라서, 의약부외품급의 분말보다 고결하기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻는 것을 목적으로 하여 단순히 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도를 99.9중량% 이상까지 높인다는 선택지는 현실적이지 않다.
그래서, 본 발명자들은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 고결성에 대해 더 연구를 거듭하여 여러 가지 시행착오를 반복한 결과, 분말 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 종래의 의약부외품급의 분말과 같은 레벨이거나, 시약급의 순도에 미치지 않은 레벨이어도 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도를 90% 이상으로 하거나, 또는, 분말의 동적 수분 흡착량을 0.01중량% 이하로 한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 의약부외품급의 분말보다 유의하게 고결하기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말임을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 결정화도나 동적 수분 흡착량이 상기한 레벨에 있는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 공업적 규모로 제조하는 방법에 대해 연구를 거듭한 결과, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase와 글루코아밀라아제를 순서대로 작용시켜서, 용액 중에 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성률 35중량% 이상의 고율로 생성시키는 동시에, 상기 용액을 정제하여, 용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86중량% 초과까지 높임으로써, 상기 용액으로부터 정석한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 포함하는 분말은 비교적 용이하게 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도를 90% 이상으로 할 수가 있는 동시에, 분말의 동적 수분 흡착량을 0.01중량% 이하로 할 수가 있음을 발견하였다.
또, 본 발명자들은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나, 동적 수분 흡착량이 0.01중량% 이하인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 종래의 의약부외품급의 분말에 비해 유의하게 고결하기 어렵기 때문에, 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 및 의약품 소재로서 취급이 용이하고, 다대한 의의와 가치가 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0중량% 초과하고 99.9중량% 미만 함유하며, 분말 X선 회절 프로필에 기초하여 산출되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상인 것을 특징으로 하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제공함으로써 상기의 과제를 해결하는 것이다.
또, 본 발명은 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0중량% 초과하고 99.9중량% 미만 함유하며, 질소기류 하에서 분말 중의 수분을 제거한 후, 온도 25℃, 상대습도 35%에서 12시간 동안 유지한 때의 동적 수분 흡착량이 0.01중량% 이하인 것을 특징으로 하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제공함으로써 상기의 과제를 해결하는 것이다.
바람직한 제1의 태양에 있어서 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 입경 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 70중량% 이상, 입경 53μm 이상 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 40 내지 60중량% 함유하고 있다. 또, 바람직한 제1의 태양에 있어서 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코스를 함유하고, 또한, 분말 전체의 환원력이 1중량% 미만이다. 또, 보다 바람직한 다른 제1의 태양에 있어서 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 L-아스코르빈산량이 무수물 환산으로 0.1중량% 이하이다.
상기와 같은 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 전형적으로는 L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시키는 공정을 거쳐서 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유한 용액으로부터 제조되는 분말이다.
또한, 본 발명은 L-아스코르빈산과 전분질을 포함하는 용액에 CGTase와 글루코아밀라아제를 순서대로 작용시켜서, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35중량% 이상인 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 얻는 공정; 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 정제하여 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86중량% 초과로 하는 공정; 아스코르빈산 2-글루코시드를 무수물 환산으로 86중량% 초과 함유하는 용액으로부터 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시키는 공정; 석출한 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 채취하는 공정; 채취된 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 숙성, 건조하여, 필요에 따라서 분쇄하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법을 제공함으로써 상기의 과제를 해결하는 것이다.
본 발명의 제조방법에서 사용하는 CGTase로는 L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase와 글루코아밀라아제를 순서대로 작용시켰을 때에, 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성률 35중량% 이상의 고율로 생성시킬 수가 있는 한, 그 기원이나 유래에 특별한 제한은 없으며, 천연의 효소이어도 좋고, 유전자 재조합에 의해 얻어지는 효소이어도 좋다. 단, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이라는 관점에서는 후술하는 지오바실러스 스테아로테르모필루스(Geobacillus stearothermophilus) Tc-62주 유래의 CGTase, 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-27주 유래의 CGTase, 또는 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-91주 유래의 CGTase를 유전자 재조합 기술에 의해 변이시킨 변이 CGTase를 사용하는 것이 바람직하고, 그 중에서도 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-62주가 생산하는 CGTase가 아스코르빈산 2-글루코시드에 대한 생성률을 높게 할 수가 있으므로, 가장 바람직하다.
사용하는 글루코아밀라아제에도 특별히 제한은 없고, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase와 글루코아밀라아제를 순서대로 작용시켰을 때에, 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성률 35중량% 이상의 고율로 생성시킬 수가 있는 한, 그 기원이나 유래에 특별한 제한은 없으며, 천연의 효소이어도 좋고, 유전자 재조합에 의해 얻어지는 효소이어도 좋다.
또, 원료로 사용하는 전분질의 종류에 의해 달라지는데, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시킬 때, CGTase와 함께 이소아밀라아제나 풀룰라나아제 등의 전분 절지 효소(starch debranching enzyme)를 작용시켜서 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률을 높이도록 하여도 좋다.
또한, 본 발명의 제조방법의 바람직한 제1의 태양에 있어서 상기 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 정제하여 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86중량% 초과로 하는 공정은 여과, 탈염한 효소반응액을 음이온 교환수지에 접촉시켜서 아스코르빈산 2-글루코시드와 L-아스코르빈산을 흡착시키고, 정제수로 D-글리코스 등의 당류를 용출제거한 후, 용리액으로서 0.5N 미만의 염산이나 염류의 수용액을 칼럼에 공급하여 아스코르빈산 2-글리코시드와 L-아스코르빈산을 용출하고, 이 용출액을 농축하여 양이온 교환수지 또는 다공성 합성수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피에 제공하고, 용리액에 의해 용출하는 방법에 의해 실시된다. 특히 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피로서 강산성 양이온 교환수지를 충전제로 하는 의사이동상식(擬似移動床式)을 사용하는 경우에는 목적으로 하는 아스코르빈산 2-글루코시드 함량이 86중량% 초과의 분획을 효율적이고 우수한 수율로 얻어지므로 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말로 이루어지는 분말상의 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 또는 의약품 소재를 제공함으로써 상기의 과제를 해결하는 것이다.
본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 유리하게 사용되는 식품 소재로는 비타민C 강화제, 콜라겐 생산 증강제, 미백제, 정미 개선제(taste-improving agent), 품질 개선제, 갈변 방지제, 산미료, 부형제, 증량제, 항산화제 등이, 화장품 소재로는 미백제, 세포 부활제, 콜라겐 생산 증강제, 비타민C 강화제, 정미 개선제, 품질 개선제, 갈변 방지제, 산미료, 부형제, 증량제, 안정제, 항산화제 등이, 의약부외품 소재로는 미백제, 세포 부활제, 콜라겐 생산 증강제, 비타민C 강화제, 정미 개선제, 품질 개선제, 갈변 방지제, 산미료, 부형제, 증량제, 안정제, 항산화제 등이, 그리고, 의약품 소재로는 미백제, 세포 부활제, 콜라겐 생산 증강제, 장기 보존제(agent for preserving organs), 래디칼 장해 억제제, 비타민C 강화제, 갈변 방지제, 부형제, 증량제, 안정제, 항산화제 등이 각각 예로 들 수 있다.
본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 종래부터 화장품 소재, 의약부외품 소재, 식품 소재 등으로 시판되고 있는 의약부외품급의 분말에 비해 유의하게 고결하기 어렵기 때문에, 보존, 보관시에나 유통시에 있어서도 분말로서의 유동성이 손상되기 어렵고, 취급이 용이하다는 이점을 가지고 있다. 또, 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 종래의 의약부외품급의 분말에 비해 유의하게 고결하기 어려움에도 불구하고, 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도를 시약급의 분말의 레벨까지 높일 필요가 없기 때문에, 그것의 제조 시에는 재결정 공정이나 결정을 반복 세정하는 공정을 추가할 필요가 없다. 따라서, 제품의 제조수율이 큰폭으로 저하하지 않고 염가로 제조할 수가 있다는 이점을 가지고 있다.
또, 본 발명의 제조방법에 의하면, L-아스코르빈산과 전분질을 원료로 하여 종래의 의약부외품급의 분말의 제조방법과 공정적으로 바뀌지 않는 제조방법에 따라, 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조할 수가 있으므로, 의약부외품급의 분말의 제조에 종래부터 필요로 했던 것과 큰 차이가 없는 시간, 노력, 제조설비 및 비용과 의약부외품급의 분말에 비해 유의하게 고결하기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조할 수가 있다는 우수한 이점이 얻어진다.
또한, 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말로 이루어지는 분말상의 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재 및 의약품 소재에 의하면, 분말상 소재를 구성하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 유의하게 고결하기 어렵기 때문에, 보존, 보관은 물론, 취급이 용이함과 동시에, 원료가 유동성이 있는 분말인 것을 전제로 만들어진 제조 플랜트에 사용하여도 원료의 수송이나 체질, 혼합 등의 과정에 지장을 초래할 우려가 없다는 이점이 얻어진다.
또, 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 식품 소재 등에 요구되는 입도 분포, 즉, 입경 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 70중량% 이상, 또한, 입경 53μm 이상 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 40 내지 60중량% 함유하는 입도 분포에 용이하게 조정할 수가 있으므로, 이것을 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 또는 의약품 소재로 사용하여도 종전의 제조공정이나 원료규격을 바꾸지 않고 종전대로 사용할 수 있다는 이점이 얻어진다. 또한, 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코스를 함유하고, 또한, 분말 전체의 환원력이 1중량% 미만인 경우에는, L-아스코르빈산과 전분질을 원료로 하여 제조된 분말임에도 불구하고, 아미노산이나 단백질 등의 분자 내에 아미노기를 가지는 타성분과 혼합하여도 변색 등의 품질저하를 야기할 우려가 없다는 이점이 얻어진다. 특히 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에서의 L-아스코르빈산 함량이 무수물 환산으로 0.1중량% 이하인 경우에는 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 분말 단독으로 장기간 보존한 경우에도 분말 자체가 담갈색으로 착색할 우려가 없고, 실질적으로 무착색이고 백색의 분말로 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재 및 의약품 소재로 이용할 수가 있다.
도 1은 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 특성 X선에 의한 분말 X선 회절 패턴의 일례이다.
도 2는 실질적으로 무정형(amorphos) 부분으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말의 특성 X선에 의한 분말 X선 회절 패턴의 일례이다.
도 3은 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 싱크로트론 방사광(synchrotron radiation)에 의한 분말 X선 회절 패턴의 일례이다.
도 4는 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말의 싱크로트론 방사광에 의한 분말 X선 회절 패턴의 일례이다.
도 5는 지오바실러스속에 속하는 미생물 유래의 CGTase의 고차구조(higher-order structure)를 도시하는 모식도이다.
도 6은 지오바실러스속에 속하는 미생물 유래의 CGTase의 촉매잔기 및 보존영역을 도시하는 모식도이다.
도 7은 본 발명에서 사용한 지오바실러스속에 속하는 미생물 유래의 CGTase 유전자를 포함하는 재조합 DNA 「pRSET-iBTC12」의 구조 및 제한효소 인식부위를 표시하는 도면이다.
도 2는 실질적으로 무정형(amorphos) 부분으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말의 특성 X선에 의한 분말 X선 회절 패턴의 일례이다.
도 3은 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 싱크로트론 방사광(synchrotron radiation)에 의한 분말 X선 회절 패턴의 일례이다.
도 4는 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말의 싱크로트론 방사광에 의한 분말 X선 회절 패턴의 일례이다.
도 5는 지오바실러스속에 속하는 미생물 유래의 CGTase의 고차구조(higher-order structure)를 도시하는 모식도이다.
도 6은 지오바실러스속에 속하는 미생물 유래의 CGTase의 촉매잔기 및 보존영역을 도시하는 모식도이다.
도 7은 본 발명에서 사용한 지오바실러스속에 속하는 미생물 유래의 CGTase 유전자를 포함하는 재조합 DNA 「pRSET-iBTC12」의 구조 및 제한효소 인식부위를 표시하는 도면이다.
1. 용어의 정의
본 명세서에서 이하의 용어는 이하의 의미를 가지고 있다.
<결정화도>
본 명세서에서 언급하는 「아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도」란, 하기 식 [1]에 의해 정의되는 수치를 의미한다.
식 [1]:
식 [1]에서 해석값 H100, H0, Hs를 구하는 기초가 되는 분말 X선 회절 프로필(profile)은 통상 반사식 또는 투과식의 광학계를 구비한 분말 X선 회절 장치에 의해 측정할 수가 있다. 분말 X선 회절 프로필은 피험시료 또는 표준시료에 포함되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 회절각 및 회절강도를 포함하고, 이와 같은 분말 X선 회절 프로필로부터 결정화도에 대한 해석값을 결정하는 방법으로는 하만스법(Harmans method), 본크법(Vonk's Method) 등을 예로 들 수 있다. 이들 해석 방법 중에 하만스법을 사용하는 것이 간편함과 정도(accuracy)의 점에서 적합하다. 오늘날 이들 해석방법은 모두 컴퓨터 소프트웨어화 되어 있으므로, 이와 같은 컴퓨터 소프트웨어 중 어느 하나가 탑재된 해석장치를 구비한 분말 X선 회절 장치를 사용하는 것이 적절하다.
또, 해석값 H100를 구하는 「실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 표준시료」로는 아스코르빈산 2-글루코시드에 대한 순도가 99.9중량% 이상(이하, 별도의 언급이 없는 한, 본 명세서에서는 중량%를 「%」로 약기한다. 단, 본 명세서에서 언급하는 결정화도에 붙은 %는 예외로 한다.)인 분말 또는 단결정이며, 분말 X선 회절 패턴에 있어서 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절 피크를 나타내고, 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 것을 사용한다. 이와 같은 분말 또는 단결정으로는 상술한 시약급의 분말, 또는 이것을 재결정화하여 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 또는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 단결정을 예로 들 수가 있다. 또한, 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 상기 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 표준시료의 분말 X선 회절 프로필을 하만스법에 의한 컴퓨터소프트웨어로 해석한 경우의 해석값 H100는 통상 70.2 내지 70.5% 정도가 된다.
한편, 해석값 H0를 구하는 「실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말 표준시료」로는 아스코르빈산 2-글루코시드에 대한 순도가 99.1% 이상인 분말이며, 그 분말 X선 회절 패턴이 무정형 부분에 유래하는 할로(halo)만으로 이루어지고, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절 피크를 실질적으로 나타내지 않는 것을 사용한다. 이와 같은 분말로는 상기한 해석값 H100를 구하는 표준시료를 적량의 정제수에 용해하고 농축한 후 동결건조 하고, 또한 카알 피셔법(Karl Fischer method)에 의해 결정되는 수분함량이 2.0% 이하가 될 때까지 진공건조함으로써 얻어진 분말을 예로 들 수가 있다. 이와 같은 처리를 하였을 경우에 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 분말이 얻어지는 것은 경험상 알려져 있다. 또한, 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 상기 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말 표준시료의 분말 X선 회절 프로필을 하만스법에 의한 컴퓨터 소프트웨어로 해석한 경우의 해석값 H0는 통상 7.3 내지 7.6%정도 가 된다.
또한, 해석값 H0를 구하는 표준시료로는 아스코르빈산 2-글루코시드에 대한 순도가 높은 것이 바람직하다는 것은 말할 것도 없으나, 해석값 H100를 구하는 표준시료로부터 상술한 바와 같이 하여 조제되는 해석값 H0를 구하는 표준시료에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도는 후술하는 실험 1-1에 설명한 대로, 해석값 H100를 구하는 표준시료의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 99.9% 이상으로 매우 높음에도 불구하고, 99.1%에 그친다. 따라서, 「실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말 표준시료」의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도는 상기한 바와 같이 99.1% 이상으로 하였다.
<동적 수분 흡착량>
본 명세서에서 언급하는 「동적 수분 흡착량」이란, 수분흡탈착 측정장치를 사용하고, 온도 25℃, 상대습도 0%의 조건 하, 질소기류 하에서 12시간 동안 유지하여 시료로부터 유리한 수분을 제거하고, 제거 후의 시료를 칭량(weighing)한 후, 시료를 온도 25℃, 상대습도 35%의 조건 하에서 동일하게 질소기류 하에 12시간 동안 유지한 직후에 다시 칭량하고, 얻어진 2종의 칭량값에 기초하여 하기 식[2]에 의해 산출되는 값을 의미한다.
식 [2]:
<환원력>
본 명세서에서 언급하는 「분말 전체의 환원력」이란, D-글루코스를 표준 물질로 사용하고, 이 분야에 있어서 범용되는 소모지넬슨법(Somogyi Nelson's method) 및 안트론 황산법(anthrone-sulfuric acid method)에 의해 각각 D-글루코스 환산에 기초하는 환원당량 및 전당량을 구하고, 하기 식 [3]을 이용하여 구할 수가 있는, 포함되는 전당량에 대한 환원당량의 백분율(%)을 의미한다.
식 [3]:
<입도 분포>
본 명세서에서 분말의 입도 분포는 이하와 같이 하여 결정한다. 즉, 일본공업규격(JIS Z 8801-1)에 준거하는, 오프닝 사이즈(opening size)가 425, 300, 212, 150, 106, 75 및 53μm의 금속제망체(metal sieve)(주식회사 이이다 제작소(Kabushiki Gaisya Iida Seisaku-sho)제)를 정확하게 칭량한 후, 순서대로 서로 포개어 로탑 체질 진탕기(ro-tap sieving shaker)(주식회사 타나카화학기계제조소(Kabushiki Gaisya Tanaka Kagaku Kikai Seisaku-sho)제, 상품명 「R-1」)에 장착한 다음, 칭취(秤取)한 일정량의 시료를 최상단의 체(오프닝 사이즈 425μm) 상에 재치하고, 체를 서로 포갠 상태로 15분 동안 진탕한 후, 각 체를 다시 정확하게 칭량하고, 그 중량으로부터 시료를 재치하기 전의 중량을 줄임으로써, 각 체에 의해 포집된 분말의 중량을 구한다. 그런 다음, 체 상에 재치한 시료의 중량에 대한, 각 체에 의해 포집된 각 입도를 가지는 분말의 중량의 백분율(%)을 계산하여 입도 분포로 나타낸다.
<아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률>
본 명세서에서 언급하는 「아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률」이란, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase 등의 효소를 작용시켜서 얻어지는 효소반응액 중에서의 무수물 환산한 아스코르빈산 2-글루코시드의 함량(%)을 의미한다.
<아스코르빈산 2-글루코시드의 무수물 환산 함량>
아스코르빈산 2-글루코시드의 무수물 환산 함량이란, 수분을 포함하지 않고 계산하였을 경우의 전 중량(total weight)에 대한 아스코르빈산 2-글루코시드의 중량 백분율(%)을 의미한다. 예를 들면, 용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수물 환산 함량이란, 용액에 포함되는 수분을 포함하지 않고, 나머지 전 고형분에 대한 아스코르빈산 2-글루코시드의 중량 백분율을 의미한다. 또, 분말 중에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수물 환산 함량이란, 분말 중의 수분을 포함하지 않고 잔부를 분말 전 중량으로 계산한 경우의 분말 전 중량에 대한 아스코르빈산 2-글루코시드의 중량 백분율을 의미한다.
<CGTase의 활성>
본 명세서에서 「CGTase의 활성」은 이하와 같이 정의된다. 즉, 0.3%(W/V) 가용성 전분, 20mM 아세트산 완충액(pH5.5), 1mM 염화칼슘을 포함하는 기질 수용액 5ml에 대하여, 적절히 희석한 효소액 0.2ml를 첨가하고, 기질용액을 40℃로 유지하면서, 반응 0분째 및 반응 10분째에 기질용액을 0.5ml씩 샘플링하고, 바로 0.02N 황산용액 15ml에 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 각 황산용액에 0.2N 요오드용액을 0.2ml씩 첨가하여 정색시키고, 10분후 흡광 광도계에 의해 파장 660nm에서의 흡광도를 각각 측정하고, 식 [4]에 의해 전분 분해 활성으로 산출한다. CGTase의 활성 1단위란, 이와 같은 측정조건으로 용액 중의 전분 15mg의 요오드 정색을 완전하게 소실시키는 효소의 양으로 정의한다.
식 [4]:
<이소아밀라아제의 활성>
본 명세서에서 「이소아밀라아제의 활성」은 이하와 같이 정의된다. 즉, 0.83%(W/V) 린트너(Lintner) 가용화 왁시 옥수수 전분(waxy corn starch), 0.1M 아세트산 완충액(pH3.5)을 포함하는 기질 수용액 3ml에 대하여, 적절히 희석한 효소액 0.5ml를 첨가하고, 기질용액을 40℃로 유지하면서, 반응 30초째와 30분 30초째에 기질용액을 0.5ml씩 샘플링하고, 바로 0.02N 황산용액을 15ml씩 첨가하여 반응을 정지시키고, 각 황산용액에 0.01N 요오드용액을 0.5ml씩 첨가하고, 25℃에서 15분 동안 정색시킨 후, 흡광 광도계에 의해 파장 610nm에서의 흡광도를 각각 측정하여 하기 식 [5]에 의해 전분 분해 활성으로 산출한다. 이소아밀라아제의 활성 1단위란, 이와 같은 측정 조건으로 파장 610nm의 흡광도를 0.004 증가시키는 효소의 양으로 정의한다.
식 [5]:
2. 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말
<결정화도 및 동적 수분 흡착량>
본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 상술한 바와 같이 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0% 초과, 99.9% 미만 함유하며, 분말 X선 회절 프로필에 기초하여 산출되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나, 또는, 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이다. 이하의 실험에 의해 나타난 바와 같이, 결정화도 또는 동적 수분 흡착량이 상기 레벨에 있는 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도, 즉, 무수물로 환산한 아스코르빈산 2-글루코시드의 함량이 의약부외품급의 분말과 거의 같은 레벨이거나, 시약급의 분말에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도에 미치지 않음에도 불구하고, 의약부외품급의 분말에 비해 유의하게 고결하기 어렵다.
또, 이하에 실험에서 나타낸 바와 같이, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0% 초과, 99.9% 미만 함유하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 있어서 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 상기 범위에 있는 분말은 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하이며, 반대로 동적 수분 흡착량이 상기 범위에 있는 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이다. 따라서, 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 또는 분말의 동적 수분 흡착량 중 어느 하나에 의해서도 규정할 수가 있고, 필요하다면 그 쌍방에 의해 규정할 수도 있다.
또한, 동적 수분 흡착이란, 일정 온도에서 시료 주위의 습도를 변화시켰을 때에 시료에 포함되는 수분량이 변화하는 현상이며, 결정화도와 같이 시료인 분말의 결정구조에 직접 유래하는 지표는 아니나, 분말의 고결에는 흡습현상이 관여하고, 수분 흡착의 용이함을 보이는 동적 수분 흡착량은 분말의 당조성이나 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도, 분말 입자의 크기 등에 의해 유의하게 변동한다고 추정되므로, 흡습에 의한 분말의 고결성을 평가하는데 있어서 유력한 지표가 되는 것으로 생각된다.
후술하는 실험을 보듯이, 동적 수분 흡착량이 약 0.05%를 초과하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 실시된 실험환경 하에서 비교적 용이하게 고결하는 것에 대하여, 동적 수분 흡착량이 약 0.01% 이하인 것은 같은 환경 하에서 실질적으로 고결하지 않는다. 이 사실은 고결하기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 실현하는데 있어서 결정화도와 함께 동적 수분 흡착량이 유력한 지표라는 것을 나타내고 있다.
또한, 결정화도를 구할 때에, 해석값 H0를 결정하기 위해서 사용한 표준시료, 즉, 「실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 분말 표준시료」는 후술하는 실험 3에 나타낸 바와 같이, 1.7%의 동적 수분 흡착량을 나타낸 것에 대하여, 해석값 H100를 결정하기 위해서 사용한 표준시료, 즉, 「실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 표준시료」는 마찬가지로 실험 3에 나타낸 바와 같이, 동적 수분 흡착량이 검출한계 이하이며, 실질적으로 동적 수분 흡착을 나타내지 않는다.
<입도 분포>
본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 그 적합한 제1의 태양에 있어서 입경 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 70% 이상, 또한, 입경 53μm 이상 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 40 내지 60% 함유 한다. 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은, 예를 들면, 식품 소재 등에 요구되는 상기의 입도 분포에 용이하게 조정할 수가 있으므로, 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 또는 의약품 소재로서 제조공정이나 원료규격을 바꾸지 않고, 종전대로 사용할 수 있다는 이점을 가지고 있다.
<반응 협잡물 및 환원력>
본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 그 적합한 제1의 태양에 있어서 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코스를 포함하고, 또한, 분말 전체의 환원력이 1% 미만이다. 잘 알려진 바와 같이, L-아스코르빈산이나 D-글루코스는 직접 환원성을 가지고, 아미노산이나 단백질 등의 분자 내에 아미노기를 가지는 화합물의 공존 하에서 가열하면 갈색의 착색을 발생시키므로, 이들 물질이 제품으로서의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 포함되는 것은 바람직하지 않다. 그러나, 예를 들면, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase 등의 효소를 작용시키는 공정을 거쳐서 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하는 경우에는 양의 많고 적음에 관계없이 미반응의 L-아스코르빈산이나 원료인 전분질에 유래하는 D-글루코스 등이 반응 협잡물로서 제품인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 혼입하는 것은 피할 수 없다. 예를 들면, 종래의 의약부외품급의 분말에 있어서는 포함되는 L-아스코르빈산과 D-글루코스의 양이 무수물 환산한 양자의 합계로 약 1%에 달하는 경우가 있고, 식품 소재 등으로 사용한 경우에 예기치 못한 갈색의 착색을 발생시키는 경우가 있었다.
그래서, 본 발명에서는 불가피적으로 피할 수 없는 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코스의 혼입을 허용하면서, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에서의 분말 전체의 환원력을 1% 미만으로 규제하는 것으로 하였다. 후술하는 실험에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 의해 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하는 경우에는 분말 전체의 환원력을 1% 미만으로 하는 것은 용이하다. L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코스를 함유하고 있어도 분말 전체의 환원력이 1% 미만이면, 아미노산이나 단백질 등의 분자 내에 아미노기를 가지는 화합물의 공존 하에서 가열하여도 갈색의 착색을 발생시키는 것은 실질적이지 않다. 따라서, L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코스를 함유하고, 또한, 분말 전체의 환원력이 1% 미만인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 착색이나 변색 걱정 없이, 식품, 화장품, 의약부외품, 의약품 일반에 배합 사용할 수가 있다는 이점을 가지고 있다. 또한, 분말 전체의 환원력이 1% 미만인 경우, 포함되는 L-아스코르빈산과 D-글루코스의 양은 무수물 환산한 합계량으로 0.2% 이하이다.
또, 본 발명의 아스코르빈산 2－글루코시드 무수결정 함유 분말은 보다 적합한 제1의 태양에서 L－아스코르빈산 함량이 무수물 환산으로 0.1%이하이다. L－아스코르빈산은 산화 방지제나 탈산소제로서 음식품 등에 사용되고 있는 것과 같이, 산소와의 반응성이 높다. 이 때문에, L－아스코르빈산은 분자 내에 아미노기를 가지는 화합물의 공존 하에서 가열하면 갈색의 착색을 발생시킬 뿐만 아니라, L－아스코르빈산을 함유하는 분말 자체의 착색에도 깊이 관여하고 있다고 생각된다. 실제로, 후술 하는 실험에 나타낸 바와 같이, 의약 부외품급의 분말에는 L－아스코르빈산이 0.2% 정도 포함되어 있으나, 본 발명자들이 얻은 지견에 의하면, 의약부외품급의 분말은 이를 전술한 상품 형태로 비교적 장기간 보존하면, 때때로 분말 자체가 담갈색으로 착색하는 현상이 보여진다. 이에 대해, 아스코르빈산 2－글루코시드 무수결정 함유 분말에서의 L－아스코르빈산함량이 0.1%이하인 경우에는 이 분말을 의약부외품급의 분말과 동일한 상품 형태로 비교적 장기간 보존하여도 분말 자체가 담갈색으로 착색할 우려가 없다. 또한, 본 발명의 제조 방법에 의하면, 정제 공정에 D－글루코오스 등의 당류를 제거하기 위한 음이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피에 이어서, 양이온 교환수지 또는 다공성 수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피를 제공함으로써, 특히 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피로서 의사이동상식을 사용하는 경우에는 제조비용을 상승시키지 않고 비교적 용이하게 본 발명의 아스코르빈산 2－글루코시드 무수결정 함유 분말에서의 L－아스코르빈산 함량을 0.1% 이하로 할 수가 있다.
3. 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법
본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0% 초과, 99.9% 미만 함유하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이며, 분말 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나, 또는, 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하인 한, 어떠한 방법에 의해 제조된 것이어도 좋고, 특정의 제조방법에 의해 제조된 것으로 한정되는 것은 아니다.
그러나, 이하에 설명하는 본 발명의 제조방법에 따르는 경우에는 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 비교적 용이하게 제조할 수가 있다. 즉, 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법은 기본적으로 이하의 (1) 내지 (5)의 공정을 포함하고 있다:
(1) 전분질과 L-아스코르빈산을 포함하는 용액에 CGTase와 글루코아밀라아제를 순서대로 작용시켜서, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35% 이상인 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 얻는 공정;
(2) 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 정제하여, 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86% 초과로 하는 공정;
(3) 아스코르빈산 2-글루코시드를 무수물 환산으로 86% 초과 함유하는 용액으로부터 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시키는 공정;
(4) 석출한 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 채취하는 공정;
(5) 채취된 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 숙성, 건조하여, 필요에 따라서 분쇄하는 공정.
이하, 각 공정에 대하여 설명한다.
<(1)의 공정>
(1)의 공정은 L-아스코르빈산과 전분질로부터 효소반응에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시키는 공정이다. 우선, 사용하는 원료 및 효소에 대하여 설명한 다음, 실시되는 효소반응에 대하여 설명한다.
A. 사용 원료 및 효소
(L-아스코르빈산)
사용하는 L-아스코르빈산으로는 히드록시산의 형태인 것이어도, 알칼리 금속염, 알칼리 토류 금속염 등의 금속염의 형태인 것이어도, 또한, 그들의 혼합물이어도 지장이 없다.
(전분질)
또, 사용하는 전분질로는 감자 전분, 고구마 전분, 타피오카 전분, 옥수수 전분, 밀전분 등을 예로 들 수가 있다. 전분질로는 분자 내에 실질적인 분기구조를 가지지 않고, 또한, 글루코스 중합도가 구비된 것이 바람직하며, 예를 들면, 시클로말토덱스트린, 시클로 아밀로스, 합성 아밀로스 등은 글루코스 중합도가 모두 6 내지 100의 범위에 있고, 직쇄구조 또는 직쇄의 환상구조를 가지고 있으므로 바람직하다. 또, 전분질로서 통상 일반의 액화 전분이나, 덱스트린 등의 전분 부분 분해물을 사용하는 경우에는 CGTase와 함께, 예를 들면, 이소아밀라아제(EC 3. 2. 1. 68), 풀룰라나아제(EC 3. 3. 1. 41) 등의 전분 절지 효소를 병용하여, 전분의 분기 부분을 절단하고, 그것의 글루코스 중합도를 조정하는 것이 바람직하다. 또한, 전분 절지 효소로는 이소아밀라아제가 효소활성 및 기질 특이성 등의 면에서 취급하기 쉬우므로 특히 바람직하다.
(CGTase)
사용하는 CGTase(EC 2. 4. 1. 19)로는 상술한 바와 같이 L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase와 글루코아밀라아제를 순서대로 작용시켰을 때에, 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성률 35% 이상의 고율로 생성시킬 수 있는 한, 그 기원이나 유래에 특별한 제한은 없으며, 천연의 효소이어도 좋고, 유전자 재조합에 의해 얻어지는 효소이어도 좋다. 천연의 효소로는, 예를 들면, 지오바실러스 스테아로테르모필루스(Geobacillus stearothermophilus) Tc-62주 유래의 CGTase 및 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-27주 유래의 CGTase가 아스코르빈산 2-글루코시드에 대하여 높은 생성률이 얻어지므로 바람직하고, 그 중에서 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-62주가 생산하는 CGTase가 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률의 관점으로부터는 가장 바람직하다.
유전자 재조합에 의해 얻어지는 CGTase로는 후술하는 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-91주 유래의 CGTase의 아미노산 서열, 즉, 서열표에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서의 제228번째의 리신 잔기를 글루타민산 잔기로 치환한 아미노산 서열을 가지는 CGTase를 예로 들 수 있다. 이와 같은 변이 CGTase를 얻기 위해서는, 주지와 같이 서열표에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서의 제228번째의 리신 잔기를 글루타민산 잔기로 치환한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를, 예를 들면, 대장균, 고초균 등의 적절히 숙주에 도입하여 형질전환하고, 그 형질전환 체내에서 이와 같은 유전자를 발현시키면 좋다.
또한, 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-27주, 동(同)Tc-62주 및 동Tc-91주는 모두 같은 출원인에 의한 일본국특허공개 소50-63189호 공보(특소공 53-27791호 공보)에 개시된 미생물이며, 2009년 7월 14일 시점에서 각각 수탁번호 FERM BP-11142, FERM BP-11143 및 FERM P-2225(국제기탁에 이관수속중: 수령번호 FERM ABP-11273)로서 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 다이6(Higashi 1-1-1, Chuo-6, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan) 소재의 독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁되어 있다. 또한, 「바실러스 스테아로테르모필루스」라는 종명으로 종래 분류된 미생물은 현재 「지오바실러스 스테아로테르모필루스」라는 종명으로 일괄하여 변경되고, 한편, 「바실러스」라는 속명이 여전히 독립한 미생물의 속을 호칭하는 명칭으로 사용되고 있으므로, 혼란을 피하기 위해, 본 명세서에서는 「바실러스 스테아로테르모필루스」와「지오바실러스 스테아로테르모필루스」를 일괄하여 「지오바실러스 스테아로테르모필루스」로 기재한다.
(글루코아밀라아제)
사용하는 글루코아밀라아제(EC 3. 2. 1. 3)에도 특별히 제한은 없고, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase와 글루코아밀라아제를 순서대로 작용시켰을 때에 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성률 35% 이상의 고율로 생성시킬 수가 있는 한, 그 기원이나 유래에 특별한 제한은 없으며, 천연의 효소이어도 좋고, 유전자 재조합에 의해 얻어지는 효소이어도 좋다.
글루코아밀라아제는 통상 효소반응액을 가열하여 CGTase에 의한 당 전이 반응을 정지시킨 후에 첨가되므로, 가열 후의 효소반응액의 냉각에 필요한 에너지와 시간을 절약할 수가 있도록 비교적 높은 온도, 예를 들면, 40 내지 60℃ 정도의 온도로 실용에 충분한 효소활성을 발휘할 수가 있는 것이 바람직하다. 또, 사용하는 글루코아밀라아제가 α-글루코시다아제를 포함하고 있던 경우, 생성된 아스코르빈산 2-글루코시드가 가수분해되므로, 글루코아밀라아제로는 α-글루코시다아제를 실질적으로 포함하지 않는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 조건을 만족하는 것이면, 사용하는 글루코아밀라아제의 공급원, 순도에는 특별한 제한은 없고, 예를 들면, 글루코아밀라아제로서 시판되고 있는 리조푸스(Rhizopus)속에 속하는 미생물에 유래하는 효소제(상품명 「글루코침(GLUCOZYME) ＃20000」나가세켐텍스주식회사(Nagase ChemteX, Corp. Tokyo, Japan) 판매)나 아스페르질루스속의 미생물에 유래하는 효소제(상품명 「글루크자임(GLUCZYME) AF6」아마노엔자임주식회사(Amano Enzyme Inc., Tokyo, Japan) 판매)를 적합하게 사용할 수가 있다.
B. 효소반응
다음으로 L-아스코르빈산에 대한 당 전이 반응 대해 설명한다. 우선, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액, 통상은 수용액에 CGTase를 작용시킨다. L-아스코르빈산과 전분질을 포함하는 수용액에 CGTase를 작용시키면, CGTase의 효소작용에 의해 L-아스코르빈산의 2위치(C-2 position)의 수산기에 1개 또는 2개 이상의 D-글루코스가 전이하고, 상기 2위치의 수산기에 1개의 D-글루코스가 결합한 아스코르빈산 2-글루코시드가 생성하는 동시에, 상기 2위치의 수산기에 2개 이상의 D-글루코스가 결합한 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토테트라오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산이 생성한다.
CGTase는 통상 전분질 농도가 1 내지 40%가 되도록 전분질과 L-아스코르빈산을 용해한 수용액에 대하여, 전분질 1g당 1 내지 500단위의 비율로 첨가되고, 상기 용액을 pH 약 3 내지 10, 온도 30 내지 70℃로 유지하면서, 6시간 이상, 바람직하게는 약 12 내지 96시간 동안 반응시킨다. L-아스코르빈산은 산화에 의해 분해하기 쉽기 때문에, 반응 중 용액을 혐기 또는 환원상태로 유지하는 한편, 빛을 차단하는 것이 바람직하고, 필요하게 따라서 반응용액에, 예를 들면, 티오요소, 황화수소 등의 환원제를 공존시킨다.
용액 중의 전분질과 L-아스코르빈산의 중량비는 무수물 환산으로 8:2 내지 3:7의 범위로 설정하는 것이 바람직하다. 전분질의 비율이 이 범위보다 커지면, L-아스코르빈산에 대한 당 전이는 효율적으로 진행하나, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 L-아스코르빈산의 시발 농도에 의한 제약을 받아서 저레벨에 그치게 된다. 반대로, L-아스코르빈산의 비율이 상기한 범위보다 커지면, 미반응의 L-아스코르빈산이 상당량이 잔존하게 되어 공업적 생산에는 바람직하지 않다. 따라서, 상기한 비율의 범위를 최선으로 하였다.
또한, CGTase에 첨가하여 전분 절지 효소로서 이소아밀라아제를 병용하는 경우, 이소아밀라아제는 L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액 중에서 CGTase와 공존시킨 상태로 전분질에 작용시키는 것이 바람직하고, 첨가량으로는 이소아밀라아제의 최적 온도, 최적 pH 등에 따라 다르나, 통상 전분질 1g당 200 내지 2,500단위로 하고, 55℃이하로 반응시킨다. 또, 전분 절지 효소로서 풀룰라나아제를 사용하는 경우도 이소아밀라아제에 준하여 사용하면 좋다.
CGTase, 또는 CGTase와 전분 절지 효소에 의한 효소반응이 대략 완료한 후, 효소반응액을 바로 가열하여 CGTase, 또는 CGTase와 전분 절지 효소를 실활시켜 효소반응을 정지시킨 다음, 이 효소반응액에 글루코아밀라아제를 작용시킨다. 글루코아밀라아제를 작용시키면, L-아스코르빈산의 2위치의 수산기에 결합하고 있는 2개 이상의 D-글루코스 사슬은 절단되어서 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산은 아스코르빈산 2-글루코시드로 변환되고, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35% 이상, 바람직하게는 37 내지 45%로 높아지게 된다.
아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35% 이상, 바람직하게는 37 내지 45%인 경우에는 후속하는 (2) 내지 (5)의 공정을 거침으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나, 분말의 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 용이하게 얻을 수가 있다. 또한, 바람직한 생성률의 상한을 45%로 한 것은 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률을 45%를 초과하여 높이는 것은 현재의 효소공학 상의 기술수준에서 볼 때 실질적으로 어렵고, 또, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률을 45%를 초과하여 높여도 얻어지는 분말 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도나 분말의 동적 수분 흡착량에 그다지 개선이 보여지지 않는다고 생각되기 때문이다.
또한, 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률이 35% 미만인 경우에는 후속하는 (2) 내지 (5)의 공정을 거쳐도 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나, 분말의 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻는 것은 어렵다. 그 이유는 확실하지는 않으나, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시킴으로써 불가피적으로 생성하는 부반응물인 5-O-α-글루코실-L-아스코르빈산이나 6-O-α-글루코실-L-아스코르빈산의 상대적인 양이 영향을 주고 있지는 않을까 추측된다.
즉, L-아스코르빈산의 5위 또는 6위의 수산기에 D-글루코스가 결합한 5-O-α-글루코실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-글루코실-L-아스코르빈산은 일반적으로 아스코르빈산 2-글루코시드의 결정화를 저해하는 결정화 저해물질이라고 생각되고 있으나, 종래의 아스코르빈산 2-글루코시드의 제조방법에서 L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 CGTase를 작용시키면, 아스코르빈산 2-글루코시드나 상술한 α-글리코실-L-아스코르빈산과 함께 이들 5-O-α-글루코실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-글루코실-L-아스코르빈산이 불가피적으로 부생성한다. 그 양은 무수물 환산으로 5-O-α-글루코실-L-아스코르빈산과 6-O-α-글루코실-L-아스코르빈산이 합계로 통상 약 1% 정도로 근소하나, 이들 당 전이물은 칼럼 정제 공정에서 아스코르빈산 2-글루코시드와 거의 같은 위치에 용출하므로, 그것의 제거는 일반적으로 어려웠다. 그런데, L-아스코르빈산과 전분질을 함유하는 용액에 전술한 천연형 또는 유전자 재조합형의 CGTase를 작용시켜서, 효소반응액 중에 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성률 35% 이상, 바람직하게는 37 내지 45%의 고율로 생성시키는 경우에는 이들 5-O-α-글루코실-L-아스코르빈산 및 6-O-α-글루코실-L-아스코르빈산이 무수물 환산한 합계로 0.5%를 초과하지는 않는다. 그 결과, 그 후의 공정을 거쳐서 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 결정화가 보다 원활하게 진행하는 것은 아닐까 추측된다.
또, 당 전이 효소로서 CGTase를 사용하는 경우에는 L-아스코르빈산의 2위치의 수산기에 2개 이상의 D-글루코스가 전이될 때에도 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산에서의 D-글루코스 간의 결합은 α-1,4 결합이므로, 그 후의 글루코아밀라아제의 작용에 의해 D-글루코스 간의 결합은 절단되어서 아스코르빈산 2-글루코시드에 용이하게 변환되고, 예를 들면,α-이소말톡실글루코 당질 생성 효소를 사용하는 경우와 같이 글루코아밀라아제 처리 후에도 α-1,6 결합 등에 의한 분기구조를 포함하는 α-글리코실-L-아스코르빈산 등의 결정화 저해물질이 잔존할 우려가 없는 것도 관계하고 있는 것은 아닐까 추측된다.
<(2)의 공정>
(2)의 공정은 상기 (1)의 공정에서 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 정제하여 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86% 초과로 하는 공정이다. 즉, (1)의 공정에서 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액을 활성탄 등에 의해 탈색 여과한 다음, 여과액을 양이온 교환수지에 의해 탈염하고, 또한 칼럼크로마토그래피를 적용함으로써 용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86%를 초과, 바람직하게는 88% 이상까지 정제한다. 정제에 사용하는 칼럼크로마토그래피로는 용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드드 함량을 무수물 환산으로 86% 초과까지 높일 수가 있는 한, 원칙적으로 어떠한 칼럼크로마토그래피를 사용하여도 좋으나, 적합한 예로는 D-글루코스 등의 당류를 제거하기 위한 음이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피에 이어서, 양이온 교환수지 또는 다공성 수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피를 제공하는 것이 좋다. D-글루코스 등의 당류를 제거하기 위한 바람직한 음이온 교환수지로는 「앰버라이트 IRA411S」, 「앰버라이트 IRA478RF」(이상, 롬 앤드 하스사 제), 「다이아이온 WA30」(미츠비시화학사 제) 등을 예로 들 수 있다. 아스코르빈산 2-글루코시드와 L-아스코르빈산을 분리하기 위한 바람직한 양이온 교환수지로는 「다웩스 50WX8」(다우케미컬사 제), 「앰버라이트 CG120」(롬 앤드 하스사 제), 「XT-1022E」(도쿄유기화학공업사 제), 「다이아이온 SK104」, 「다이아이온 UBK 550」(이상, 미츠비시화학사 제) 등을 예로 들 수 있다. 다공성 수지로는 「토요펄 HW-40」(토소사 제), 「셀파인 GH-25」(칫소사 제) 등을 예로 들 수가 있다. 양이온 교환수지 또는 다공성 수지를 사용하여 칼럼크로마토그래피를 제공하는 경우, 칼럼에 부하하는 원료액의 농도는 고형분 약 10 내지 50%, 수지에 대한 부하량은 습윤수지 용적의 약 1/1000 내지 1/20, 습윤수지 용적과 거의 같은 양의 정제수를 선속도 0.5 내지 5m/시간으로 통액하는 것이 바람직하다. 그 중에서도 양이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피로서 의사이동상식을 사용하는 경우에는 정제하여 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 높아지고, L-아스코르빈산이나 D-글루코스 등의 협잡물, 특히 L-아스코르빈산 함량이 저감되고, L-아스코르빈산 함량이 무수물 환산으로 0.1%이하로 적은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 얻어지므로 바람직하다. 또한, 양이온 교환수지를 충전제로 사용하는 의사이동상식의 칼럼크로마토그래피에서의 용리조건으로는 조작 온도, 설정 유속 등에 의해서도 달라지는데, 의사이동상식의 칼럼크로마토그래피에 제공되는 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액의 농도는 무수물 환산으로 60% 이하, 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액의 부하량은 습윤 수지 용적에 대해 용적비로 1/20 이하, 용리액으로 사용하는 정제수량은 용적비로 상기 부하량의 30배까지, 통상 5~20배 정도로 하는 것이 바람직하다.
용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 함량이 무수물 환산으로 86% 이하인 경우에는 후속하는 (3) 내지 (5)의 공정을 거쳐도 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나, 분말의 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻기는 어렵다. 그 이유는 용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 함량이 무수물 환산으로 86% 이하인 경우에는 그 후의 공정을 거쳐서 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 낮고, 결정화가 원활하게 진행하지 않기 때문이라고 생각된다.
아스코르빈산 2-글루코시드 함량을 무수물 환산으로 86%를 초과, 바람직하게는 88% 이상까지 정제한 용액은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시키는 공정에 앞서, 소정의 농도, 통상은 아스코르빈산 2-글루코시드 농도 약 65 내지 85%까지 농축된다. 농축액의 온도는 통상 약 30 내지 45℃로 조절된다. 이것의 농도 및 온도는 아스코르빈산 2-글루코시드에 대한 과포화도로는 1.05 내지 1.50에 해당한다.
<(3)의 공정>
(3)의 공정은 아스코르빈산 2-글루코시드를 무수물 환산으로 86% 초과, 바람직하게는 88% 이상 함유하는 용액으로부터 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시키는 공정이다. 즉, (2)의 공정에서 소정의 순도 및 농도로 정제, 농축되고, 소정의 온도로 조정된 아스코르빈산 2-글루코시드 함유 용액은 조정관(crystallizer)에 옮겨지고 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 종정을 0.1 내지 5% 함유시켜서 완만하게 교반하면서, 6 내지 48시간에 걸쳐서 액의 온도를 5 내지 20℃까지 서냉(gradually cooling)함으로써 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 석출시킨다. 또한, 조정관 내 등에 이미 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정의 종정이 존재하는 경우에는 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정의 종정은 특별히 첨가할 필요는 없다. 결국, 농축액으로부터의 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정의 석출은 종정의 존재 하에서 실시되면 좋다. 또, 필요에 따라서 정제액의 농축과 농축액으로부터의 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정의 석출은 그들을 동시에 실시하는 전당방식(boiling process)에 의해 실시하여도 좋다.
<(4)의 공정>
(4)의 공정은 석출한 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 채취하는 공정이다. 즉, 조정관으로부터 마세큐트(massecuite)을 채취하여 통상의 방법에 따라 이 마세큐트로부터 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 원심분리에 의해 채취한다.
<(5)의 공정>
(5)의 공정은 채취된 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 숙성, 건조하고, 필요에 따라서 분쇄하는 공정이다. 즉, 원심분리에 의해 채취한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 소량의 탈이온수나 증류수 등의 정제수 등으로 세정하고, 결정 표면에 부착한 불순물을 씻어낸다. 세정에 사용하는 물의 양에는 특별한 제한은 없으나, 지나치게 많으면 표면의 불순물뿐만 아니라 결정 자체도 용해하므로 제조수율이 저하하고, 또한 세정수의 비용도 늘어나므로, 통상은 결정중량의 30%까지, 바람직하게는 15~25%의 양의 세정수를 사용하여 결정 표면을 세정하는 것이 바람직하다. 또한, 이 세정은 결정을 바스켓식의 원심분리기에 넣고, 원심력 하에서 실시하는 것이 바람직하다. 이렇게 하여 채취, 세정한 결정은 소정의 온도 및 습도 분위기 중에 일정시간 동안 유지함으로써 숙성, 건조하고, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나, 또는, 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하의 분말로 한다.
숙성, 건조공정에서의 결정 함유 분말의 품온이나 분위기의 상대습도 및 숙성, 건조시간은 기대한 결정화도 또는 동적 수분 흡착량을 나타내는 분말이 얻어지는 한 특별한 제한은 없으나, 숙성, 건조공정에서 결정 함유 분말의 품온은 20 내지 55℃, 분위기의 상대습도는 60 내지 90%로 유지되는 것이 바람직하다. 또, 숙성, 건조시간은 양자의 합계로 약 5 내지 24시간으로 하는 것이 바람직하다. 숙성, 건조공정을 거친 결정 함유 분말은 이어서 실온까지 자연방랭(unforcedly cooled an ambient temperature)된다. 이에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나 또는 분말의 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻을 수가 있다. 얻어진 결정 분말은 그대로 또는 필요에 따라서 분쇄하여 제품으로 된다.
상기 (1) 내지 (5)의 공정은 상기 (1)의 공정에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률 및 상기 (2) (3)의 공정에서의 용액 중의 아스코르빈산 2-글루코시드의 함량을 제외하고는 의약부외품급의 분말의 제조공정과 기본적으로 동일하고, 시약급의 분말의 제조공정에서는 필수적인 재결정 공정이나 결정을 반복세정하는 공정은 포함되지 않는다.
또한, 상술한 바와 같이 하여 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 숙성, 건조공정을 거친 후 자연방랭함으로써, 상당히 신속하게 유동성이 뛰어나고, 또한, 거의 흡습성이 없는 분말이 되나, 자연방랭 시간이 짧으면 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상까지 오르지 않고, 또, 분말의 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하로 내려가지 않는다. 따라서, 이러한 분말을 그대로 제품으로 하였을 경우에는 의약부외품급의 분말과 마찬가지로 통상의 보존환경 하에서도 고결할 가능성이 있는 분말밖에 얻어지지 않는다. 고결하기 어려운 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻는데 필요한 최단의 자연방랭 시간은 분위기의 온도나 습도 등의 영향을 받고, 또,
사용하는 건조용 장치·설비의 규모나 구조 등에 의하여도 변화하나, 일정한 조건 하에서는 거의 변화하지 않는다고 생각된다. 따라서, 실제로 사용하는 특정의 장치, 설비에 대해 일단 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상, 또한 분말의 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하가 되는데 필요한 자연방랭 시간과 분위기의 온도 및 습도의 관계를 조사해 두면, 그 후에는 매회 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 결정화도나 동적 수분 흡착량을 조사할 필요는 없고, 자연방랭 시간을 기준으로 하여 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조하는 것이 가능하게 된다.
또, 본 발명자들은 상기 숙성, 건조 후에 결정 함유 분말을 자연방랭 하는 것이 아니라, 예를 들면, 실온 정도의 청정한 공기를 취부하여 실온 정도의 품온으로까지 강제적으로 냉각함으로써 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결정화가 보다 신속하게 진행하고, 보다 단시간에 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도를 90% 이상, 분말의 동적 수분 흡착량을 0.01% 이하로 할 수가 있다는 것을 발견하였다. 취부한 공기(blowing air)의 온도는 약 15℃ 내지 30℃의 범위 내에 있는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 18 내지 28℃의 범위 내이다. 또, 취부한 시간은 통상 5 내지 60분 정도가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10 내지 30분이다. 취부한 공기의 온도에 따라 다르나, 취부한 시간이 5분 미만에서는 취부 시간(blowing time)에 의한 강제냉각의 효과가 그다지 인정되지 않고, 60분을 넘게 취부하여도, 그 이상의 결정화도의 상승을 기대할 수 없으므로 바람직하지 않다. 또, 공기의 취부의 경우에는 결정 함유 분말을 절적히 교반하거나, 결정 함유 분말에 적절한 진동을 주어서 취부에 의한 냉각 효과가 분말 전체에 고루 미치도록 하는 것이 바람직하다.
이상과 같이 하여 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 98.0% 초과 99.9% 미만 함유하고, 분말 X선 회절 프로필에 기초하여 산출되는, 분말 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나, 또는 질소기류 하에서 분말 중의 유리 수분을 제거한 후, 온도 25℃, 상대습도 35%에서 12시간 동안 유지하였을 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하인 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이며, 종래의 의약부외품급의 분말이 고결하는 조건 하에서도 고결하지 않는, 의약부외품급의 분말에 비해 유의하게 고결하기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이다.
또한, 분말원료가 고결하면, 제조 플랜트에는 여러 가지의 악영향을 미칠 우려가 있다. 예를 들면, 식품제조의 분야에서 분말상의 원료를 취급하는 경우에는 분말원료를 롤 분쇄기에서 더 미세하게 분쇄하거나, 제조 라인에 대한 에어 블로우(air blowing)에 의한 공기 수송이나 지그재그 코일 컨베이어(zigzag coil-conveyor)에 의한 수송이 종종 실시된다. 그 때, 만약 분말원료가 고결하고 있다면, 롤 분쇄기의 롤이 손상되거나 타는 등의 문제가 발생하고, 또 제조 라인에 설치한 체나 수송관이 폐색하는 등의 문제를 발생시킬 수가 있다. 또, 고결한 분말원료는 그 자체의 용해나 다른 원료와의 혼합, 반죽에 있어서 작업상의 지장을 초래할 우려가 크다. 이와 같은 분말의 고결이 원인이 되는 제조공정에서의 여러 가지 문제에 관하여는, 예를 들면, 시바타 츠토무(Tutomu SHIBATA) 저, 「분립체 트러블 슈팅」, 주식회사공업조사회(Kogyo Chosakai Publishing Co., Ltd., Tokyo, Japan) 발행, 2006년, 15 내지 19 페이지에 상세하게 서술되어 있다.
본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 종래의 의약부외품급의 분말에 비해 유의하게 고결하기 어렵기 때문에, 분말원료를 취급하는 것을 전제로 설계된 제조 플랜트를 사용하는 음료를 포함한 식품 제조, 화장품 제조, 의약부외품 제조, 또 의약품 제조의 각 분야에서 다른 단독 또는 복수의 분말상의 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등에 안심하고 함유시킬 수가 있다는 우수한 이점을 구비하고 있다.
상기한 다른 분말상의 식품 소재로는 곡류가루, 전분, 분당(powdered sugas), 분말 조미료, 분말 향신료, 분말 과즙, 분말 유지, 분말 펩티드, 분말 노른자, 분유, 탈지분유, 분말 커피, 분말 코코아, 분말 된장, 분말 간장, 야채 분말 등을 예로 들 수가 있고, 화장품 소재로는 분(face powder), 탈크, 카올린, 마이카, 세리사이트(sericite), 전분, 벤토나이트, 실크 파우더, 셀룰로오스 파우더, 나일론 파우더, 바스 솔트(bath salt), 소프 팁(soap tip), 이산화티탄, 이산화규소(실리카), 산화아연 등을 예로 들 수가 있고, 의약부외품 소재로는 아미노산염, 비타민제, 칼슘제, 부형제, 증량제, 살균제, 효소제 등을 예로 들 수 있고, 또, 의약품 소재로는 분말상의 유효 성분, 올리고당, 유당, 전분, 덱스트린, 백당, 결정 셀룰로오스, 자당 에스테르, 지방산 에스테르 등의 부형제, 증량제, 셸락 등의 코팅제 등을 예로 들 수가 있다.
또, 상기와 같이 하여 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 통상 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코스를 함유하고, 또한, 분말 전체의 환원력이 1% 미만이다. 즉, 상기와 같이 하여 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 통상 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코스를 각각 단독 또는 합계로 고속 액체 크로마토그래피 등의 분석방법에 의해 검출할 수 있는 레벨, 구체적으로는 무수물 환산으로 0.01% 이상 0.2% 이하 함유하고 있으나, 분말 전체의 환원력은 1% 미만이고, 후술하는 실험에 나타낸 바와 같이 아미노산이나 단백질 등의 분자 내에 아미노기를 가지는 화합물의 존재 하에서 가열하여도 실질적으로 변색이 없는 우수한 분말이다. 또, 상기와 같이 하여 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 바람직하게는 L-아스코르빈산의 함량이 0.1% 이하이다. 이와 같이 L-아스코르빈산 함량이 0.1% 이하로 낮은 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 이를 의약부외품급의 분말과 동일한 상품 형태로 비교적 장기간 보존하여도 분말 자체가 착색할 우려가 없는 우수한 분말이다.
또한, 상기와 같이 하여 얻어지는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 통상 입경 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 70% 이상 포함하고, 또한, 입경 53μm 이상 150μm 미만의 입자를 분말 전체의 40 내지 60% 포함하고 있어서, 그대로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말제품으로 할 수가 있다. 만약, 입경이 큰 분말 입자가 많이 포함되어 있거나, 입도 분포가 기대한 입도 분포와 다른 경우에는 적절히 분쇄하여 입경을 작게 하거나, 또는, 체 등에 의해 분급(classify)하여 입도를 조정해서 분말제품으로 하면 좋다.
이하, 본 발명에 대하여 실험에 의해 구체적으로 설명한다.
<실험 1: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 고결성(solidification)에 미치는 결정화도의 영향>
아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 0 내지 100%의 범위에 있는 복수의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 조제하고, 그의 고결성을 시험함으로써 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에서의 결정화도와 고결성의 관련성을 조사하였다. 상세하게는 이하와 같다.
<실험 1-1: 피험시료의 조제>
<피험시료 1>
실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 표준시료로서 시약급의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(상품명 「아스코르빈산 2-글루코시드 999」, 코드번호: AG124, 순도 99.9% 이상)을 사용하여 이것을 피험시료 1로 하였다.
<피험시료 2>
실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 표준시료로는 피험시료 1을 적량의 정제수에 용해하고, 3일에 걸쳐 동결건조 한 후, 40℃ 이하에서 하룻밤 진공건조하여 얻어진, 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 분말을 사용하여, 이것을 피험시료 2로 하였다. 또한, 피험시료 2의 수분함량을 카알 피셔법에 의해 측정한 바 2.0%였다.
<피험시료 3, 4>
피험시료 3, 4로서 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 피험시료 1과 피험시료 2의 사이에 넣는 것을 이하의 순서로 조제하였다. 즉, 피험시료 2와 동일하게 하여 조제한 무정형 부분으로 이루어지는 분말을 금속제 트레이 내에 스프레드하고, 온도 25℃, 상대습도 90%로 조정된 항온, 항습의 챔버 내에 24시간 또는 72시간 동안 수용함으로써 결정화를 촉진시켜서, 분말을 부분적으로 결정화시켰다. 그 후, 금속제 트레이를 챔버로부터 꺼내고, 38℃에서 하룻밤 진공건조함으로써 2종류의 분말을 조제하였다. 항온, 항습의 챔버 내의 수용시간이 24시간인 것을 피험시료 3, 72시간인 것을 피험시료 4로 하였다. 또한, 피험시료 3 및 4는 분석시험에 제공하기 직전까지 뚜껑 달린 바이알병(vial) 내에 밀봉하고, 건조제와 함께 데시케이터 내에 밀봉보존하였다.
<실험 1-2: 피험시료 1 내지 4의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도와 결정화도>
<아스코르빈산 2-글루코시드 순도>
피험시료 1 내지 4의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도를 이하와 같이 하여 구하였다. 즉, 피험시료 1 내지 4의 중 어느 하나를 정제수에 의해 2% 용액으로 하고, 0.45μm 멤브란 필터(membrane filter)에 의해 여과한 후, 하기 조건에 의한 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 제공하고, 시차굴절계(refractive index detector)에 의한 크로마토그램(chromatogram)에 출현한 피크의 면적으로부터 계산하여 무수물 환산하였다. 결과는 표 1에 설명한다.
·분석 조건
HPLC 장치:「LC-10 AD」(주식회사 시마즈제작소(Shimadzu Corp., Kyoto, Japan)제)
디가서(degasser):「DGU-12 AM」(주식회사 시마즈제작소제)
칼럼:「Wakopak Wakobeads T-330」(와코순약공업주식회사(Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) 판매 H+형)
샘플 주입량: 10μl
용리액: 0.01%(용적/용적) 질산수용액
유속: 0.5ml/분
온도: 25℃
시차굴절계:「RID-10 A」(주식회사 시마즈제작소제)
데이터 처리장치: 「크로마토팩 C-R7A」(주식회사 시마즈제작소제)
<결정화도>
피험시료 1 내지 4에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도를 이하와 같이 하여 구하였다. 즉, 시판의 반사광 방식에 의한 분말 X선 회절 장치(스펙트리스 주식회사(Spectris Co., Ltd., Tokyo, Japan)제, 상품명 「X' Pert PRO MPD」)를 사용하고, Cu 대음극으로부터 방사되는 특성 X선인 CuKα선(X선 관전류 40mA, X선 관전압 45kV, 파장 1.5405 옹스트롬)에 의한 분말 X선 회절 프로필에 기초하고, 동(同)분말 X선 회절 장치에 탑재된 전용의 해석 컴퓨터소프트웨어를 사용하고, 피험시료 1 내지 4의 각각에 대해 하만스법에 의한 결정화도의 해석값을 구하였다. 하만스법에 의한 결정화도의 해석에 앞서, 각 분말 X선 회절 패턴에서 피크끼리 겹치고, 회절강도, 산란 강도 등을 감안하면서 최적으로 판단되는 베이스 라인이 얻어지도록 소프트웨어에 설정된 입상도 및 밴딩 팩터(bending factor)를 각각 적절한 레벨로 맞추었다. 또한, 하만스법에 대해서는 피 에이치 하만스(P. H. Harmans)와 A 바이딩거(A. Weidinger), 「저널 오브 어플라이드 피직스」(Journal of Applied Physics), 제19권, 491~506 페이지(1948년) 및 피 에이치 하만스(P. H. Harmans)와 A 바이딩거(A. Weidinger), 「저널 오브 폴리머 사이언스」(Journal of Polymer Science), 제4권, 135~144 페이지(1949년)에 상세하게 서술되어 있다.
피험시료 1에 대한 결정화도의 해석값을 해석값 H100, 피험시료 2에 대한 결정화도의 해석값을 해석값 H0로 하고, 각 피험시료에 대한 결정화도의 해석값을 Hs로 하여 상기한 식 [1]에 대입함으로써 결정화도를 구하였다. 또한, 피험시료 1에 대한 하만스법에 의한 결정화도의 해석값(해석값 H100) 및 피험시료 2에 대한 동(同)해석값(해석값 H0)은 각각 70.23% 및 7.57%였다. 결과는 표 1에 함께 설명한다. 또한, 표준시료인 피험시료 1 및 2에 대해서는 분말 X선 회절 패턴을 각각 도 1 및 도 2에 도시하였다.
도 1에 도시한 바와 같이, 피험시료 1의 분말 X선 회절 패턴에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절 피크가 회절각(2θ) 4 내지 65°의 범위에 명료하고 분명하게 출현하고, 무정형 부분에 특유한 할로는 전혀 인정되지 않았다. 한편, 도 2에 도시한 바와 같이, 피험시료 2의 분말 X선 회절 패턴에서는 도 1의 분말 X선 회절 패턴과는 달리, 무정형 부분에 특유한 할로가 베이스 라인의 융기(bunchy baseline)로서 분명하게 출현하였으나, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절 피크는 전혀 인정되지 않았다.
<실험 1-3: 피험시료 1 및 2의 싱크로트론 방사광에 의한 분말 X선 회절>
본 실험에서는 피험시료 1 및 2가 각각 해석값 H100 및 H0를 결정하기 위한 표준시료로서 적절한 것임을 더 뒷받침할 목적으로 이들 피험시료를 싱크로트론 방사광(이하, 「방사광」이라고 함)을 X선원에 사용하고, 미약한 회절이나 산란의 시그널을 검출할 수가 있는 투과광 방식의 분말 X선 회절에 제공하였다. 또한, 측정조건은 다음과 같았다.
<측정조건>
분말 X선 회절 장치: 고속 분말 X선 회절 장치(코즈정기사(Kohzu
Precision Co. Ltd., Kanagawa, Japan) 판매,
제품번호 「PDS-16」), 데바이 세러 모드
(Debye Scherrer mode),
카메라장: 497.2mm
X선원: 편향 전자석에서의 방사광(효고현 빔 라인(BL08B2))
측정파장: 0.7717 옹스트롬(16.066keV)
측정강도: 109포톤/초
측정각: 2 내지 40°
노광시간: 600초간
화상촬영: 이미징 플레이트(후지필름사제, 상품명 「이미징플레이트
BAS-2040」)
화상독해장치: 이미지 애널라이저(후지필름사제, 「바이오이미징
애널라이저 BAS-2500」)
측정은 대형 방사광 시설 「SPring-8」(효고현 사요군 사요쵸 코토 1-1-1(1-1-1, Koto, Sayo-cho, Sayo, Hyogo, Japan)) 내에 설치된 「효고현 빔 라인(BL08B2)」을 이용하여 실시하였다.
분말 X선 회절의 측정에 앞서, 피험시료 1 및 2를 유발로 갈은 후, 53μm의 체로 걸러서, 체를 통과한 분말을 X선결정 회절용의 캐필러리(capillary)(주식회사토호(Toho KK, Tokyo, Japan) 판매, 상품명 「마크 튜브」, No.14(직경 0.6mm, 린데만유리제)) 내에 충전장이 대략 30mm가 되도록 균일하게 충전하였다. 이어서, 캐필러리를 시료의 충전 종단으로 절단하고, 개구부를 접착제로 봉한 후, 시료 마운트에 캐필러리를 점토로 고정하여, 캐필러리의 길이방향(longitudinal direction)이 분말 X선 회절 장치의 광축에 대해서 수직이 되도록 시료 마운트를 분말 X선 회절 장치에 설치하였다.
아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 배향에 의한 분말 X선 회절 프로필에 대한 영향을 제외하기 위해, 측정 중 캐필러리의 길이방향에 1회/60초의 주기로 시료 마운트를 ±1.5mm의 폭으로 등속 왕복진동시키면서, 캐필러리의 길이방향을 회전축으로 하여 시료 마운트를 2회/초의 주기로 등속 회전시켰다.
피험시료 1 및 2에 대하여 얻어진 분말 X선 회절 프로필을 해석하고, 분말 X선 회절 패턴을 작성하는 과정에서는 측정 정밀도를 올리기 위해서, 통상의 방법에 따라 각 분말 X선 회절 프로필로부터 분말 X선 회절 장치에 유래하는 백그라운드 시그널을 제거하였다. 이렇게 하여 얻어진 피험시료 1 및 2에 대한 분말 X선 회절 패턴을 각각 도 3 및 도 4에 도시한다.
도 3에 도시한 바와 같이, 방사광을 사용한 분말 X선 회절에 의한 피험시료 1에 대한 분말 X선 회절 패턴에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절 피크가 회절각(2θ) 2 내지 40°의 범위에 명료하고 분명하게 출현하였다. 도 3으로 도 1을 비교하면, 방사광의 파장(0.7717 옹스트롬)과 특성 X선의 파장(1.5405 옹스트롬)이 다르기 때문에, 도 3에서는 도 1에서의 거의 2분의 1의 회절각(2θ)으로 각 회절피크가 출현한다는 차이는 있으나, 도 1 및 도 3에서의 회절 패턴은 상당히 잘 일치하고 있었다. 또, 도 3에서의 각 회절피크의 강도는 도 1에서의 회절 피크의 강도보다 100배 가깝게 강력함에도 불구하고, 각 회절피크의 반값폭(peak width at half height)은 도 1에서보다 분명히 좁고 분리도도 높았다. 또, 도 3의 분말 X선 회절 패턴에서는 후술하는 도 4에서 도시한 바와 같이 무정형 부분에 특유한 할로는 전혀 인정되지 않았다. 이것은 피험시료 1 중의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결정성이 상당히 높고, 피험시료 1이 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 것을 나타내고 있다.
한편, 도 4에 도시한 바와 같이, 방사광을 사용한 분말 X선 회절에 의한 피험시료 2에 대한 분말 X선 회절 패턴에서는 무정형 부분에 특유한 할로가 베이스 라인의 융기로서 분명하게 출현하고, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 특유한 회절 피크는 전혀 인정되지 않았다. 이것은 피험시료 2가 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 것을 나타내고 있다.
방사광을 X선원으로 사용하여 얻어진 상기의 결과는 피험시료 1 및 피험시료 2가 식 [1]에서의 해석값 H100 및 해석값 H0를 결정하기 위한 표준시료로서 적절한 것임을 뒷받침하고 있다.
<실험 1-4: 고결성 시험>
피험시료 1 내지 4의 각각에 대해 그 고결성을 조사하는 목적으로 이하의 실험을 실시하였다. 즉, 실험 1-1에서 조제한 피험시료 1 내지 4를 1g씩 칭취하고, 각각 별개로 내저부가 반구형상의 14ml 뚜껑 달린 폴리프로필렌제 원통 튜브(벡튼 디킨슨 사(Becton, Dickinson and Company, New Jersey, USA) 판매, 상품명 「팔콘 튜브 2059」, 직경 1.7cm, 높이 10cm)의 내부에 충전하고, 튜브를 튜브랙에 직립시킨 상태로 50℃의 인큐베이터(어드번택토요주식회사(advantac Toyo Kaisya, Ltd., Tokyo, Japan) 판매, 상품명 「CI-410」)의 내부에 수용하고, 24시간에 걸쳐서 정치한 후, 튜브를 인큐베이터 밖으로 꺼내고, 튜브로부터 뚜껑을 제거하여 튜브를 완만하게 전도시킴으로써, 피험시료를 흑색 플라스틱제 평판 상에 꺼내고, 꺼낸 피험시료 상태를 육안으로 관찰하였다.
고결의 유무는 피험시료가 평판 상에서도 또한 튜브내 바닥부의 반구형상을 분명하게 유지하고 있는 경우를 「고결 있음」(+), 피험시료가 튜브내 바닥부의 형상을 근소하지만 식별할 수 있는 경우를 「다소 고결 있음」(±), 피험시료가 붕괴하고, 튜브내 바닥부의 형상을 유지하고 있지 않은 경우를 「고결 없음」(-)로 판정하였다. 결과는 표 1에서의 「고결성」의 란에 나타낸 바와 같다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 해석값 H100를 결정하기 위한 표준시료로 한 피험시료 1(결정화도 100.0%)는 평판 상에 꺼내면 붕괴하고, 튜브내 바닥부의 형상을 유지하지 않고, 「고결 없음」(-)으로 판단되었다. 이에 대해, 해석값 H0를 결정하기 위한 표준시료로 한 피험시료 2(결정화도 0.0%)는 튜브로부터 평판 상에 꺼내어도 또한 튜브내 바닥부의 반구형상을 명확하게 유지하고 있어서 명백하게 「고결 있음」(+)으로 판단되었다. 평판 상에 꺼내어진 피험시료 2가 유지하고 있는 튜브내 바닥부의 반구형상의 형태는 평판에 가볍게 진동을 준 정도로는 붕괴하지 않을 정도였다.
결정화도가 88.3%인 피험시료 3은 피험시료 2와 마찬가지로 튜브로부터 평판 상에 꺼내어도 또한 튜브내 바닥부의 반구형상을 명확하게 유지하고 있어서 명백하게 「고결 있음」(+)로 판단되었으나, 결정화도가 93.1%인 피험시료 4는 피험시료 1과 마찬가지로 평판 상에 꺼내자마자 붕괴하여 「고결 없음」(-)로 판단되었다.
또한, 피험시료 2 내지 4는 상술한 바와 같이 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 99.9%의 피험시료 1을 기본으로 조제한 것이지만, 상술한 HPLC 분석에 의하면, 그들 아스코르빈산 2-글루코시드 순도는 모두 99.1%에 머물렀다. 이 이유는 확실하지 않으나, 조제 도중에 어떠한 이유로 아스코르빈산 2-글루코시드가 극히 미량이지만 분해 등을 하여 없어진 것으로 추측된다.
상기의 결과는 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 99.1% 이상 함유하는 분말의 경우, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 높을수록 고결성이 낮은 경향이 있다는 것을 나타내고 있으며, 결정화도가 88.3%의 피험시료 3이 「고결 있음」(+)로 판단되고, 결정화도가 93.1%의 피험시료 4가 「고결 없음」(-)로 판단되었다는 사실은 상기 고결성 시험에서 「고결 있음」(+)로부터 「고결 없음」(-)로 바뀌는 임계점이 결정화도 88.3%와 93.1%의 사이에 있다는 것을 나타내고 있다.
<실험 2: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 고결성과 결정화도의 관계>
본 실험에서는 실험 1의 결과에 기초하여 고결성과 결정화도의 관계를 더 상세하게 조사하기 위해서, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 0 내지 100%의 범위에 있고, 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 99.1 내지 99.9%인 7종류의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 사용하여 실험 1과 동일하게 고결성에 대하여 시험하였다.
<실험 2-1: 피험시료의 조제>
실험 1-1에서 조제한 피험시료 1과 피험시료 2를 각각 적량 덜어서 균일하게 혼합함으로써, 표 2에 나타내는 피험시료 5 내지 9의 분말을 조제하였다. 실험 1-2에 기재한 방법에 의해 구한 피험시료 5 내지 9의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도와 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도는 표 2에 나타낸 바와 같았다. 또한, 표 2에서의 피험시료 1 및 2에 대한 결과는 표 1과 같다.
<실험 2-2: 고결성 시험>
피험시료 5 내지 9를 실험 1-4의 고결성 시험에 제공하였다. 결과를 표 2의 「고결성」의 란에 설명하였다. 또한, 표 2에서의 피험시료 1 및 2에 대한 「고결성」은 표 1에 기재한 피험시료 1 및 2에 대한 고결성 시험 결과를 나타낸 것이다.
표 2의 결과에 나타낸 바와 같이, 결정화도가 29.9%인 피험시료 9는 「고결 있음」(+)로 판단되고, 결정화도가 89.2%인 피험시료 8은 「다소 고결 있음」(±)로 판단되었다. 이것에 대해, 결정화도가 91.5%인 피험시료 7, 결정화도가 92.6%인 피험시료 6 및 결정화도가 99.8%인 피험시료 5는 모두 피험시료 1과 동일하게 「고결 없음」(-)로 판단되었다. 이들 결과는 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 99.1% 이상 99.9% 미만 함유하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 있어서 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상의 경우, 본 실험의 조건 하에서는 고결하지 않는 것을 나타내고 있다.
<실험 3: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 고결성에 미치는 동적 수분 흡착량의 영향>
아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 고결에는 분말의 흡습성이 유의하게 관여하고 있다고 추정되므로, 본 실험에서는 피험시료 1 및 2, 및 피험시료 5 내지 9에 대해, 흡습성의 많고 적음을 판정하는 유용한 지표 중 하나라고 생각되는 동적 수분 흡착량을 측정하고, 실험 2-2에서 얻은 고결성에 대한 시험 결과와 대조함으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 고결에 미치는 동적 수분 흡착량의 영향에 대하여 검토하였다.
<실험 3-1: 동적 수분 흡착량의 측정>
실험 1-1에서 조제한 피험시료 1 및 2, 및 실험 2-1에서 조제한 피험시료 5 내지 9를 각각 약 50mg씩 칭취하고, 각각 별개로 메쉬 버켓(mesh bucket)에 넣어 버켓 홀더(SUS 제)에 설치한 상태로 수분흡탈착 측정장치(Hiden Isocheme사 판매, 상품명 「IGA SORP」)의 내부에 정치하고, 200ml/분의 질소기류 하, 온도 25℃, 상대습도 0%에서 12시간 동안 유지함으로써 피험시료로부터 수분을 제거하고, 바로 피험시료를 칭량하였다. 그 후, 또 질소기류 하, 온도 25℃, 상대습도 35%에서 12시간 동안 유지하여 다시 칭량하였다. 수분을 일단 제거한 피험시료의 중량과 피험시료를 질소기류 하, 온도 25℃, 상대습도 35%에서 12시간 동안 가습한 직후의 중량을 상기 식 [2]에 대입하여 동적 수분 흡착량(%)을 구하였다. 피험시료 1 및 2, 및 피험시료 5 내지 9에 대하여, 본 실험에서 얻은 동적 수분 흡착량의 결과를 표 3에 설명한다. 아울러, 실험 2-1에서 얻은 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도, 및 실험 2-2에서 얻은 고결성에 대한 시험 결과를 표 3에 설명한다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 피험시료 2, 5 내지 9의 동적 수분 흡착량은 검출한계인 0.01미만(즉, 표 중의 「<0.01」에 대응한다. 이하 동일)에서 1.70%의 범위로 서로 다르고, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 99.1% 이상 99.9% 미만 함유하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이어도 동적 수분 흡착량의 수치가 유의하게 다른 것이 있음을 나타내고 있다. 즉, 피험시료 1, 5, 6의 동적 수분 흡착량은 모두 검출한계 이하의 낮은 값이었던 것에 비해, 피험시료 2, 8, 9는 모두 0.05%를 초과하는 동적 수분 흡착량을 나타내고, 피험시료 2에 이르러서는 동적 수분 흡착량은 1.70%이며, 피험시료 8, 9의 10배 이상이었다.
이들 결과와 표 3의 「고결성」의 란에 나타내는 결과를 비교하면, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 있어서 분말의 고결성과 동적 수분 흡착량의 사이에는 명백한 상관성이 있다는 것을 알 수 있다. 즉, 동적 수분 흡착량이 검출한계 이하 또는 0.01%로 낮은 값을 나타내는 피험시료 1, 5, 6, 7이 모두 「고결 없음」(-)이었던 것에 비해, 동적 수분 흡착량이 0.05 내지 1.70%에 이르는 피험시료 2, 8, 9는 모두 「고결 있음」(+), 또는「다소 고결 있음」(±)이었다. 본 실험의 결과는 고결하기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 실현하는데 있어서 결정화도와 함께 동적 수분 흡착량이 유력한 지표가 될 수 있다는 것을 설명하고 있다. 또, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드를 99.1% 이상 99.9% 미만 함유하는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 동적 수분 흡착량이 검출한계 이하인지, 0.01% 이하이면 본 실험의 조건 하에서는 고결하지 않는다고 판단된다.
또한, 본 실험에서 피험시료 2가 1.70%라는 상당히 높은 동적 수분 흡착량을 나타냈던 것은 피험시료 2에서의 수분 흡착의 주체가 무정형 부분임을 시사하고 있다. 한편, 피험시료 1의 동적 수분 흡착량이 검출한게 이하의 낮은 값이었던 것은 피험시료 1이 피험시료 2와 같은 무정형 부분을 실질적으로 함유하고 있지 않음을 시사하고 있다. 이것은 도 1 및 도 3에 도시한 피험시료 1의 분말 X선 회절 패턴과도 잘 정합하고 있고, 식 [1]에 기초하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도를 계산하는 기초가 되는 해석값 H100를 결정하기 위한 표준시료로서 피험시료 1이 적절한 것임을 뒷받침하고 있다.
<실험 4: 강제냉각이 분말의 결정화도, 동적 수분 흡착량 및 고결성에 미치는 영향>
선행하는 실험에 의해 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 있어서는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도와 분말의 동적 수분 흡착량이 각각 분말의 고결성과 밀접한 관계를 가지고 있는 것이 밝혀졌다. 본 실험에서는 분말 제조시의 숙성, 건조공정 후에서의 결정 함유 분말의 강제냉각이 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 결정화도, 동적 수분 흡착량 및 고결성에 미치는 영향에 대하여 조사하였다.
<실험 4-1: 피험시료의 조제>
실험 1-1에서 피험시료 2와 동일하게 하여 조제한 분말을 금속제 트레이 내에 스프레드하고, 온도 25℃, 상대습도 90%가 되도록 조절한 항온, 항습의 챔버 내에 16시간 동안 수용함으로써 결정화를 촉진시키고, 분말을 부분적으로 결정화시켰다. 그 후, 금속제 트레이를 챔버로부터 꺼내서, 40℃에서 8시간 동안 건조시키고, 이어서 약 2시간 동안 자연히 방랭하여 얻은 분말을 피험시료 10, 건조 후에 20℃의 공기를 15분 또는 40분 동안 금속제 트레이 내의 분말에 취부하여 트레이 내의 분말을 강제냉각함으로써 얻은 분말을 각각 피험시료 11 및 피험시료 12로 하였다. 또한, 피험시료 10 내지 12는 분석시험에 제공하기 직전까지 뚜껑 달린 바이알병 내에 밀봉하여 건조제와 함께 데시케이터 내에 밀봉 보존하였다.
<실험 4-2: 아스코르빈산 2-글루코시드 순도의 측정>
실험 1-2에 기재한 방법에 의해, 피험시료 10 내지 12의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도를 구하여 표 4에 기재하였다. 피험시료 1의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도는 표 1과 같다.
<실험 4-3: 결정화도 및 동적 수분 흡착량의 측정>
피험시료 10 내지 12의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 및 분말의 동적 수분 흡착량은 각각 실험 1 및 실험 3 기재의 방법에서 측정하였다. 결과를 표 4에 설명한다. 또한, 표 4에서의 피험시료 1에 대한 결과는 표 1및 표 3과 같다.
<실험 4-4: 고결성 시험>
피험시료 10 내지 12를 실험 1-4의 고결성 시험에 제공하였다. 결과를 표 1에 기재한 피험시료 1에 대한 고결성 시험의 결과와 함께 표 4에서의 「고결성」의 란에 설명하였다.
표 4에서 밝혀진 바와 같이, 결정화에 의해 얻은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 숙성, 건조한 후에, 자연방랭하여 조제한 피험시료 10은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 88.1%, 동적 수분 흡착량이 0.06%이며, 고결성 시험에서 「고결 있음」(+)라는 결과가 되었다. 이에 대해, 분말을 숙성, 건조한 후에, 20℃의 공기를 15분 동안 취부하여 강제냉각한 피험시료 11은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 91.5%, 동적 수분 흡착량이 검출한계 이하이며, 고결성 시험에서 「고결 없음」(-)라는 결과가 되었다. 마찬가지로 분말을 숙성, 건조한 후에, 20℃의 공기를 40분 동안 취부하여 강제냉각한 피험시료 12는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 94.1%, 동적 수분 흡착량이 검출한계 이하이며, 고결성 시험에서 「고결 없음」(-)라는 결과가 되었다. 이들 결과는 분말을 숙성, 건조한 후에 자연히 방랭하는 것보다도 강제냉각하는 것이 분말의 결정화가 촉진되며, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 높고, 또한, 분말의 동적 수분 흡착량이 낮은, 즉, 고결하기 어려운 분말을 제조하는데 있어서 유리하다는 것을 나타내고 있다.
<실험 5: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 고결성에 미치는 아스코르빈산 2-글루코시드 순도의 영향>
선행하는 실험에 의해, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 99.1% 이상이라는 고순도의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 있어서는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도와 분말의 동적 수분 흡착량이 각각 분말의 고결성과 밀접한 관계를 가지고 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 본 실험에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 고결성과 아스코르빈산 2-글루코시드 순도의 관계에 대하여 검토하였다.
<실험 5-1: 피험시료의 조제>
이하와 같이 하여, L-아스코르빈산과 전분질의 일종인 덱스트린을 함유하는 수용액으로부터 표 5에 나타내는 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 서로 다른 피험시료 13 내지 18을 조제하고, 실험 1-4에서와 동일한 고결성 시험에 제공하였다.
즉, 덱스트린(마츠야화학공업주식회사(Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japam) 판매, 상품명 「파인덱스＃100」) 4 중량부를 물 15중량부에 가열 용해하고, L-아스코르빈산 3중량부를 첨가하고, pH5.5, 액체의 온도를 55℃로 유지하면서, 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-62주 유래의 CGTase를 덱스트린 1g당 100단위와 이소아밀라아제(주식회사하야시바라생물화학연구소 판매)를 덱스트린 1g당 250단위 첨가하고, 50시간 동안 반응시켜서, 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시켰다. 또한, 반응액 중에는 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토테트라오실-L-아스코르빈산 등의α-글리코실-L-아스코르빈산류도 당연히 생성하고 있다고 추측된다.
반응액을 가열함으로써 효소를 실활시킨 후, pH4.5로 조정하고, 글루코아밀라아제(상품명 「글루크자임 AF6」아마노엔자임주식회사(Amano Enzymes Inc., Aichi, Japan) 판매)를 덱스트린 1g당 50단위 첨가하여 24시간 동안 반응시킴으로써, 상기와 같은 α-글리코실-L-아스코르빈산류를 아스코르빈산 2-글루코시드까지, 또, 혼재하는 미반응의 올리고당을 D-글루코스까지 분해하였다. 이 시점에서 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드에 대한 생성률은 39%였다.
반응액을 가열함으로써 글루코아밀라아제를 실활시키고, 활성탄으로 탈색 여과한 후, 여과액을 양이온 교환수지(H+형)의 칼럼에 통액하여 탈염한 후, 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루시코드를 흡착시키고, 수세하여 D-글루코스를 제거한 후, 0.5N 염산 용액으로 용출하였다. 또한, 이 용출액을 고형분 약 50%까지 농축하고, 이어서 강산성 양이온 교환수지(다우케미컬사(Dow Chemical Company) 제조, 상품명 『다웩스(DAWEX) 50WX4』, Ca2 +형)를 사용하는 칼럼크로마토그래피에 제공하였다. 이 고형분 약 50%에 농축한 용출액을 칼럼에 그 습윤수지 용적의 약 1/50량 부하하고, 부하량의 50배의 정제수를 선속도 1m/시간으로 통액하여 용출액을 칼럼용적의 0.05용적량씩 분획하였다. 그런 다음, 각 분획의 조성을 실험 1-1에서 설명한 HPLC법에 의해 측정하고, 무수물 환산으로 아스코르빈산 2-글루코시드 함량이 80% 이상인 6분획에 대해, 그들을 농도 약 76%까지 감압 농축하고, 얻어진 농축액을 조정관에 담고, 종정으로 실험 1-1에서의 피험시료 1을 2%씩 첨가하여 농축액을 완만하게 교반하면서, 2일에 걸쳐 액의 온도를 40℃에서 15℃로 내림으로써 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정을 정석시켰다.
그런 다음, 통상의 방법에 따라 바스켓형 원심분리기에 의해 마세큐트로부터 결정을 채취하고, 소량의 증류수로 세정한 후, 숙성, 건조하고, 25℃의 공기를 30분 동안 취부 냉각하고, 분쇄함으로써, 표 5에 나타내는 피험시료 13 내지 18을 얻었다.
또한 표 5에 나타낸 피험시료 1 및 2는 실험 1-1과 동일한 것이며, 그들 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도, 및 동적 수분 흡착량은 선행하는 실험에서 얻은 결과를 그대로 나타낸 것이다. 또, 피험시료 19는 종래의 의약부외품급의 분말인 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(상품명 「AA2G」주식회사하야시바라생물화학연구소 판매)을 사용하였다. 선행하는 실험에서 설명한 방법에 의해 피험시료 13 내지 19의 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 및 분말의 동적 수분 흡착량을 측정하여 결과를 표 5에 설명하였다.
<실험 5-2: 고결성 시험>
실험 5-1에서 얻은 피험시료 13 내지 19의 고결성을 실험 1-4와 동일한 방법으로 시험하였다. 결과를 표 5에 나타낸다. 또한, 표 5에 나타낸 1 및 2에 대한 고결성 시험의 결과는 표 1의 것을 그대로 나타낸 것이다.
<실험 5-3: 보존성 시험>
실험 1-4 등에서 실시된 고결성 시험이 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 실제의 보존시에서의 고결성을 평가하는 시험으로서 타당한 것임을 확인하기 위하여, 실험 1-1의 방법에서 얻은 피험시료 1, 실험 5-1에서 얻은 피험시료 13 내지 18, 및 피험시료 19에 대하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 실제로 보존되는 상태, 환경, 기간 등을 상정한 보존성 시험을 실시하였다.
즉, 피험시료 1 및 피험시료 13 내지 19를 10kg씩 덜어서, 각각 이중으로 한 폴리에틸렌봉지(세로 80mm×가로 600mm)에 넣은 것을 각 피험시료에 대해 1봉지씩 제작하였다. 그 다음에 각 폴리에틸렌봉지를 개구부를 위로 향하게 하고, 개구한 채로 스틸캔에 넣어(18리터용) 스틸캔의 뚜껑을 덮지 않고 정치하고, 실온에서 습도조절 없는 환경하에서 45일 동안 보존하였다. 45일 동안 보존한 후, 스틸캔으로부터 각 피험시료가 들어있는 폴리에틸렌봉지를 꺼내고, 봉지로부터 피험시료를 흑색 플라스틱제 평판 상에 담아서 그 때의 피험시료의 유동성과 고결상태를 육안으로 관찰하였다.
고결의 유무는 피험시료 중에 괴상물(solidification)이 인정되고 보존 개시시와 비교하여 유동성이 저하하고 있는 경우를 「고결 있음」(+)으로 판정하고, 괴상물이 인정되지 않고 보존 개시시와 비교하여 유동성에 변화가 없는 경우를 「고결 없음」(-)으로 판정하였다. 또한, 본 보존시험에서의 각 피험시료의 보존형태는 개구부를 고무 밴드로 폐구하고 있지 않은 점, 건조제를 넣지 않은 점, 및 스틸캔의 뚜껑을 덮고 있지 않은 점을 제외하고, 의약부외품급의 분말의 상품형태와 동일하고, 실제로 시장에 유통하여 보존될 때의 형태와 동일하다. 또한, 상기 3개의 상이점은 시험 결과가 조기에 얻어지도록 보존시험에서의 보존환경을 실제의 보존환경보다 다소 가혹하게 하기 위해 의도적으로 설정된 상이점이다. 결과를 표 5에 함께 설명하였다.
표 5에 나타낸 바와 같이, 실질적으로 무정형 부분으로 이루어지는 피험시료 2 및 의약부외품급의 분말인 피험시료 19를 제외하고, 그 나머지 피험시료 1 및 피험시료 13 내지 18에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 높아짐에 따라, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 높아지는 경향이 있다. 또한, 고결성 시험에서 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 각각 97.4% 및 98.0%인 피험시료 13 및 14가 「고결 있음」(+) 또는 「다소 고결 있음」(±)으로 판단된 것에 대하여, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 98.6 내지 99.7%인 피험시료 15 내지 18은 「고결 없음」(-)로 판단되었다. 이들 결과는 고결성을 좌우한다고 생각되는 아스코르빈산 2-글루코시드 순도에 대한 문턱값이 98.0% 부근에 있다는 것을 나타내고 있고, 「고결 없음」(-)로 평가되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻으려면 98.0%를 초과하는 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 필요하다고 결론지을 수가 있다.
또, 피험시료 15 내지 18의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도는 98.6 내지 99.7%이고, 의약부외품급의 분말인 피험시료 19의 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 98.9%과 거의 동일한 레벨이며, 시약급의 분말이고 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 피험시료 1의 순도보다 유의하게 낮음에도 불구하고, 피험시료 1과 마찬가지로 고결은 전혀 인정되지 않았다. 또한, 피험시료 15 내지 18의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도는 91.6 내지 99.5%, 의약부외품급의 분말인 피험시료 19의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도는 88.9%와 90%를 밑돌고 있었다. 이와 같은 결과로부터 의약부외품급의 분말인 피험시료 19보다 유의하게 고결하기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻으려면, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도를 90% 이상으로 할 필요가 있다고 판단된다.
또한, 피험시료 1 및 피험시료 13 내지 18에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 높아짐에 따라 동적 수분 흡착량이 저하하는 경향이 인정되어 동적 수분 흡착량이 0.07%인 피험시료 13이 「고결 있음」(+), 동적 수분 흡착량이 0.04%인 피험시료 14, 및 동적 수분 흡착량이 0.03%인 피험시료 19가 「다소 고결 있음」(±)로 판단된 것에 대해, 동적 수분 흡착량이 0.01%인 피험시료 15 및 동적 수분 흡착량이 검출한계 이하인 피험시료 16 내지 18은 「고결 없음(-)」로 판단되었다. 이러한 결과는 분말의 동적 수분 흡착량이 0.01% 이하인 경우에는 의약부외품급의 분말인 피험시료 19보다 유의하게 고결하기 어려운 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻을 수 있는 것을 나타내고 있다.
또한, 표 5의 최하단에 나타낸 바와 같이, 각 피험시료를 실제의 상품형태에 따라서, 10kg 용량의 봉지에 넣은 상태로 45일 동안 보존한 보존성 시험에서도 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도가 각각 97.4% 및 98.0%인 피험시료 13 및 14가 「고결 있음」(+)으로 판단된 것에 대하여, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도가 98.6 내지 99.7%인 피험시료 15 내지 18은 「고결 없음」(-)로 판단되어 고결성 시험과 동일한 결과가 얻어졌다. 이 사실은 실험 1-4 등에서의 고결성 시험이 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 실제의 보존환경 하에서의 고결성을 평가하는 시험으로서 타당한 것임을 나타내고 있다.
<실험 6: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 있어서의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결정화도와 결정자 지름의 관계>
일반적으로 결정 함유 분말 한 개의 분말 입자는 복수의 단결정, 즉, 복수의 결정자에 의해 구성되어 있다고 생각되고 있고, 그 분말의 결정화도가 높으면, 각각의 분말 입자의 결정자의 크기(지름)는 크다고 추측된다. 이와 같은 결정자 지름은 분말 X선 회절 프로필에 기초하여 산출되는 회절 피크의 반값(가)폭과 회절각을 사용하여 하기 식 [6]에서 나타내는 「세러(Scherrer)의 식」에 기초하여 산출할 수가 있다고 되어 있고, 일반적인 분말 X선 회절 장치에는 이와 같은 결정자 지름 산출용의 컴퓨터소프트웨어가 탑재되고 있다. 그래서, 실험 1에서 조제한 실질적으로 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정으로 이루어지는 피험시료 1, 실험 5에서 조제한 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이며, 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도 및 그의 무수결정의 결정화도가 종래의 의약부외품급의 분말에 비교적 가까운 피험시료 15 및 실험 5에서 사용한 종래의 의약부외품급의 분말인 피험시료 19를 선택하고, 하기 방법에 의해 이들 분말 한 개의 분말 입자에 포함되는 결정자 지름을 산출하였다.
식 [6]:
<아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결장자 지름의 산출방법>
결정자 지름 산출의 기초가 되는 분말 X선 회절 프로필로 실험 1 또는 실험 5에 있어서 각각 피험시료 1, 15, 19에서의 아스코르빈산 2－글루코시드 무수결정에 대한 결정화도의 해석값의 결정에 사용한 분말 X선 회절 프로필을 사용하였다. 이와 같은 분말 X선 회절 프로필을 해석하고 작성한 회절 패턴으로부터 아스코르빈산 2－글루코시드 무수결정의 결정자 지름의 계산에 사용하는 회절 피크로 한 개의 분말입자 내에서의 결정자의 불균일에 기인하는 회절 피크 폭에 대한 영향이 적다고 판단되는 비교적 저각의 영역이고, 또한, 각각 분리 가능하다고 생각된 회절각(2θ)이 10.4°, 13.2°, 18.3°, 21.9° 및 22.6°의 부근의 회절 피크를 선택하였다. 분말 X선 회절 장치에 부속하는 해석 처리용 컴퓨터소프트웨어(「엑스퍼트 하이스코어 플러스(X＇pert Highscore Plus)」)를 사용하고, 각각의 피험시료의 분말 X선 회절 프로필을 처리하고, 선택한 5개의 회절 피크의 반값폭과 회절각(2θ)을 구하고, 표준품으로서 규소(미국국립표준기술연구소(NIST) 공급, X선 회절용 표준 시료(「Si640C」))를 사용하였을 경우의 측정값에 근거하여 보정하였다. 이 보정 후의 반값폭과 회절각(2θ)을 사용하여 상기 소프트웨어 중의 「세라(Scherrer)의 식」에 의한 프로그램으로 이들 피험시료에서의 아스코르빈산 2－글루코시드 무수결정의 결정자 지름을 산출하였다. 결과를 표 6에 나타낸다. 또한, 각 피험시료의 결정자 지름은 선택한 5개의 회절 피크 각각에 대하여 산출하고, 그들 평균값으로 나타내었다. 또, 각 피험시료의 아스코르빈산 2－글루코시드의 순도 및 그 무수결정에 대한 결정화도는 표 5에서의 것을 그대로 나타낸 것이다. 또한, 피험시료 15 및 19의 분말 X선 회절 패턴은 모두 아스코르빈산 2－글루코시드 무수결정에 특유의 명료하고 분명한 회절 피크가 회절각(2θ) 4 내지 65°의 범위에 출현하고, 회절 피크의 패턴은 피험시료 1의 분말 X선 회절 패턴(도 1)과 잘 정합하고 있었으므로, 이들 피험시료의 분말 X선 회절 프로필로부터 각각의 피험시료에 포함되는 아스코르빈산 2－글루코시드 무수결정의 결정자 지름을 산출하고 비교하는 것은 타당하다고 판단하였다.
표 6에 나타낸 바와 같이, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 100%인 피험시료 1에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결정자 지름은 1,770Å로 산출되었다. 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 91.6%인 피험시료 15에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결정자 지름은 1,440Å로 산출되었다. 또, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 88.9%인 피험시료 19에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정의 결정자 지름은 1,380Å로 산출되었다. 이들 3종의 피험시료 간에서는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 높을 수록 그 결정자 지름이 큰 값을 나타내고, 결정화도와 결정자 지름 간에는 상관관계가 인정되었다.
<실험 7: 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 환원력과 착색의 관계>
선행하는 실험에서 사용한 피험시료는 모두 L-아스코르빈산과 전분질을 포함하는 용액에 CGTase를 작용시키는 공정을 거쳐 얻어진 아스코르빈산 2-글루코시드 함유한 용액으로부터 조제되는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이다. 이와 같은 제법에 의한 경우, 얻어지는 분말에는 양의 많고 적음에 관계없이, 제조방법에 특유의 협잡물인 L-아스코르빈산 및 D-글루코스가 포함되게 된다. L-아스코르빈산이나 D-글루코스는 모두 환원성을 가지고 있고, 포함되는 양에 의해서도 달라지는데, 단백질이나 아미노산 등의 아미노기를 가지는 화합물을 포함하는 제품에 사용하였을 경우, 제품에 좋지 않은 변색을 가져올 우려가 있다. 그 중에서도 L-아스코르빈산은 산소와의 반응성이 높고, 이를 사용한 제품에 좋지 않은 변색을 초래할 뿐만 아니라, 종래의 의약부외품급의 분말을 장기간 보존한 경우에 때때로 인정된 분말 자체의 변색의 원인도 된다고 생각된다.
그래서, 본 실험에서는 선행하는 실험에서 사용한 피험시료 1 및 피험시료 15 내지 19에 대해, 그들의 분말에서의 L-아스코르빈산과 D-글루코스의 합계량, L-아스코르빈산량, 또한, 분말 전체의 환원력과 착색성의 관계에 대하여, 하기의 순서로 가열처리에 의한 가속시험을 실시함으로써 검토하였다.
10ml 스크류캡이 달린 시험관 내에 각 피험시료를 무수물 환산으로 150mg씩 칭취하고, 시험관의 개구부를 막은 상태로 오븐(마스다이화주식회사(Masuda Corp., Osaka, Japan) 판매, 상품명 「DYING-OVEN SA310」) 내에 수용하여 80℃에서 3일 동안 가온하였다. 이어서, 시험관에서 스크류캡을 제거하고, 각 피험시료에 탈이온수를 3ml씩 첨가하여 용해시킨 후, 분광 광도계(주식회사시마즈제작소 판매, 상품명 「UV-2400 PC」)에 의해 파장 400nm에서의 흡광도를 측정하였다. 가온에 따르는 착색의 정도는 파장 400nm에서의 흡광도의 수치가 0.50 미만인 경우:「착색하지 않거나, 또는 실질적으로 착색하지 않음」(-), 상기 흡광도의 수치가 0.50 이상인 경우:「착색함」(+)의 2 단계로 판정하였다. 결과를 표 7에 설명한다.
또한, 각 피험시료 중의 L-아스코르빈산과 D-글루코스의 합계량은 실험 1-1에서 설명한 HPLC법에 의해 결정하였다. 또, 분말 전체의 환원력에 대해서는 D-글루코스를 표준물질로 사용하고, 이 분야에서 범용되고 있는 소모지넬슨법 및 안트론 황산법에 의해 각각 환원당량 및 전(全) 당량을 측정하고, 그것들을 상술한 식 [3]에 대입하여 계산함으로써 구하였다. 각 피험시료에서의 L-아스코르빈산과 D-글루코스와의 합계량, L-아스코르빈산량 및 분말 전체의 환원력은 표 7에 설명하는 바와 같다.
표 7에 나타낸 바와 같이, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에서는 실질적으로 아스코르빈산 2-글리코시드 무수결정으로 이루어지는 시약급의 분말인 피험시료 1에서는 L-아스코르빈산 및 D-글루코스량은 모두 검출한계 이하였다. 이에 대해 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 피험시료 12 내지 18 및 종래의 의약부외품급의 분말인 피험시료 19에서는 어떤 분말에서도 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코스가 검출되었다. 또한, 이와 같은 분말에 있어서는 피험시료 15 내지 18과 같이 L-아스코르빈산과 D-글루코스의 합계량이 무수물 환산으로 0.2% 이하인 경우에는 「착색하지 않거나, 또는 실질적으로 착색하지 않음」(-)로 판단된 것에 대해, 피험시료 19와 같이 L-아스코르빈산과 D-글루코스의 합계량이 무수물 환산으로 0.3%, 「착색함」(+)로 판단되었다. 또한, 이와 같은 분말의 착색성에 가장 강력하게 관여한다고 생각되는 L-아스코르빈산에 대해서는 피험시료 15 내지 18과 같이 그 함량이 무수물 환산으로 0.1% 이하인 경우에는 「착색하지 않거나, 또는 실질적으로 착색하지 않음」(-)로 판단된 것에 대하여, 피험시료 19와 같이 L-아스코르빈산량이 무수물 환산으로 0.2%에 달하면 「착색함」(+)로 판단되었다. 또한, 이미 설명한 바와 같이 L-아스코르빈산은 효소와의 반응성이 높고, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 착색에 관여하고 있다고 생각되므로, L-아스코르빈산량이 0.1% 이하의 경우에는 이와 같은 분말을 종래의 의약부외품급의 분말의 상품 형태로 장기보존하는 경우, 실질적으로 착색을 우려하지 않아도 좋다.
한편, 환원력에서 보면, 피험시료 15 내지 18과 같이 분말 전체의 환원력이 1% 미만인 경우, 「착색하지 않거나, 또는 실질적으로 착색하지 않음」(-)로 판단된 것에 대해, 피험시료 19와 같이 분말 전체의 환원력이 1%를 초과하면, 「착색함」(+)로 판단되었다. 이 결과는 상기한 L-아스코르빈산과 D-글루코스의 합계량을 지표로 하여 판정한 결과와 잘 일치하고 있었다.
이상의 결과는 제조방법에 기인하여, 불가피적으로 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코스를 검출할 수 있는 레벨로 포함하고 있어도 분말 전체의 환원력을 1% 미만으로 하는 경우에는 착색의 우려가 없는 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻을 수 있다는 것을 나타내고 있다. 또, 사용한 제품의 착색뿐만 아니라, 분말 자체의 착색이라는 관점을 포함하면, L-아스코르빈산의 함량은 무수물 환산으로 0.1% 이하가 바람직하다는 것을 나타내고 있다.
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 더 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
〈CGTase 조효소액의 제조〉
지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-62주(독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 수탁번호 FERM BP-11143)을 뉴트리언트 아가(nutrient agar)(Difco사 판매)의 사면배지를 사용하여 50℃에서 2일 동안 배양하였다. 사면배지에서 균체를 1 백금이 묻히고, 가용성 전분 2%, 염화암모늄 0.5%, 인산수소칼륨 0.05%, 황산마그네슘 0.025% 및 탄산칼슘 0.5%를 포함하는 시드(seed)용 액체배지에 식균하고, 50℃에서 3일 동안 진탕 배양하고, 또한, 시드 배양하여 얻은 배양액을 가용성 전분을 덱스트린으로 바꾼 것 이외에는 시드 배지와 동일 조성의 메인 배양용 액체배지에 식균하여, 50℃에서 3일 동안 진탕 배양하였다. 이 배양액을 원심분리로 제균하고, 원심상청액을 UF막으로 액량이 약 18분의 1이 될 때까지 농축하여 CGTase 조효소액으로 하였다.
〈아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조〉
액화 감자 전분 4중량부를 물 20중량부에 첨가하여 가열 용해하고, L-아스코르빈산 3중량부를 첨가하고, pH를 5.5로 조정하여 기질용액으로 하였다. 이에 상기 CGTase의 조효소액을 액화 전분의 고형분 1g당 100단위와 이소아밀라아제(주식회사하야시바라 제조)를 액화 전분의 고형분 1g당 250단위를 첨가하고, 55℃에서 40시간 동안 반응시켜서 아스코르빈산 2-글루코시드와 함께 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토테트라오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산을 생성시켰다.
본 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, pH4.5로 조정하고, 이에 글루코아밀라아제(아마노엔자임주식회사 판매, 상품명 「글루크자임 AF6」, 6,000단위/g)를 액화 전분의 고형분 1g당 50단위 첨가하여, 55℃에서 24시간 동안 처리하고,α-글리코실-L-아스코르빈산을 아스코르빈산 2-글루코시드까지, 또, 혼재하는 미반응의 당질을 D-글루코스까지 분해하였다. 본 반응액 중의 L-아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 약 39%였다. 또, 본 반응액은 무수물 환산으로 5-O-α-글루코실-L-아스코르빈산과 6-O-α-글루코실-L-아스코르빈산을 합계로 약 0.1% 함유하고 있었다.
본 반응액을 가열하여 효소를 실활시키고, 활성탄으로 탈색 여과하고, 여과액을 양이온 교환수지(H+형)으로 탈염하고, 이어서 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루코시드를 흡착시키고 수세하여 D-글루코스를 제거한 후, 0.5N 염산 용액으로 용출하였다. 또한, 이 용출액을 고형분 약 50%까지 농축하고, 강산성 양이온 교환수지(상품명 『다이아이온 UBK550』Na+형, 미츠비시화학사 제)를 충전한 10개의 칼럼을 사용한 의사이동상식의 칼럼크로마토그래피에 제공하였다. 고형분 약 50%까지 농축한 용출액을 칼럼에 그 습윤수지 용적의 약 40분의 1량 채우고, 채운 양의 약 15배의 용리액을 칼럼에 공급함으로써 아스코르빈산 2-글루코시드를 용출하고, L-아스코르빈산 함량이 적은, 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유 분획을 채취하였다. 채취한 분획에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 92.2%였다.
이 분획을 감압 농축하고, 농도 약 72%의 농축액으로 하고, 이를 조정관에 담고, 분석용의 표준 시약으로 판매되고 있는 L-아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말(주식회사하야시바라생물화학연구소 판매, 상품명 「아스코르빈산 2-글루코시드 999」(코드번호: AG124, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 99.9% 이상))을 종정으로 2% 첨가하여 40℃로 하고, 부드럽게 교반하면서 서냉하여 2일 동안 15℃까지 내려서 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 석출시켰다.
석출한 결정을 바스켓형 원심분리기로 회수하고, 소량의 냉정제수로 분무하여 세정한 후, 38℃에서 3시간 동안 숙성, 건조한 후, 25℃의 공기를 45분 동안 취부 냉각하고, 분쇄하여 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 99.5%, L-아스코르빈산과 D-글루코스의 합계의 함량 0.1%, L-아스코르빈산 함량 0.1% 미만, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 97.0%, 분말 전체의 환원력 0.25%의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다. 본 분말의 동적 수분 흡착량은 검출한계 이하였다. 본 분말의 입도 분포를 측정한 바, 입경 150μm 미만의 입자가 91.2%, 입경이 53μm 이상 150μm 미만의 입자가 50.2% 포함되어 있었다. 본 분말에 대해, 실험 1-4 및 실험 7과 각각 동일한 방법에 의해 고결성 시험 및 착색성 시험을 실시한 바, 본 분말은 고결성 시험에서 「고결 없음」(-)로 판단되고, 착색성 시험에서는 「착색하지 않거나, 또는 실질적으로 착색하지 않음」(-)로 판단되었다.
본 분말은 의약부외품 대상 미백 성분 등으로서 시판되고 있는 종래의 의약부외품급의 분말(상품명 「AA2G」주식회사하야시바라생물화학연구소 판매)과 비교하여, 고결하기 어렵고 착색성이 낮기 때문에 취급이 용이하다. 본 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급의 분말과 다르지 않기 때문에, 종래의 의약부외품급의 분말과 마찬가지로, 단독 또는 다른 성분과 혼합하여 분말상의 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등으로서 적합하게 사용할 수가 있다. 또, L-아스코르빈산 함량이 0.1% 이하이므로, 이를 종래의 의약부외품급의 분말과 동일한 상품 형태로 장기간 보존하여도 분말 자체가 착색할 우려가 없다.
실시예
2.
〈CGTase조효소액의 제조〉
지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-62주로 바꾸어 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-27주(독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 수탁번호 FERM BP-11142)를 사용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하여 CGTase 조효소액을 조제하였다.
〈아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조〉
옥수수 전분 5중량부를 물 15중량부에 첨가하고, 시판의 액화 효소를 첨가하여 가열 용해하고, L-아스코르빈산 3 중량부를 첨가하고, pH를 5.5로 조정하여 기질용액으로 하였다. 이에 상기 CGTase의 조효소액과 이소아밀라아제(주식회사하야시바라생물화학연구소 제조)를 각각 옥수수 전분의 고형분 1g당 100단위 및 1,000단위 첨가하여 55℃에서 50시간 동안 반응시켜서 아스코르빈산 2-글루코시드 및 그 외 α-글리코실-L-아스코르빈산을 생성시켰다.
이 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, pH를 4.5로 조정하고, 이에 글루코아밀라아제(나가세켐텍스주식회사 판매, 상품명 「글루코침＃20000」, 20,000단위/g)를 옥수수 전분의 고형분 1g당 50단위 첨가하고, 55℃에서 24시간 동안 반응시키고, 2-O-α-말토실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토트리오실-L-아스코르빈산, 2-O-α-말토테트라오실-L-아스코르빈산 등의 α-글리코실-L-아스코르빈산을 아스코르빈산 2-글루코시드까지, 또, 혼재하는 당질을 D-글루코스까지 분해하였다. 본 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 약 37%였다. 또, 본 반응액은 무수물 환산으로 5-O-α-글루코실-L-아스코르빈산과 6-O-α-글루코실-L-아스코르빈산을 합계로 약 0.2% 함유하고 있었다.
본 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, 활성탄으로 탈색 여과하고, 여과액을 양이온 교환수지(H+형)로 탈염하고, 이어서 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루코시드를 흡착시키고, 수세하여 D-글루코스를 제거한 후, 0.5N 염산 용액으로 용출하고, 또한 다공성 수지(상품명 『토요펄 HW-40』, 토소사 제)를 사용한 칼럼크로마토그래피에 제공하여 아스코르빈산 2-글루코시드를 고함유하고, L-아스코르빈산량이 적은 분획을 채취하였다. 채취한 분획에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 89.5%였다.
이 분획을 감압 농축하고, 농도 약 76%로 하여 이를 조정관에 담고, 실시예 1에서 제조한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 종정으로 2% 첨가하여 40℃로 하고, 부드럽게 교반하면서 서냉하여 2일 동안 15℃까지 내려서 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 정석시켰다.
바스켓형 원심분리기로 결정을 회수하고, 결정을 소량의 증류수로 분무하여 세정한 후, 35℃에서 8시간 동안 숙성, 건조한 후, 25℃의 공기를 15분 동안 취부 냉각하고, 분쇄하는 것으로써 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 99.2%, L-아스코르빈산과 D-글루코스의 합계의 함량 0.1% 미만, L-아스코르빈산 함량 0.1% 미만, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 94.4%, 분말 전체의 환원력 0.15%의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다. 본 분말의 동적 수분 흡착량은 검출한계 이하였다. 본 분말의 입도 분포를 측정한 바, 입경이 150μm 미만의 입자가 83.2%, 입경이 53μm 이상 150μm 미만의 입자가 57.1% 포함되어 있었다. 본 분말을 사용하여 실험 1-4 및 실험 7과 각각 동일한 방법에 의해 고결성 시험 및 착색성 시험을 실시한 바, 본 분말은 고결성 시험에서 「고결 없음」(-)로 판단되고, 착색성 시험에서는 「착색하지 않거나, 또는 실질적으로 착색하지 않음」(-)로 판단되었다.
본 분말은 의약부외품 대상 미백 성분 등으로서 시판되고 있는 종래의 의약부외품급의 분말(상품명 「AA2G」주식회사하야시바라생물화학연구소 판매)과 비교하여, 고결하기 어렵고 착색성이 낮기 때문에 취급이 용이하다. 본 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급의 분말과 다르지 않기 때문에, 종래의 의약부외품급의 분말과 마찬가지로 단독 또는 다른 성분과 혼합하여, 분말상의 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등으로서 적합하게 사용할 수가 있다. 또, L-아스코르빈산 함량이 0.1% 이하이므로, 이를 종래의 의약부외품급의 분말과 동일하고 상품 형태로 장기간 보존하여도 분말 자체가 착색할 우려가 없다.
실시예
3
〈변이 CGTase의 조제〉
지오바실러스 스테아로테르모필루스(구분류에서는 바실러스 스테아로테르모필루스) Tc-91주 기원의 CGTase는 그 유전자가 클로닝되고, 유전자의 염기서열(서열표에서의 서열번호 2로 표시되는 염기서열)로부터 성숙형 CGTase의 아미노산 서열(서열표에서의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열)이 결정되어 있고, 상기 CGTase의 아미노산 서열 상에는α-아밀라아제 패밀리로 분류되는 효소군에 공통으로 존재한다고 알려진 4개의 보존영역이 존재하는 것이 알려져 있다. 또, 상기 CGTase 단백질의 입체 구조는 X선 결정구조 해석에 의해 이미 밝혀져 있고, 도 5에 도시한 바와 같이, A, B, C 및 D의 4개의 도메인을 가진다고 알려져 있다(「공업용 당질효소 핸드북」, 코단샤사이언티픽(Kodansya Scientific K.K. Ed., Tokyo, Japan) 편집, 코단샤 발행, 56 내지 63 페이지(1999년) 참조). 또한, 상기 CGTase의 3개의 촉매잔기, 즉, 서열표에서의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서의 225번째의 아스파라긴산(D225), 253번째의 글루타민산(E253), 324번째의 아스파라긴산(D324)도 판명하고 있다(「공업용 당질효소 핸드북」, 코단샤사이언티픽 편집, 코단샤 발행, 56 내지 63 페이지(1999년) 참조). 상기 CGTase의 1차 구조의 모식도를 도 6에 도시한다. 상기 CGTase의 유전자 DNA에 하기의 순서로 변이를 도입하고, 야생형 CGTase보다 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성능이 우수한 변이 CGTase를 취득하였다.
즉, 본 발명자들이 보유하고 있는 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-91주(독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 수탁번호 FERM P-2225(국제기탁에 이관수속중: 수령번호 FERM ABP-11273)) 유래의 CGTase 유전자를 사용하고, 그것이 암호화하는 아미노산 서열을 바꾸지 않고 변이시켜 제한효소 절단부위 등을 도입 또는 결실시키고, 그것을 플라스미드 벡터에 재조합, 야생형 CGTase를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 제작하였다. 상기 재조합 DNA 「pRSET-iBTC12」의 구조를 도 7에 도시하였다. 이어서, 얻어진 재조합 DNA에서의 야생형 CGTase의 활성잔기를 포함하는 영역을 암호화하는 유전자 단편(Nde I-EcoT22I 단편)을 잘라내고, PCR 변이 키트(상품명 「GeneMorph PCR Mutagenesis Kit」, 스트라타진사(Stratagene Company) 판매)를 사용하여 시험관 내에서 무작위로 변이를 주고, 원래의 재조합 DNA로 되돌림으로써 여러가지 아미노산 치환이 발생한 CGTase 변이체를 암호화하는 유전자 혼합물을 제작하였다. 그 변이 유전자를 발현 플라스미드 벡터(expression plasmid vector)에 편성, 재조합 DNA를 제작하였다. 상기 재조합 DNA를 사용하여 대장균을 형질전환하고, CGTase 변이체 유전자 도서관을 제작하였다.
다음으로, 얻어진 유전자 도서관으로부터 13,000주를 초과하는 형질전환체를 단리하고, 배양하여 얻어진 균체로부터 CGTase 변이체를 포함하는 용균액을 조효소액으로서 조제하였다. 얻어진 조효소액을 L-아스코르빈산과 전분 부분 분해물을 포함한 수용액에 작용시키고, 생성하는α-글리코실-L-아스코르빈산을 글루코아밀라아제 처리하여 아스코르빈산 2-글루코시드를 생성시키고, 그 생성량을 야생형 CGTase와 비교함으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드 고생산형 CGTase 변이체를 생산하는 형질전환체를 스크리닝하였다. 그 스크리닝의 과정에서 목적으로 하는 변이 CGTase 유전자를 유지하는 형질전환체를 얻었다. 상기 형질전환체가 유지하는 변이 CGTase 유전자의 염기서열을 해독한 바, 서열표에서의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서의 제228번째의 리신 잔기가 글루타민산 잔기로 치환하고 있는 것이 판명되었다.
상기 CGTase 변이체를 암호화하는 유전자 DNA를 유지하는 형질전환체를 암피실린 Na염 100μl/ml를 포함한 T배지(배지 1L당, 박토 트립톤(Bacto-trypton) 12g, 박토 이스트 추출물(Bacto-Yeast Extract) 24g, 그리세롤 5ml, 17mM 인산1칼륨, 72mM 인산2칼륨을 함유)를 사용하여 37℃에서 24시간 동안 호기적으로 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 균체를 초음파 파쇄기(상품명 「Ultra Sonic Homogenizer UH-600」, 엠에스티주식회사(MST Co., LTd.)제)를 사용하여 파쇄처리하고, 파쇄액 상청액을 60℃에서 30분 동안 열처리하고, 숙주 유래의 비내열성 단백질을 변성, 실활시켰다. 열처리액을 더 원심분리하여 CGTase 변이체의 부분 정제 표품(specimen)을 제조하였다.
〈아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조〉
감자 전분 5중량부를 물 15중량부에 첨가하고, 시판의 액화 효소를 첨가하여 가열 용해하고, L-아스코르빈산 3중량부를 첨가하고, pH를 5.5로 조정하여 기질용액으로 하였다. 이에 상기 방법에서 얻은 CGTase 변이체의 부분 정제 표품을 감자 전분 1g당 20단위 첨가하고, 65℃에서 72시간 동안 반응시켜서 아스코르빈산 2-글루코시드 및 α-글리코실-L-아스코르빈산을 생성시켰다. 반응 후, 반응액을 가열하여 CGTase 변이체를 실활시켰다. 이 반응액에 글루코아밀라아제(나가세켐텍스주식회사 판매, 상품명 「글루코침＃20000」, 20,000단위/g)를 감자 전분 1g당 100단위 첨가하고, pH5.0, 40℃에서 약 18시간 동안 반응시킴으로써 반응액 중의α-글리코실-L-아스코르빈산을 아스코르빈산 2-글루코시드까지, 또, 혼재하는 당질을 D-글루코스까지 분해하였다. 본 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 약 40%였다. 또, 본반응액은 무수물 환산으로 5-O-α-글루코실-L-아스코르빈산과 6-O-α-글루코실-L-아스코르빈산을 합계로 약 0.3% 함유하고 있었다.
이 반응액을 가열하여 글루코아밀라아제를 실활시키고, 활성탄으로 탈색 여과하고, 여과액을 농축하고, 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루코시드를 흡착시키고 수세하여 D-글루코스를 제거한 후, 1.5N 염산 용액으로 용출하였다. 이어서, 실시예 1과 마찬가지로 하여 강산성 양이온 교환수지를 사용한 의사이동상식의 칼럼크로마토그래피에 제공하고, 아스코르빈산 2-글루코시드 함량이 높고, L-아스코르빈산 함량이 적은 분획을 채취하였다. 채취한 분획에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 90.4%였다.
이것을 양이온 교환수지(H+형)로 탈염한 후, 감압 농축하고, 농도 약 75%의 농축액으로 하고, 이를 조정관에 담고, 실시예 1에서 제조한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 종정으로 2% 첨가하여 45℃로 하고, 부드럽게 교반하면서, 서냉하여 2일 동안 10℃까지 내리고, 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 정석시켰다. 얻어진 결정을 회수하고, 결정을 소량의 냉탈이온수를 분무하여 세정한 후, 38℃에서 3시간 동안 숙성, 건조하고, 하룻밤 자연방랭하고 분쇄함으로써 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 약 98.8%, L-아스코르빈산과 D-글루코스의 합계의 함량 0.1% 미만, L-아스코르빈산 함량 0.1% 미만, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 93.5%, 분말 전체의 환원력 0.31%의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다. 또, 본 분말의 동적 수분 흡착량은 검출한계 이하였다. 본 분말의 입도 분포를 측정한 바, 입경 150μm 미만의 입자가 93.1%, 입경 53μm 이상 150μm 미만의 입자가 48.2% 포함되어 있었다. 본 분말을 사용하여 실험 1-4 및 실험 7과 각각 동일한 방법에 의해 고결성 시험 및 착색성 시험을 실시한 바, 본 분말은 고결성 시험에서 「고결 없음」(-)로 판단되고, 착색성 시험에서는 「착색하지 않거나, 또는 실질적으로 착색하지 않음」(-)로 판단되었다.
본 분말은, 의약부외품 대상 미백 성분 등으로서 시판되고 있는 종래의 의약부외품급의 분말(상품명 「AA2G」주식회사하야시바라생물화학연구소 판매)과 비교하여, 고결하기 어렵고 착색성이 낮기 때문에 취급이 용이하다. 본 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급의 분말과 다르지 않기 때문에, 종래의 의약부외품급의 분말과 마찬가지로 단독, 또는 다른 성분과 혼합하여, 분말상의 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등으로서 적합하게 사용할 수가 있다. 또, L-아스코르빈산 함량이 0.1% 이하이므로, 이를 종래의 의약부외품급의 분말과 같은 상품 형태로 장기간 보존하여도 분말 자체가 착색할 우려가 없다.
실시예
4.
〈아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조〉
CGTase와 함께 이소아밀라아제(주식회사하야시바라 제조)를 전분 고형물 1g당 500단위 첨가하여 55℃에서 반응시킨 것 이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 효소반응을 실시하였다. 글루코아밀라아제 처리 후의 반응액의 L-아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 약 45%였다. 또, 본 반응액은 무수물 환산으로 5-O-α-글루코실-L-아스코르빈산과 6-O-α-글루코실-L-아스코르빈산을 합계로 약 0.2% 함유하고 있었다. 실시예 3과 동일하게 정제하고, 채취한 분획에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 91.8%였다.
실시예 3과 동일하게 결정화를 실시하고, 얻어진 결정을 회수하고, 결정을 소량의 냉탈이온수로 분무하여 세정한 후, 38℃에서 3시간 동안 숙성, 건조하고, 하룻밤 자연방랭하고 분쇄함으로써, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 99.2%, L-아스코르빈산과 D-글루코스의 합계의 함량 0.1% 미만, L-아스코르빈산 함량 0.1% 미만, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 95.6%, 분말 전체의 환원력 0.25%의 L-아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다. 또, 본 분말의 동적 수분 흡착량은 검출한계 이하였다. 본 분말의 입도 분포를 측정한 바, 입경 150μm 미만의 입자가 92.7%, 입경 53μm 이상 150μm 미만의 입자가 44.2% 포함되어 있었다. 본 분말을 사용하여 실험 1-4 및 실험 7과 각각 같은 방법에 의해 고결성 시험 및 착색성 시험을 실시한 바, 본 분말은 고결성 시험에서 「고결 없음」(-)로 판단되고, 착색성 시험에서는 「착색하지 않거나, 또는 실질적으로 착색하지 않음」(-)로 판단되었다.
본 분말은 의약부외품 대상 미백 성분 등으로서 시판되고 있는 종래의 의약부외품급의 분말(상품명 「AA2G」주식회사하야시바라생물화학연구소 판매)과 비교하여, 고결하기 어렵고 착색성이 낮기 때문에 취급이 용이하다. 본 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급의 분말과 다르지 않기 때문에, 종래의 의약부외품급의 분말과 마찬가지로 단독, 또는 다른 성분과 혼합하여 분말상의 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등으로서 적합하게 사용할 수가 있다. 또, L-아스코르빈산 함량이 0.1% 이하이므로, 이를 종래의 의약부외품급의 분말과 동일한 상품 형태로 장기간 보존하여도 분말 자체가 착색할 우려는 없다.
실시예
5.
〈아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조〉
감자 전분 5중량부를 물 15중량부에 첨가하고, 시판의 액화 효소를 첨가하여 가열 용해하고, L-아스코르빈산 3중량부를 첨가하고, pH를 5.5로 조정하여 기질용액으로 하였다. 이에 CGTase(주식회사하야시바라생물화학연구소 제조, 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-91주(독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 수탁번호 FERM P-2225(국제기탁에 이관수속중: 수령번호 FERM ABP-11273)) 유래)와 이소아밀라아제(주식회사하야시바라생물화학연구소 제조)를 각각 감자 전분 1g당 100단위 및 1,000단위 첨가하여 55℃에서 50시간 동안 반응시켜서 아스코르빈산 2-글루코시드 및 그 외의 α-글리코실-L-아스코르빈산을 생성시켰다. 이 반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, pH를 4.5로 조정하고, 이에 글루코아밀라아제(나가세켐텍스 주식회사 판매, 상품명 「글루코침＃20000」, 20,000단위/g)를 감자 전분 1g당 50단위 첨가하고, 55℃에서 24시간 동안 반응시키고, α-글리코실-L-아스코르빈산을 아스코르빈산 2-글루코시드까지, 또, 혼재하는 당질을 D-글루코스까지 분해하였다. 본 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 생성률은 약 38%였다. 또, 본반응액은 무수물 환산으로 5-O-α-글루코실-L-아스코르빈산과 6-O-α-글루코실-L-아스코르빈산을 합계로 약 0.4% 함유하고 있었다.
본반응액을 가열하여 효소를 실활시킨 후, 활성탄으로 탈색 여과하고, 여과액을 양이온 교환수지(H+형)으로 탈염하고, 이어서 음이온 교환수지(OH-형)에 L-아스코르빈산 및 아스코르빈산 2-글루코시드를 흡착시키고, 수세하여 D-글루코스를 제외한 후, 0.5N 염산 용액으로 용출하고, 또한 다공성 수지(상품명 『토요펄 HW-40』, 토소사 제)를 사용한 칼럼크로마토그래피에 제공하여 아스코르빈산 2-글루코시드를 고함유하고, L-아스코르빈산량이 적은 분획을 채취하였다. 채취한 분획에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 함량은 무수물 환산으로 87.6%였다.
이 분획을 감압 농축하고, 농도 약 76%로 하고, 이를 조정관에 담고, 실시예 1에서 제조한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 종정으로 2% 첨가하여 40℃로 하고, 부드럽게 교반하면서 서냉하여 2일 동안 15℃까지 내려서 아스코르빈산 2-글루코시드의 무수결정을 정석시켰다. 바스켓형 원심분리기로 결정을 회수하고, 결정을 소량의 증류수로 분사하여 세정한 후, 35℃에서 8시간 동안 숙성, 건조하고, 20℃의 공기를 10분 동안 취부 냉각하고, 분쇄함으로써 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 98.5%, L-아스코르빈산과 글루코스의 합계의 함량 0.1% 미만, L-아스코르빈산 함량 0.1% 미만, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 94.8%, 분말 전체의 환원력 0.15%의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 얻었다. 본 분말의 동적 수분 흡착량은 검출한계 이하였다. 본 분말의 입도 분포를 측정한 바, 입경 150μm 미만의 입자가 83.0%, 입경 53μm 이상 150μm 미만의 입자가 57.7% 포함되어 있었다. 본 분말을 사용하여 실험 1-4 및 실험 7과 각각 같은 방법에 의해 고결성 시험 및 착색성 시험을 실시한 바, 본 분말은 고결성 시험에서 「고결 없음」(-)로 판단되고, 착색성 시험에서는 「착색하지 않거나, 또는 실질적으로 착색하지 않음」(-)로 판단되었다.
본 분말은 의약부외품 대상 미백 성분 등으로서 시판되고 있는 종래의 의약부외품급의 분말(상품명 「AA2G」주식회사하야시바라생물화학연구소 판매)과 비교하여, 고결하기 어렵고 착색성이 낮기 때문에 취급이 용이하다. 본 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말인 점에서는 종래의 의약부외품급의 분말과 다르지 않기 때문에, 종래의 의약부외품급의 분말과 마찬가지로 단독, 또는 다른 성분과 혼합하여 분말상의 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등으로서 적합하게 사용할 수가 있다. 또, L-아스코르빈산 함량이 0.1% 이하이므로, 이를 종래의 의약부외품급의 분말과 동일한 상품 형태로 장기간 보존하여도 분말 자체가 착색할 우려가 없다.
비교예
1.
〈아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조〉
이소아밀라아제를 사용하지 않았던 것 이외에는 실시예 5와 동일한 방법으로 지오바실러스 스테아로테르모필루스 Tc-91주(독립행정법인산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 수탁번호 FERM P-2225(국제기탁에 이관수속중: 수령번호 FERM ABP-11273)) 유래의 CGTase(주식회사하야시바라생물화학연구소 제조)를 사용하여 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 제조한 바, 글루코아밀라아제 처리 후의 반응액에서의 아스코르빈산 2-글루코시드 생성률은 약 28%였다. 또, 본 반응액은 무수물 환산으로 5-O-α-글루코실-L-아스코르빈산과 6-O-α-글루코실-L-아스코르빈산을 합계로 약 1.0% 함유하고 있었다. 이 반응액을 실시예 5와 동일하게 탈색, 탈염, 정제하여 아스코르빈산 2-글루코시드의 고함유 분획을 채취한 바, 아스코르빈산 2-글루코시드 고함유 분획에서의 아스코르빈산 2-글루코시드의 함량은 무수물 환산으로 87.7%였다.
이 고함유 분획을 실시예 5와 동일하게 농축하고, 아스코르빈산 2-글루코시드를 결정화시켜서, 이를 채취, 숙성, 건조한 후 냉각한 바, 아스코르빈산 2-글루코시드 순도 98.5%, L-아스코르빈산과 D-글루코스의 합계의 함량 0.4%, L-아스코르빈산 함량 0.2%, 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도 89.1%, 분말 전체의 환원력 1.17%의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말이 얻어졌다. 본 분말의 동적 수분 흡착량은 0.04%였다. 본 분말의 입도 분포를 측정한 바, 입경 150μm 미만의 입자가 78.1%, 입경 53μm 이상 150μm 미만의 입자가 50.2% 포함되어 있었다.
본품 분말을 사용하여 실험 1-4 및 실험 7과 각각 동일한 방법에 의해 고결성 시험 및 착색성 시험을 실시한 바, 본 분말은 고결성 시험에서 「고결 있음」(+)로 판단되고, 착색성 시험에서는 「착색함」(+)로 판단되었다. 본 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 미만이고, 또한, 동적 수분 흡착량이 0.04%와 0.01%를 초과하고 있으므로, 유통 내지는 보존 기간 중에 고결할 우려가 있고, 이것을 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재, 의약품 소재 등으로서 사용하는 경우에는 심각한 지장을 초래할 수도 있다. 또, L-아스코르빈산 함량이 0.2%로 높으므로, 유통 내지는 보존기간 중에 분말 자체가 착색할 우려가 있다.
<보존성 시험>
실시예 1 내지 5 및 비교예 1에서 얻은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말에 대해, 실험 5-3에서 동일한 방법에 의해 보존성 시험을 실시하였다. 본 보존성 시험에서 얻은 결과와 각 실시예 및 비교예에서 확인한 고결성 시험의 결과를 함께 표 7에 나타낸다.
표 8에 나타낸 바와 같이, 각 분말을 실제의 상품형태에 따라서 10kg 용량의 봉지에 넣은 상태로 45일 동안 보존한 보존성 시험에서, 실시예 1 내지 5의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 모두 「고결 없음」(-)로 판단된 것에 비해, 비교예 1의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 「고결 있음」(+)로 판단되었다. 이러한 결과는 고결성 시험의 결과와 잘 일치하고 있었다.
이상과 같이, 상기 실험 1 내지 7 및 실시예 1 내지 5에 나타내는 본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이거나, 동적 수분 흡착량이 검출 한계 이하의 0.01% 이하이므로, 제조방법에 특유의 협잡물인 L-아스코르빈산 및/또는 D-글루코스를 통상의 액체 크로마토그래피로 검출 가능한 레벨로 항상 포함하면서, 또한 아스코르빈산 2-글리코시드의 순도가 98.0%를 초과 99.9% 미만, 구제척으로는 순도가 98.5%(실시예 5 참조) 이상 99.8% 이하(실험 2 참조)와, 시약급의 분말의 순도 99.9%에 미달하고, 아스코르빈산 2-글루코시드의 순도라는 점에서 시약급의 분말과 구별할 수 있는 레벨임에도 불구하고, 고결성 시험에서 「고결성 없음」(-)로 판단되는 취급이 용이한 분말이다.
실시예
6.
<비타민C 분말 제제(식품 소재로서의 적용예)>
실시예 1 내지 5 중 어느 하나의 방법에서 얻은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 20중량부를 분말상 식품 소재로서 사용하고, 이에 자당 70중량부, 덱스트린 10중량부, 적량의 향료를 첨가하고, 혼합기를 시용하여 교반혼합하여 비타민C 분말 제제를 제조하였다. 본품은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말과 다른 분말을 혼합기를 사용하여 용이하고 균일하게 혼합할 수가 있고, 제조공정상 아무런 지장없이 제조할 수가 있었다. 본품은 다른 식품 소재와 용이하게 혼합가능하고, 장기간 보존하여도 갈변이나 고결이 발생하기 어려운 비타민C 분말 제제이다. 본품이나 이것을 배합한 조성물은 비타민C의 생리기능을 가지고 있으므로, 피부나 점막의 건강 유지나 미백의 목적으로 경구적으로 섭취할 수가 있다.
실시예
7.
<미백 파우더(화장품 소재로서의 적용예)>
〈배합 처방〉
(배합 성분) (%)
α,α-트레할로스 59. 5
폴리에틸렌 글리콜 6000 20
실리카 5
실시예 1 내지 5 중 어느 하나의 방법에서 얻은
아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말 15
향료 적량
색제 적량
방부제 적량
전 량을 100%로 한다.
〈제조방법〉
혼합기에α,α-트레할로스, 폴리에틸렌 글리콜 6000, 실리카, 향료, 색제 및 방부제를 첨가하고 균일하게 혼합한 분말에 실시예 1 내지 5 중 어느 하나의 방법에서 얻은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 첨가하고, 균일하게 될 때까지 교반, 혼합하여 미백 파우더를 조제하였다. 본품은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말과 다른 분말을 혼합기를 사용하여 용이하고 균일하게 혼합할 수가 있고, 제조공정상 아무런 지장없이 제조할 수가 있었다. 본품은 다른 화장품 소재와 용이하게 혼합 가능하고, 장기간 보존하여도 갈변이나 고결이 발생하기 어려운 미백 파우더이다. 본품이나 이것을 배합한 조성물은 피부 외용제로서 미백 목적으로 사용할 수가 있다.
본 발명의 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말은 종래의 의약부외품급의 분말에 비해 유의하게 고결하기 어렵기 때문에, 종래의 의약부외품급의 분말보다 취급하기 쉽고, 식품 소재, 화장품 소재, 의약부외품 소재 또는 의약품 소재로서 음식품, 화장품, 의약부외품, 의약품, 사료, 이료(餌料), 화학품, 공업품 등의 모든 분야에서 사용할 수가 있다. 또, 본 발명에 의한 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말의 제조방법은 천연의 원료인 전분질 및 L-아스코르빈산으로부터 이와 같은 아스코르빈산 2-글루코시드 무수결정 함유 분말을 원하는 양, 염가로 제조하는 방법으로 전분 당화물을 제조하는 업계나 비타민 유도체를 제조하는 업계에서 사용할 수가 있다.
도 5 및 도 6에서,
A: CGTase의 도메인 A
B: CGTase의 도메인 B
C: CGTase의 도메인 C
D: CGTase의 도메인 D
도 5에서,
나선: α-헤릭스 구조
판 형상 화살표: β-시트 구조
가는 끈: 루프 구조
도 6에서,
[1]: α-아밀라아제 패밀리에 공통하는 보존영역 1
[2]: α-아밀라아제 패밀리에 공통하는 보존영역 2
[3]: α-아밀라아제 패밀리에 공통하는 보존영역 3
[4]: α-아밀라아제 패밀리에 공통하는 보존영역 4
●: 촉매잔기
D225: CGTase에서의 촉매잔기 중 하나인 제225번째 아스파라긴산 잔기
E253: CGTase에서의 촉매잔기 중 하나인 제253번째 글루타민산 잔기
D324: CGTase에서의 촉매잔기 중 하나인 제324번째 아스파라긴산 잔기
도 7에서,
pUC ori: 플라스미드 pUC의 복제 개시점
T7: T7 프로모터
흰색 화살표(Amp): 암피실린 내성 유전자
흑색 화살표: CGTase 유전자
A: CGTase의 도메인 A
B: CGTase의 도메인 B
C: CGTase의 도메인 C
D: CGTase의 도메인 D
도 5에서,
나선: α-헤릭스 구조
판 형상 화살표: β-시트 구조
가는 끈: 루프 구조
도 6에서,
[1]: α-아밀라아제 패밀리에 공통하는 보존영역 1
[2]: α-아밀라아제 패밀리에 공통하는 보존영역 2
[3]: α-아밀라아제 패밀리에 공통하는 보존영역 3
[4]: α-아밀라아제 패밀리에 공통하는 보존영역 4
●: 촉매잔기
D225: CGTase에서의 촉매잔기 중 하나인 제225번째 아스파라긴산 잔기
E253: CGTase에서의 촉매잔기 중 하나인 제253번째 글루타민산 잔기
D324: CGTase에서의 촉매잔기 중 하나인 제324번째 아스파라긴산 잔기
도 7에서,
pUC ori: 플라스미드 pUC의 복제 개시점
T7: T7 프로모터
흰색 화살표(Amp): 암피실린 내성 유전자
흑색 화살표: CGTase 유전자
서열목록 전자파일 첨부
Claims (11)
- 무수물 환산으로 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산을 98.0중량% 초과하고 99.8중량% 이하 함유하며, 분말 X선 회절 프로필에 기초하여 산출되는 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정에 대한 결정화도가 90% 이상이고 99.8% 이하이며, 질소기류 하에서 분말 중의 수분을 제거한 후, 온도 25℃, 상대습도 35중량%에서 12시간 동안 유지한 때의 동적 수분 흡착량이 0중량%를 초과하고 0.01중량% 이하이며, L-아스코르빈산 및 D-글루코스 중 어느 한 쪽 또는 양 쪽을 함유하고, L-아스코르빈산 양이 무수물 환산으로 0중량% 초과하고 0.1중량% 이하이며, 또 분말 전체의 환원력이 0.12중량% 이상이고 1중량% 미만인 것을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
L-아스코르빈산과 전분질을 포함하는 용액에 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제를 작용시키는 공정을 거쳐서 얻어지는 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함유 용액으로 제조된 분말인 것을 특징으로 하는 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말. - 전분질과 L-아스코르빈산을 포함하는 용액에 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제와 글루코아밀라아제를 순서대로 작용시켜서 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산의 생성률이 35중량% 이상이고 45중량% 이하인 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함유 용액을 얻는 공정; 얻어진 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함유 용액을 정제하여, 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함량을 무수물 환산으로 86중량% 초과하고 92.2중량% 이하로 하는 공정; 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함량을 무수물 환산으로 86중량% 초과하고 92.2중량% 이하 함유하는 용액으로부터 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산의 무수결정을 석출시키는 공정; 석출된 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산의 무수결정을 채취하는 공정; 및 채취된 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산의 무수결정을 숙성, 건조하고, 분쇄하는 공정을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 1항 기재 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말의 제조방법.
- 제 4항에 있어서,
전분질과 L-아스코르빈산을 포함하는 용액에 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제와 글루코아밀라아제를 순서대로 작용시켜서 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함유 용액을 얻는 공정에 있어서, 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제와 함께 전분 절지 효소(starch debranching enzyme)를 작용시키는 것을 특징으로 하는 제조방법. - 제 4항 또는 제 5항에 있어서,
상기 얻어진 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함유 용액을 정제하여, 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함량을 무수물 환산으로 86중량% 초과하고 99.2중량% 이하로 하는 공정이 음이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피에 의해 당류를 제거하는 공정과, 양이온 교환수지를 충전제로 사용하는 의사이동상식(擬似移動床式)의 칼럼크로마토그래피를 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. - 제 4항 또는 제 5항에 있어서,
상기 얻어진 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함유 용액을 정제하여, 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 함량을 무수물 환산으로 86중량% 초과하고 99.2중량% 이하로 하는 공정이 음이온 교환수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피에 의해 당류를 제거하는 공정과, 강산성 양이온 교환수지 또는 다공성 수지를 사용하는 칼럼크로마토그래피를 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. - 제 1항에 기재된 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분말상의 식품 소재.
- 제 1항에 기재된 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분말상의 화장품 소재.
- 제 1항에 기재된 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분말상의 의약부외품 소재.
- 제 1항에 기재된 2-O-α-D-글루코실-L-아스코르빈산 무수결정 함유 분말로 이루어지는 것을 특징으로 하는 분말상의 의약품 소재.
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