DE1767502A1

DE1767502A1 - Verfahren zur Herstellung von Naehrmedien fuer Pilze und Mikroorganismen

Info

Publication number: DE1767502A1
Application number: DE19681767502
Authority: DE
Inventors: Worgan Jeffrey Thornton
Original assignee: National Research Development Corp UK
Current assignee: National Research Development Corp UK
Priority date: 1967-05-17
Filing date: 1968-05-16
Publication date: 1971-10-28
Also published as: FR1602801A; OA02816A; GB1220807A

Description

Beschreibung zur Patentanmeldung der

NATIONAL RESEARCH DEVELOPMENT CORPORATION,

66 - 74, Victoria Street, London S.W.l/ENGLAND

betreffend:

"Verfahren zur Herstellung von Nährmedien für Pilze und Mikroorganismen"

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nährmedien für Pilze und Mikroorganismen. Die Erfindung betrifft in erster Linie die Herstellung von Nährmedien, die zur Aufzucht höherer Pilze geeignet sind und soll insbesondere bezüglich dieser Mikroorganismen beschrieben werden, obwohl sie auch auf andere Klassen von Mikroorganismen anwendbar ist.

Die Myzelien der eßbaren Arten Morchella hortensis und

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Tricholoma nudum wurden im halbtechnischen Maßstab in Mengen erzeugt und erwiesen sich als potentiell wertvolle Quellen von Protein und von Vitaminen. Antibiotika, Verbindungen zur Krebsbekämpfung, Nukleotide, Mittel zur Geschmacksverstärkung und die Antioxydationsmittel gehören zu den Produkten, die aus dem Myzelwachstum höherer Pilze erhalten worden sind.

Als Kohlenstoffquelle in Kulturmedien wurden im Laboratorium Zucker wie Glukose in weitem Umfang verwendet. Im großtechnischen Betrieb ist jedoch eine wirtschaftlichere Kohlenstoffquelle nötig und es sind zu diesem Zweck bestimmte flüssige Abfallstoffe untersucht worden, die gelöste Zucker enthalten, z.B. Melassen, Sulfitablaugen, Abfälle von Konservenfabriken und bestimmte feste und halbfeste Stoffe, aus denen Zucker extrahiert werden können. Stärkehaltige Materialien, aus denen durch saure Hydrolyse oder durch Einwirkung von Enzymen die entsprechenden Zucker hergestellt werden können, sind ebenfalls als Kohlenstoffquelle verwendet worden, jedoch sind solche Stoffe gewöhnlich selbst wertvoll als menschliche oder tierische Nahrungsmittel oder als Stärkequellen für andere Verwendungen und es wurde daher die Aufmerksamkeit auf feste und halbfeste Materialien gerichtet, die hauptsächlich aus Zellulose, Hemizellulose oder Lignin bestehen, die in der Natur weitverbreitet sind und in großen Mengen als Nebenprodukte bei der Industrie, Land-

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wirtschaft und Forstwirtschaft anfallen. Materialien der letztgenannten Art sind Äther in ihrer natürlichen Form zu langsam angreifbar durch Mikroorganismen, um von praktischem Wert zu sein und es ist daher vorgeschlagen worden, sie über längere Zeit mechanisch zu zermahlen oder einer chemischen Behandlung zu unterwerfen, z.B. einer Hydrolyse, um ein geeignetes Substrat herzustellen. Die vorgeschlagenen mechanischen Behandlungsformen bedingen einen erheblichen Energieaufwand, der die Vorzüge eines billigen Rohmaterials kompensiert, weshalb eine hydrolytische Behandlung vorgezogen wurde. Die Bedingungen, unter denen eine Hydrolyse bewirkt wurde, sind hauptsächlich sehr drastisch gewesen, wobei z.B. Schwefelsäure unter Druck bei Temperaturen von I50 bis 185°C und hochkorrosive Reagenzien wie rauchende Salzsäure verwendet worden sind. Diese Verfahren erfordern die Verwendung von korrosionsfesten Anlagen und die erhaltenen Hydrolysate müssen gewöhnlich zur Entfernung von Nebenprodukten einschließlich überschüssiger Mengen Furfurol und anderer Substanzen, die das Wachstum von Mikroorganismen hemmen, nachbehandelt werden, wobei diese Erfordernisse ebenfalls gegen die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens sprechen.

Es wurde gefunden, daß ein geeignetes Substrat aus den genannten Abfallstoffen durch viel weniger drastische chemi-

sehe Behandlungsverfahren hergestellt werden kann, als dies bisher möglich war, und daß darüber hinaus es möglich ist, zur Vorbehandlung des Rohmaterials Chemikalien zu verwenden, die als solche von den Mikroorganismen benötigt werden oder Ionen enthalten, die für das Wachstum im fertigen Medium erforderlich sind.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden die zum Wachstum der Mikroorganismen notwendigen Elemente in Form ihrer Verbindungen als Reagenzien verwendet,

um das als Kohlenstoffquelle verwendete Rohmaterial löslich

zu machen oder teilweise abzubauen. Diese Behandlung macht die Kohlenstoffquelle dieser Rohmaterialien, auf denen das Wachstum der meisten Mikroorganismen zu langsam erfolgt, um sie als Basis eines industriellen

Verfahrens einzusetzen, für die Mikroorganismen leichter

verfügbar. Die Elemente werden als Reagenzien in Form der folgenden Verbindungen verwendet:

P - als Phosphorsäure oder saure Phosphate,

S - als Schwefelsäure,

K - als Kaliumhydroxyd oder Kaliumcarbonat,

N - als Salpetersäure, Ammoniak oder Harnstoff.

Calcium und Magnesium können als HydroRyde und kleinere Mengen von Eisen, Mangan und Zink in Form ihrer Salze eben-

falls verwendet werden.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines Nährmediums für Pilze und Mikroorganismen, wobei Stoffe pflanzlicher Herkunft zu einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle abgebaut werden, und ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangsstoffe hintereinander in jeder gewünschten Reihenfolge mit sauren und alkalischen Reagenzien behandelt, die wenigstens den größeren Teil des im fertigen Nährmedium benötigen Phosphors, Schwefels, Stickstoffs oder Kaliums oder einer Kombination dieser Elemente bereitstellen, wobei wenigstens eine dieser Behandlungen das Ausgangsmaterial abbaut und die andere entweder eine Abbaubehandlung oder eine Neutralisationsbehandlung darstellt.

Wenn eine Abbaubehandlung durch Säure verwendet wird, wird diese vorzugsweise unter relativ milden Bedingungen durchgeführt, nämlich solchen Bedingungen, bei denen die Bildung unerwünschter Nebenprodukte vermieden wird. Eine teilweise Umwandlung des Polysacharids zu Monosachariden kann gestattet werden, ist jedoch für die Herstellung eines brauchbaren Mediums nicht von wesentlicher Bedeutung und es werden sehr gute Ergebnisse ohne die Anwendung überatmosphärischer Drucke erhalten.

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Es braucht nur eine der Behandlungen mit Säure und Alkalien eine Abbaubehandlung zu sein, jedoch werden vorzugsweise beide derartigen Behandlungen als Abbaubehandlungen durchgeführt, damit eine maximale Extraktion der gewünschten Stoffe in flüssiger Form erreicht wird. Ein besonderer Vorteil der Anwendung einer sauren Abbaubehandlung als erste Behandlung, der die Stoffe ausgesetzt werden, liegt darin, daß ein wertvoller Sterilisationseffekt erzielt wird und wertvolle Wachstumsfaktoren aus den Ausgangsstoffen entfernt werden, bevor sie durch eine Alkali-Behandlung möglicherweise zerstört werden können. Beispielsweise wtrdetfbei einem pH-Wert unter 4 sogar Sporenleicht bei Temperaturen von 80 bis

100⁰C zerstört. Wenn nach einer solchen Behandlung eine alkalische Abbaubehandlung bei einem pH-Wert über 9 durchgeführt wird, wird ein zusätzlicher Sterilisierungseffekt erhalten. Wenn solche Behandlungen in geschlossenen Behältern durchgeführt werden und steriles Wasser für jede benötigte Waschbehandlung verwendet wird, wird das erhaltene Medium vor dem Gebrauch wenig oder gar nicht weiter sterilisiert werden müssen.

Bei der Durchführung des Verfahrens ist es erwünscht, die in den Behänd lungs stufen und bei den Waashstufen verwendete Wassermenge auf einem Minimum zu halten und die Reagenzien werden vorzugsweise in einer Wassermenge gelöst

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verwendet, die nicht mehr als das ^fache, vorzugsweise nicht mehr als das 2fache der Menge beträgt, die für das vollständige Befeuchten des Materials notwendig ist.

Ausgangsstoffe

Das Verfahren kann auf jeden Ausgangsstoff aus dem Pflanzenreich angewendet werden, ist jedoch besonders für die Anwendung auf Ausgingsstoffe geeignet, die hauptsächlich aus Zellulose, Hemizellulose und Lignin bestehen, wegen deren niedriger Kosten.

Stoffe, die einen hohen Mengenanteil Hemizellulosen enthalten, werden im allgemeinen leichter extrahiert. Beispiele solcher Stoffe sind Strohsorten und Schalen von Getreidearten, Maiskolben, Sägemehl und Holzabfälle, Rübenabschnitte, ausgepreßtes Zuckerrohr und Kakaoschalen, Abfallprodukte aus der Verarbeitung von Früchten und Gemüsen, Kartoffelstengel, Erbsenranken und Schoten, gemahlene Nußschalen und -häute, Kaffeeröstabfälle und Mahlrückstände.

Weitere Quellen von Ausgangsstoffen sind die Seepflanzen und Pflanzen von geringem wirtschaftlichen Wert, die in bestimmen Gebieten wild wachsen, z.B. Farnkräuter und bestimm-

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te Arten von Wasserunkräutern. Mikroorganismen

Mikroorganismen, die für die Aufzucht auf den erfindungs· gemäß hergestellten Medien geeignet sind, sind solche, die nicht die gesamte Kohlenstoffquelle in Form eines Zuckers benötigen. Mikroorganismen, bei denen eine Quelle für organischen Stickstoff nicht notwendiges Erfordernis sind, werden für das Verfahren ebenfalls besser geeignet sein.

Die Anzahl von Mikroorganismen, die dafür bekannt Zellulose, Hemizellulosen und verwandte Verbindungen nutzbar zu machen, ist viel größer als früher angenommen wurde und diese Organismen sind nicht auf irgendeine Gruppe beschränkt sondern wtrd^innerhalb der Bakterien, Schimmelpilze, höheren Pilze, Aktinomyzeten oder Hefen gefunden.

Mikroorganismen der folgenden Gruppe sind für das Verfahren geeignet.

Höhere Pilze oder Speisepilze aus den Klassen der Basidiomyzeten und Askomyzeten.

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Schimmelpilze der Gruppen Fenieillium, Aspergillus, Rhizopus, Trichotheeiura, Trichoderma, Myrothecium und Fusarium.

Bakterien der Gruppen Bacillus, Achromobacter, Pseudomonas, Lactobacillus, Cytophoga, Sporocytophaga, Vibrio, Chlostridium, Bacteroides und Ruminococcus.

Actinomyceten der Gruppen Streptomyces, Nocardia, Micromonospora und Streptosporangium.

Es wurden folgende Arten höherer Pilze geprüft:

Agaricus campestris Polyporus frondosus Tricholoma nudum Morchella hybrida Lentinus lepideus Boletus luteus

sowie die folgenden Schimmelpilzarten:

Penicillin chrysogenum
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae.

Vorbehandlungsbedingungen

Je nach der Art der als Kohlenstoffquelle verwendeten Aus-

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ßAD ORIGINAL

gangsstoffe, der zu züchtenden Mikroorganismen, der Produktart, die aus dem mikrobiologischen Verfahren erzeugt werden soll und je nach den wirtschaftlichen Überlegungen bezüglich der Chemikalienkosten und des Aufwands für Anlagen und Brennstoffe können die Reagenzien auf verschiedene Weise angewendet werden, um das Nährmedium aus dem Rohmaterial herzustellen.

Die möglichen Verfahrensweisen unterliegen folgenden Prinzipien:

1) Eine vorhergehende milde Wärmebehandlung mit den sauren Komponenten der Reagenzien erzielt nicht nur eine Extraktion eines Teils der Ausgangsstoffe, sondern erhöht die Löslichkeit des Rückstands in nachfolgenden alkalischen Lösungen. Rohstoffe, die gewöhnlich in Form großer Teilchen erhalten werden,können leicht nach dieser Behandlung zu einem Pulver zermahlen werden. Z.B. können Baumwollfasern nach 1stündigem Erhitzen auf 100⁰C durch Behandlung in 0,1-n H₂SO₁^ in trockenem Zustand zwischen dem Finger zu einem Pulver zermahlen werden.

2) Einweichen in verdünnter Säure erhöht die Löslichkeit der Stoffe in der nachfolgenden Behandlung mit alkalischen Lösungen.

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BAD ORIGINAL

3) Die Gegenwart kleiner Mengen von Zink in der alkalischen Lösung erhöht deren löslichmaehende Wirkung auf die Materialien.

Zellulose wird in Gegenwart von Luft und Alkali abgebaut und dieser Effekt wird erhöht, wenn eine kleine Menge Eisen oder Mangan anwesend ist. Diese Verfahrens stufe wird am besten
ausgeführt, nachdem vorher mit Wasser, Säure oder Alkali extrahiert worden ist oder anschließend an eine Wärmebehandlung mit verdünnter Säure.

5) Wachstumsfaktoren und wasserlösliche Verbindungen, die von den Mikroorganismen gebraucht werden, können besser zuerst durch kaltes oder heisses Wasser oder durch Einweichen des Materials in verdünnter Säure extrahiert werden.

6) Die Menge der verwendeten Reagenzien sollte nicht die Konzentrationen im Endprodukt übersteigen, die das Wachstum der Mikroorganismen hemmen.

7) Die Mengen und Konzentrationen der ausgewählten Reagenzien sollten derart sein, daß im Endprodukt ein optimales Gleichgewicht der Nährstoffe für das Wachstum erhalten wird.

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BAD ORIGINAL

8) Im Fall einiger Rohmaterialien kann eine ausreichende Verbesserung der Extraktion erreicht werden,

die die Verwendung von NaOH oder Na₂CO, außer KOH, NH^OH,Ca(OH)₂ und Mg(OH)₂ rechtfertigt.

9) Das optimale Gleichgewicht der Nährstoffe im als Endprodukt erhaltenen Nährmedium kann entsprechend der durch die Mikroorganismen nutzbar gemachten Kohlenstoffquelle unterschiedlich sein. Wenn einmal festgestellt ist, daß der Mikroorganismus auf dem zuerst hergestellten Medium wächst, sollten weitere Versuche durchgeführt werden, das optimale Medium für das Wachstum oder die Bildung des gewünschten Produkts aufzufinden.

10) Im Fall einiger Rohstoffe kann es ratsam sein, nicht deren völlige Löslichkeitsmachung zu versuchen. Der nach der Herstellung eines Extrakts vom Medium zurückbleibende Rückstand kann in einer der folgenden Arten verwendet werden:

(a) Nach der Zugabe von Nährsalzen kann er als Medium für das Oberflächenwachstum von Mikroorganismen verwendet werden. Wenn das Myzel höherer eßbarer Pilze auf dem Rückstand ge-

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züchtet wird, kann z.B. ein Produkt erhalten werden, das als Nährmittel für Tiere geeignet ist.

(b) Der Rückstand kann getrennt löslich gemacht werden, indem er mit Alkali behandelt und oxydiert wird.

(c) Der Rückstand kann im hergestellten Medium dispergiert werden, um als Nährstoff für einige Mikroorganismen zu dienen.

Allgemeine Anwendungsmethoden für das Verfahren und Berechnung der Reagenzmengen

Wenn die genauen Bedingungen für das Nährmedium der Mikroorganismen bekannt sind, können die äquivalenten Mengen jedes Reagenzes gemäß den folgenden Tabellen berechnet werden. Wenn die genauen Erfordernisse für den Nährstoff nicht bekannt sind, wird ein typisches Medium für die zu untersuchende Art von Mikroorganismus als Basis der Berechnung verwendet.

In den folgenden Tabellen sind Beispiele für Medien angegeben, die synthetische Medien für die Züchtung von Myzelien höherer Pilze darstellen. Die angegebene Menge von 10 bis 50 g pro Liter Zucker, die gewöhnlich

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BAD ORfGINAi.

als Kohlenstoffquelle in diesen Medien verwendet wird* wird durch das löslich gemachte oder abgebaute Rohmaterial ersetzt.

TABELLE I

Nitrate als Stickstoffquelle

Menge je Liter Nährsalze für das Medium	Äquivalente Menge der Elemente	Äquivalente Menge des Reagens
1 g KH₂PO₄ )	0,29 g K 0,33 g F	0,42 g KOH 0,72 g H₃PO₄
7,Sg KNO, ) ^J )	1 g N 2,8 g K	4,6 g HNO, 4 g KOH-³
oder
6,1 g NaNO, )	IgN 1,6 g Na	4,6 g HNO, 2,9 NaOH ->

0,5 g MgSO₄TH₂O ) U,05 g Mg 0,12 g Mg(OH)₂

) 0,065 g S 0,2 g H₂SO₄

0,3 g CaCl₂ )

0,01 g FeCl₃-OH₂O 0,004 g ZnCl₂ 0,0072 g MnSO₄^H₂O H₂O 1 Liter

0,11 g Ca 0,18 g Ca(OH)₂

0,20 g Cl 0,21 g HCl

14 . 109844/0437 OBIGIHAl

1S

TABELLE II

Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle

Menge je Liter Nährsalze für das Medium	)	Äquivalente Menge des Elements	Äquivalente Reagens- menge
1 g KH₂PO₄	)	0	0,42 g KOH
		0.	0,72 g H₃PO₄
4,7 g (NH₄)₂S0₄		1:	1,2 g NH₃
	)	1;	3,52 g H₂SO₄
0,5 g MgSO₁-TH₂O	)	o,	0,12 g Mg (OH)₂
	) )	o,	0,2 g H₂SO₄
0,3 g CaCl₂	J V	o,	0,18 g Ca(OH)₂
	0,	0,21 g HCl
	,29 g K
,23 g P
,OgN
,14 g S
»05 g Mg
,065 g S
,11 g Ca
20 g Cl

0,01 g PeCl₃-OH₂O
0,004 g ZnCl₂
0,0072 g

H₂O 1 Liter

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TABELLE III

Ammoniumnitrat oder Harnstoff als Stick stoff quelle

Benötigte Menge an Elementen je Liter Medium

(a) Harnstoff (b) NH₄NO,

Äquivalente
Reagens»enge

0,29 g K 0,23 g P 1,OgN 0,05 g Mg

0,065 g S 0,11 g Ca

0,20 g Cl 0,42 g KOH
0,72 g H₅PO₄
2,21 g Harnstoff
0,12 g Mg(OH)₂

0,2 g H₂SO₄
0,18 g Ca(OH)₂

0,42 g KOH

0,72 g H₅PO₄

0,608 g NH₃ 2,25 g HNO₃

0,12 g Mg(OH)₂

0,2 g H₂SO₄. 0,18 g Ca(OH)₂

0,21 g HCl 0,21 g HCl

0,01 g FeC1,.6H₂O

0,004 g ZnCl₂ 0,0072 g MnSO₄^H₂O

. 16 _r109844/0437

Es wurde gefunden, daß bei der Behandlung des Rohmaterials vorteilhaft Mengen von Säure oder Alkalien zusätzlich zu denen als Nährstoff verwendeten Mengen angewendet werden können, wobei Natrium- oder Calciurahydroxyd oder -carbonate für die Alkalibehandlung und eine leicht verfügbare preiswerte Säure wie Salzsäure für die Säurebehandlung ver wendet werden können. Die Konzentration dieser zusätzlichen Reagenzien sollte nicht 1 g Mol pro Liter im fertigen Medium übersteigen.

Verfahren zur Anwendung der Reagenzien

Bei der Anwendung der Reagenzien bestimmt die Wasserabsorption, die Teilchengröße und der physikalische Zustand des Rohmaterials das minimale Volumen an Flüssigkeit« das für Jede Behandlung mit den Reagenzien angewendet werden kann. Im Fall von unvermahlenen Haferspelzen beträgt beispielsweise das Minimalverhältnis von Flüssigkeit zu Feststoff etwa 2,5:1.

Alternative Verfahren zur Anwendung der Reagenzien für das Löslichmaohen und Abbauen der Rohstoffe sind im folgenden zusammengestellt.

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1S

Erste Behandlung Zweite Behandlung

Wärmebehandlung mit Säuren

(a) Wärmebehandlung mit Alkallen oder

(b) Einweichen im alkalischen Reagens oder

(c) Einweichen in alkalischen Reagenzien und durch Lüften

Einweichen in Säure )

wie oben

Wärmebehandlung mit alkalischen Reagenzien

(a) Einweichen in Säuren oder

(b) Wärmebehandlung mit Säuren

Einweichen in alkali-\ sehen Reagenzien

(a) Einweichen in Säuren oder

(b) Wärmebehandlung mit sauren

Reagenzien

Einweichen in alkalischen Reagenzien und Lüften

(a) Einweichen in sauren Reagenzien oder

(b) Wärmebehandlung mit Säuren

In manchen Fällen können mit Vorteil mechanische Behandlungen zum Abbau der Rohstoffe eingeführt werden. Der Energieaufwand zur Zerkleinerung von Fasermaterial z.B. zu einem Pulver ist erheblich kleiner, nachdem die Stoffe mit Säure« Alkali oder Harnstofflösungen behandelt worden sind. Die gebildeten feinen Teilchen werden einer weiteren Behandlung mit chemischen Reagenzien eher

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zugänglich sein und selbst ohne weitere chemische Behandlung werden sie als Nährstoffe für Mikroorganismen leichter verfügbar sein.

Wo Eisen, Mangan und Zink in Ionenform als Nährstoffe im Endprodukt gewünscht sind oder wenn die Gegenwart dieser Ionen nicht das Wachstum der Mikroorganismen stört, können Salze, die diese Ionen enthalten, zur Erhöhung der Wirksam-» keit der alkalischen Reagenzien zugefügt werden. Die Konzentration von Eisen, Mangan und Zink als Ionen sollte zwischen 1 Mikrogramm und 100 Milligramm pro Liter im als Endprodukt erhaltenen Medium liegen.

Wenn die alkalischen Extrakte neutralisiert werden, wird gewöhnlich ein feiner Niederschlag gebildet. Die Niederschlagbildung ist minimal, wenn beim Kombinieren der sauren und alkalischen Extrakte der pH-Wert des alkalischen Extrakts nicht unter dem des schließlich erhaltenen Mediums liegt. Dieser Niederschlag wird aus Hemizellulosen und Zellulosanen bestehen, die durch Abbau der größeren Zellulosen Moleküle erhalten worden sind. Da diese Substanzen nicht mehr in einer komplexen Matrix wie im ursprünglichen Material miteinander verbunden sind« werden sie als Nährstoffe für die Mikroorganismen leicht verfügbar sein. Die Tatsache, daß sie in Form eines feinverteilten Niederschlags vorliegen, macht sie ebenfalls leichter als Nährstoff verfügbar. Lignin kann ebenfalls einen Teil dieses

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Niederschlags bilden und für einige Mikroorganismen (insbesondere Arten der höheren Pilze) werde« dieses als Nährstoff verfügbar sein.

Wenn ein klares Medium von Wichtigkeit ist, kann der Niederschlag abfiltriert und getrennt mit einem Teil der sauren Reagenzien in lösung erhitzt werden. Der größte Teil des Niederschlags wird durch diese Behandlung löslich gemacht und der erhaltene filtrierte Extrakt kann zum Medium zugesetzt werden.

Bedingungen zur Wärmebehandlung mit sauren Reagenzien

Diese Bedingungen sind weniger drastisch als die Bedingungen, die zur Hydrolyse aller Kohlehydrate zu Zuckern benötigt werden. Zur Behandlung vieler Rohmaterialien wurde ein Erhitzen mit den sauren Reagenzien bei oder unter 100⁰C für 2 bis 3 Stunden als ausreichend befunden. Bestimmte Rohstoffe können mit Vorteil mit den sauren Reagenzien bis zu 10 Stunden bei 100⁰C oder bis zu 3 Stunden bei 121⁰C erhitzt werden.

In Versuchen zur Abschätzung des Wirkungsgrads des Verfahrens wird empfohlen, daß das Erhitzen mit den sauren Reagenzien bei 100⁰C durchgeführt wird, bis ein positiver Versuch auf die Anwesenheit von Furfurol erhalten wird,

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wobei die Grenzen dieser Säurebehandlung in der Wärme gerade unterhalb dieser Heizperiode gesetzt werden.

Bedingungen zur Wärmebehandlung mit den alkalischen Reagenzien

Zur Behandlung vieler Rohstoffe wurde ein Erhitzen mit den alkalischen Reagenzien über eine Zeitspanne von 2 bis 3 Stunden bei einer Temperatur bei oder unter 100⁰C für ausreichend befunden. Bestimmte Rohstoffe können mit Vorteil bis zu 10 Stunden auf 100⁰C oder bei höheren Temperaturen bis zu 150⁰C für Zeitspannen bis zu J> Stunden erhitzt werden.

Bedingungen für das alkalische Einweichen und die alkalische Oxydation

Das Material muß in den alkalischen Reagenzien bei O⁰C bis 30°C über Zeitspannen zwischen 2 und 48 Stunden eingeweicht werden. Wenn die alkalische Weiche zur Extraktion von löslich gemachtem Material angewendet wird oder wenn alkalisch behandeltes Material mit Wasser gewaschen wird, kann die Anwendung von Temperaturen unter 20⁰C die Menge löslich gemachten Rohmaterials erhöhen.

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Die am besten geeignete Dauer des Aussetzens an der Luft der alkalisch behandelten Stoffe schwankt mit der Temperatur, wobei die Belüftungsdauer maximal wie folgt vorgeschlagen wird:

Temperatur 20⁰C

Belüftungsdauer	Tage
14	η
5	It
2	Stunden
24

40⁰C 50 bis 100⁰C

In Versuchen mit Haferspelzen wurde beispielsweise gefunden, daß eine Belüftung der alkalisch behandelten Spelzen bei 60°C für 4 Stunden ausreichte.

Verfahren zur Herstellung halbfester Medien für das Flächenwachstum von Pilzen

Zur Herstellung dieser Arten von Nährmedien können alternativ die folgenden Verfahren angewendet werden. In allen genannten Verfahren werden die Reagenzien gelöst, falls nichts anderes erwähnt ist, unter Verwendung des minimalen Wasservolumens, das zur vollständigen Befeuchtung des Rohmaterials notwendig ist.

Verfahren 1. Das Rohmaterial wird entweder eingewlcht oder mit den sauren Reagenzien in der Wärme behandelt und dann durch Zugabe einer konzentrierten Lösung der alkalischen

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Reagenzien neutralisiert.

Verfahren 2. Das Rohmaterial wird entweder eingeweicht, eingeweicht und gelüftet oder in der Wärme mit den alkalischen Reagenzien behandelt und dann neutralisiert durch Zugabe einer konzentrierten Lösung der sauren Reagenzien.

Verfahren 3. Ein Teil des Rohmaterials wird mit den sauren Reagenzien wie im Verfahren 1 behandelt. Der Rest des Rohmaterials wird mit den alkalischen Reagenzien durch eine der im Verfahren 2 angegebenen Behandlungen behandelt. Die mit Säure und Alkalien behandelten Rohmaterialien werden dann zusammengegeben, um das Medium zu bilden.

Verfahren 4. Das Rohmaterial wird mit einem Teil der sauren Reagenzien behandelt und anschließend eine konzentrierte Lösung aller alkalischen Reagenzien zugegeben. Eine der Behandlungen gemäß Verfahren 2 wird dann angewendet und das Medium durch Zugabe einer konzentrierten Lösung des Rests der sauren Reagenzien neutralisiert.

Verfahren 5. Wie gemäß Verfahren 4 mit der Ausnahme, daß ein Teil der alkalischen Reagenzien zuerst verwendet wi rd.

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Jedes dieser Verfahren kann bei der Herstellung von Nährmedien entsprechend der Erfindung Je nach dem verwendeten Rohmaterial Vorteile haben. Für ein vorgegebenes Rohmaterial werden die Behändlungsbedingungen weniger drastisch sein als die Bedingungen, die für die Herstellung von flüssigem Medium angewendet werden.

Es ist vorteilhaft, die Wärmebehandlung mit den sauren und/oder den alkalischen Reagenzien vorzunehmen, da hierbei sterile Medien hergestellt werden können unter weniger drastischen Bedingungen der Wärmebehandlung, als sie zur Sterilisation von Medien benötigt werden, wenn diese einen pH-Wert besitzen, der für das Mikrobenwachstum verwendet wird.

Beispiele für Anwendungen des Verfahrens

Das allgemeine Verfahren, das bei der Durchführung der in den Beispielen 1 bis I5 beschriebenen Methoden angewendet wird, ist das folgende:

Eine abgewogene Menge Rohmaterial wird in Wasser für wenigstens 5 Stunden eingewlcht und das minimale Volumen Wasser bestimmt, das zur vollständigen Befeuchtung dee Materials notwendig ist. Die zur ersten Behandlung gebrauchten Reagenzien werden in 120 bis 200 % dieses Wasservolumens

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aufgelöst und die geeignete Behandlung durchgeführt.

Die Flüssigkeit wird von dem Rückstand abgezogen, der so weitgehend wie möglich von Flüssigkeit befreit wird durch Abpressen. Der Rückstand wird dann verschiedene Male mit Wasser gewaschen und falls eine anschließende Behandlung folgen soll, werden die Reagenzien in einem Minimalvolumen Wasser gelöst und zur Behandlung des nassen Rückstands verwendet. Wenn dieser Rückstand nicht als Teil des Mediums benötigt wird, wird er von Flüssigkeit durch Pressen befreit und gewaschen.

Alle Extrakte und Waschflüssigkeiten werden kombiniert und bilden das Medium und in bestimmten Fällen wird der unlösliche aber chemisch abgebaute Rückstand ebenfalls zugefügt. Wenn die sauren und alkalischen Extrakte und Waschlösungen zusammengegeben werden, wird gewöhnlich ein feiner Niederschlag gebildet, der im Medium belassen wird. Bei allen untersuchten Mikroorganismen wurde gefunden, daß dieser Niederschlag ein leicht verfügbarer Nährstoff ist.

Das hergestellte Medium erfordert nur kleinere Einstellun-

gen für das Wachstum optimalen pH-Wertsund wird schließlich auf das vorbestimmte Volumen aufgefüllt.

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Wenn dieses Verfahren in einem geschlossenen System durchgeführt wird und steriles Wasser zum Auswaschen verwendet wird, braucht das fertige Medium nicht weiter sterilisiert zu werden. Zur Abschätzung der Wirksamkeit der Extraktionsverfahren kann der Rückstand (wenn er nicht als Teil des Mediums verwendet wird) getrocknet und ausgewogen werden.

Die Verwendbarkeit des hergestellten Mediums für das Wachstum eines Pilzmyzels kann nach folgendem Verfahren abgeschätzt werden:

Das Medium wird in Mengen von 50 ml in konische Kolben von 250 ml verteilt und falls notwendig, durch Erhitzen 20 Minuten auf 115°C sterilisiert. Es wird anschließend mit 1 ml einer Suspension von homogenisiertem, gewaschenem Myzelium geimpft. Die geimpften Kolben werden auf einem Schüttelinkubator 3 bis 7 Tage bebrütet. Die Kolben werden entfernt und 5 bis 10 Minuten auf 100⁰C erhitzt, um weiteres Wachstum zu unterbrechen. Das Myzelium wird abfiltriert, gewaschen, getrocknet und ausgewogen. Gehört unlöslicher Rückstand zum Medium, so kann das Wachstum aus der Proteinausbeute nach der Methode von Kjeldahl bestimmt werden.

Es können zur Auswertung des Wachstums von Bakterien und Hefen auf den hergestellten Nährböden übliche mikrobiolo-

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gische Techniken verwendet werden. Nützliche Produkte aus Bakterien, Hefen oder Pilzen können durch übliche Verfahren oder biologische Prüfungsmethoden bestimmt werden. Die verschiedenen Verfahren und Ergebnisse für die Beispiele 1 bis I5 sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt. Die in den Tabellen beschriebenen Behandlungen wurden im einzelnen wie folgt durchgeführt:

Für Jedes Beispiel werden 20 g Ausgangsstoff verwendet* um 1 Liter Nährmedium herzustellen, was einer angenäherten Konzentration von 15 g löslicher Kohlenstoffquelle je Liter entspricht. Als

Mikroorganismus wird Tricholoma nudum verwendet, außer wo in den Tabellen andere Mikroorganismen angegeben sind. Es wird 4 bis 7 Tage bei 28°C auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert (100 Schüttelbewegungen pro Minute, 2,5 cm Ausschlag) oder mit Hilfe eines Drehschüttiers (250 Umdrehungen pro Minute) unter Anwendung der in den Tabellen I und III aufgeführten Nährstoffe mit Glukose als Kohlenstoffquelle. Tricholoma nudum wird unter gleichen Bedingungen wie bei den angegebenen Beispielen gezüchtet. Typische Ergebnisse dieser Versuche sind in den Tabellen angegeben.

(a) Saures Einweichen. Entsprechend der ausgewählten Stick-

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stoffquelle für das Medium werden die in der jeweiligen Tabelle angegebenen sauren Reagenzien kombiniert, in 100 ml Wasser gelöst, zu 20 g des Rohmaterials zugegeben und 18 Stunden stehengelassen. Eine konzentrierte Lösung der sauren Reagenzien wird zu dem nassen Rückstand zugegeben, wenn nach der sauren Weiche eine vorher angegebene Behandlung nachfolgt*

(b) Saure Wärmebehandlung. Die sauren Reagenzien, die in den entsprechenden Tabellen aufgeführt sind, werden in 100 ml Wasser gelöst, zu 20 g Spelzen zugefügt, mindestens 4 Stunden stehengelassen und dann erwärmt, während der angegebenen Zeit auf die angegebene Temperatur. In einigen Beispielen wird Salpetersäure

bei der anfänglichen sauren Wärmebehandlung fortgelassen und verwendet, um anschließend an die alkalische Extraktion eine weitere saure Wärmebehandlung durchzuführen.

(c) Alkalisches Einweichen. Die alkalischen Reagenzien in den entsprechenden Tabellen werden in 100 ml Wasser gelöst und zu 20 g des Rohmaterials zugefügt und 2k Stunden stehengelassen. Wenn die alkalische Welche anschließend an eine saure Behandlung durchgeführt wird, werden die alkalischen Reagenzien in einer Mindestmenge Wasser gelöst und zu dem nassen, gewaschenen Rückstand zugegeben. Nach gründlichem Mischen des alkalisch behan-

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delten Rückstands wird 24 Stunden stehengelassen.

(d) Alkalische Wärmebehandlung. Die in den entsprechenden Tabellen aufgeführten alkalischen Reagenzien werden In 100 ml Wasser gelöst und zu 20 g Rohmaterial zugegeben und wenigstens 4 Stunden stehengelassen und dann für die angegebene Dauer und Temperatur erwärmt. Wenn diese Behandlung an eine saure Behandlung anschließt, werden die alkalischen Reagenzien in einem Mindestvolumen Wasser gelöst und zum nassen gewaschenen Rückstand zugefügt.

(e) Belüften. Das mit Säure oder Alkalien behandelte Rohmaterial wird von überschüssiger Flüssigkeit des Reagenzes abgepreßt und auf einem offenen Tablett oder einer Schale bei der angegebenen Temperatur und Zeitdauer ausgebreitet.

(f) In den in den Tabellen aufgeführten Einzelheiten werden in Einzelfällen zusätzliche Reagenzien angeführt.

Die angegebenen Mengen sind zusätzlich zu denen, die in den Tabellen I bis III genannt sind.

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Beispiele 1 bis 6

Rohmaterial - Käfarspelzen N₀?¹ als N-quelle, Reagenzien (vgl. Tabelle I)

	1	Erste Be handlung	Zweite Be handlung	Dritte Be handlung	% Extrahiert	Myzeliumausbeute pro 100 g Kohlenstoffquelle	17671
	2	Eingeidcht in sauren Reagen zien	Eingeweicht in Alkali-Reagen zien		65	17,9 g	O
	3	Erwärmt mit sauren Reagen zien 1/2 h bei 100⁰C	Eingeweicht in Alkali-Reagen zien	-	78	18,5 g
O <P 09 #*		Erwärmt mit sauren Reagen zien 1/2 h bei 100⁰C	Eingeweicht in Alkali-Reagen zien	-	Rest zusammen mit Myzelium	35 g
Ϊ437		Erwärmt mit sauren Reagen zien, kein HNO,	Eingeweicht in Alkali-Reagen zien	Erwärmt mit HNO, -2h bei 100⁰C	75	T. nudum 29,7 g Morchella Hyorida 24,8 g
					Forts.:

Forts.

Erste Behandlung

Zweite Behandlung

Dritte Be- % Extrahiert Myzellumausbeute pro handlung 100 g Kohlenstoffquelle

Eingeweicht in Alkall-Reagenzien

Erwärmt' mit sauren Reagenzien bei 100⁰C

65

17,6 g

Eingeweicht in Alkali-Reagenzien + 1,5 g NaOH zusätzlich

Erwärmt mit sauren Reagenzien + 2,3 g HNO, als Zusatz 2 η bei 100°C

22,9 g

Anmerkung: Die Ausbeuteangabe in Beispiel 3 kann etwas ungenutzte Haferspelzen einschließen. Die erhöhte Proteinausbeute (6,2 g) gegenüber der Angabe in Beispiel 3 (4,0 g) zeigt Jedoch ein höheres Wachstumsausmaß an.

cn ο ro

Beispiele 7 bis 10 Verschiedene Ausgangsstoffe

* als N-Quelle, Reagenzien (vgl. Tabelle I)

Erste Behandlung 2. Behandlung J>, Behandlung

Extrahiert Myceliumausbeute je g Kohlenstoffquelle

Kakaoschalen

Erwärmt mit sauren Reagenzien 1/2 h bei 100⁰C

Eingeweicht in Alkali-Reagenzien

11,6 g

Maisstiele

Erwärmt mit sauren Reagenzien 75 Min. bei 100⁰C

Eingeweicht in Alkali-Reagenzien

Erwärmt mit Alkalireagen zien 5 h bei 60⁰C

Weizenstroh

Erwärmt miΪ sauren Reagenzien 4 h bei 90°C

Eingeweicht in Alkali-Reagenzien

Erwärmt mit Alkali-Reagenzien 1 h bei 100⁰C und 24 h belüftet 65

18,6 g

gorts.:

Forts.:

Erste Behandlung 2. Behandlung Dritte Behandlung % Extrahiert

%eeliumausbeute je 100 g Kohlenstoffquel le

Reisspelzen

Erwärmt mit sauren Eingeweicht in Reagenzien 6 h bei Alkali-Reagen-100⁰C zien

29.5 g

Glukose als Kohlenstoffquelle

19,2 g

Beispiele 11 bis 13 Ausgangsstoffe Weizenspelzen und Kakaoschalen« NH^NO, als N-Quelle (Reagenzien vgl. Tabelle III (b)) Erste Behandlung Zweite Behandlung Dritte Behandlung % Extrahiert Myceliumausbeute

pro 100 g Kohlenstoff quelle

11 Haferspelzen

Erwärmt mit sauren Eingeweicht in Erwärmt mit HNO, ,-o ₁₉

Reagenzien ohne HNO, Alkal-Reagen- 2 h bei 100⁰C ■> °° ^L<L ^g

1/2 h ^? zien

12 Erwärmt mit sauren Eingeweicht in Erwärmt mit HNO,, Kq h. p* „ ' Reagenzien ohne HNO, Alkali-Reagen- 2 h bei 100⁰C ^ ^oy'* ° ^s

ο + 0,9 g HCl, 1/2 h ^{zien + X}'° S ^Na0H

■m _———_— ;

** 13 Kakaoschalen

ο Erwärmt mit sauren Eingeweicht in Erwärmt mit HNO, ^), c pr ο «.

*- Reagenzien ohne HNO, Alkali-Reagen- 2 h bei 100⁰C * ⁰^⁰ ^⁵'^ ^s

^ + 2,53 g HCl ^p zien + 2,85 g

^ 1/2 h NaOH

Glukose als Kohlenstoffquelle 21,9 g Beispiele 14 und Haferspelzen (NH₄J₂SO₄ als N-Quelle (vgl. Tabelle II) Erste Behandlung Zweite Behandlung 3· Behandlung % Extrahiert Myceliumausbeute

pro 100 g Kohlenstoff quelle

14 Eingeweicht in Erwärmt mit sauren

Alkali-Reagenzien Reagenzien 15 Min.

15 Erwärmt mit sauren Eingeweicht in Reagenzien 20 Min. Alkali-Reagenzien bei 100⁰C

«/Ο

Beispiel 16

Extraktion von Haferspelzen mit Alkali(NaOH)

10 g gemahlene Haferspelzen, die durch ein Sieb der Maschenweite 0,246 ram gesiebt worden waren, werden in 20 ml 1Obiger Natronlauge 24 Stunden eingeweicht. Die Spelzen werden dann in einem Heißluftofen 1 Stunde auf 60⁰C erwärmt und bei Raumtemperatur 24 Stunden gelüftet.

Die alkalisch behandelten Spelzen werden dann wiederholt mit Wasser gewaschen und insgesamt 1 Volumen von etwa l60 ml Extrakt erhalten. Der pH-Wert wird dann auf 5,5 mit Salpetersäure eingestellt und das Endvolumen auf 175 ml aufgefüllt. Beim Ansäuern des Extrakts bildet sich ein feiner flockiger Niederschlag, der nach dem Abfiltrieren, Trocknen und Wiegen etwa 11 % des extrahierten Materials aus den Spelzen auemacht. Dieser Niederschlag wird als Teil des Nährmediums zurückbehalten.

Das Gesamtgewicht des aus den Spelzen extrahierten Materials beträgt 6,5 g.

10 ml des Extrakts werden zu 40 ml des folgenden SaIzmediums in einem konischen Kolben von 250 ml gegeben.

- 56 -

. 1098U/0437

Salzmedium

1 g KH₂PO₄ 0,5 g Mg SO₄.71^0 4,7 g (NH₄J₂SO₄ 0,3 g CaCl₂

gelöst in

800 ml destilliertem Wasser, pH-Wert auf 5,5 eingestellt

Das Medium in den 250 ml-Kolben wird 20 Minuten bei einem Dampfdruck von 1,07 atm sterilisiert. Jeder Kolben enthält dann 50 ml steriles Medium mit 0,75 % Haferspelzenextrakt + anorganische Nährsalze.

Nach der beschriebenen Methode werden Nährmedien für höhere Pilze erhalten. Agaricus campestris und Boletus luteus werden in Schüttelkolbenkulturen auf diesem Haferspelzenmedium gezüchtet. Agaricus campestris wird auch in 40 ml des gleichen Salzmediums gezüchtet, wozu 10 ml Zuckerlösung mit je 2,5 g Xylose und Glukose zugegeben sind.

Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle aufgeführt:

TABELLE!

1098U/0437

Organismus

Medium % Kohlenstoff-

quelle im Medium

Ptyceliumausbeute je 100 g C-Quelle

Agaricus Cam- Haferpestris spelzenextrakt

Glukose Xylose

Boletus luteus Haferspelzen extrakt

0,75 %

5 %

5 *

0,75 %

25 g

5,4 g €A g

30 g

Dieses Beispiel zeigt, daß Kulturen höherer Pilze auf Medien wachsen, die durch alkalische Behandlung von Rohmaterialien aus Kohlehydraten hergestellt sind. Es zeigt auch, daß diese Organismen alkalische Extrakte von Haferspelzen als Kohlenstoffquelle verwerten können und daß die Myzeliumausbeute sogar größer sein kann als sie mit Zuckern wie Xylose und Glukose als Kohlenstoffquelle erhalten wird.

Beispiel 17

Saures Einweichen bei Raumtemperatur und folgende Alkali-Behandlung

10 g ungemahlene Haferspelzen werden Über Nacht in 45 ml

109844/0437

l#iger Phosphorsäure eingeweicht. Die überschüssige Säure (30 ml) wird abgetrennt und der Rückstand mit 30 ml Wasser gewaschen. Der saure Extrakt und die Waschlaugen werden kombiniert und abgestellt und bilden Teil des Mediums.

Zur Entfernung des größten Teils Feuchtigkeit vor der Alkalizugabe wird der Rückstand 2 1/2 Stunden auf 6O⁰C erhitzt. Der teilweise getrocknete Rückstand wird über Nacht in 40 ml Alkalireagens (10 g NaOH +1Og KOH je 100 ml) eingeweicht und nach dem Ausbreiten in dünner Schicht 1 Stunde auf 6O⁰C erwärmt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gelüftet.

Versuche» diesen Rückstand mit kleinem Wasservolumina zu waschen, ergibt ein Gel. Es werden daher I50 ml Wasser zugegeben und eine fast klare dicke Flüssigkeit gebildet, aus der eine kleine Menge Sediment abgetrennt werden kann. Das Sediment wird zwei- oder dreimal mit Wasser gewaschen.

Der kombinierte saure Extrakt und die Waschflüssigkeiten und die alkalischen Extrakte und Waschflüssigkelten werden zusammengegeben zu einem Gesamtvolumen von 4j5O al. Der pH-Wert des Mediums wird auf 5,5 mit einem gleichen Volumen (122 ml) n/10 HNO, und n/10 HgSO^ eingestellt. Das endliche.

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109844/Π437

1 /b/502 HO

Volumen des Mediums wird auf 600 ml aufgefüllt. Das Gesamtgewicht des aus 10 g Haferspelze extrahierten Materials
ist 7*3 g. Die Konzentration des Haferspelzenextrakts im Medium beträgt 1,25 %.

Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Organismus % Kohlenstoffquelle Myceliumausbeute

im Medium je 100 g C-Quelle

Boletus luteus 1,25 18 g

Tricholoma nudum 1,25 22 g

Agarius Campestris 1,3 16 g

Die Wachstumsexperimente wurden wie im Beispiel 1 durchgeführt .

Beispiel 18

Wärmebehandlung mit sauren Reagenzien und anschließender Wärmebehandlung mit Alkali-Reagenzien

40 g ungemahlene Haferspelzen werden über Nacht in 120 ml einer Lösung eingeweicht, die diejLn Tabelle 1 angegebenen

- 40 -

sauren Reagenzien enthält, und mit diesen Reagenzien 2 5/4 Stunden auf 10O⁰C erwärmt, überschüssiges saures Reagens (60 ml) wird abgezogen und der Rückstand zweimal mit 60 ml Wasser gewaschen. Ein abschließendes Waschen wird durch Einweichen des Rückstands 1 Stunde in 50 ml einer Lösung aus 0,42 g KOH (1/10 der Alkalireagenzien von Tabelle I) durchgeführt. 54 ml der alkalischen Waschflüssigkeit werden abgezogen und bilden Teil des Mediums.

Das verbleibende alkalische Reagens (4,0 g KOH) wird in 50 ml Wasser gelöst und der Rückstand in dieser Lösung über Nacht eingeweicht. Nach dem Abziehen des alkalischen flüssigen Reagenzes (75 ml) wird der Rückstand 1 Stunde auf 100⁰C in feuchter Atmosphäre erwärmt. Nach dieser Behandlung wird der Rückstand weich und zerfällt leicht. Nach einer Behandlung während 1 Minute in einem Waring-Mischer mit 200 ml Wasser wird eine homogene klare Flüssigkeit erhalten.

Zu den kombinierten sauren Extrakten und Waschflüssigkeiten werden 0,12 g Mg(OH)₂ und 0,18 g Ca(OH)₂ zugegeben und diese Lösung mit den alkalischen Extrakten und Waschflüssigkeiten kombiniert. Eine kleine Menge feinen Niederschlags wird bei dieser Stufe gebildet. Der gemessene pH-Wert des Mediums beträgt 4,5. Zur Einstellung des

- 41 -

pH-Wertes auf 5,5 sind J>2 ml 0,1-n NaOH nötig.

Das Volumen des Mediums wird auf 1 1 aufgefüllt. Es wird nach Wunsch für Wuchsexperimente verteilt und durch Erhitzen 20 Minuten auf 115°C sterilisiert.

Die Konzentration der Haferspelzen im Medium beträgt 4 %. Es werden folgende Ergebnisse erhalten:

Organismus % Kohlenstoffquelle Myzeliumausbeute

im Medium pro 100 g C-Quelle

Tricholoma nudum 4,0 12 g

Beispiel 19

Herstellung eines halbfesten Mediums aus Weizenstroh

(A) 40 g Weizenstroh werden in 200 ml einer Lösung eingetaucht, die die in Tabelle I angegebenen sauren Reagenzien enthält. Nach dem Einweichen über 4 Stunden wird es 1/2 Stunde auf 100°C erhitzt. Die alkalischen

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Reagenzien gemäß Tabelle I werden in einem Minimum Wasser gelöst und zur Neutralisation zugesetzt. Der pH-Wert wird auf 5,5 eingestellt und das Weizenstroh durch Erhitzen bei 1,07 atm 20 Minuten sterilisiert.

(B) 40 g Weizenstroh werden mit 200 ml Lösung behandelt, die die in Tabelle I angegebenen alkalischen Reagenzien enthält, und anschließend 24 Stunden eingeweicht. Die sauren Reagenzien gemäß Tabelle I werden in einem Minimum Wasser gelöst und zur Neutralisation des alkalisch behandelten Strohs verwendet. Der pH-Wert wird auf 5*5 eingestellt und das Weizenstroh durch Erhitzen auf 1,07 atm 20 Minuten sterilisiert.

(C) 40 g Weizenstroh werden 4 Stunden in 75 ml einer Lösung eingeweicht, die die sauren Reagenzien gemäß Tabelle III (c) enthält. Das sauer behandelte Stroh wird dann 2 Stunden auf 100⁰C erhitzt und durch Zugabe von 5 ml einer Lösung neutralisiert, die die alkalischen Reagenzien gemäß Tabelle III (c) enthält; der pH-Wert des Mediums wird auf 5,5 eingestellt.

Die Zugabe von Alkali und die pH-Werteinstellung werden in steriler Atmosphäre unter Verwendung steriler Reagenzien durchgeführt. Das Strohmedium wird 7 Tage bei 28⁰C

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10984W0437

inkubiert und zeigt bei diesem Versuch keine Anzeichen von Mikroorganismen als Verunreinigung. Eine weitere Sterilisierung war nicht erforderlich.

(D) Es wurde wie gemäß (C) gearbeitet unter Verwendung von 40 g Haferspelzen.

Die Proben von modifiziertem Weizenstroh werden mit homogenisiertem Myzel von Tricholoma nudum und Agaricus Campestris geimpft und bei 28⁰C bebrütet. Das Stroh wird sehr schnell mit wachsenden Myzelien bedeckt, wobei das Wachstum nach 7 Tagen Inkubationszeit ein Maximum erreicht.

PATENTANSPRÜCHE:

Claims

PATENTANSPRÜCHE :

1) Verfahren zur Herstellung eines Nährmediums für Pilze und Mikroorganismen durch Abbau eines Ausgangsstoffs pflanzlichen Ursprungs, bis dieser eine assimilierbare Kohlenstoffquelle bildet, dadurch gekennzeichnet, daß man den Ausgangsstoff hintereinander in jeder gewünschten Reihenfolge mit sauren und alkalischen Reagenzien behandelt, die wenigstens den größeren Teil der Elemente Phosphor, Schwefel Stickstoff oder Kalium oder eine Kombination dieser Elemente beisteuern, der im fertigen Medium benötigt wird, wobei wenigstens eine der Behandlungen eine Abbaubehandlung und eine andere entweder eine Abbaubehandlung oder eine Neutralisationsbehandlung sind.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

1/67502

daß die saure Behandlung bei Atmosphärendruck durchgeführt wird.

3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die saure wie die alkalische Behandlung Abbaubehandlungen sind.

4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einer sauren Behandlung eine alkalische Behandlung folgen läßt.

5) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil des Ausgangsmaterials durch eine saure Behandlung und ein Teil durch alkalische Behandlung abgebaut und die abgebauten Produkte kombiniert wer-

6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Abbaubehandlung bei einer Temperatur über Umgebungstemperatur durchgeführt wird.

7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Abbaubehandlung mittel? «tier Lösung des Reagenses in einer Wassermenge durchgeführt wird_f

BAD ORIGINAL - 2 -

109844/D437

die nicht mehr als das ^fache der Menge beträgt, die zur vollständigen Befeuchtung des Materials notwendig ist.

8) Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial zwischen zwei aufeinanderfolgenden Behandlungen oder nach der letzten Behandlung

an der Luft eingeweicht wird. mt

9) Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die saure Abbaubehandlung bei oder unter 100⁰C bis zu 10 Stunden mit einer Säuremenge bis zu

50 Gew.-^ des Ausgangsmaterials durchgeführtlwird.

10) Verfahren nach Anspruch 1 bis 9* dadurch gekennzeichnet, daß die, alkalische Abbaubehandlung bei einer Temperatur bis zu 100⁰C für eine Zeitspanne bis zu 10

Stunden durchgeführt wird. M

11) Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß alle Behandlungen mit den Reagenzien in einem geschlossenen System durchgeführt werden.

12) Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als saures Reagens Phosphorsäure oder ein saures Phosphat verwendet werden.

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Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als saures Reagens Schwefelsäure verwendet wird.

14) Verfahren nach Anspruch 1 bis 13* dadurch gekennzeichnet, daß als alkalisches Reagens Kaliumhydroxyd oder Kaliumcarbonat verwendet werden.

15) Verfahren nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß als alkalisches Reagens Natriumhydroxyd oder Natriumcarbonat verwendet werden.

16) Verfahren nach Anspruch 1 bis I5, dadurch gekennzeichnet, daß als Stickstoffquelle Salpetersäure, Ammoniak oder Harnstoff verwendet werden.

17) Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß als alkalisches Reagens Calciumhydroxid verwendet wird.

18) Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als pflanzliches Material ein Material verwendet wird, das hauptsächlich aus Zellulose und/oder Hemizellulose besteht.

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Γ/67502

19) Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß als pflanzliches Material Haferspelzen verwendet werden.

20) Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß als pflanzliches Material Kakaoschalen verwendet werden.

21) Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß als pflanzliches Ausgangsmaterial Maisstengel verwendet werden.

22) Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß als pflanzliches Ausgangsmaterial Weizenstroh verwendet wird.

Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß als pflanzliches Ausgangsmaterial Reisspelzen verwendet werden.

24) Verfahren nach Anspruch 1 bis 2jJ, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium eh flüssiges Medium 1st« das durch Extraktion von wenigstens 30 Gew.-% des Ausgangsmaterials erhalten worden ist.

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so ^m7502

25) Verfahren nach Anspruch 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium ein halbfestes Medium ist, das durch Abbaubehandlung mit einem alkalischen Reagens und anschließender Neutralisation mit einem sauren Reagens erhalten worden ist.

26) Verfahren nach Anspruch 29* dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismen höhere Pilze verwendet werden.

27) Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Pilz ein eßbarer Edelpilz ist.

28) ( Verfahren nach Anspruch 27* dadurch gekennzeieh-I

net,' daß dar Edelpilz Agaricus campestris oder Agarlcus bisporus ist.

29) Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Edelpilz Tricholoma nudum ist.

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