ES2576359T3

ES2576359T3 - Composición particulada que contiene ácido 2-O-alfa-D-glucosil-L-ascórbico cristalino anhidro, proceso para producir la misma y usos de la misma

Info

Publication number: ES2576359T3
Application number: ES14159427.5T
Authority: ES
Inventors: Takashi Shibuya; Seisuke Izawa; Tomoyuki Nishimoto; Shigeharu Fukuda; Toshio Miyake
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 2009-09-03
Filing date: 2010-09-03
Publication date: 2016-07-07
Anticipated expiration: 2030-09-03
Also published as: KR101064941B1; KR101571079B1; CN105342870A; KR101781360B1; KR20170108915A; CA2714377A1; CA2956625C; KR20110025157A; JP2014058565A; BR112012004864A2; CN102093448A; JP2014015469A; JP2018052978A; MX2012002696A; JP6074405B2; TW201119649A; BR112012004864B1; AU2010214807B2; CA2714377C; JP2015061871A

Abstract

Una composición particulada que comprende ácido 2-O-α-D-glucosil-L-ascórbico cristalino anhidro, que comprende ácido 2-O-α-D-5 glucosil-L-ascórbico en una cantidad de más de 98,0 % en peso pero inferior al 99,9 % en peso, sobre una base sólida seca; que tiene un grado de cristalinidad de 90 % o superior para el ácido 2-O-α-D-glucosil-L-ascórbico cristalino anhidro, cuando se calcula sobre la base de un perfil de análisis de difracción de rayos X en polvo de dicha composición; que contiene partículas con un tamaño de partícula de menos de 150 μm en una cantidad de 70 % en peso o superior a toda la composición particulada, y las que tienen un tamaño de partícula de al menos 53 μm pero inferior a 150 μm en una cantidad de 40 a 60 % en peso de la composición entera; que contiene ácido L-ascórbico y/o D-glucosa; y que tiene un poder reductor de toda la composición que es menor que uno por ciento en peso.

Description

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<Distribución del tamaño de partícula>

En la memoria descriptiva, la distribución del tamaño de partícula de una composición particulada se determina como sigue: Tamices e metal con tamaños de abertura de 425, 300, 212, 150, 106, 75 y 53 µm, producidos por Kabushiki Gaisha Iida Seisaku-sho, que cumplen las normas industriales japonesas (JIS Z 8801-1), se pesan con precisión, se apilan en el orden identificado anteriormente y se montan en un agitador de tamización rotatorio "R-1", producido por Kabushiki Gaisha Tanaka Kagaku Kikai Seisaku-sho. Una cantidad prescrita de la muestra pesada se coloca en el tamiz superior (que tiene un tamaño de abertura de 425 µm) entre los tamices apilados, seguido de agitación de los tamices durante 15 minutos al tiempo que se mantienen las condiciones de apilación. Después, cada uno de los tamices apilados se pesó con precisión y el peso de la muestra recogida en cada uno de los tamices se determinó restando el peso de cada uno de los tamices antes de cargar la muestra del peso del tamiz correspondiente después de la agitación. La distribución del tamaño de partícula se expresa mediante el cálculo del porcentaje en peso (%) del peso de la composición particulada recogida en cada uno de los tamices con respecto al de la muestra cargada.

El término "rendimiento de la producción de ácido 2-glucósido ascórbico", como se hace referencia en la memoria descriptiva significa un contenido (%) de ácido 2-glucósido ascórbico, b.s.s., en una solución de reacción enzimática obtenida al permitir que una enzima tal como la CGTasa actúe en una solución que contiene ácido L-ascórbico y sustancia amilácea.

El término contenido de ácido 2-glucósido ascórbico, b.s.s., significa un porcentaje (%) en peso de ácido 2-glucósido ascórbico con respecto al peso total de una muestra que contiene el mismo cuando se calcula excluyendo el agua. Por ejemplo, el significado del contenido de ácido 2-glucósido ascórbico, b.s.s. en una solución es un porcentaje (%) en peso de ácido 2-glucósido ascórbico con respecto al contenido de sólidos totales, excluyendo el agua contenida en la solución. Si bien el significado del contenido de ácido 2-glucósido ascórbico, b.s.s., en una composición particulada es un porcentaje (%) en peso del peso de ácido 2-glucósido ascórbico con respecto a peso total de la composición particulada, cuando se calcula con respecto al peso total de la composición particulada como excluyendo el agua contenida en la composición particulada.

El término "actividad CGTasa", como se denomina en la presente memoria descriptiva se define como sigue: A cinco mililitros de una solución acuosa de sustrato que contiene 0,3 % (p/v) de un almidón soluble, tampón de acetato 20 mM (pH 5,5), y cloruro de calcio 1mM, se añade 0,2 ml de una solución de enzima diluida apropiadamente, y la solución resultante se mantiene a 40 ºC, y se toman muestras a 0 min y 10 min después de iniciar la reacción enzimática en cantidades respectivas de 0,5 ml, seguido de la adición de inmediato de 15 ml de solución 0,02 N de ácido sulfúrico a cada muestra para suspender la reacción enzimática. Cada una de las soluciones resultantes se mezcla con 0,2 ml de solución de yodo 0,2 N para desarrollar colores, y, después de 10 minutos, las soluciones coloreadas se miden, respectivamente, para determinar la absorbancia a una longitud de onda de 660 nm mediante un espectrofotómetro, seguido del cálculo de la actividad de CGTasa usando la siguiente fórmula [4] como una actividad para la hidrólisis del almidón. Una unidad de actividad de CGTasa se define como la cantidad de enzima que disminuye completamente el color de yodo de una solución que contiene 15 mg de almidón.

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Nota: “Aa" significa la absorbancia a una longitud de onda de 660 nm de una solución de reacción 0 minutos después de iniciar la reacción enzimática.

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“Ab" significa la absorbancia a una longitud de onda de 660 nm de una solución de reacción 10 minutos después de iniciar la reacción enzimática.

El término "actividad de isoamilasa", como se denomina en la presente memoria descriptiva se define como sigue:

A tres mililitros de una solución acuosa de sustrato que contiene 0,83 % (p/v) de almidón céreo soluble de Lintner y tampón de acetato 0,1 mM (pH 3,5), se añaden 0,5 ml de una solución enzimática diluida apropiadamente, y la solución resultante se mantiene a 40 ºC, y se toman muestras a 0,5 min y 30,5 min después de iniciar la reacción enzimática en cantidades respectivas de 0,5 ml, seguido de la adición de inmediato de 15 ml de solución 0,02 N de ácido sulfúrico a cada muestra para suspender la reacción enzimática. Cada una de las soluciones resultantes se mezcla con 0,5 ml de solución de yodo 0,01 N para desarrollar colores a 25 ºC durante 15 minutos, y, después, las soluciones coloreadas se miden, respectivamente, para determinar la absorbancia a una longitud de onda de 610 nm mediante un absorciómetro, seguido del cálculo de la actividad de amilasa usando la siguiente fórmula [5] como una actividad para la hidrólisis del almidón. Una unidad de actividad de la isoamilasa se define como una cantidad de enzima que aumenta la absorbancia por 0.004 a una longitud de onda de 610 nm en las condiciones de medición anteriores.

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Nota: “Aa" significa la absorbancia de una solución de reacción a una longitud de onda de 610 nm.

“Ab" significa la absorbancia de una solución control a una longitud de onda de 610 nm.

2. Composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro de la presente invención

Como se ha descrito anteriormente, la composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro de la presente divulgación contiene más de 98,0 %, pero menos de 99. 9 %, b.s.s., de ácido 2-glucósido ascórbico; y tiene un grado de cristalinidad de 90 % o superior para ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro, cuando se calcula sobre la base de un perfil de análisis de difracción de polvo de rayos X; o tiene un nivel de sorción de vapor dinámica del 0,01 % o inferior. Como se explica mediante los siguientes experimentos, la composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro de la presente divulgación, que tiene el grado de cristalinidad o el nivel de sorción de vapor dinámica anterior, es significativamente apenas solidificable en comparación con polvos de calidad de producto de parafarmacia, a pesar de que tiene sustancialmente el mismo nivel de pureza del ácido 2-glucósido ascórbico que los polvos de calidad de producto parafarmacia o tiene una menor pureza de ácido 2-glucósido ascórbico que la de un polvo de calidad de reactivo.

Adicionalmente, como se muestra en los siguientes experimentos, entre las composiciones particuladas que contienen más de 98,0 % pero menos de 99,9 %, b.s.s. de ácido 2-glucósido ascórbico, los que tienen un grado de cristalinidad dentro del intervalo anterior tienen un nivel de sorción dinámica de vapor de 0,01 % o inferior, mientras que aquellos con un nivel de sorción dinámica de vapor dentro del intervalo anterior tienen un grado de cristalinidad de 90 % o superior para ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro. Por lo tanto, la composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro de la presente divulgación puede definirse mediante el grado de cristalinidad para ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro o el nivel de sorción dinámica de vapor de la composición particulada y, si es necesario, puede estar definida por ambos.

El significado de la sorción dinámica de vapor es un fenómeno donde el nivel de vapor contenido en una muestra cambia a medida que la humedad alrededor de la muestra cambia a una temperatura constante. Aunque, a diferencia del grado de cristalinidad, el nivel de sorción dinámica de vapor como un índice representativo de la susceptibilidad de la sorción de vapor no es un índice que depende directamente de la estructura cristalina de un polvo como una muestra, se puede especular que el fenómeno de absorción de humedad se refiere a la solidificación de la composición particulada y puede cambiar de manera significativa, dependiendo de la composición de sacáridos, así como la pureza del ácido 2-glucósido ascórbico y el tamaño de partícula de la composición

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particulada. Por lo tanto, se considera que el nivel de sorción dinámica de vapor sería un potente índice para la evaluación de la solidificación de la composición particulada por absorción de humedad.

Como se encuentra en los siguientes experimentos, una composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro con un nivel de sorción dinámica de vapor de más de 0,05 % se solidifica con relativa facilidad en las condiciones experimentales ensayadas, mientras que aquellos con un nivel de sorción dinámica de vapor de 0,01 % o menor no solidifican sustancialmente en las mismas condiciones. El hecho indica que el nivel de sorción dinámica de vapor junto con el grado de cristalinidad son potentes índices en la realización de una composición particulada sustancialmente apenas solidificable que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro.

La muestra estándar usada para la determinación del valor analítico H0 en la obtención del grado de cristalinidad, es decir, "una muestra estándar en polvo que contiene ácido 2-glucósido ascórbico que consiste sustancialmente en la forma amorfa del ácido 2-glucósido ascórbico" exhibió un nivel de sorción dinámica de vapor de 1,7 % como se muestra en el experimento 3 descrito más adelante; mientras que la muestra estándar utilizada para la determinación del valor analítico H100 en la obtención del grado de cristalinidad, es decir, "una muestra estándar en polvo que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro, que consiste sustancialmente en la forma cristalina anhidra del ácido 2-glucósido ascórbico" exhibió un nivel de sorción dinámica de vapor más bajo que el límite de detección y no mostró sustancialmente ninguna sorción de vapor dinámica, como se muestra de manera similar en el Experimento 3.

<Distribución del tamaño de partícula>

La composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro de la presente invención contiene partículas con un tamaño de partícula de menos de 150 µm en una cantidad de 70 % en peso o más de la composición particulada completa y contiene los que tienen un tamaño de partícula de 53 µm o más pero inferior a 150 µm en una cantidad de 40 a 60 % de toda la composición particulada. Puesto que la composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro de la presente invención puede, por ejemplo, controlarse fácilmente dentro de la distribución del tamaño de partícula identificada anteriormente requerida en materiales para productos alimenticios, tiene el mérito de que puede usarse como material para productos alimenticios, cosméticos, productos de parafarmacia, o productos farmacéuticos de manera similar a los convencionales sin alterar ninguna etapa de producción o regulaciones de materiales convencionales.

La composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico anhidro cristalino de la presente invención contiene ácido L-ascórbico y/o D-glucosa y tiene un poder reductor de la composición particulada total de menos de uno por ciento. Como es bien conocido, el ácido L-ascórbico y la D-glucosa tienen reducibilidad directa e inducen coloración marrón cuando se calientan en coexistencia con un compuesto que tiene un grupo amino intramolecularmente, tales como aminoácidos y proteínas, y, por lo tanto, preferentemente, no deben estar presentes en una composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro como producto. Sin embargo, por ejemplo, en la producción de una composición particulada, que contiene ácido 2glucósido ascórbico cristalino anhidro, obtenido a través de una etapa de permitir que una enzima, tal como la CGTasa, actúe sobre una solución que contiene ácido L-ascórbico y sustancia amilácea, las impurezas de reacción, tales como ácido L-ascórbico intacto y D-glucosa derivados de la sustancia amilácea material coexistirán inevitablemente en la composición particulada producida de este modo a cualquier tasa. Por ejemplo, en polvos convencionales de calidad de producto de parafarmacia, las cantidades de ácido L-ascórbico y D-glucosa contenidos en los mismos podrían alcanzar aproximadamente un uno por ciento, b.s.s., en total, y esto puede inducir una reacción de coloración marrón impredecible cuando se utilizan como materias primas para productos alimenticios, etc.

Por lo tanto, en la presente invención, al tiempo que permite la incorporación inevitable de ácido L-ascórbico y/o Dglucosa, el poder reductor de toda la composición particulada de la composición particulada que contiene ácido 2glucósido ascórbico cristalino anhidro se controla a menos del uno por ciento. Como se muestra en los experimentos descritos más adelante, en la producción de la composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro de la presente invención mediante el proceso de acuerdo con la presente divulgación, el poder reductor de toda la composición particulada se puede ajustar fácilmente a menos de uno por ciento. Siempre que el poder reductor de toda la composición particulada sea menos de uno por ciento, las composiciones en partículas que contienen ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro, que aún contiene ácido L-ascórbico y/o D-glucosa, no inducen sustancialmente la coloración marrón, incluso cuando calientan en presencia de un compuesto con un grupo amino intramolecular, tales como aminoácidos y proteínas. En consecuencia, cualquier composición particulada que contienen ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro, que contiene ácido L-ascórbico y/o D-glucosa y tiene un poder reductor de cada composición particulada total de menos de uno por ciento, tiene el mérito de que se puede incorporar en productos alimenticios, cosméticos, productos de parafarmacia y productos farmacéuticos en general sin miedo a causar coloración o un cambio de color. A este respecto, cuando el poder reductor de toda la

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B. Reacción enzimática

A continuación se explica la reacción de transferencia de sacáridos a ácido L-ascórbico. Se deja que la CGTasa actúe sobre una solución, por lo general, una solución acuosa que contiene ácido L-ascórbico y sustancia amilácea. Cuando la CGTasa actúa sobre una solución acuosa de este tipo, uno o más restos de D-glucosa se transfieren al grupo hidroxilo en la posición C-2 del ácido L-ascórbico, dando lugar a la formación de ácido 2-glucósido ascórbico con un resto de D-glucosa unido al grupo hidroxilo en la posición C-2 anterior, y otros ácidos α-glicosil-L-ascórbicos tales como ácido 2-0-α-maltosil-L-ascórbico, ácido α 2-0-maltotriosil-L-ascórbico y ácido 2-0-α-maltotetraosil-Lascórbico, que tienen al menos dos restos de D-glucosa unidos al grupo hidroxilo en la posición C-2 anterior.

Normalmente se deja que la CGTasa actúe sobre una solución acuosa, preparada previamente para disolver el ácido L-ascórbico y la sustancia amilácea para dar una concentración de sustrato de 1 a 40 %, en una cantidad de 1 a 500 unidades/g de sustancia amilácea, seguido de un enzimática de reacción a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 y una temperatura de 30 a 70 ºC durante al menos seis horas, preferentemente, de aproximadamente 12 a aproximadamente 96 horas. Dado que el ácido L-ascórbico es susceptible a la oxidación, la solución debería, preferentemente, mantenerse en condiciones anaerobias o reductoras durante la reacción enzimática, al tiempo que se protege de la luz y coexistiendo, opcionalmente, por ejemplo, un agente reductor tal como tiourea o sulfuro de hidrógeno.

La relación en peso, b.s.s., de la sustancia amilácea y el ácido L-ascórbico en la solución deben ser, preferentemente, de 8:2 a 3:7. Cuando la relación de la sustancia amilácea supera el intervalo anterior, la transferencia de sacárido a ácido L-ascórbico procede eficazmente; sin embargo, el rendimiento de la producción de ácido 2-glucósido ascórbico está restringido por la concentración inicial de ácido L-ascórbico, dando lugar a un nivel relativamente bajo. Mientras que, cuando la relación de ácido L-ascórbico supera el intervalo anterior, el ácido Lascórbico intacto permanecerá en una cantidad considerable y esto no es preferible en una producción a escala industrial. De acuerdo con lo anterior, la relación identificada anteriormente se considera la mejor.

Además de la CGTasa, en el caso de la utilización de la isoamilasa como enzima desramificante del almidón, tales preferentemente se debe permitir que la isoamilasa actúe sobre la sustancia amilácea en coexistencia con la CGTasa, en una solución que contiene ácido L-ascórbico y sustancia amilácea, donde la cantidad de isoamilasa que se va a añadir es, generalmente, de 200 a 2.500 unidades/g de sustancia amilácea y la enzima se hace reaccionar enzimáticamente a una temperatura de 55 ºC o más baja, variando en función de la temperatura óptima y el pH de la isoamilasa utilizada. Cuando se usa la pululanasa como enzima desramificante de almidón, se pude usar de acuerdo con el caso de la isoamilasa.

Una vez completada una reacción enzimática con CGTasa sola o junto con una enzima desramificante de almidón como un todo, la solución de la reacción enzimática resultante se calienta instantáneamente para inactivar la CGTasa sola o en combinación con la enzima desramificante de almidón y suspender la reacción enzimática, seguido de permitir que la glucoamilasa actúe sobre la solución resultante. Mediante la acción de la glucoamilasa, una cadena de dos o más restos de D-glucosa unidos al grupo hidroxilo en la posición C-2 del ácido L-ascórbico se escinde para transformar el ácido α-glicosil-L-ascórbico, tal como ácido 2-0-α-maltosil-L-ascórbico, ácido α-2-0maltotriosil-L-ascórbico y ácido 2-0-α-maltotetraosil-L-ascórbico en ácido 2-glucósido ascórbico en un mayor rendimiento de producción tan alto como de 35 % o superior, preferentemente, de 37 a 45 % de ácido 2-glucósido ascórbico.

En el caso de que el rendimiento de producción de ácido 2-glucósido ascórbico sea del 35 % o mayor, preferentemente de 37 a 45 %, facilita la obtención de una composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro que tiene un grado de cristalinidad de 90 % o más alto para ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro o un nivel de sorción dinámica de vapor de 0,01 % o menor de la composición particulada a través de las siguientes etapas (2) a (5). La razón por la cual el límite superior del rendimiento de la producción preferible se establece en 45 % es la siguiente: es sustancialmente difícil superar el límite superior en vista de nivel tecnológico de ingeniería enzimática de hoy, mientras que incluso si el rendimiento de la producción de ácido ascórbico 2-glucósido se incrementa a más del 45 %, el grado de cristalinidad para el ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro en la composición particulada resultante y el nivel de sorción de vapor dinámica de la misma no mejorarían tanto.

En el caso de que el rendimiento de producción de ácido 2-glucósido ascórbico sea menor del 35 %, es difícil obtener una composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro que tiene un grado de cristalinidad de 90 % o más alto para ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro o un nivel de sorción dinámica de vapor de 0,01 % o menor de la composición particulada, incluso si se separa mediante las siguientes etapas (2) a (5). Aunque la razón es incierta, se puede especular que la dificultad anterior sería dependiente de una cantidad relativa de ácido 5-0-α –glucosil-L-ascórbico-ácido ascórbico y ácido-6-O-α-glucosil-L-ascórbico como subproductos productos que se forman inevitablemente cuando se permite que la CGTasa actúe sobre una solución que contiene ácido L-ascórbico y sustancia amilácea.

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Excepto para el rendimiento de la producción de ácido 2-glucósido ascórbico en la etapa (1) anterior y el contenido de ácido 2-glucósido ascórbico de cualquiera de las soluciones de las etapas anteriores (2) y (3), las etapas anteriores (1) a (5) son, básicamente, las mismas que las etapas de la producción de polvos de calidad de producto de parafarmacia y están libres de cualquier etapa para recristalización y para el lavado repetido de cristales, que son ambas indispensables en el proceso de producción de polvos de calidad de reactivo.

La composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro obtenido de este modo se convierte bastante rápido en una composición particulada sustancialmente no higroscópica con una capacidad de fluidez mejorada mediante enfriamiento no forzado después de las etapas de envejecimiento y secado, sin embargo, el grado de cristalinidad para el ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro no aumenta a 90 % o más y el nivel de sorción dinámica de vapor de la composición particulada no baja a 0,01 % o menor, cuando el tiempo de enfriamiento no forzado es demasiado corto. Cuando una composición particulada, preparada con un tiempo de enfriamiento no forzado corto, se convierte directamente en un producto final, solo se obtiene una composición particulada que, posiblemente, se solidifica en circunstancias normales de almacenamiento de manera similar a los polvos de calidad de producto de parafarmacia. Al estar influido por la temperatura y la humedad atmosféricas y también al variar en función de la escala y la estructura de los aparatos/instalaciones utilizados para el secado, el posible requisito de tiempo de enfriamiento no forzado más corto para la obtención de la composición particulada apenas solidificable de la presente invención se considera que es casi constante en condiciones constantes. Por lo tanto, cuando la relación entre (i) el requisito de tiempo de enfriamiento no forzado para ajustar el grado de cristalinidad al 90 % o superior para ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro y ajustar el nivel de sorción dinámica de vapor cuando tiene incluso un nivel de una composición particulada del mismo a 0,01 % o inferior, y (ii) la temperatura y la humedad atmosféricas, se examinan una vez con aparatos e instalaciones específicas para el uso real, no es necesario en cada caso para examinar el grado de cristalinidad y el nivel de sorción de vapor dinámica de una composición particulada en cada momento de la producción, pero la composición particulada de la presente invención se puede obtener mediante el uso del tiempo de enfriamiento no forzado anterior como índice.

Los presentes inventores encontraron además que, en lugar del enfriamiento no forzado de la composición particulada que contiene cristales después del envejecimiento y secado identificados anteriormente, por ejemplo, un enfriamiento forzado soplando un aire limpio con aproximadamente la temperatura ambiente a la composición particulada para bajar la temperatura a aproximadamente la temperatura ambiente se produce suavemente la cristalización de ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro en una composición particulada con un grado de cristalinidad de 90 % o superior para ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro y un nivel de sorción dinámica de vapor de 0,01 % o menor en un período de tiempo relativamente corto. El aire de soplado tiene preferentemente una temperatura que varía de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 ºC, más preferentemente, de 18 a 28 ºC. Además, el tiempo de soplado es, por lo general, preferentemente, de aproximadamente 5 a aproximadamente 60 minutos, más preferentemente, de 10 a 30 minutos. Al variar en función de la temperatura del aire de soplado, el efecto del enfriamiento forzado no se observa tan claramente con un tiempo de soplado de menos de cinco minutos, mientras que no se espera un incremento mejorado del grado de cristalinidad, incluso con un tiempo de soplado de más de 60 minutos y, por lo tanto dicho tiempo de soplado no es preferible. En el caso del aire de soplado, el efecto de enfriamiento debe ejercerse, preferentemente, en la totalidad de la composición particulada que contiene cristales, tanto mediante agitación como vibración apropiadas de la composición particulada.

La composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro obtenido de este modo es de la presente divulgación, que contiene ácido 2-glucósido ascórbico en una cantidad de más del 98,0 % pero inferior al 99,9 %, b.s.s., y, o bien tiene un grado de cristalinidad de 90 % o superior para el ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro, cuando se calcula sobre la base de un perfil de análisis de difracción de rayos X en polvo de la composición particulada, o tiene un nivel de sorción dinámica de vapor de 0,01 % o menor, cuando se mantiene a 25 ºC con una humedad relativa del 35 % durante 12 horas después de la retirada del agua libre de la composición particulada en una corriente de gas nitrógeno. Comparando con los polvos convencionales de calidad de producto farmacéutico, la composición particulada es una composición particulada significativamente apenas solidificable que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro, incluso en las condiciones donde los polvos convencionales se solidificarán.

Entre paréntesis, la solidificación de los materiales tiene el inconveniente de afectar de forma variada a las plantas de producción. Por ejemplo, en el campo de una producción de alimentos donde se utilizan materiales pulverulentos, tales materiales con frecuencia se pulverizan finamente mediante trituradoras de rodillos, se transportan por aire a las líneas de producción mediante soplado de aire y se transportan mediante transportadores de bobina en zigzag. En tales ocasiones, si se solidificaran los materiales pulverulentos, se inducirían a los siguientes acontecimientos problemáticos: Los rodillos de las trituradoras de rodillos pueden quedar dañados o quemados, o se pueden bloquear los tamices y los tubos de transporte instalados en las líneas de producción. Además, los materiales pulverulentos solidificados tienen un alto riesgo de causar acontecimientos problemáticos operativos en su disolución y en su mezcla o amasado con otros materiales. Los problemas en las etapas de producción causados por la solidificación de tales polvos se describen con detalle en, por ejemplo, "Funryutai-Trouble-Shooting" (resolución de problemas de partículas pulverulentas), editado por Tsutomu Shibata, publicado por Kogyo Chosakai Publishing Co., Ltd., Tokyo, Japón, pp. 15-19, 2006.

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Una composición particulada, preparada mediante la disolución de la muestra de ensayo n.º 1 en una cantidad adecuada de agua purificada, liofilización de la solución resultante durante tres días y secado del producto resultante al vacío a una temperatura de 40 ºC o más baja durante la noche, se utilizó como otra muestra estándar que consiste sustancialmente en ácido 2-glucósido ascórbico amorfo y se denominó "muestra de ensayo n.º 2". La muestra de ensayo n.º 2 tenía un contenido de humedad de 2,0 % cuando se mide con el método de Karl Fischer.

Como muestras de ensayo n.º 3 y 4 con un grado de cristalinidad para el ácido 2-glucósido ascórbico cristalino que está entre los de las muestras de ensayo n.º 1 y 2, las siguientes muestras se prepararon del siguiente modo: una composición particulada que consiste en ácido 2 glucósido ascórbico amorfo preparada de forma similar al método para la muestra de ensayo n.º 2 se extendió sobre una bandeja metálica y se cristalizó parcialmente manteniéndola en una cámara con una temperatura y humedad constantes controladas a una temperatura de 25 ºC y una humedad relativa de 90 % durante 24 o 72 horas para acelerar la cristalización. Sucesivamente, se sacó la bandeja metálica de la cámara, se secó al vacío a 38 ºC durante la noche para obtener dos tipos de composiciones particuladas, donde una con un tiempo de mantenimiento de 24 horas en la cámara de temperatura y humedad controladas se llamó "muestra de ensayo n.º 3", mientras que la otra con un tiempo de mantenimiento de 72 horas se llamó "muestra de ensayo nº. 4". Las muestras de ensayo n.º 3 y 4 se introdujeron, respectivamente, en un vial sellado con un tapón y conservado con un desecante en un desecador en una condición de sellado hasta justo antes de someterlas al ensayo de análisis.

Experimento 1-2: Purezas del ácido 2-glucósido ascórbico y grados de cristalinidad de las muestra de ensayo n.º 1 a 4

Las purezas del ácido 2-glucósido ascórbico de las muestras de ensayo n.º 1 a 4 se determinaron del siguiente modo: usando agua purificada, cada una de las muestras de ensayo se realizó en una solución acuosa al 2 %, que después se filtró de membrana de 0,45 µm. El filtrado se sometió a cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en las siguientes condiciones, seguido del cálculo de la pureza del ácido 2-glucósido ascórbico, b.s.s., de cada una de las muestras de ensayo basados en el área del pico de cada cromatograma del índice de refracción. Los resultados se indican en la tabla 1.

Condiciones analíticas

Sistema de HPLC: "LC-10AD", comercializado por Shimadzu Corp., Kyoto, Japón; Desgasificador: "DGU-12AM", comercializado por Shimadzu Corp., Kyoto, Japón; Columna: "WAKOPAK WAKOBEADS T-330", H+-forma, comercializada por Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón; Volumen de inyección de la muestra: 10 µl; Eluyente: 0,01 % (v/v) de solución acuosa de ácido nítrico; Caudal: 0,5 ml/min; Temperatura: 25 °C; Detector del índice de refracción: "RID-10A", comercializado por Shimadzu Corp., Kyoto, Japón; Aparato de procesamiento de datos: "CHROMATOPAK C-R7A", comercializado por Shimadzu Corp., Kyoto, Japón;

Los grados de cristalinidad de las muestras de ensayo números 1 a 4 para anhidra del ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro se determinaron mediante: sometiendo cada muestra de ensayo al análisis utilizando "X 'Pert PRO MPD", un nombre del producto de un difractómetro de rayos X en polvo de luz reflejada disponible en el mercado comercializado por Spectris Co., Ltd., Tokio, Japón; irradiando un rayo de CuK α (corriente eléctrica de los rayos X: 40 mA, voltaje eléctrico: 45 kV, longitud de onda: 1,5405 Å), como rayos X característicos irradiados desde la diana d Cu, a la muestra para obtener un perfil de difracción de rayos X en polvo; y determinando el valor de análisis para el grado de cristalinidad de cada una de las muestras de ensayo n.º 1 a 4 mediante el método de Harmans usando un software informático del método de Harman instalado exclusivamente en el difractómetro. Antes del análisis anterior, el grado de partículas y el factor de flexión preestablecido en el software se ajustaron, respectivamente, a los niveles apropiados para la obtención de una línea de base juzgada como la más preferible, teniendo en cuenta los picos solapados mutuamente, la intensidad de la difracción y la intensidad de la dispersión en los respectivos patrones de difracción de rayos X en polvo. El método de Harmans se describe con detalle en P. H. Harmans y A. Weidinger, "Journal of Applied Physics, Vol. 19, pp. 491-506 (1948) y P. H. Harmans y A. Weidinger, "Journal of Polymer Science", Vol. 4, pp. 135-144 (1949). El grado de cristalinidad de cada muestra de ensayo se calculó sustituyendo los datos siguientes en la fórmula 1 anterior: Hs como el valor del grado de cristalinidad de cada muestra de ensayo; H100, el valor analítico del de la muestra de ensayo n.º 1; y H0, el valor analítico del de la muestra de ensayo n.º 2. Cuando se analiza mediante el

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sincotrónica. Dado que la longitud de onda de la radiación sincotrónica (0,7717 Å) era diferente de la de los rayos X característicos (1,5405 Å), cada pico de difracción en la figura 3 apareció en aproximadamente un medio del ángulo de difracción (2 θ) de cada uno de los picos correspondientes en la figura 1. Sin embargo, los patrones de difracción de rayos X en polvo en las figuras 1 y 3 coincidían extremadamente bien con los demás. Mientras tanto, la anchura del pico a la mitad de la altura de cada pico de difracción en la figura 3 era evidentemente más estrecha que la de la figura 1, y cada pico de difracción en la figura 3 mostró mayor resolución que la de la figura 1, aunque la resistencia del pico en la figura 3 fue casi 100 veces superior que la de la figura 1. El patrón de difracción de rayos X en polvo en la figura 3 mostró ausencia de halo específico del ácido 2-glucósido ascórbico amorfo, como se muestra en la siguiente figura 4. El resultado indica que el grado de cristalinidad de la muestra de ensayo n.º 1 para el ácido 2glucósido ascórbico anhidro cristalino es extremadamente alto, y la muestra de ensayo n.º 1 consiste sustancialmente en ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro.

Como se muestra en la figura 4, el patrón de difracción de rayos X en polvo de la muestra de ensayo n.º 2 obtenido mediante el uso de radiación sincotrónica mostró un halo notable específico para el ácido 2-glucósido ascórbico amorfo como una línea de base aglutinada pero ningún pico de difracción específico del ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro. Este resultado indica que la muestra de ensayo n.º 2 consiste sustancialmente en ácido 2glucósido ascórbico amorfo.

Los resultados anteriores, obtenidos mediante el uso de radiación sincotrónica como fuente de rayos X avalan que las muestra de ensayo n.º 1 y 2 son muestras estándar adecuadas para definir los valores analíticos H100 y H0, respectivamente, para su uso en la fórmula 1.

Experimento 1-4

Ensayo de solidificación

El siguiente experimento fue investigar la propiedad de solidificación de las respectivas muestra de ensayo n.º 1 a 4: Un gramo de cada una de las muestra de ensayo n.º 1 a 4, preparadas en el Experimento 1-1, se colocó por separado en un "TUBO FALCON 2059. ", un nombre de producto de un tubo de polipropileno cilíndrico de 14 ml (1,7 cm de diámetro, 10 cm de altura) que tiene una forma inferior hemiesférica y una tapa, comercializado por Becton, Dickinson and Company, New Jersey, EE.UU.. Los tubos se fijaron a una gradilla para tubos verticalmente y se dejaron reposar durante 24 horas, después de colocar la gradilla para tubos en "IC-410", un nombre de producto de un incubador comercializado por Advantec Toyo Kaisha, Ltd.,, Tokio, Japón, controlada a 50 ºC. Después de la incubación, se sacaron los tubos de la incubadora, seguido de la retirada de cada tapa, sacando cada muestra de cada tubo para colocarla en una placa de plástico plana negra girando los tubos boca abajo lentamente, y observando macroscópicamente las condiciones de las muestras.

El grado de solidificación de cada muestra de ensayo se juzgó sobre la base de los siguientes criterios:

"Solidificada", (+): La muestra mantenía claramente la forma hemiesférica de la parte inferior del tubo, incluso en la placa; “Ligeramente solidificada", (±): La muestra mostraba ligeramente la forma hemiesférica de la parte inferior del tubo; "No solidificada", (-): La muestra estaba deformada y no mostraba la forma hemiesférica de la parte inferior del tubo. Los resultados se mostraron en la columna de "Capacidad de solidificación" de la Tabla 1.

Tabla 1

Muestras de ensayo n.º: 1 2 3 4

Pureza del ácido 2-glucósido ascórbico (%): 99,9 99,1 99,1 99,1

Grado de cristalinidad (%): 100,0 0,0 88,3 93,1

Solidificación: - + + -

Como se muestra en la Tabla 1, la muestra de ensayo n.º 1, como una muestra estándar para definir el valor analítico H100 (grado de cristalinidad: 100,0 %), se consideró "no solidificada" (-), porque colapsaba fácilmente y no mantenía la forma hemiesférica de la parte inferior del tubo, cuando se sacó del tubo y se colocó sobre una placa plana. Por el contrario, la muestra de ensayo n.º 2 como otra muestra estándar para definir el valor analítico H0 (grado de cristalinidad: 0,0 %), se consideró "solidificada" (+), porque seguía manteniendo la forma hemiesférica de la parte inferior del tubo, cuando se sacó del tubo y se colocó sobre la placa. La forma hemisférica de la muestra de ensayo n.º 2 no se colapsó ni siquiera cuando se le dio una ligera vibración a la placa.

La muestra de ensayo n.º 3 con un grado de cristalinidad de 88,3 % mantuvo la forma hemiesférica de la parte inferior del tubo, incluso cuando se sacó del tubo y se colocó en la placa, y se consideró que claramente estaba "solidificada" (+), similar a la muestra de ensayo n.º 2. La muestra de ensayo n.º 4, con un grado de cristalinidad de 93,1 % colapsó igual que la muestra de ensayo n,. 1, sin embargo, perdió su forma y colapsó justo después de haberla sacado del tubo y colocado en la placa y se consideró "no solidificada" (-).

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nivel de sorción dinámica de vapor, que se supone que es un índice útil para la estimación de la higroscopicidad, de las muestras de ensayo n.º 1 y 2 y las muestras de ensayo n.º 5 a 9 se midieron y el efecto del Nivel de sorción dinámica de vapor sobre la solidificación de las composiciones particuladas que contienen ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro se investigó mediante la verificación de los resultados del ensayo de solidificación obtenidos en el experimento 2-2.

Experimento 3-1

Medición del nivel de sorción dinámica de vapor

Aproximadamente, alícuotas de 50 mg de las muestras de ensayo n.º 1 y 2, preparadas en el experimento 1-1, y las muestras de ensayo n.º 5 a 9, preparadas en el experimento 2-1, se colocaron, respectivamente, en una cubeta para muestras de malla y se dejaron reposar en "IGA SORP", un aparato para sorción dinámica de vapor comercializado por Hiden Isocheme Corp., aunque las cubetas para muestras de malla se fijaron a soportes para muestras (hechos de acero inoxidable). Las muestras de ensayo se deshidrataron manteniéndolas a una temperatura de 25 º c y a una humedad relativa del 0 % durante 12 horas en corriente de gas nitrógeno a un caudal de 200 ml/min y se pesaron inmediatamente. Además, las muestras de ensayo se mantuvieron a una temperatura de 25º c y una humedad relativa del 35 % durante 12 horas en una corriente de gas nitrógeno y se pesaron de nuevo. El nivel de sorción dinámica de vapor (%) de cada muestra de ensayo se calculó sustituyendo en la fórmula 2 mencionada anteriormente el peso de cada muestra de ensayo cuya humedad se ha eliminado y el peso de la misma muestra justo después de su hidratación a una temperatura de 25 ºC y una humedad relativa del 35 % de durante 12 horas. Los datos de los niveles de sorción dinámica de vapor de las muestras de ensayo n.º 1 y 2, así como las muestras de ensayo n.º 5 a 9, obtenidas en este experimento, se muestran en la tabla 3. En paralelo, las purezas del ácido 2glucósido ascórbico, obtenidas en el experimento 2-1, y los resultados de los ensayos en la solidificación del mismo, obtenidos en el experimento 2-2, se muestran en la tabla 3.

Tabla 3

Muestras de ensayo n.º: 1 2 5 6 7 8 9

Pureza del ácido 2-glucósido ascórbico (%): 99,9 99,1 99,8 99,7 99,6 99,5 99,4

Nivel de sorción dinámica de vapor (%): <0,01 1,70 <0,01 <0,01 0,01 0,05 0,13

Solidificación: - + - - - ± +

Como se muestra en la Tabla 3, los niveles de sorción dinámica de vapor de las muestras de ensayo n.º 2 y 5 a 9 variaron desde menos de 0,01 % (correspondiente a "<0,01" en la Tabla 3 y esto se aplica en lo sucesivo), es decir, un valor menor que el límite de detección, a 1,70 %, y esto indica que incluso las composiciones particuladas que contienen ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro, que contiene ácido 2-glucósido ascórbico en una cantidad de 99,1 % o más, pero menos de 99,9 %, b.s.s., pueden tener niveles de sorción dinámica de vapor significativamente diferentes. Cada muestra de ensayo n.º 1, 5 y 6 tenía un nivel de sorción dinámica de vapor más bajo que el límite de detección. Por el contrario, las muestras de ensayo n.º 2, 8 y 9 tenían un nivel de sorción dinámica de vapor de más de 0,05 %, en particular, la muestra de ensayo n.º 2 tenía un nivel de sorción dinámica de vapor de 1,70 %, un nivel de sorción dinámica de vapor 10 veces más alto que los de las muestras de ensayo n.º 8 y

9.

Según la comparación de los resultados anteriores y los resultados de la columna de "Solidificación" en la Tabla 3, existe una clara correlación entre la solidificación de las composiciones particuladas que contienen ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro y sus niveles de sorción dinámica de vapor;.muestras de ensayo n.º 1, 5, 6 y 7, que tiene un nivel de sorción dinámica de vapor menor que el límite de detección o tan bajo como del 0,01 %, se consideró "no solidificada" (-), mientras que las muestra de ensayo n.º 2, 8 y 9, que tiene un nivel de sorción dinámica de vapor que alcanza del 0,05 a 1,70 %, se consideraron "solidificadas" (+) o "ligeramente solidificas" (±). Los resultados de este experimento indican que, además del grado de cristalinidad, el nivel de sorción dinámica de vapor de una composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro debe ser un índice útil para la realización de una apenas solidificable. Los resultados anteriores también indican que una composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro con un contenido de ácido 2-glucósido ascórbico de 99,1 % o mayor pero menor que 99,9 %, b.s.s., y con un nivel de sorción dinámica de vapor de 0,01 % o menor, no se solidifica en las condiciones de este experimento.

El hecho de que la muestra de ensayo n.º 2 mostraba un marcado nivel de sorción dinámica de vapor alto, tanto como de 1,70 % en este experimento sugiere que la sorción de vapor es inducida principalmente por el ácido 2glucósido ascórbico amorfo. Por otro lado, el hecho de que la muestra de ensayo n.º 1 mostró un nivel de sorción dinámica de vapor menor que el límite de detección sugiere que la muestra no contiene sustancialmente ácido 2glucósido ascórbico amorfo como la muestra de ensayo n.º 2. Estos resultados también coincidieron con los patrones de difracción de rayos X en polvo de las muestras de ensayo n.º 1 mostrados en las figuras 1 y 3, y avalan que la muestra de ensayo n.º 1 es una muestra estándar adecuada para definir el valor analítico H100 para el ácido 2glucósido ascórbico cristalino anhidro, como base para el cálculo del grado de cristalinidad para ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro de acuerdo con la Fórmula 1.

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Como es evidente a partir de la Tabla 4, la muestra de ensayo n.º 10, preparada mediante enfriamiento no forzado después de las etapas de envejecimiento y secado de una composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro obtenido por cristalización, tenía un grado de cristalinidad de 88,1 % para el ácido 2glucósido ascórbico cristalino anhidro y un nivel de sorción dinámica de vapor de 0,06 %, y se consideró "solidificada" (+) mediante el ensayo de solidificación. Por el contrario, la muestra de ensayo n.º 11, preparada mediante enfriamiento forzado soplando aire a 20 ºC durante 15 minutos después del envejecimiento y secado de una composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro, tenía un grado de cristalinidad 91,5 % para el ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro y un nivel de sorción de vapor dinámica menor que el límite de detección, y se consideró "no solidificada" (-) mediante el ensayo de solidificación. De un modo similar, la muestra de ensayo n.º 12, preparada mediante enfriamiento forzado soplando aire a 20 ºC durante 40 minutos después del envejecimiento y secado de una composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro, tenía un grado de cristalinidad 94,1 % para el ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro y un nivel de sorción de vapor dinámica menor que el límite de detección, y se consideró "no solidificada" (-) mediante el ensayo de solidificación. Estos resultados indican que la cristalización de una composición particulada puede estimularse mediante enfriamiento forzado en lugar de enfriamiento no forzado realizado después de las etapas de envejecimiento y secado de una composición particulada, lo que significa que el enfriamiento forzado es más ventajoso que el enfriamiento no forzado en la preparación de una composición particulada con un mayor grado de cristalinidad del ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro y un nivel de sorción dinámica de vapor menor, es decir, una composición particulada apenas solidificable.

Experimento 5

Influencia de la pureza del ácido 2-glucósido ascórbico sobre la solidificación de una composición particulada que contiene ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro

A partir de los experimentos anteriores, se reveló que, en una composición particulada que contiene ácido 2glucósido ascórbico cristalino anhidro con una pureza de ácido 2-glucósido ascórbico tan alta como 99,1 % o más, tanto el grado de cristalinidad para el ácido 2-glucósido ascórbico cristalino anhidro y el nivel de sorción dinámica de vapor, respectivamente, se relacionan estrechamente con la solidificación de la composición particulada. En este experimento, la relación entre la solidificación de la composición particulada y la pureza del ácido L-ascórbico de la misma se investigó adicionalmente.

Experimento 5-1

Preparación de la muestra de ensayo

Las muestras de ensayo n.º 13 a 18, mostradas en la Tabla 5, que tienen diferentes purezas de ácido 2-glucósido ascórbico, se prepararon a partir de soluciones acuosas que contienen ácido L-ascórbico y dextrina, un tipo de sustancia amilácea, tal como se describe a continuación; y se sometieron al ensayo de solidificación de forma similar al Experimento 1-4.

Cuatro partes en peso de "PINEDEX #100", una dextrina comercializada por Matsutani Chemical Industries Co., Ltd., Hyogo, Japón, se disolvió en 15 partes en peso de agua por calentamiento. Después, tres partes en peso de ácido L-ascórbico se mezclaron con la solución. Sucesivamente, 100 unidades/g de dextrina de la CGTasa de la cepa Tc62 de Geobacillus stearothermophilus y 250 unidades/g de dextrina de la isoamilasa, comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japón, se mezclaron con la solución anterior y se sometieron a una reacción enzimática mientras se mantenía la solución resultante a un pH de 5,5 y una temperatura de 55 ºC durante 50 horas para formar ácido 2-glucósido ascórbico. Se puede especular que los ácidos α -glicosil-Lascórbicos, tal como ácido 2-0-α –maltosil-L-ascórbico, ácido 2-O-α-maltotriosil-L-ascórbico, ácido 2-O-α-Lmaltotetraosil-ascórbico, etc., deben formarse en la solución de reacción.

Después de la inactivación de las enzimas por calentamiento, la solución de reacción se ajustó a pH 4,5, se mezcló con 50 unidades/g de dextrina de "GLUCZYME AF6",un nombre de producto de una muestra de glucoamilasa comercializada por Amano Enzymes Inc., Aichi, Japón, y se sometió a una reacción enzimática durante 24 horas para hidrolizar los ácidos α-glicosil-L-ascórbicos anteriores en ácido 2-glucósido ascórbico e hidrolizar los oligosacáridos concomitantes restantes en D-glucosa. Después de la reacción, la solución de reacción contenía ácido 2-glucósido ascórbico en un rendimiento de producción de 39 %.

La solución de reacción se calentó para inactivar la glucoamilasa, se decoloró y se filtró con un carbón activado, se sometió a una columna de resina de intercambio catiónico (forma H+) para el desalado y después se sometió a una resina de intercambio aniónico (forma OH-) para absorber el ácido L-ascórbico y el ácido 2-glucósido ascórbico, seguido de lavado de la resina con agua para eliminar la D-glucosa y alimentar una solución de ácido clorhídrico 0,5 N para efectuar la elución. El eluato se concentró para dar un contenido de sólidos de aproximadamente 50 % y después se sometió a cromatografía en columna usando "DOWEX 50WX4" (forma Ca2+-), un nombre del producto de una resina de intercambio catiónico de ácidos fuertes comercializada por Dow Chemical Company. El eluato concentrado para dar un contenido de sólidos de aproximadamente 50 % se cargó en la columna en un volumen de

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Claims

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