DE1918282B2 - Verfahren zur Herstellung von Diestern kondensierter Phosphorsauren - Google Patents

Description

nit einem Monoester oder Monoestersalz der Monoader Oligophosphorsäure der allgemeinen Formel

HO —Ρ

Ο —Ρ

ΟΗ

Ο —R" (IV)

in der R" und in die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, in Gegenwart eines oder mehrerer organischer Lösungsmittel.

Es ist bereits bekannt, daß Diester kondensierter Phosphorsäuren durch Kondensation von Phosphor- κ säureamiden und Monoestern der Phosphorsäure hergestellt werden können (vgl. zum Beispiel H. G. Khorana et al. »J. Am. Chem. Soc«. Bd. 80. S. 3756 [1958], Bd. 83, S. 659 [1961], A. L. Nussbaum et a«. »Tetrahedron«, Bd. 20, S. 2467 [1964], RK. Kochetkov et al, »Tetrahedron«. Bd. 19. S. 1207 [1963], Y. F u r u k a w a et al, »Chem. Pharm. Bull. Japan«. Bd. 13, 16 [1965], und J. G. Moffatt et al, »J. Am. Chem. Soc«, Bd. 88, S. 838 [1966]).

Die bekannten Verfahren haben jedoch die Nachteile, daß die Reaktionszeiten übermäßig lang sind und die Reaktionen nicht bis zum Ende ablaufen, wobei darüber hinaus noch große Mengen an unerwünschten Nebenprodukten gebildet werden. Dadurch sinken die Ausbeuten an den gewünschten Diestern, die bei den bekannten Verfahren in Abhängigkeit von dem gewünschten Produkt oder dem angewendeten Lösungsmittel erheblichen Schwankungen unterliegen und gewöhnlich zwischen etwa 20 und etwa 80% betragen, wobei die Ausbeute an isoliertem Produkt zwischen etwa 18 und etwa 70% liegt.

Aufgabe der Erfindung ist es nun. ein verbessertes Verfahren zur Herstellung der genannten Diester kondensierter Phosphorsäuren anzugeben, mi* dessen Hilfe es möglich ist, auf wirtschaftliche Weise innerhalb kürzerer Reaktionszeiten die gewünschten Diester kondensierter Phosphorsäuren mit gleichbleibend höheren Ausbeuten herzustellen.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Ver fahren zur Herstellung von Diestern kondensierte Phosphorsäuren der eingangs genannten Art. das dadurch gekennzeichnet ist. daß man als organisches Lösungsmittel einen oder mehrere Phosphorsäuretriester der allgemeinen Formel

R₁ - O — P — O — R₂ (V)

ί
R₃

verwendet, in der R₁. R₂ und R₃ Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylreste bedeuten, und die Umsetzung bei einer Temperatur von 0 bis 7O⁰C durchführt.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die bei derartigen Verfahren bisher auftretenden Schwierigkeiten, beispielsweise das Problem der Schwerlöslichkeit der Ausgangsmaterialien, das Erfordernis einer langen Reaktionszeit (da die Umsetzung bei höheren Temperaturen stürmisch verläuft, wurden die bisher bekannten Verfahren bei Raumtemperatur durchgeführt, die zur Erzielung annehmbarer Ausbeulen etwa 3 bis etwa 4 Tage dauerten), die Bildung unerwünschter Nebenprodukte selbst bei Raumtemperatur und die Erzielung zu geringer Ausbeuten zu umgehen. Die A.usgangsmaterialien weisen in den erfindungsgemäß eingesetzten Phosphorsäuretriestern eine bessere Löslichkeit auf und das eingesetzte Lösungsmittel verhindert die Zersetzung des nach der Umsetzung erhaltenen Phosphorsäurediesters. Daoei hat sich gezeigt, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren schon nach 2 bis 5 Stunden der gewünschte kondensierte Phosphorsäureester in einer Ausbeute von etwa 90% und mehr erhalten werden kann, wenn die Umsetzung bei etwa 5O⁰C durchgeführt wird.

Nach der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das dabei erhaltene Reaktionsgemisch, das eine Lösung oder Suspension darstellen kann, gegebenenfalls unter Zugabe von Wasser auf übliche Weise aufgetrennt und gereinigt.

Besonders günstige Ergebnisse werden dann erzielt, wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Phosphorsäuretriester Tri-n-propylphosphat, Tricyclohexylphosphat, Trimethylphosphat, Tri-n-butylphosphat, Triäthyiphosphat, Tribenzylphosphat oder Trio-cresylphosphat verwendet wird.

Als Ausgangsmaterialien können in dem erfindungsgemäßen Verfahren sämtliche Ester von Mono- oder Oligophosphorsäureamiden, Ester von Pyridyl-mono- oder -oligcphosphaten und Monoester von Mono- oder Oligophosphorsäure verwendet werden, d. h., R und R" können Mono- oder Oligophosphorreste, die einen Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylrest enthalten, oder Reste, die einen oder mehrere Zuckerreste im Molekül enthalten, wie Ribonucleosid- oder Desoxyribonucleosidreste vom Imidazol-, Pyridin-, Pyrimidin-, Flavin- und Purin-'fyp sowie verschiedene Pentosyl-, Desoxypentosvl-, Hexosyl-, Desoxyhexosyl- und Heptosylnucleosidreste der obigen fünf Arten oder Reste von deren Derivaten oder Zuckerreste, wie Pentose, Dcsoxypentose, Hexose, Desoxyhexose, Heptose, Desoxyheptose und Oligosaccharose oder Reste von deren Derivaten (solche, in denen eine Phosphorgruppe mit einem OH-Rest in einer beliebigen Stellung in den Zuckern verbunden ist), Aminosäurereste, z. B. N-substituierte Serine. N-substituierte Threonine, N-substituierte Homoserine, N-substituierte /i-Hydroxyglutaminsäuren. N-substituierte ,f-Hydrox\asparaginsäuren, N-substituiertes y-Hydroxyprolin und N-substituierte >-Hydroxylysine, oder Reste von Vitaminderivaten, z. B. Pyridoxin, Pyridoxal, Pyridoxamin. Thiamin, Pantethin, Pantothensäure, Pantothensäurenitril, Pantethein und Derivate davon, oder Reste von Steroidderivaten. z. B. Testosteron, Prednisolon, Pregnenolon, östriol, östradiol und Cholesterol, bedeuten.

Als Phosphorsäurepyridyldiester können solche verwendet werden, in denen der Wasserstoff siner der freien Hydroxylgruppen in dem Phosphorsäurerest durch einen Pyridylrest und dessen Derivate ersetzt ist und die in der «-, ß-, oder y-Stellung des Pyridylrestes gebunden sind.

Es können auch anorganische oder organische Salze der obigen Derivate der Phosphorsäure verwendet werden. Zu diesen Salzen gehören beispielsweise das Lithiumsalz, Ammoniumsalz, Natriumsalz,

Kaliumsalz, Trimethylaminsalz. Triäthylaminsalz, Tri-n-propylaminsalz (einschließlich des isomeren Aminsalzes), Tri-n-butylaminsalz (einschließlich dessen isomerer Aminsalze), Cyclohexylaminsalz, Piperidinsalz, Pyridinsalz, Dicyclohexylguan-dinsalz und 4 - Morpholino - N,N' - dicyclohexylcarboxamidinsalz. Gewöhnlich ist es jedoch zweckmäßig, ein organisches Aminsalz zu verwenden, da dessen Löslichkeit höher ist.

Als organische Phosphorsäuretriester können in den erfindungsgemäßen Verfahren nicht nur aliphatische Triester der Phosphorsäure, wie Trimethylphosphat, Triäthylphcsphat, Tri-n-propylphosphat oder dessen Isomeres, Tri-n-butylphosphat oder dessen Isomere, Tri-n-amylphosrhat oder dessen Iso- is mere und Trihexylphosphat, sondern auch aromatische Triester der Phosphorsäure, wie Tri-o-cresylphosphat, Tri-m-cresylphosphat und Tribenzylphosphat, oder alicyclische Triester der Phosphorsäure, wie Tricyclohexylphosphat und Tricyclopentylphosphat, verwendet werden. Bevorzugt werden solche Triester verwendet, die bei Raumtemperatur flüssig sind, so daß nach Beendigung der Reaktion eine leichte Behandlung möglich ist, es können aber auch Phosphate verwendet werden, die beim Erhitzen flüssig werden.

Die Reaktionszeit kann durch Erhitzen auf bis zu etwa 70⁰C wesentlich verkürzt werden. So kann bei 50° C die Reaktion in etwa 1 bis 5 Stunden beendet sein. Wenn die Reaktionsteilnehmer und Produkte längere Zeit nachdem die Reaktion beendet ist miteinander in Berührung bleiben, treten leicht Nebenreaktionen auf. Es ist daher zweckmäßig, die Reaktion nicht länger als notwendig durchzuführen und das gewünschte Produkt von dem nicht umgesetzten Ausgangsmaterial sobald als möglich abzutrennen.

Es isl notwendig, andere Lösungsmittel zuzugeben. Andererseits ist aber eine Zugabe verschiedener Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, die für die Reaktion unschädlich sind, durchaus zulässig. Beispielsweise können Lösungsmittel, wie sie bisher schon verwendet wurden, zugesetzt werden.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Diester kondensierter Phosphorsäuren können nach üblichen Methoden gereinigt werden. Es ist vorteilhaft, das gewünschte Produkt in Form eines Alkalisalzes abzutrennen, es ist jedoch auch möglich, das Endprodukt a'> relativ uniösliches Salz, beispielsweise als Calciumsalz. Bariumsalz oder Quecksilbersalz, zu isolieren und das Salz in die freie Säure oder ein lösliches Alkalisalz zu überführen. Der Diester kann auch gereinigt, isoliert und in ein Salz übergeführt werden, indem man das Reaktionsgemisch mit Aktivkohle, Ionenaustauscherharzen oder lonenaustauschercellulosederivaten behandelt, um die in dem Reaktionsgemisch enthaltenen Diester kondensierter Phosphorsäuren zu adsorbieren und zu eluieren und dann nach üblichen Verfahren zu behandeln. Die Adsorptionsbehandlung kann direkt mit dem Reaktionsgemisch erfolgen, mit einem Gemisch aus Reaktionsgemisch und Wasser oder mit einer wäßrigen Lösung, die durch Vermischen von Wasser mit einem durch Zusatz von Äther, halogenierten Kohlenwasserstoffen oder Ketonen zu dem Reaktionsgemisch erhaltenen Niederschlag hergestellt wurde. Da die Menge an Diestern, die in dem erfindungsgemäß hergestellten ReaUionsgcinisch vorliegt, äußerst hoch ist, kann eine große Ausbeute an hochreinem Produkt bei nur einmaliger Durchführung der oben beschriebenen Adsorptions- und Elutionsbehandlung erhalten werden.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Diester kondensierter Phosphorsäuren können als Coenzyme, Arzneimittel oder biochemische Reagenzien verwendet werden.

Beispiel 1

Zu 180 mg (0,3mMol) N,N' - Di - cyclohexylcarboxyamidiniumadenij >in-5'-phosphoramidat und einem Tri - η - butylammoniumriboflavin - 5' - phosphat, das gesondert aus 575 mg Pyridiniumribonavin-S'-phosphat nach einem Verfahren hergestellt worden war, bei dem 370 mg (2 mMol) Tri-n-butylamin enthaltendes wasserfreies Benzol zu einem Pyridiniumsalz zugegeben und anschließend Pyridin durch wiederholte azeotrope Verdampfung unter vermindertem Druck mit wasserfreiem Benzol abgetrennt wurde, wurden 30 ml Tri-n-propyiiihosphat zugesetzt. Nach 4tägigem Stehenlassen des Gemisches an einem dunklen Platz wurde es mit 50 ml Wasser vermischt und dreimal mit je 50 ml Chloroform extrahiert. Der nH-Wert der wäßrigen Schicht wurde auf etwa 7 eingestellt und die wäßrige Lösung durch eine Kolonne von 4 χ 15 cm aus DEAE-Cellulose vom Cl-Typ gegeben. Nach dem Waschen der Cellulosekolonne mit Wasser wurde dnc 0,005 n-HCl'0,015 n-LiCl-Lösung hindurchgegeben, um Mononucleotide zu entfernen, und anschließend wurde während eines möglichst kurzen Zeitraums eine 0,005 n-HCl/0,035 n-LiCl-Lösung hindurchgeleitet, um eine Flavinadenindinucleotid (FAD)-Fraktion zu eiuieren. Die Fraktion wurde mit Triäthylamin neutralisiert, im Vakuum eingeengt, mit 20 ml Methanol vermischt und dann mit 400 ml Aceton und 40 ml Äther vermischt, wobei ein Niederschlag ausfiel. Zu dem adf diese Weise erhaltenen orangefarbenen Niederschlag wurden 4 ml Methanol unter Rühren zugesetzt, und dann wurden 40 ml Aceton und 4 ml Äther zum Auswaschen zugegeben. Schließlich wurde der Niederschlag in Wasser gelöst, und die Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 122 mg eines Lithiumsalzes des FAD (Li₂FAD) erhalten wurden. Das dabei erhaltene Material zeigte als Spektraleigenschaften Verhältnisse der optischen Dichte bei 260/450 πΐμ von 3,28 und bei 375/450 πΐμ von 0,82 bei pH 7.

Beispiel 2

Zu 383 mg (1 mMol) Adenosin-5'-phosphat (2H₂O) wurden 10 ml wasserfreies Pyridin und 706 mg (2 mMol) Tri-n-octylamin zugegeben. Das Gemisch wurde im Vakuum verdampft, und anschließend wurden Wasser und Pyridin durch wiederholte Entwässerung durch dreimalige Zugabe und Verdampfen des Pyrii'.ins und Entfernen des Pyridins durch azeotrope Verdampfung unter Anwendung von wasserfreiem Benzol daraus entfernt. Zu dem auf diese Weise erhaltenen Produkt wu^rden 430 mg (0,5 mMol) gut getrocknetes Prednisolon-21-phosphorsäuremorpholid zugegeben und den 50 ml Tricyclohexylphosphat, die 0,5 mMol Tri-n-octylamin enthielten, zugesetzt. Das Gemisch wurde etwa 5 bis 10 Stunden auf 60° C erhitzt, gekühlt und dreimal mit je 50 ml Wasser und 50 ml Äther extrahiert. Die wäßrigen Schichten wurden gesammelt und im Vakuum auf etwa 15 ml eingeengt. Nach Einstellung des pi 1-Wertes

des Konzentrats auf etwa 7,5 wurde das Konzentrat durch eine Kolonne von 2 χ 30 cm aus DEAE-Cellulose vom [HCO₃]"-Typ gegeben. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und dann durch lonenaustauschchromatographie nach einer Lineargradient-Methode unter Verwendung von 51 Wasser und 5 1 0,15-m Triäthylammoniumhydrogencarbonat mit einem pH-Wert von etwa 7,5 eluiert. Die das gewünschte Dinucleotid enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockene verdampft, wobei 350 mg pulverförmiges Prednisolonadenosindiphosphat [P¹ -(Prednisolon-21)-P²-(adenosin-5')pyrophosphat] erhalten wurden. Das Produkt zeigte bei der Papierchromatographie unter Anwendung von Isopropanol-NH₃—H₂O (7:1:2) einen einzelnen Fleck mit einem R_f-Wert von 0,59.

Beispiel 3

Zu 492 mg (2 raMol) gut getrocknetem Pyridoxal-5-phosphat wurden 1,42 g Tri-n-octylamin zugegeben. Zu dem auf diese Weise hergestellten Gemisch wurden 50 ml Tri-methylphosphat und 374 mg (1 mMol) Adenosin-5'-phosphorsäureäthylamid zugesetzt und 8 Stunden bei 40⁰C gehalten. Nach Zusatz von 50 ml Wasser zu dem Reaktionsgemisch wurde dieses dreimal jeweils mit 50 ml Äther an einem dunklen Platz extrahiert. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde durch eine Kolonne von 2 χ 7 cm aus DEAE-Cellulose vom Cl "-Typ gegeben. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen, und es wurden 0,003 n-HCl/ 0,015 n-LiCl hindurchgeleitet, um die Mononucleotide zu entfernen. Anschließend wurde die gewünschte Hauptfraktion mit 0.005 n-HCl/0,05 n-LiCl eluiert. Die Fraktion wurde im Vakuum eingeengt, und 100 ml Methanol/Aceton (2:5) wurden zu dem restliehen Konzentrat zugesetzt, wobei das hellgelbe Lithiumsalz des Pyridoxaldenosindiphosphat [PMPyridoxal - 5) - P² - (adenosin - 5') - pyrophosphat] ausfiel. Der erhaltene Niederschlag wurde mit Äther gewaschen und getrocknet, wobei 328 mg Kristalle erhalten wurden.

Analyse für C₁₈H₂₀N₆O₁₂P₂Li₂:

Berechnet:

C 36,76, H 3,43, N 14,29, P 10,53%;

gefunden:

N 14,25, P 10,45%.

Beispiel 4

221 mg eines gut getrockneten 4-Morpholin-N.N'-dicyclohexylcarboxamidinium-adenosin-S'-n-pyridylphosphat-a-pyrtdylesters und 445 mg Tri-n-butylammonium-a-D-glucose-1-phosphat wurden zu 10 ml Tri-n-buiylphosphat zugesetzt. Man ließ das Gemisch einen Tag bei 40⁰C stehen. Nach Zugabe von 10 ml Wasser, die 120 mg Lithiumacetat enthielten, wurde das Gemisch dreimal mit Äther extrahiert. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde durch eine Kolonne von 1,5 χ 10 cm aus einem Ionenaustauscher vom Cl"-Typ gegeben und die Kolonne mit Wasser gewaschen, α-j-Glucose-1-phosphat, AMP und V¹,P² - Di(adenosin - 5^ - diphosphat wurden mit 0,007Sn-HCl eluiert. Anschließend wurde das gewünschte Produkt (ADPG) mit 0,01 n-HCl/0,025 n-LiCl-Lösung eluiert. Die ADPG-Fraktion wurde tnit LiOH neutralisiert, im Vakuum eingeengt, und anschließend wurden 2SmI Methanol und 120 ml Autos dcas Koazeatrat Tugefügt wobei ein Niederschlag erhalten wurde. Der so erhaltene Niederschlag wurde mit Methanol/Aceton gewaschen und getrocknet. Man erhielt 151 mg eines Lithiumsalzes von P'-(Adenosin-5')-P²-(u-D-glucose-l)pyrophosphat (Li₂ADPG -5H₂O).

Analyse für C₁₆H₂₂N₅O₁₅P₂Li₂ · 5H₂O:

Brechnet:

C 27,84, H 4,67, N 10,14, P 8,97%; gefunden:

C 27,78, H 4,63, N 10,10, P 8,90%.

Beispiel 5

213 mg eines gut getrockneten 4-Morpholin-N,N' - dicyclohexylcarboxamidinium - uridin - 5' - phosphat-«-pyridylesters und 445 mg Tri-n-butylammonium-tt-D-glucose-1-phosphat wurden zu 10 ml Triäthylphosphat zugesetzt. Man ließ das so hergestellte Gemisch 2 bis 3 Tage bei 30⁰C stehen, 10 ml Wasser wurden zugesetzt und dreimal mit Äther extrahiert. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde dutch eine Kolonne von 2 χ 10 cm aus DEAE-Cellulose vom Cl "-Typ gegeben und die Kolonne mit Wasser gewaschen. Nachdem UMP mit 0,003n-HCl/0,02n-LiCl eluiert worden war, wurde die UDPG-Fraktion mit 0,003η· HCl/0.06n-LiCl eluiert. Die erhaltene UDPG-Fraktion wurde mit LiOH auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt, im Vakuum zur Trockene eingedampft, in 5 ml Methanol gelöst und dann mit einer gemischter. Lösung aus 35 m! Aceton und 5 ml Äther versetzt, wobei ein weißer Niederschlag erhalten wurde. Der erhaltene Niederschlag wurde in 3 ml Methanol wieder gelöst und mit einer Mischung aus 30 ml Aceton und 5 ml Äther versetzt, wobei ein weiterer Niederschlag erhalten wurde. Der zweite Niederschlag wurde mit Äther gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei 158 mg eines Lithiumsalzcs von P^l-(Uridin-5')-P²-(a-n-glucose-l)-pyrophosphat (Li₂UDPG · 6H₂O) erhalten wurden.

Analyse für C₁₅H₂₂H₂O₁₇P₂ · Li₂ · 6H₂O:

Berechnet:

P 9.00, Phosphor zu Uridin zu Glucose = 2:1:1; gefunden:

P 8,90, Phosphor zu Ui'din zu Glucose = 1.98:1,00:0,97.

Beispiel 6

520 mg Dicyclohexylguanidinium .ytidin-5'-phos phorsäureamid und 150 mg O-Phosphoryl-N-carbo benzoxy-i.-serin wurden zu 50 ml Tt ibenzylphospha gegeoen. Das so hergestellte Gemisch ließ mai einen Tag bei 40⁰C stehen. Nach Zugabe von 50 m Wasser wurde das Reaktionsgemisch dreimal mi jeweils 50 ml Äther extrahiert. Die erhaltene wäßrig Schicht wurde durch eine lonenaustauscher-Kolonn in der HCOO'-Form gegeben, das Haiz mit Wasse und dann mit 31 1 n-HCOOH/O^-m HCOONH gewaschen. Nachdem die UV-Absorption des aus strömenden Gutes verschwunden war, wurden etw 21 2 n-HCOOH/0^-m HCOONH₄ durch die Kc lonne gegeben, um CDP-N-Carbobenzoxy-L-serin ζ eluieren. Die so erhaltene Fraktion wurde durch ein mit 1 g Aktivkohle beschickte Kolonne gegeben, ui das gewünschte Produkt zu adsorbieren, die Kohl wurde mit Wasser gewaschen und mit konzentriertei NH₄OH-H₂O-EtOH (0,5:50:50) eluiert. D₅

Eluat wurde im Vakuum zur Trockene eingeengt. Man erhielt DCP-N-Carbobenzoxy-i.-scrin in einer Ausbeute von 80%, berechnet auf das L-Serin. Zu diesem Produkt wurden 50 ml 30%ige MeOH und 100 mg 10%ige Palladiumkohle zugegeben, und 8 Stuni;n eine katalytische Reduktion durchgeführt. Nach dem Filtrieren wurden 20 ml konzentrierter NH₄OH-H₂O-EtOH (0,5:50:50) zu dem Rückstandskuchen zugegeben, um das gewünschte Produkt zu eluieren. Das Filtrat und Eluat wurden gesammelt und konzentriert. Nachdem die konzentrierte Lösung durch eine 10 ml Kolonne eines Ionenaustauschers vom [HCOO]"-Typ geleitet worden war, wurde das Harz mit Wasser gewaschen und dann mit 0,1 n-HCOOH (etwa 100 ml) eluiert. Die das CDP-L-Serin enthaltende Fraktion wurde gesammelt, an 1 g Aktivkohle adsorbiert, mit Wasser gewaschen und dann mit 100 ml konzentriertem NH₄OH-H₂O-EtOH (0,5:50:50) eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum konzentriert und mit 100 mg Bariumacetat-Monohydrat versetzt. Nachdem das Bariumacetat gelöst war, wurde Äthanol zugegeben, wobei etwa 200 mg Bariumsalz des CDP-i.-Serins (C₁₂H₁₈O₃N₄P₂Ba · C₂H₅OH · H₂O) ausgefällt wurden. *5 Analyse Tür C₁₂H₁₈O₁₃N₄P₂Ba · C₂H₅OH · H₂O:

Bei echnet:

CM,42. H3_:8L N 8.13. P 8.99%;
gefunden: C 24,95. H 4,20, N 7,95, P 8,74%.

[„]'„' +T (C = 1,0; H₂O).

Beispiel 7

0,5 g Dicyclohexylguanidinium - 2' - desoxycytidin-5'-phosphorsäurcamid und 150 mg O-Phosphoryl-N-carbobenzoxy-i.-serin wurden zu 50 ml Triäthylphosphat gegeben, das Gemisch 1 bis 2 Tage bei 40⁰C stehengelassen, und dann wie im Beispiel 7 beschrieben behandelt, wobei sich eine Ausbeute von 150 mg Bariumsalz des 2'-Desoxycytidin-5'-diphosphat - ι - serin (DCDP - ι. - Serin) (12 Äthanol -5H₂O) ergab.

Analyse Wr C_nH₁₈O₁₂N₄P₂Ba · 1 2C₂H₅OH · 5H₂O:

Berechnet ... N 7,76, P 8,57%;

gefunden .... N 7,89, P 8,45%. so

[«]? +9° (C = 1,0; H₂O).

Beispiel 8

ss

117 g (0,1 mMol) Di - (4 - morpholin - N.N' - dicyclohexylcarboxamidinium) - salz des P¹ - (Guanosin - 50 - P² - (4 - morpholin) - pyrophosphat (GDP-Morp'.iolidat) (4 Moleküle Kristallwasser) wurden fto durch eine azeotrope Destillation im Vakuum dehydratisiert Die azeotrope Vakuumdestillation wurde dreimal unter Verwendung von Pyridin und zweimal unter Verwendung von wasserfreiem Benzol durchgeführt Getrennt wurden 293 mg (0,4 mMol) Tributylammoniumguanosin-S'-phosphat unter Verwendung des gleichen Dehydratisierungsverfahrens getrocknet

Die beiden getrockneten Verbindungen wurden zu 20 ml Triäthylphosphat gegeben und einige Tage bei Raumtemperatur (etwa 25° C) stehengelassen. Nach Zugabe von 25 ml Wasser wurde das Gemisch in eine Kolonne von 2 χ 35 cm mit DEAE-Cellulose vom HCO₃~-Typ gegeben, gründlich mit Wasser gewaschen und dann nach einer Lineargradient-Methode unter Anwendung von 3,5 1 Triäthylammoniumhydrogcncarbonat (0,005 bis 0,5 Mol) eluiert Es wurden Fraktionen, die GDP-Morpholidat und GMP als erste Spitze, GDP als die zweite Spitze und GP₃G als die dritte Spitze enthielten, erhalten; Ausbeute 82%.

Die dritte Fraktion wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft. 25 ml Methanol wurden zu dem Rückstand zugegeben und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Die Eindampfung wurde viermal durchgeführt. Schließlich wurde das so erhaltene Produkt in 5 ml Methanol gelöst und mit einer Acetonlösung. die 1 Mol Natriumiodid in einer Menge 2fach äquivalent zu den phosphorhaltigen Resten enthielt, vermischt. Es wurden weitere 25 ml Aceton zu dem Gemisch gegeben und der erhaltene weiße Niederschlag mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei das Natriumsalz des P\P³-Di-(guanosin-5')-triphosphats erhalten wurde. Das Produkt zeigte einen einzelnen Fleck mit einem R_rWert von 0,32 bei der Papierchromatographie unter Verwendung von Isobuttersäure - 1 Mol Ammoniumhydroxyd — 0,1 Mol Tetranatriumäthyiendiaminieiraessigsäure (100:60:1.6).

Beispiel 9

830 mg Bis-(tri-n-octy!ammonium)-D-mannose-(i-l-phosphat und 320 mg 4-Morpholin-N,N'-dii/clohexylcarboxyamidiniumguanosin - 5' - phosphorsäuremorpholid wurden zu 25 ml Tri-o-cresylphosphat zugesetzt und die Reaktion 3 bis 4 Tage bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem das Reaktionsgemisch wie im Beispiel 2 behandelt worden war, wurde die erhaltene wäßrige Schicht durch eine Kolonne von 3 χ 30 cm mit DEAE-Cellulosc vom HCO₃-Tyρ gegeben, die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und dann nach einer Lineargradient-Mcthode unter Anwendung von 3 1 0.005-m Triäthylammoniumhydrogencarbonat vom pH-Wert 7.5 und 3 1 0,15-rn Triäthylammoniumhydrogencarbonat vom pH-Wert 7,5 eluiert. Die erhaltene Hauptfrakiion wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft und in 10 ml Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Eindampfungsvorgang wurde nochmals wiederholt. Nachdem der Rückstand in einer geringen Menge Wasser gelöst worden war, wurde die Lösung an einer Kolonne von 2 χ 15 cm mit einem Ionenaustauscher vom Cr-Typ adsorbiert und nach einer Lineargradient-Methode unter Anwendung von 3 1 0.003n-HCl und 31 einer 0,003 n-HCl/0,1 Sn-LiCl-Lösung eluierl. Die gewünschte Fraktion wurde auf einen pH-Wert von etwa 5,0 mit LiOH eingestellt und im Vakuum zur Trockene eingedampft.

Das Rückstandsprodukt wurde in einer geringen Menge Wasser gelöst und Methanol/Aceton zu der Lösung zugegeben, wobei ein Niederschlag erhalten wurde. Der Niederschlag wurde mit Äther gewaschen und dann getrocknet, und man erhitr-h 231 mg ein«

Lithiumsalzes des P^l-(Guanosin-5')-P²-(«-D-mannose-l)-pyrophosphats (Li₂GDPM -6H₂O).

Analyse für C₁₆H₂₃N₅O₁₆P₂Li₂ · 6H₂O:

Berechnet"

P 8,50, P zu Guanosin zu Mannose = 2:1:1;
gefunden:

P 8,01, P zu Guanosin zu Mannose

= 1,89:1,0:1,01.

Beispiel 10

221 mg (0,2mMol) Bis-(4-morpholin-N,N'-dicyclohexylcarboxamidinium) - adenosin - 2',3' - cyclophosphat-5'-phosphorsäuremorpholid wurden durch azeotrope Destillation im Vakuum mit wasserfreiem Pyridin durch azeotrope Destillation im Vakuum unter Anwendung von wasserfreiem Benzol stark dehydratisiert. Gesondert wurden 368 mg (0,6 mMol) des Bariumsalzes des ( + }-Pantethein-4'-phosphats · (6H₂O) durch ein lonenaustauschverfahren unter Anwendung eines Ionenaustauschers vom H*-Typ entsalzt, mit 1,2 mMol Tri-n-butylamin versetzt und dann azeotrop mit wasserfreiem Pyridin und Benzol dehydratisiert. Beide auf die vorstehende Weise hergestellten Verbindungen wurden in 10 ml Triäthylphosphat gelöst. Man ließ die Lösung einen Tag bei Raumtemperatur (etwa 25°C) stehen und engte anschließend die Lösung im Vakuum ein. Nach Zusatz von 10 ml Wasser wurde die Lösung dreimal jeweils mit 10 ml Äther extrahiert, die erhaltene wäßrige Schicht im Vakuum zur Trockene eingedampft. Nachdem der so getrocknete Rückstand in 10 ml 0.1 n-HCl gelöst war. ließ man die Lösung etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft, 5 ml Methanol zu dem Rückstand gegeben und das Gemisch wiederum im Vakuum zur Trockene eingedampft. Nach zweimaliger Wiederholung dieses Verfahrens wurde der Rückstand in 3 ml Wasser gelöst, die Lösung mit NH₄OH auf einen pH-Wert von etwa 6,0 eingestellt, und es wurden 4 ml 2-Mercaptoäthanol zu der Lösung zugegeben. Man Heß das Gemisch über Nacht stehen. Das Gemisch wurde mit etwa 50 ml Wasser verdünnt und durch eine Kolonne von 2 χ 30 cm mit DEAE-Cellulose vom Cl -Typ gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurde eine Lineargradientenelution durchgerührt unter Anwendung von 1,51 0,003 n-HCl und 1,51 0,0OSn-HClAlSn-LiCl.

Die die dritte Spitze aufweisende Fraktion (enthaltend CoA und Iso-CoA; Ausbeute etwa 80%) wurde gesammelt, auf einen pH-Wert von etwa 4,5 mit LiOH eingestellt und anschließend im Vakuum zur Trockene eingedampft. 5 ml Methanol und 50 ml Aceton wurden zu dem Rückstand gegeben und das

ίο Gemisch gut gerührt. Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt und wieder mit Methanol/Aceton behandelt. Das Auswaschen mit Methanol/Aceton wurde wiederholt, bis keine Cl-Ionen mehr in der überstehenden Flüssigkeit festgestellt wurden. Der Niederschlag wurde getrocknet. Er wurde dann in 50%igem wäßrigem 2-Mercaptoäthanol gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde durch eine Kolonne von 3,5 χ 50 cm mit Ionenaustauscher-Cellulose vom Cl "-Typ gegeben. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und dann nach einer Lineargradient-Methode unter Anwendung von 2,5 1 0,03 n-LiCl/0,003 n-HCl und O.lOn-LiCl/O.OOSn-HCl eluiert. Die Spitze A (Iso-CoA) und Spitze B (CoA) wurden getrennt auf einen pH-Wert von etwa 4,5 mit LiOH eingestellt und beide Fraktionen getrennt mit Methanol/Aceton versetzt, wobei sich ein Niederschlag bildete. Auf diese Weise wurden 39 mg eines Lithiumsalzes des CoA-(Coenzym A) bzw. 35 mg eines Lithiumsalzes des Iso-CoA erhalten. Das Verhältnis von Phosphor zu Adenosin betrug 2,97.

Analyse fur C₂₁H₃₃N₇Oj₆P₃SLi₃ · 6H₂O:

Berechnet:
C 28,84, H 5,08, N 10,98%;

gefunden (nach Trocknung bei 100° C):
C 28,54, H 4,98, N 9.85%.

Vergleichsversuche:

7um Nachweis der technischen Überlegenheit de:

erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den be kannten Verfahren wurden Vergleichsversuche durch geführt, deren wesentliche Daten und Ergebnisse ir der folgenden Tabelle zusammengefaßt sind.

Verfahren	Produkt	Ausgangsmateria]	Verwendetes Lösungsmittel	Reaktions temperatur	Reaktions zeit	Ausbeute
Beispiel 1	FADLi2	N,N'-Dicyclo-	Tri-n-propyl-	Raum	4 Tage	51,0%
		hexylcarb-	phosphat	temperatur		(Isolierung)
		oxamidium-
		adenosin-
		5'-phosphor-
		säureamid
Literatur 1	FADLi2	desgl.	o-Chlor-	Raum	4 Tage	40,0%
			phenolpyridin	temperatur		(Isolierung]
Beispiel 2	PMPredniso-	Piednisolon-	Tricyclohexyl-	60cC	5 bis 10 Std.	90,8%
	lon-21).	2i-phosphor-	phosphat			(Isolierung)
	P2-(Adenosin-5')-	säuremorpholid
	pyrophosphat
Literatur 2	desgl.	desgl.	Pyridin	6O0C	16StA	30,0%
						(Isolierung]

	13	1 9	18 282	Ausgangsmalcriul	Verwendetes Lösungsmittel	Rcaktions- lcmpcratur	14	Ausbeute
				Dicyclohexyl-	Tribenzoyl-	40° C		80% (Reak
	Produkt	Fortsetzung	guanidinium-	phosphat		Rcaktions- j zeit	tionsausbeute)
Verfahren	CDP-N-Carbo-	cytidin-5'-phos-			1 Tag
Beispiel 6	benzoxy-L-serin	phorsäureamid
		desgl.	o-Chlorphenol	37° C		19% (Reak
						tionsausbeule)
	desgl.	Dicyclohexyl-	Triäthylphos-	40° C	10 Tage	27,6%
Literatur 3		guanidinium-	phat			(Isolierung)
	d-CDP-L-serin	2'-desoxycytidin-			1 bis 2 Tage
Beispiel 7		5'-phosphor-
		säurcamid
		desgl.	o-Chlorphenol	37CC		4,3% (Isolierung)
		GDP-Morpho-	Triäthylphos-	Raum		82%
	deagl.	Hd	phat	temperatur	10 Tage	(Isolierung)
Literatur 3	GP3G	GDP-Morpho-	DMSO	Raum	mehrere	23%
Beispiel 8		Hd		temperatur	Tage	(Isolierung)
	GP3G	4-Morpholin-	Tri-o-cresyl-	Raum	4 Tage	69,1%
Literatur 4		N,N'-dicyclo- hexylcarbox- amidinium-	phosphat	temperatur		(Isolierung)
	GDPM	guanosin-			3 bis 4 Tage
Beispiel 9		5'-phosphor-
		morphoiid
		desgl.
			Pyridin	Raum		63,0%
		Bis-(4-morpho-		temperatur		(Isolierung)
	GDPM	lin-N,N'-di-	Triäthyl-	Raum	4 Tage	80,0% (Reak
Literatur 5		cyclohexyl-	phosphat	temperatur		tionsausbeute)
	CoA & Iso-CoA	carboxamidi-			I Tag
Beispiel 10		nium)-adeno-
		sin-2',
		3'-cyclisches
		Phosphat-
		5'-phosphor-
		morpholid
		desgl.
		Pyridin	Raum-		55,4% (Reak-
	CoA & Iso-CoA		15Std.
Literatur 5

temperatur

tionsausbeute]

Literatur 1: H. G. K h ο r a η a et al: »J. Am. Chcm. Soc.« 80. 3756 (1958). Literatur 2: A. L. Nussbaum et al: »Tetrahedron« 20, 2467 (19M). Literatur 3: Y. F u r u k a w a et al: »Chem. Pharm. Bull-Japan« 13, 16 (1965). Literatur 4: S. G. M ο f fa 11 et al: »J. Am. Chem. Soc« 88, 838 11966). Literatur 5: H. G. K h ο r a n a el al: »J. Am. Chem. Sot« 83, 659 (1961).

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Diestern kondensierter Phosphorsäuren der allgemeinen Formel

Il

R — O —ΡΟΗ

o—p —o

OH

P—O —R"

/ »i -r /t

OH

(D

in der R und R' organische Reste mit einer Alkyl-. Cycloalkyl- oder Arylgruppe, einen Zuckerrest einschließlich Nucleosiden oder Mono- oder Oligosacchariden vom Imidazol-, Flavin-, Pyridin-, Pyrimidin- oder Purintyp, einen Aminosäurerest, einen Vitaminrest oder einen Steroid rest und m und η die ganzen Zahlen O, 1, 2, 3 bedeuten, durch Umsetzung eines Monoesters oder Monoestersalzes eines Mono- oder Oligophosphorsäureamids der allgemeinen Formel

Β— Ρ

il

Ο— P-I
OH

Ο —R (11)

/η

in der R und η die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und B eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe oder eine cyclische organische Base bedeutet, oder eines Diesters oder Diestersalzes einer Mono- oder Oligophosphorsäure der allgemeinen Formel

Il

R' —Ο —Ρ

OH

-O— P —

OH

O —R

(111)

45

in der R und η die oben angegebene Bedeutung besitzen und R' einen a-, ß- oder y-Pyridylrest bedeutet, mit einem Monoester oder Monoestersalz der Mono- oder Oligophosphorsäure der allgemeinen Formel

Il

HO—P OH

Il

Ο —ΡΟΗ ;

O —R" (IV)

in der R" und »1 die oben angegebene Bedeutung <\s besitzen, in Gegenwart eines oder mehrerer organischer Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungs- mittel einen oder mehrere Phosphorsäuretriester der allgemeinen Formel verwendet

R₁-O-P-O-R₂

in der R₁, R₂ und R₃ Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylreste bedeuten, und die Umsetzung bei einer Temperatur von O bis 70" C durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, ι ß man als Phosphorsäuretriester Trin-propylp >sphat, Tricyclohexylphosphat, Trimethylphosphat. Tri-n-butylphosphat, Ί näthylphosphat. Tribenzylphosphat oder Tri-o-cresylphosphat verwendet.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Diestern kondensierter Phosphorsauren der allgemeinen Formel

R—O—ΡΟΗ

Il ο—ρ- ο

OH

Ii

-Ρ —Ο —R"

/ ni + η

OH

in der R und R" organische Reste mit einer Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylgruppe, einen Zuckerrest einschließlich Nucleosiden oder Mono- oder Oligosacchariden vom Imidazol-, Flavin-, Pyridin-, Pyrimidin- oder Purintyp, einen Aminosäurerest, einen Vitaminrest oder einen Steroidrest und m und η die ganzen Zahlen O, 1, 2 und 3 bedeuten, durch Umsetzung eines Monoesters oder Monoestersalzes eines Mono- oder Oligophosphorsäureamids der allgemeinen Formel

B — P —

OH

Ο —Ρ

ΟΗ

Ο —R

in der R und 11 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und B eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe oder eine cyclische organische Base bedeutet, oder eines Diesters oder Diestersalzes einer Mono- oder Oligophosphorsäure der allgemeinen Formel

R' — O

Il
-p —

OH

11 ο —ρ —

OH

Ο —R (ΠΙ)

in der R und /1 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und R' einen «-, /i- oder y-Pyridylrest bedeutet,