DE1470320A1 - Verfahren zum enzymatischen Abbau von Nucleinsaeuren - Google Patents

Description

Mountain View Avenue, .Orangeburg, New York (Y.St.A.)

Verfahren zum enzymatischen Abbau von Nucleinsäuren

Die Erfindung "betrifft den Abbau von Nucleinsäuren unter Verwendung von Enzymen und die Herstellung der entsprechenden Hydrolysenprodukte, die als 5'-Nucleotide bezeichnet werden, sowie die G-ewinnung der enzymhalt ig en ^ Mittel und deren Verwendung. Obwohl das erfindungsgemässe ' Verfahren mit jeglichen Nucleinsäuren, wie Eibonucleinsäure und Desoxyribonucleinsäure durchgeführt werden kann, wird es nachstehend im einzelnen mit Bezug auf Bibonuoleinsäure beschrieben.

In der nachstehenden Besohreibung ist Eibonuoleinsäure mit "ENS" abgekürzt. Der Ausdruok "ENS-Derivate" bezieht sich auf Eibonuoleoside und Eibonuoleotide sowie Verbindungen, die Derivate oder Homologe dieser Spaltprodukte von ENS sind. Ein Eibonuoleosid ist ein N-Glukosid einer heterocyclischen Base, im allgemeinen ein Pyrimidin oder Purin. Ein Eibonucleotid ist ein Phosphorsäureester eines Eibonuoleosids und kann Eibonuoleosidmonophosphat " oder ein Eibonucleosidpolyphosphat sein.

ENS ist ein Polymermolekül, das weitverbreitet in der Natur vorkommt, und zwar häufig in Form von langen Xetten mit Molekulargewichten bis zu 10 bis 10 . Man ist z.Z. der Ansicht, dass BNS-Polymere (die sioh in erster Linie im Zytoplasma der Zellen befinden) in versohiede- nen. Polymerisationsgraden im Zusammenhang mit der Synthese spezieller Proteine stehen, die von den Zellen benötigt werden.
Monomere Nucleotide von ENS finden sioh in den

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Zellen insbesondere in Kombination mit vielen B-Vitaminen ind ftangieren in dieser Form als Coenzyme, die bestimmte Reaktionen fördern, die für die normale Punktion des" Organismus notwendig sind.

Die Polymerstruktur von Ribonucleinsäure und die Beziehung des Polymeren zu den verschiedenen möglichen Spaltprodukten kann schematisch wie folgt dargestellt werden:

t	I C
'. I

R ist hierbei in der Natur meistens eine Purin- oder Pyrimidinbase und kann im übrigen Adenin, Guanin, Uracil oder Cytosin sein. Die senkrechte ausgezogene Linie bedeutet einen Cp.-Zucker in Pyranosekonfiguration (d-Ribose), und die Zahlen 3¹ und 5¹ stellen jeweils das dritte bzw. fünfte C-Atom dieses Zuckers dar. P ist eine Phosphatesterbrücke, die benachbarte Monomere durch eine Bindung zwischen den 5¹- und 5'-Kohlenstoffatomen verbindet.

Das schematisch dargestellte Polymere kann nach vielen Methoden mit den verschiedensten Enzymen, die aus dem Gewebe von Säugetieren, Schlangengift und anderen lebenden Zellen, wie Mikroorganismen, mit äußerst hohen Kosten isoliert werden, abgebaut werden. Es^Tfird angenommen, daß der Prozeß gewöhnlich stufenweise in bestimmten verschiedenen Abschnitten vonstatten geht. Bei der obigen Darstellung wird das Enzym, dessen Aktivität für die Verringerung der Größe von N (Verkürzung der Kettenlänge) verantwortlich ist, als Nuclease oder Depolymerase bezeichnet. Ist diese Verkürzung einmal erfolgt, können die

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Phosphafbrücken spezifisch entweder an den durch die gestrichelten linien angedeuteten Punkten oder an den Wellenlinien angegriffen werden. Bnersteren Fall sind Monomereinheiten mit Phosphorsäureestern, die an die 5•-Stellung gebunden sind (5'-Nucleotide^ das einzige Produkt, während im letzteren Fall 3'-Nucleotide entstehen Das in dieser spezifischen Yfeise wirksame !Ferment wird allgemein als "Phosphodiesterase" bezeichnet« Es gibt für jeden Angriffspunkt ein spezifisches Enzym. Die Nucleotide können anschließend durch Abspaltung von Phosphat (durch 3*- oder 5'—Phosphomonoesterase) und durch weitere Abspaltung der Base (H) -vom Zucker weiter abgebaut werden« ^ Enzyme, die diese Hydrolyse katalysieren, werden Buoleosi- ™ dasen genannt. Schließlich gibt es auch eine Enzymwirkung in einigen Zellextrakten, durch die dre NK^-Äadikale aus Basen, die sie enthalten, entfernt werden., Diese Enzyme werden als Desaminasen bezeichnet«

Viele der vorstehend genannten Spaltprodukte sind auf Grund ihrer Bedeutung in Forschungsarbeiten auf dem Gebiet der Chemie und Eigenschaften von BUS wichtige Handelsprodukte geworden« Sie werden ferner in pharmazeutischen Präparaten verwendet. Außerdem haben die 5 *-Ribonucleotide (insbesondere Inosin-5'-monophosphat (IMP) und Guanosin-5«--monophosphat (GICP)) als Mittel zur Steigerung des Geschmacks von Nahrungsmitteln Bedeutung ™ erlangt.

Gegenstand der Erfindung ist ein einfaches, wirtschaftliches und schnelles Verfahren zur Herstellung von enzymhaltigen Stoffen, die BK_S zu hydrolysieren vermögen, wobei hohe Ausbeuten an Ribonuoleotiden erhalten werden. Ein λ^;^reiterer Erfindungsgegenstand ist die Verwendung der gemäß der Erfindung hergestellten enzymli .ltigen Stoffe in einem einfachen, wirtschaftlichen und schnellen Verfahren zur Hydrolyse von HITS., wobei RibonucIJ&tide in hohen Ausbeuten erhalten werden.

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Gemäß der Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß die schnell sprossenden Teile,(d.h. die Wurzel und Stengel) von keimenden Saaten eine besonders reiche Quelle von Enzymen darstellen, die RNS zu spalten vermögen. Es wurde ferner gefunden, daß diese Enzyme in einfacher und wirksamer Weise für diese Spaltung von ENS, insbesondere für die Herstellung von 5'-Nuoleotiden, ausgenutzt werden können.

Der Bnaymgehalt ist in den Sprossenden Wurzeln am höchsten, ι in den Stengeln geringer, afcfer nooh in brauchbarer Höhe, während der Sameft ode? die Kerne .eelbst keine technisch φ interessanten lnzymmea|en enthalten. Eeioh an Enzymen sind die sprossenden Jpeile von Samen allgem*;Ln und der Samen von einkeimblävlrigen Pflanzen im besonderen. Bevorzugt werden Samen, die eich mälzen lassen, wie Hafer, Gerste, Weizen, Mais, Roggen, Hirse, Sorghum und Eeis sowie viele Arten von Grassamen, .Sonnenblumenkerne, Erbsen und Bohnen,

Da gewisse Saaten, wie Gerste, in geringerem Umfange aber auch Weizen und Reis| allgemein großtechnisch in großen Mengen zur Herstellung von Malz gekeimt werden und die Wurzeln allgemein als Nebenprodukt zu niedrigem Preis verfügbar sind, werden die letzteren für die Zwecke der fc Erfindung besonders bevorzugt und machen die Erfindung vom wirtschaftlichen Gesichtspunkt besonders interessant und vorteilhaft.

In einigen Ländern werden Bohnen zur Erzeugung von Bohnensprößlingen angebaut, wobei die Wurzeln zu niedrigem Preis und in großen Mengen für die Zwecke der Erfindung anfallen. ·

Es wurde festgestellt, daß die Enzymwirkung wenig oder nicht geringer wird, wenn die Wurzeln oder Blattkeime getrocknet werden, auch wenn dies bei verhältnismäßig hoher Temperatur erfolgt, wie es allgemeinen beim Darren

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BAD ORIGINAL

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von Malz der Fall ist. Außerdem behalten die Wurzeln ihre Wirksamkeit für eine Reihe von Jahren, ohne daß besondere Vorsichtsmaßnahmen bei der Lagerung getroffen werden*

Wie bereits erwähnt, werden getrocknete Würzelkeime von Gerstenmalz aus wirtschaftlichen Erwägungen und wegen der leuchten Verfügbarkeit bevorzugt, jedoch können alle leioht erhältlichen Wurzeln bzw. Wurzelkeime, z.B, diejenigen von Weizenmalz, Heismalz oder Roggenmalz oder von Bohnen-Schößlingen, sowie die Wurzeln der oben genannten Samen verwendet werden.

Gemäß der Erfindung werden die unzerkleinerten, sohnell ^ sprossenden Teile von keimenden Saaten zunächst einer Behandlung unterworfen, bei der ein enzymatisohes Medium erhalten wird, das RMS unter BrzJeLung der gewünschten hohen Ausbeuten an Nucleotiden zu hydrolysieren vermag. Die normalerweise trockenen Samenteile werden zuerst entweder in Wasser,eingeweicht und dann mit einer weiteren Wassermenge gewasohen oder einer Vielzahl von Wäschen mit Wasser unterworfen. Wenn die Samenteile zuerst eingeweicht und dann gewaschen werden, beträgt die Einweiohdauer etwa 30-90 Minuten, um die Samenteile zu konditionieren und zu hydratisieren« Die eingeweichten Samenteil· werden ansohließend zur Entfernung von Bakterien mit M

Wasser gewaschen. Die Wasohbehandlung ist besonders wichtig, wenn es sich bei den Samenteilen um gemälzte Wurzeln handelt, da diese Wurzeln aus dem Mäl«prozess Bakterien enthalten, die, wenn sie nicht entfernt werden, zur BiI-_ dung von Enzymen führen, die die 5.·.-Nucleotide zerstören» Die Y/äaohe kann kontinuierlich unter kontinuierlicher Entfernung des Wasohwassere-oder wiederholt ohargenweise erfolgen, wobei das gebrauchte Wasohwasser naoh jeder Wäsche entfernt wird. Das zum Einweichen der Samenteile und/oder zum Wasohen verwendete Wasser darf nicht extrem "hart" sein, d.h. mehr als etwa 1000 Teile Mineralstoffe pro Million Teile enthalten. Wenn die natürlichen Wasser-

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fässer

quellen nur »hartes» liefern, sollte die abschließende - \~ Wäsche der Samenteile vorzugsweise mit "weichem" Wasser vorgenommen werden.

Wie bereits erwähnt, kann das Einweichen ausgeschaltet werden, wenn die Wasohdauer genügend lang ist, um die gewünschte Hydratisierung und konditionierende Wirkung zu erzielen,, TJm die Entfernung oder Vernichtung schädlicher Bakterien zu unterstützen, können geringe Mengen eines geeigneten Bakterizide dem Wasohwaseer während > einer oder mehrerer Wäschen zugesetzt werden.

ft ■ ■ '*

ψ< ' Fach ausreichendem Waschen wird zusätzliches Wasser mit den gewaschenen Samenteilen im bevorzugten Verhältnis von etwa j - 15 Gew.-Teilen pro G-ewiohtsteil feststoff (Samenteile) gemischt. Wenn es sich bei den Samenteilen um die beim Mälzen gebildeten Keimlinge handelt, beträgt das Verhältnis von Wasser zu [Feststoff vorzugsweise etwa iO:t»

Die Suspension aus Wasser und Samenteilen wird anschließend einer verhältnismäßig kurzen Wä>rmebehandlung unterworfen (etwa 0,7-7 Minuten, vorzugsweise 2-5 Minuten),

Ϊ während der die Suspension bewegt wird_e Zur Durchführung dieser Behandlung kann Wasserdampf in genügender Menge

P so lange unmittelbar in die Suspension eingeleitet werden, daß deren Temperatur schnell auf 70-85⁰G, vorzugsweise auf 70-75⁰O gebracht und bei diesem Wert gehalten wird. Optimale Ergebnisse werden bei etwa 72⁰O erreicht. Vor der Heizperiode werden der Suspension unter Rühren Biosphatasedeaktivatoren oder -inhibitoren zugesetzt» Geeignete Deaktivatoren sind Metallionen (Zink), vorzugsweise ZnAc₂·Η₂0 als Deaktivator von 5»-Eibonuoleotidase und Borationen (z.B. -H^BO·,)» die als Deaktivator der allgemeinen Phosphatasen wirkeam sind. Es wird angenommen, daß während der Wärmebehandlung duroh die Einwirkung der Temperatur und des Deaktivators auf die Suspension von

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Wasser und Sament eilende ine Zerstörung der Phoephatase- und lionoesteraaeenzyme und anderer Enzyme mit Ausnahme der Ribonuelease und Phosphodiesterase, die für die anschließende Hydrolyse von RNSL' zu 5*-Ribonuoleotiden wesentlich sind, stattfindet. Zur Erzielung optimaler Ergebnisse wird nach dem Erreichen der bevorzugten !temperatur von 7O-75°G das Erhitzen etwa 5 Minuten fortgesetzt, wobei die erhitzte Suspension während der gesamten Zeit bewegt wird·

Enzymatisohe Medien, die in der besohrie'benen Weise hergestellt werden, haben eine große Wirkungsbreite in Bezug auf die Ribonucleinsäure, aber nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Wirkung so gesteuert werden, daß eine überraschend hohe Ausbeute an 5'-Nucleotiden durch Hydrolyse dieser Säure mit diesen Medien in verhältnismäßig kurzer Zeit erhalten wird· So ist es gemäß der Erfindung möglich, 5^Nucleotide selektiv aus EHS durch Umsetzung einer Aufschlußlösung aus HETS und Enzymmaterial zu erhalten, die etwa 1,5-515 Stunden auf etwa 60-7O⁰O erhitzt wird«, Der Anfangs-p_H-Wert der RNS-Lösung kann bis zu 8,5 betragen_fund während der Hydrolyse läßt man den Pjj-Wert der Behandlungslösung vorzugsweise nicht unter .etwa 5,2 sinken«

E3 ist wichtig, daß die Samenteile während der Wärmebehandlung und während der anschließenden Hydrolyse der RNS in Form getrennter Einzelteil ehe η vorliegen«, Viele unerwartete und überraschende Vorteile werden während der Hydrolyse der Ribonucleinsäure durch Verwendung eines wärmebehandelten Enzymmediums erzielt, das aus Wasser und den schnell sprossenden Teilen von keimenden Saaten besteht, worin die Saaenteile nicht zerkleinert sind und in Form von getrennten Einzelteilchen im Medium bleiben» Verbesserte Verhältnisse von enzymatischem Medium zur RNS-Lösung sind möglich, und ganz erheblich kürzere Hydrolysezeiten sind erforderlich. Die Abtrennung der

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Feststoffe ist bedeutend vereinfacht, und weniger nichtenzymatisohe Verunreinigungen gelangen durch Extraktion in das Hydrolysatgemisch. Im allgemeinen ist eine G-esamtverarbeitung des enzymatischen Mediums und des Hydrolysatgemisches möglich,, wobei außergewöhnlich hohe Ausbeuten an 5*-Mononuoleotiden in der hydrolysieren Lösung erzielt werden.

Gemäß der Erfindung wird eine Ribonuoleinsäurelösung zusammen mit dem enzymatisohen Medium -(das die Samenteile enthält) aus der Wärmebehandlungsstufe in eine Hydaiysenstufe eingeführt, wobei eine Spalt- oder Hydrolyselösung gebildet wird, die die suspendierten Samenteile enthält. Die Fueleinsäurelösung kann beispielsweise aus RHS, Wasser und einer geeigneten Menge eines alkalischen Materials zur Einstellung des Ρτ,-Wertes dieser lösung auf den bevorzugten alkalischen Bereich bestehen. Zur Einstellung des PjT-Wertes eignen sich alle bekannten älkalisohen Materialien, z,B. Ammoniumhydroxyd und Ammoniumcarbonat, Uatriumhydroxyd, Iris(hydroxymethyl)-aminomethan und mit Wasser mischbare-primäre, sekundäre und tertiäre Amine.

Es wurde ferner gefunden, daß durch die Anwesenheit von Zinkionen in der Spalt- oder Hydrolyselösung (dem enzymatischen Medium zugesetzt und in die Abbaulösung überführt) die Enzymwirkung beschleunigt wird, und daß Zinkionen in einer Konzentration von etwa 0,001 - O_fOt Mol in der Behandlungslösung die G-esohwindigkeit der Hydrolyse steigern. Durch Zusatz anderer Ionen, wie Oaloium, Kupfer oder Eisen,wird jedoch die HydadLyse der Nuolein-

geheurt.
eäure^/nrenn das in der beschriebenen Weise aua Keimwurzeln von Malz erhaltene enzymhaltige Material verwendet wird. Bei Verwendung eines enzymhaltigen Mediums (einschließlich der Samenteile) der vorstehend beschriebenen Art und einer wässrigen RFS-Lösung mit einer MS-Konzentratlon bis zu 4-10 i» kann die Abbau- oder Hydrolyselösung (eneymhaltiges

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Medium einschließlich der Samenteile + EFS-lösung einschließlich des Mittels zur ^-Einstellung) etwa 2-4$ EHS "behalten, wobei das Verhältnis des enzymhaltigen Mediums: zur BIS-Lösung etwa 1x1 bis etwa 3:1 beträgt» Die endgültige Spaltlösung, deren p„-Wert (falls erforderlich) periodisch so korrigiert werden kann, daß er im Bereich von 5,2 - 8,5 bleibt, wird zur Erzielung eines maximalen Umsatzes der RiTS in 5^I-Ribonuoleotide etwa 1»5 - 5,5 Stunden auf etwa 60-7O⁰O (vorzugsweise 63-67⁰G) erhitzte

lach Beendigung der Hydrolyse muß die Enzymreaktion schnell abgebrochen werden» Dies kann dadurch erreicht ^j werden, daß man die Hyda&ysenlösung etwa 10-20 Minuten auf 8O⁰G oder darüber erhitzt oder sie schnell auf etwa 35⁰G kühlt und auf etwa Ρττ 3»5 ansäuert« Anschließend werden die Produkte der Eydrolyse und das aufgebrauchte enzymhaltige Medium, das die aufgebrauchten Samenteile enthält, in eine getrennte Stufe eingeführt, in der die Samenteile entfernt werden, wobei eine endgültige Enzymspaltlöaung gebildet wird, die auf die nachstehend beschriebene Weise behandelt wird·

Beispiel 1 A, Vorbereitung der Samenteile. g

66,6 kg getrocknete Malzkeimwurzeln (Hannohen von National ' Malt Go.) wurden in 800 1 Wasser suspendiert und 20 Minuten gerührt. Die obenstehende. [flüssigkeit wurde vom Boden. ·^! des Wasch— und Mischbehälters abgezogen und verworfen· Frisches Wasser in einer Menge von 830 1 wurde in den Wasch*, und Mischbehälter gegeben.- Das G-emisoh. wurde weiten j 20 Minuten gerührt und die WäsoJiflüssigkeit erneut vom J Behälter abgezogen und verworfen· Anschließend wurden noch .| 3 weitere Wäschen von gleicher Dauer unter Verwendung von praktisch gleichen Wassermengen durchgeführt, ι

9 0 δ 8 ϊ%/13 2 0

Bo Vorbehandlung der Samenteile.

Nach der fünften Fäsche wurden die sauberen nassen Wurzelkeime mit 830 1 Frischwasser gemischt. Zur selektiven Unterdrückung der Enzymaktivität wurden dem Gemisch 210 g ΖηΑθ2»Η₂0 und 666 g EUBOo zugesetzt. Das Gemisch aus Wasser und Wurzelkeimen wurde dann unter Rühren mit Frischdampf schnell auf 72⁰G erhitzt und 5 Minuten bei 71,3-72,3⁰O gehalten,

O. Hydrolyse der BN3

150 1 RNS-Iösung (30 kg handelsübliche RFS und 500 g NaP) mit einem p^Wert von 7,0 - 7,1 (eingestellt mit NaOH) und einer Temperatur von 15-2O⁰C wurde».schnell zu der vorbehandelten Suspension von Wasser und Samentpilen gegeben. Das Gesamtgemisch wurde gerührt und die Temperatur auf etwa 65⁰G eingestellt. Anschließend wurde das Gemisch 2 Stunden unter Rühren bei einer Temperatur zwischen 64,5 und 65,5⁰C gehabten«, Die Analyse der Hydrolysenlösung zeigte, daß die Nuoleinsäure zu 95$ gespalten war und daß 9O?6 5 »-Nucleotide anwesend waren· Die Hydrolyse wurde durch Senkung der Temperatur des Gemisches auf 35°C und Einstellung des p~-Werts auf 3,4 - 3,6 durch Zusatz von HGl abgebrochen. Die Abbaulösung wurde zur Entfernung der ausgebrauchten Pflanzenteile filtriert. Das Piltrat wurde zur Gewinnung der von Verunreinigungen freien 5'-Nucleotide weiter behandelt.

Um die Erfindung weiter zu veranschaulichen, sind in der folgenden Tabelle weitere Beispiele zusammengestellte

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⁸A ORIGINAL

	Samen	Tabelle	I	Zahl	Volu	Gesamt	Bauer	Tempe
	teile,		der	men	volu	der	ratur
Bei-	kg ♦	Vorbehandlung der Samenteile	Wä	der	men des	Vor-	der Vo2»-
spiel		Wasch-	schen	gewa	Vorbe-	be-	behand-'
		waeser-	von	schenen	hand-	handJ-	lung,
		menge	3e	Samen-	lungsge-	lung,
		pro Wä	20 Min.	teile,l	mieches, 1	Min.
	68,2	sche, 1	5	532	800	5	71,5
	68,3		5	473	947	4	70,0
2	67,5		5	414	730	7	71,0
3	66,0	740	5	370	730	5	70,5
4	66,0	784	5	340	750	4	71,0
VJl	66,0	710	5	340	714	2	70,5
6		710
7	7)0
	7^0

Getrocknete Malzwurzelkeime "Hannohen" von National Malt Company.

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!Tabelle II

BNS - Hydrolyse

Bei	HITS,	BNS-	Temp.	Wrt	Dauer	Temp,	RNS-	Bn.a-	End
spiel	kg	IÖ-	der	der	der	der	Spal-	wert	wert
		sung,	BN3-	RNS-	lydro-	Hydro	tung,	der	der
		1	lö~	Lö-	lyse,	lyse,	ajL	frei	51-
			sung	sung	Std.		7°	en	Eudeo
			b. Zu			O		Phosph	.tide,
			gabe,					*
			0C	7,0
2	30	250	46	8,5	5	65	84,5	9,7	74,8
3	30	230	46	8,5	3	65	92,0	9,7	82,3
4	30	230	46	8,5	3H	65	90,0	7,4	82,6
5	27	200	46	8,5	5	65	99,0	12,3	86,7
6	30	233	46	8,5	4	65	93,0	10,6	82,4
7	30	233	43	51/2	65	87,4	13,0	74,4

Die vorstehenden Beispiele 1—7 "beziehen sich auf die Ausfühirungeform der Erfindung, bei der die getrockneten Samenteile ohne vorheriges Einweichen gewaschen werden. In den Beispielen 8-tO, die in der folgenden Tabelle zusammengestellt sind, wurden die getrockneten Samenteile (Hannchen-Malzwureelkeime von National Mali Co.) verschiedenlange Zeit in Wasser eingeweicht und anschließend einmal 25 Minuten gewaach«n.

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.- 13 -

Iabelle III Vorbehandlung der 3amenteile

Beispiel \ _8 9 10

Gewicht der Samenteile, kg Einweichwasser, 1 Einweichdauer, Min.

Volumen des Wasohwassera, 1 Volumen der gewasohenen Samenteile, Gesamtvolumen des Vorhehandlungegemisches, 1

Vorhehandlungsdauer, Min.

Temperatur der Vorbehandlung,

Tabelle IV RNS - Hydrolyse

Beispiel £3 9 Ip

HlIS-Gewicht, kg

Volumen der RNS-Lösung, 1 Temperatur der RNS-Iösung,⁰G

68,0	68,2	66,0
710	710	740
30	60	90
710	720	740
370	380	400
800	820	860
5	5	5
70,5	70,5	70,5

30	30	30	4
230	230	250	65
45	46	46	88,2
8,5	8,5	8,5	6,5
4	4	81,7
65	65
78,6	83,5
6,2	6,5
72,4	77,0

der RNS-Lösung 8,5 8,5 8,5 ä

Dauer der Hydrolyse, Std. Temperatur der Hydrolyse, ⁰O Endwert der HNS-Spaltung, $ Endv/ert der freien Phosph., <f> Endwert der 5'-Nucleotide, $>

Beispiel

Eine Heihe von Versuchen wurde durchgeführt, um die optimalen Vorarbeitungsbeciingungen und Parameter der Arbeitsbedingungen für die Herstellung von 5»-Mononuoleotiden gemäß der Erfindung zu ermitteln. Die Versuche S₁) bis O₃), die In der

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nachstehenden Tabelle zusammengestellt sind, beziehen sich · auf die Terarbeitung, bei der gleichmäßige Mengen von getrockneten Samenteilen (getrocknete Hannchen—Malzwurzelkeime von National Malt Oo.) folgenden Behandlungen unterworfen wurden: 1)5 Waschen mit Wasser, 2) Vermischung mit Wasser im Verhältnis von 1,0 kg Wurzelkeime pro 10 1 Wasser und 3) Wärmebehandlung unter den in der Tabelle genannten Bedingungen. Das erhaltene enzymhaltige Medium (einschließlich der Malzwurzelkeime) wurde dann in jedem Fall folgenden Behandlungen unterworfen: 1) Vermischung mit einer 91 Obigen RNS-Iiösung (Anfangs-p_H etwa 7,0) im Verhältnis von 2,2 kg trockene Y/urzelkeime pro kg handelsübliche ENS (etwa 90$) und 2) Hydrolyse bei etwa 65⁰C für die in der Tabelle genannte Dauer. Das HydroIysengemisch enthielt ( als Folge der vorstehenden Mengenverhältnisse) y/o RNS. Das Hydrolysat wurde nach Abbruch der Enzymwirkung analysiert (siehe Tabelle) um den Prozentsatz an gebildeten Nucleotiden zu bestimmen.,

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Tabelle Y

Ver-	Wärmebehandlung	Dauer,	Hydrolyse	Zusammensetzung des	Phosph.,	Hydro-
	temp·,	Min.,	Dauer,Std.	lysate	36,2
such	0O				43,4	5*-BfUCUBD-
		5		RNS-Spal- Freie	48,6	tide,
a-,)	65	5	1,5	tung,^	25,8	47,4
a2)	65	5	2	83,6	30,7	49,0
a.)	65	10	2,5	92,4	35,8	47.3
	65	10	1,5	95,9	16,0	60,6
TDq )	65	10	2	86,4	19,5	60,5
*■»)	65	20	2,5	91,2	22,4	60.3
j C1)	65	20	1,5	96,1	6,5	72,7
	65	20	2	88,7	7,5	75,0
	65	40	2.5	94,5	8,3	72.7
S1)	65	40	1,5	95.1	11,0	81,3
	65	40	2	87,8	5,2	83,9
d3)	65	40	2,5	91,4	6,2	87,1
	65	5	5	95,4	6,7	86,7
ei)	70	5	1,5	97,7	9,5	83,5
e2)	70	5	2	88,8	3,6	87,3
e3)	70	5	2,5		4,1	89 s 9
	70	10	5	96,6	4.5	87.0
	70	10	1,5 .	96,5	4,4	84,5
f2)	70	10	2	88,1	4,4	87,0
f3)	70	20	2.5	91,1	5,0	88,5
«1>	70	20	1,5	93.0	4,9	81,8
g2)	70	20	2	86,2	6,6	85,2
g3)	70	3	2,5	89,6	6.3	87,4
ni)	72	3	1,5	92,4		83,9
h2)	72	3	2	88,8	84,4
h3)	72		2.5	91,0	87.4
	93.7

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	Tabelle V (Forts,	Dauer,	Hydrolyse	1	Zusammensetzung	Freie	des Rydroly-
Ver	Wärmebehandlung	Min.	Dauer,		Bats	Ihosph
such	Temp.,		Std,	ENS-Spal-	4,4	5'-Nucleo-
	0O	5		tung,/0	5,4	.,tide, #
		5	1,5	87,4	6,1	83,0
I1)	72	5	2	91,3	6.9	85,9
	72	5	3	94,8	3,9	88,7
i3)	72	1O	4	94.4	4,5	87,5
1A )	72	10	1,5	85,8	4,7	81,9
	72	10	2	90,9	3,7	86,4
I9)	72	20	2,5	90.3	4,1	85.6
J3)	72	20	1,5	84,1	4,4	80,4
	72	20	2	89,3	4,2	95,2 ■
	72	3	2,5	90,9	3,9	86,5
I1)	72	3	1,5	84,4	4,2	80,2
I2)	75	3	2	88,7	3,7	84,8
	75	5	2,5	92.1	3,3"	87,9
3 Dl1)	75	5	1,5	89,5	3,7	86,5
JIq )	75	5	2	92,2	5,7	88,9
n,)	75	5	2,5	91,9	2,7	88,2
%)	•75	10	5	94,4	3,1	88.7
n1>	75	10	1,5	86,1	3.3	83,4
ng)	75		2	90,3	2,7	87,2
η·,)	75	20	2.5	91.8	3,2	88,5
O1)	75	20	1,5	83,9	3,4	81,2
	75	20	2	89,9		86,7
O3)	75	2,5	91,3	87,9
	75

Die in Tabelle V aufgeführten Analysenergebnisse zeigen, daß optimale Hydrolyse zu i?»-Nucleotiden stattfindet, wenn die Wärmebehandlung des enzymhaltigen Mediums etwa 5 Minuten bei 70-75⁰C vorgenommen und die Hydrolyse 2-2,5 Stunden bei

7,0 (Anfangs-p_H der HITS-Lösung) und 65 wird.

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durchgeführt

Beispiel 11

In einer weiteren Versuchsreihe wurden die zusätzlichen Yerarbeitungsbedingungen ermittelt. Bei den in Tabelle VI zusammengestellten Versuchen p^) bis zO wurden einheitliche Mengen der getrockneten Samenteile (die gleichen Malzkeimwurzeln und Mengen wie in Beispiel 10) 1) 5 Wässerwäschen unterworfen, 2) mit V/asser im Verhältnis von 1,0 kg Wurzelkeime pro 10 1 Wasser gemischt und 3) unter den in der Tabelle genannten Beäingungen wärmebehandelt. Das erhaltene enzymhaltige Medium (einschließlich der Malzkeimwurzeln) wurde dann in jedem Fall 1) mit einer 9fiffo±gen RNS-Lösung χει Verhältnis von 2,2 kg getrocknete Wurzelkeime pro kg handelsübliche RNS (etwa 9O$ig) gemischt und 2) bei verschiedenen Temperaturen und Ρττ-Werten der BNS-Lösung für die in der Tabelle genannte Dauer hydrolysiert_β Das Hydrolysengemisch enthielt als Folge der vorstehenden Mengenverhältnisse 3% 1ÜTÖ. Das Hydrolysat wurde nach dem Abbruch der Enzymaktivität analysiert (siehe Tabelle), um den Prozentsatz an gebildeten Nucleotiden zu bestimmen,.

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Tabelle 71

Ver	Wärmebehandlung	Dauer Min.	7	Hydrolys	Temp. 0C	e	Zusammensetzung	Freie Phosph,,	des Hydro
such	Temp», 0C	5	7	PH	65	Dau er, Std	Iysats	4,4
	72	5	7	,0	65	1,5	HIS- Spal- tunp,^	5,4	s' -Nucleo tide, /α
P1)	72	5	7	,0	65	2	87,4	6,1	83,0
P2)	72	5	7	,0	65	3	91,3	6,9	85,9
P3)	72	3	7	,0	65	4	94,8	2,7	88,7
P4)	80	3	7	,0	65	1,5	94,4	2,9	87,5
I1)	80	3	7	,0	65	2	65,6	3,2	62,9
	80	2	7	lP	65	2,5	74,3	3,0	71,4
	80	2	7	,0	65	1,5	79,5	3,3	76,3
ri)	80	2	7	,0	65	2	72,9	3,7	69,9
	80	1	7	,0	65	2,5	81,9	0,0	78,6
Γ3}	90	1	7	»o	65	1,5	87,2	0,1	83,2
B1)	90	1	6	,0	65	O	13,7	0,4	13,7
B?)	90	5	6	,0	65	2,5	17,5	4,1	17,4
B3)	72	5		,0	65	1,5	19,9	4,8	19,5
	72	5	' j	,0	65	2	85,9	5.3	81,8
	72	5	r ι J	l9_	65	2,5	91,5	4,4	86,7
V	72	5	ι J	0	65	1,5	92,2	5,4	86,9
J U1)	72	5	r J	0	65	2	87,4	6,1	83,0
U?)	72	5	8,	0	65	3	91,3	6,9	85,9
U3)	72	5	8,	0	65	4	94,8	4,0	«8,7
ua)	72	5	8J	0	65	1,5	94,4	4,7	87,5
V1)	72	5	8,	0	65	2	88,0	5,0	84,0
V2)	72	5	°,	0	65	2,5	90,1	4,9	85,4
V3>	72	5		5	65	1,5	92,0	5,3	87,0
	72	5	5	65	2	87,2	5,8	82,3
W2)	72		5	2,5	91,9	86,6
	91,9	86,1

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	Tabelle	Dauer, Min.	VI	(Forts,	Temp 0O	.,Dau- er, Std,	J	Freie Phosph.	,tide, io
Ver	Färmebehandlung	5	Hydrolyse	60	1,5		4,1.	73,7
such		5		60	2		4,6	82,4
	Temp., 0O	5	Ή	60	2,5	Zusammensetzung des Hydro	5,1	83,0
X1)	72	5	7,0	65	1,5	lysate	4,4	83,0
X2)	72	5	7,0	65	2	RNS- Sp al- tung,	5,4	85,9
x?)	72	5	7,0	65	3	77,8	6,1	88,7
y-j)	72	5	7,0	65	4	87,0	6.9	87,5
Jp)	72	5	7,0	70	1,5	88,1	5,7	83,6
7,)	72	5	7,0	70	2	87,4	6,5	86,0
	72	5	7,0	70	2,5	91,3	7,0	85,7
Z1)	72		7,0		94,8
Zp)	72		7,0	94,4
Z3)	72	7,0	89,3
			92,5
92,7

Die in Tabelle VI aufgeführten Analysenwerte zeigen, daß optimale Hydrolyse zu 5«-Nucleotiden stattfindet, wenn die Wärmebehandlung des enzymhaltigen llediums etwa 5Minuten bei etwa 72⁰O und die Hydrolyse 2-3 Stunden bei p 6,0-8,5 und 65-7O⁰O durchführt wird.

Beispiel .12

Versuche v/ur:ieii durchgeführt, ui'i die \/irksaDikeit von enzym— haltigen iiedien zu en.ii ;teln, die unter Vei*wendung der ecLnell sprossenden Teile anderer Saaten hergestellt werden. Ir. der folgenden Tabelle VII find die Hydrolysenergebnisse angegeben, die ?ait gleichen !,engen ilungbohnenschößlingen, Sojabohnensoliü,-liegen und den "./urzelkeimen von Hafer, Weizen un.l lieis, die in ,,leicher ".'/eise verarbeitet wurden, erhalten vmr ien.

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BAD ORlQINAt.

Tabelle VII

Ver- Pflanzenteile Hydrolyse Zusammensetzung des Hydrolysuch sats

Dauer, Gespal- Freie 5*-Nucleo-CJ. - tene Haosph», tide, ^bta " MS-Men- ^ „,

1:	Mungbohnen- schößlinge	1,5	30,5	-'	-
2	Il Il	2,5	44,2	15,2	40,4
3	ti Il	3,5	55,6
4	Sojabohnen schößlinge	1,5	17,5	—	-
VJl	Il Il	2,5	25,2	12,9	21,1
6	ti 11	3,5	34,0		_.
7	Haferwurzel keime	1,5	33,2	18,6	27,0
8	Il It	2,5	45,6
9	Weizenwurzel keime	1,5	91,7	-	-
10	11 It	2	93,0	27,5	66,1
11	It 11	3	93 *6	12,6	47,3
12	Reiswurzel keime	1,5	59,9	15,8	60,5
13	It Il	2,5	76,3	18,2	64,9
14	Il It	3,5	83,1

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Beispiel 13

Weitere Versuche wurden durchgeführt, um die Peststellung zu bestätigen, daß mit den schnell sprossenden Teilen von keimenden Saaten eine wesentlich stärkere Enzymwirkung erzielbar ist als mit den Samen oder Kernen selbst.

Malzsprößlinge wurden fünfmal mit Wasser gewaschen, anschließend mit Wasser gemischt und 5 Minuten bei 72°C gehalten. Zu Beginn der Wärmebehandlung wurden Zinkionen zum Gemisch gegeben. Die Sprößlinge wurden abfiltriert und mit RNS-Lösung bei p_H 7*0 gemischt. Die Endkonzentration an RNS im Gemisch betrug J>%. NaP wurde in einer solchen Menge zugegeben, daß die Lösung 0,001 Mol Zn und 0,©5# NaP enthielt. Die Lösung wurde auf 65⁰C erhitzt und bei dieser Temperatur gehalten. Die Ergebnisse der Analyse des Hydrolysate sind in Tabelle VIII aufgeführt.

Ganze Malzkörner wurden fünfmal mit Wasser gewaschen und in zwei gleiche Teile geteilt. Ein Teil wurde in einem Waring-Blendor gemahlen. Beide Teile wurden mit der gleichen Wassermenge gemischt und 5 Minuten bei 72⁰C gehalten. Zu Beginn dieser Behandlung wurden Zinkionen zugesetzt. Die gleichen Mengen an Wasser und Samenteilen wurden verwendet wie während der vorhergehenden Versuche mir. Malzsprößlingen. Beide enzymhaltige Medien (gemahlene Körner und ungemahlene Körner) wurden mit RNS-Lösung bei p™ 7*0 gemischt. Die Endkonzentration an RNS in beiden Gemischen betrug J>%. Auch hier wurde NaP zugegeben, jede Lösung wurde auf 65⁰C erhitzt und bei dieser Temperatur gehalten. Die Ergebnisse der Analyse des Hydrolysats sind in Tabelle VIII genannt.

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	Tabelle	VIII	Freie Phosph»,	Hydrolysats
Enzymhaltige	Dauer der		8,9 9,8	5 »-Nucleotide i>
Medien	Hydrolyse, Std.	Zusammensetzung des	9,5 11,0 13,0	87,3 91,2
Filtrierte Sprößlinge. ti It	1,5 2	Gespaltene RNS-Menge,	3,8 4,3	40,5 35,0 38,6
Gemahlene Malz körner 1,5 η ti 2 tt ,1 It 3	96,2 100,0		4,6 7,0
Ganze Malzkör ner 1,5 it ti 2 it Ii 3	50,0 46,0 51,6
9,4 11,3

Nach der Analyse der RNS zu 5'-Nucleotiden werden Verunreinigungen entfernt, die die anschließende Abtrennung der 5'-Nucleotide stören können. Diese Verunreinigungen .ε.Lid hauptsächlich 1) anorganische Phosphate, 2) Prcteir. n:..-. 1 3-l enzymhaltigen Medium, 3) geringe uen^enuicht Iij arolyshorter Nucleinsäure und 4) Nucleoside. Die ^¹'ten drei /erum· jixiigungen können nach wenigstens zwei _.e dioden entfernt v/er.:.en_e Bei einer dieser Methoden wird Bariuuii/aroxya bis zu p-_; -,0 zugegebena Durch diese Zugabe wird die iUizyiuv/irkung u._.^;. ; ;elbar aufgehoben und die Ausfällung von Vorunreinigrn ;·: verursacht, die von der 5'-Nucleotidlösung abfiltrierr - .en können. Bei dieser Methode ist die Entfernung geri... - _ Mengen der gewünschten 5'-Nucleotide, insbesondere vul Pui*innucleotiden, möglich. Nach der zweiten Methode werden die Verunreinigungen durch Zugabe von Alkohol zur Hydrolysenlösung entfernt. Hierdurch wird die Enzvnwirkung aufge-hoben

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BAD ORIGINAL

und Protein und etwasNatriumphosphat ausgefällt. Auch hier werden geringe Mengen an Purinnucleotiden ausgefällt. Die Fällung wird abfiltriert und das Filtrat zur Abtrennung von 5^r-Nucleotiden verwendete

Ohne Rücksicht auf die zur Reinigung des Hydrolysats angewendete Methode enthält das Piltrat (nach EntfernugLg der Verunreinigungen) Nucleotide, die in bekannter Weise durch Ionenaustausch abgetrennt werden können.

Es sei bemerkt, daß ein enzymhaltiges Medium, bestehend aus Wasser und nicht zerkleinerten Samenteilen (die in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben, wärmebehandelt wurden), zum Abbau bzw. zur Spaltung von Desoxyribonuoleinsäure zu 5^f-Deso3yribonuoleotiden verwendet werden kann·

Patentanapttiiohe

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Claims (12)

Patentansprüche

1. Verfahren zum enzymatisohen Abbau von Nucleinsäuren unter Hydrolyse zu vorwiegend 5' -rNuoleotiden, dadurch gekennzeichnet, dass man dazu eine wässrige enzymhaltige Suspension von diskreten Partikeln von schnellsprossenden Saatteilen, wie keimenden Samenwurzeln und/oder -Stengeln, verwendet.

2· Verfahren naoh Anspruoh 1, daduroh gekennzeichnet, dass man ein duroh Mieohen von Wasser mit den diskreten Partikeln der sohnellsprossenden Saatteil·, Zusetzen von die Enzyme desaktivierenden Substanzen und Erhitzen zwecke Zerstörung der den Abbau von Nuoleinsäure inhibierenden Enzymbestandteilen gewonnenes enzymatisohes Medium mit der abzubauenden Nuoleinsäure mischt, die so erhaltene Hisohung bis zur Bildung der 5'-Nucleotide auf die Hydrolyeentemperatur erwärmt, danach die verbrauchten Saatteile aus dem die 5'-Nucleotide enthaltenden wässrigen Hydrolysengemieoh abtrennt, und die ö'-Nuoleotide aus der von Feststoffen befreiten Hydrolysenmisohung gewinnt·

3· Verfahren naoh Anspruoh 1 oder 2, daduroh gekennzeichnet, dass man ein enzymatisohes Medium verwendet, bei dem die Saatteile vor dem Vermischen mit Wasser zur Entfernung von Bakterien gewaschen worden sind.

J? 4· Verfahren naoh Anspruoh 5» daduroh gekennzeichnet, dass <o man ein enzymatisohes Medium verwendet, bei dem die Saat-

k> teile vor dem Waschen mit Wasser zwecks Hydratisierung in ^ Wasser eingeweicht worden sind·

" 5· Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, zum Abbau von Eiboo nuoleineäure unter Hydrolyse zu vorwiegend 5'-Ribonucleicotiden, daduroh gekennzeichnet, dass man ein duroh Mischen von etwa 5 bis 15 Gew.-Teilen, vorzugsweise etwa 10 Gew.-Teilen, Wasser und etwa 1 Gew.-!Teil der abgetrennten schnell· sprossenden Saatteile, Zusetzen der desaktivierenden Sub-' stanzen und Erhitzen während etwa 0,5 bis

7 Minuten, vor-

U70320

zugsweise etwa 2 bis 5 Minuten, auf eine Temperatur von etwa 70 bis 85°C, vorzugsweise etwa 70 bis 75°0, gewonnenes enzymatisohes Medium mit der abzubauenden Eibonuoleinsäure, die vorteilhaft mit einem Anfangs-pH-Wert bis zu etwa 8,5 vorliegt, vermischt,zweokmässig im Verhältnis von etwa 1 bis 3 G-ew.-Teilen Enzymmedium zu etwa 1 Gew. ,-Teil Eibonucleinsäure in einer bis zu etwa 10 io Eibonucleinsäure enthaltenden wässrigen Lösung, dass man die so erhaltene Mischung zweokmässig etwa 1,5 bis 5,5, vorteilhaft etwa 1,5 bis 3 Stunden lang auf etwa 60 bis 70⁰C, vorteilhaft auf etwa 63 bis 67°0,erwärmt, wobei man zweokmässig während der dabei erfolgenden M

Hydrolyse den pH-Wert der Misohung auf über etwa 5#2 hält, dass man danaoh die verbrachten Saatteil· abtrennt und die 5'-Bibonucleotide aus der von Feststoffen befreiten Hydrolysenmischung gewinnt.

6 ο Verfahren naoh Anspruoh 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man ein enzymatisohes Medium verwendet, dem als desaktivierende Substanz Metallionen, vorteilhaft Zink-Ionen, zweokmässig in einer Menge von wenigstens 0,001 Mol, zugesetzt sind·

7ο Verfahren nach Anspruoh 6, daduroh gekennzeichnet, dass man ein enzymatisohes Medium verwendet, dem als desaktiv&erende Substanz zusätzlich Borat-Ionen zugesetzt sind. "

8. Verfahren naoh Anspruoh 6 oder 7, daduroh gekennzeioho net, dass man ein enzymatisohes Medium verwendet, das einen cp Gehalt an Zink-Ionen von etwa 0,001 bie 0,01 Mol in dem J^ der Hydrolyse auszusetzenden Gemisoh aus Enzymmedium "*·> und Ribonucleinsäure sicherstellt.

ro 9« Verfahren naoh Anspruoh 5 bis 8, daduroh gekennzeichnet, dass man nach dem Erwärmen des Gemisohes aus Enzymmedium und Ribonucleinsäure die Ribonucleasen und die Phosphodiesterasen inaktiviert, zweokmässig durch Kühlen der Hydrolysenmisohung auf etwa 35⁰O und Ansäuern auf einen pH-Wert von etwa 3,5 oder durch etwa 10 bis 20-Minütiges Erhitzen der Misohung auf über etwa 80⁰C.

10« Wässriges enzymhaltiges Medium zum Abbau von Bibo— nucleinsäure zu vorwiegend 5'-Bibonuoleotiden naoh Anspruch 5 bis 9» eta gekennzeichnet duroh eine etwa 0,5 bis 7 Minuten lang auf etwa 70 bia 85°C erwärmte Dispersion von in Form von diskreten Partikeln vorliegenden Teilen von schnellsprossenden Saaten, wie keimende Samenwurzeln und/oder -stengel in Wasser·

11. Medium naoh Anspruch 10, gekennzeichnet durch ein Verhältnis von etwa 1 Gew.-Teil Saatteile zu etwa 5 bis 15 Gew.-Teilen Wasser·

12. Medium nach Anspruoh 10 oder 11, daduroh gekennzeichnet, dass die Dispersion in Gegenwart von Zink-Ionen erwärmt worden ist.

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