DE2622982B1 - Verfahren zur Gewinnung von Eiweiss mit niederem Nucleinsaeuregehalt aus Mikroorganismen - Google Patents

Description

• Mehrere Möglichkeiten für diese Extraktion der RNA wurden bereits beschrieben: a) alkalische Extraktion - deutsche Offenlegungsschrift 16 70 110.3, b) saure Extraktion, c) Behandlung mit hoher Salzkonzentration (NaCl, KC1, NH4Cl), d) Behandlung mit Detergentien (Dodecylsulfat usw) Alle diese Verfahren haben den Nachteil, daß die Mikroorganismen teilweise auf recht komplizierte Weise aufgeschlossen werden müssen, und das Eiweiß durch die Behandlung und die verschiedenen Zusätze teilweise hydrolysiert, racemisiert oder anderweitig verändert wird und dadurch für Ernährungszwecke unbrauchbar oder weniger geeignet wird. So verändert beispielsweise die alkalische Extraktion das Eiweiß in seiner Struktur derart, daß es kolloidale Lösungen bildet Eine Abtrennung wird erst nach Neutralisation möglich und erfordert danach die Entfernung der gebildeten Neutralsalze. Außerdem wird die herausgelöste RNA teilweise denaturiert und läßt sich enzymatisch nicht mehr quantitativ in lösliche Mononucleotide spalten.
• Aus der US-PS 37 20 585 ist es weiter bekannt, bei zwei bestimmten Hefesorten eine kurzzeitige Hitzeschockbehandlung durchzuführen, die aus einem zwei bis zwanzig Sekunden dauernden Erhitzen auf 60 bis 70"C und anschließendem ca. 20minütigem Erhitzen auf 45 bis 50"C bei pH-Werten zwischen 4,5 und 7 besteht.
• Dieses Verfahren hat den Nachteil. daß es Proteasen freisetzt, die das verwertbare (verdauliche) Eiweiß spalten und damit die Eiweißausbeute erheblich vermindert wird. Der restliche RNA-Gehalt wird nur reduziert und liegt immer noch über dem bevorzugten Bereich von 2%.
• Aus der DT-OS 2042571 ist ein Verfahren zur Gewinnung von Protein aus bakterieller Biomasse bekannt, bei welchem zuerst eine schockartige Alkalibehandlung vorgenommen, dann angesäuert wird und unter sauren Bedingungen eine Lyse vorgenommen wird und danach erneut neutralisiert und das Protein gewonnen wird. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß große Mengen an Alkali und Säure erforderlich sind und daher der Verfahrensaufwand zu hoch ist. Außerdem bestehen Abwasserprobleme durch den hohen Salzgehalt, der durch die Reaktion des Alkalis mit der Säure entsteht Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von Einzellerprotein zu schaffen, welches die oben dargestellten Nachteile der bekannten Verfahren nicht aufweist Insbesondere ist es ein Ziel der Erfindung, ein einfaches Verfahren zu schaffen, welches großtechnisch durchführbar ist, keine aufwendigen Apparaturen benötigt, ohne Zusatz von Fremdsubstanzen durchführbar ist und keine vorangehende Behandlung zur Abtötung und zum Aufschluß der Mikroorganismen erfordert und umweltfreundlich ist Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Gewinnung von Protein mit verringertem Nucleinsäuregehalt aus Mikroorganismen durch Wärmebehandlung, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß eine wäßrige Aufschlämmung der Mikroorganismen, gegebenenfalls unter Zusatz eines Materials mit Ribonuclease-Wirksamkeit, bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8,5 zwischen 63 bis 67"C erhitzt wird, bis der Gehalt an 5'-Nucleotiden im Medium einen bestimmten Wert erreicht hat, danach kurz aufgekocht und das unlösliche Rohprotein aus der Suspension abgetrennt wird.
• Bei der Durchführung des Verfahrens der Erfindung wird die Nucleinsäure ausschließlich in 5'-Nucleotide gespalten, die im Medium erscheinen, wobei keine 2'-und/oder 3'-Nucleotide gebildet werden. Je nach dem Nucleinsäuregehalt des eingesetzten Mikroorganismus und dem angestrebten Endgehalt an Nucleinsäure läßt sich daher leicht vorher bestimmen, bei welchem 5'-Nucleotidgehalt im Medium der Nucleinsäuregehalt auf den angestrebten Wert vermindert ist und daher die Erhitzungsbehandlung bei 63 bis 67"C beendet werden kann. Dabei ist es entscheidend wichtig, daß die genauen Temperaturgrenzen zwischen 63 und 67"C, vorzugsweise 65"C eingehalten werden und dabei der pH-Wert immer im angegebenen Bereich bleibt Da durch das Freiwerden der Nucleotide der pH-Wert im Laufe der Wärmebehandlung sinkt, wird durch Basenzugabe, vorzugsweise von Natronlauge, Kalilauge oder Ammoniak, der angegebene pH-Wert-Bereich eingehalten.
• Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden endogene Nucleasen aktiviert, und dies führt zur Spaltung der Nucleinsäure unter Bildung der als Nebenprodukte sehr erwünschten 5'-Nucleotide Adenosinmonophosphat (AMP), Guanosinmonophosphat (GMP), Cytosinmonophosphat (CMP) und Uridinmonophosphat (UMP). Die erforderliche Erhitzungsdauer hängt ab vom jeweils verwendeten Mikroorganismus, insbesondere von seinem Gehalt an endogenen Nucleasen. Da der Nucleasegehalt sehr verschieden sein kann, ist auch die Erhitzungsdauer sehr unterschiedlich und liegt im allgemeinen zwischen etwa 20 Minuten und etwa 20 Stunden.
• Im Laufe der erfindungsgemäßen Erhitzungsbehandlung wird das Eiweiß bereits großenteils in den unlöslichen Zustand überführt. Die Fällung des Eiweißes wird dann durch das kurze Aufkochen, d. h. auf Erhitzen zwischen etwa 90 und 100"C bei Normaldruck oder höheren Temperaturen bei Überdruck, vervollständigt.
• Dann wird das unlösliche Rohprotein aus der Suspension abgetrennt, beispielsweise durch Abzentrifugieren oder Filtrieren, und kann dann seiner Verwendung als Nahrungsmittel zugeführt oder in beliebiger Weise weiterverarbeitet werden.
• Für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich alle Arten von Mikroorganismen bzw. Einzellern wie beispielsweise Hefen, Bakterien, Pilze und dergleichen.
• Beispiele für geeignete Mikroorganismen sind Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Candida boidinii als Hefen, Nocardia erytropolis als Mycobakterium, Bacillus cereus und Bacillus subtilis für Bacillaceae, Streptococcus faecalis für Streptococcen, Pseudomonas fluoreszens für Pseudomonaden, Aspergillus niger für Schimmelpilze. Wie bereits erwähnt, werden die Mikroorganismen vorzugsweise in frisch geernteter, lebensfähiger Form eingesetzt, d. h. so, wie sie aus dem Züchtungsmedium gewonnen werden. Es können jedoch auch nach den bekannten Methoden der Konservierung lebender Mikroorganismen behandelte Einzeller verwendet werden, z. B. schonend getrocknete oder Iyophilisierte Einzeller.
• Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die Erhitzungsdauer zu verringern durch Zusatz eines Materials mit Ribonucleasewirksamkeit Hierunter werden sowohl gereinigte Ribonucleasepräparate als auch vorgereinigte oder rohe biologische Präparate verstanden, welche Ribonuclease enthalten. Bevorzugt werden als Material mit Ribonucleasewirksamkeit Keimlinge von Gräsern und Getreidearten, insbesondere Malzputzkeime oder Extrakte daraus, vorzugsweise Malzkeimextrakt Bei dieser Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren auch auf RN-asefreie Mikroorganismen wie beispielsweise die E. Coli MRE 600-Mutante anwendbar.
• In der Regel erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine Herabsetzung des RNA-Gehaltes im Einzellereiweiß auf 0 bis 0,2 Gew.-%. Die Verluste an Protein sind gering, insbesondere ist die Spaltung von Eiweiß und der Wertverlust durch Racemisierung vernachlässigbar.
• Die Proteinausbeute erreicht beim Verfahren der Erfindung 90% und mehr. Ein besonderer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß die Ribonucleinsäure praktisch quantitativ in die 5'-Nucleotide gespalten wird, die selbst wertvolle Substanzen darsteilen. Es ist daher möglich, aus dem Filtrat nach Abtrennung des Rohproteins präparativ die Nucleotide zu gewinnen.
• Besonders vorteilhaft ist es jedoch, das Filtrat wieder zur Neuzüchtung von Mikroorganismen zu verwenden.
• Die Mikroorganismen bauen aus den Nucleotiden wieder die benötigte Nucleinsäure auf, so daß praktisch auf diese Weise ein Kreislauf der Nucleotide erreicht wird. Gleichzeitig werden von den Mikroorganismen auch die übrigen in Lösung gegangenen Zellbestandteile, restliches löslich gebliebenes Protein und dgl. für das neue Wachstum verwertet. Daher kann die sonst bei der Züchtung von Mikroorganismen übliche Zugabe von Biotin oder Hefeextrakt ganz oder weitgehend unterbleiben.
• Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein reineres, besser verdauliches Eiweiß erhalten, welches frei ist von Detergentien, Salzen oder RNA. Bei den bisher üblichen Zellaufschlüssen mit Alkali oder Säuren werden dagegen verschiedene Aminosäuren im Eiweiß zerstört oder racemisiert.
• Ein besonderer Effekt des erfindungsgemäßen Yerfahrens liegt weiter darin, daß der Eigengeruch des Eiweißes, der vor allem bei Hefen ausgeprägt ist, dabei verschwindet. Auch dies macht das Einzellereiweiß gemäß Erfindung für den Gebrauch als Nahrungsmittel besser geeignet.
• Die RNA-Entfernung erfolgt auf besonders einfache und billige Weise. Als Nebenprodukte können die 5'-Nucleotide gewonnen werden. Durch Rückführung des Filtrats in die Kulturbrühen lassen sich darüber hinaus Einsparungen bei den Kulturmedien erzielen.
• Das Verfahren ist auch umweltfreundlich, da der Zellaufschluß ohne Schwierigkeiten verbrannt werden kann, was bei einem mit Salz, Säure oder Alkali durchgeführten Aufschlußmaterial nicht möglich ist.
• Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
• Beispiele lbis7 Je 2001 einer wäßrigen Aufschlämmung der in der Tabelle 1 aufgeführten Mikroorganismen mit einem Trockenmassegehalt von ca. 15 bis 20% werden auf 65"C erhitzt und 15 Stunden unter leichtem Rühren bei dieser Temperatur gehalten. Der pH-Wert wird dabei durch Zugabe von Natronlauge stets zwischen 7 und 8,5 gehalten. Anschließend wird der Ansatz kurz aufgekocht und das Rohprotein über Separatoren abgetrennt und getrocknet Die Ausbeute lag zwischen 25 und 32 kg Rohprotein. Tabelle 1 zeigt den RNA-Gehalt des Ausgangsmaterials und die dabei erzielte Spaltung der RNA.
• Tabelle 1 Tabelle 2 Bei- Biomasse Gattung RNA-Gehalt RNA- Bei- RNA-Spaltung spiel Spaltung spiel mit Malzkeimextrakt 1 Saccharomyces cerevisiae Hefe 0,5-1,5% 100% 8 100% 2 Saccharomyces Hefe 1,8% 87% 9 90% carlsbergensis 3 Candida boidinii Hefe 1,6% 11,3% 10 26% (ca. 14 Mte. alt) 4 Nocardia erytropolis Mycobakterium 1,6% 77% 11 100% 5 Bacillus cereus Bacillaceae 2,2% 16% 12 30% (mindestens 1 Jahr alt) 6 Streptococcus faecalis Streptococcen 2,3% 100% 13 100% 7 Pseudomonas fluoreszens Pseudomonaden 5,1% 55% 14 70% Wie die Tabelle 1 zeigt, verläuft das erfindungsgemäße Verfahren bei frischen Mikroorganismen mit sehr guter Ausbeute an 5'-Nucleotiden. Bei längere Zeit gelagerten Mikroorganismen ist die Ausbeute niedriger, was auf den verringerten RN-asegehalt zurückgeführt wird.
• Beispiele 8 bis 14 a) 3 kg Malzkeime werden gemahlen, mit 301 Wasser versetzt und 40 Min. bei 65"C gehalten. Die erhaltene Suspension wird direkt oder nach Abzentrifugieren der unlöslichen Malzkeimfragmente im folgenden Verfahren eingesetzt.
• b) Je 2001 einer Aufschlämmung der gleichen Mikroorganismen wie in den Beispielen 1 bis 7 mit gleichem Trockenmassegehalt, wie dort beschrieben, werden auf ca. 65"C erhitzt, mit der nach a) erhaltenen Malzkeimsuspension bzw. dem Extrakt versetzt und anschließend zwischen 2 und 15 Stunden bei 65"C weitererhitzt Die Aufarbeitung erfolgt dann wie bei den Beispielen 1 bis 7 beschrieben. Die Ausbeute lag zwischen 25 und 35 kg Rohprotein, der durchschnittliche Gehalt an reinem Eiweiß bei 70%.
• Tabelle 2 zeigt die erzielte Spaltung der RNA. Die Ausbeute an 5'-Nucleotiden betrug bei etwa 10% RNA-Gehalt in der Trockensubstanz jeweils ca. 7 bis 800 g an jedem der vier verschiedenen 5'-Nucleotide, bei geringerem RNA-Gehalt dem Ausgangsmaterial entsprechend weniger.
• Beispiel 15 Wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, wurde eine Aufschlämmung von 100g Trockenstubstanz Saccharomyces cerevisiae mit einem Gehalt von ca. 45% Protein und 1,5 bis 3% RNA in der Trockensubstanz ohne Zusatz eines Materials mit Ribonucleasewirksamkeit bei 65"C erhitzt, abgekocht und das Rohprotein abgetrennt Die Zusammensetzung von Filtrat und Rohprotein wurde bestimmt und ist in der nachfolgenden Tabelle 3 angegeben. Aus den angegebenen Werten ergibt sich eine Anreicherung des Eiweißgehalts im Rohprotein von 45 auf 56%.
• Bei Mikroorganismen mit höherem Ausgangseiweißgehalt kann die Ausbeute an Rohprotein bis auf 85% ansteigen.
• Tabelle 3 Bei- Filtrat Rohprotein spiel (kann zur Neuzüchtung zugesetzt werden) Menge T. S.I) Gehalt/ 5'-Nucleotide Rohprotein- Gehalt Ausbeute Proteolyt RNA-Gehalt Protein menge T. S.1) Protein Protein abbaubares Protein 15 30 g 16% 5-10% 70 g 56% 89% ca. 80% nicht nachd. T. S. d. T. S. weisbar ) = bezogen auf eingesetzte Trockensubstanz.

Claims (1)

1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Gewinnung von Protein mit verringertem Nucleinsäuregehalt aus Mikroorganismen durch Wärmebehandlung, d a durch g e -kennzeichnet, daß eine wäßrige Aufschlämmung der Mikroorganismen, gegebenenfalls unter Zusatz eines Materials mit Ribonucleasewirksamkeit, bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8,5 zwischen 63 bis 67"C erhitzt wird, bis der 5'-Nucleotidgehalt im Medium die gewünschte Höhe erreicht hat, danach kurz aufgekocht und dann das unlösliche Rohprotein aus der Suspension abgetrennt wird.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert durch Zusatz von wäßriger Natronlauge, Kalilauge oder wäßrigem Ammoniak im angegebenen Bereich gehalten wird.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Material mit Ribonucleasewirksamkeit Getreidekeimlinge oder ein Extrakt davon verwendet werden.

   Es ist bekannt, daß die Weltbevölkerung rapide zunimmt und dadurch in wenigen Jahrzehnten eine akute Nahrungsmittelknappheit zu erwarten ist In vielen Ländern ist dieser Zustand heute schon erreicht.

   Das Hauptproblem stellt dabei der Eiweißmangel dar.

   Der tägliche Bedarf des Menschen an Eiweiß beträgt ca.

   70 bis 100 g. In unterentwickelten Ländern wird dieser Eiweißbedarf hauptsächlich aus pflanzlicher Nahrung gedeckt Im Gegensatz zum tierischen Eiweiß enthält aber das pflanzliche Eiweiß sehr wenig an den beiden essentiellen Aminosäuren Lysin und Methionin. Wenn nur pflanzliches Eiweiß zur Verfügung steht, können deshalb schwerwiegende Mangelkrankheiten auftreten.

   Aus diesem Grund wird seit Jahren versucht, zur Deckung des Eiweißbedarfes der Weltbevölkerung neben tierischem und pflanzlichem Eiweiß auch mikrobielles Eiweiß heranzuziehen. Mikrobielles Eiweiß hat den Vorteil, daß es eine ähnliche Aminosäure-Zusammensetzung hat wie tierisches Eiweiß. Bei einer Ernährung mit mikrobiellem Eiweiß ist das Auftreten von Mangelkrankheiten, wie sie bei rein pflanzlicher Kost vorkommen können, nicht zu befürchten.

   Schon seit Jahrzehnten versucht man, Mikroorganismen zur Erzeugung von Nahrungs- oder Futtermitteln zu verwenden. Diese Kleinlebewesen besitzen den Vorteil, unter günstigen Bedingungen viel rascher als Pflanzen oder Tiere zu wachsen. Die nachstehende Tabelle zeigt dies anhand der Verdoppelungszeiten einiger Lebewesen Organismen Verdoppelungszeit der Biomasse Hefen und Bakterien 20-120 Minuten Mikroorganismen wie Algen 1-48 Stunden Gras 1-2 Wochen Küken 2-4 Wochen Schwein 4-6 Wochen Rind 1-2 Monate Die rasche Vermehrung der Mikroorganismen zeigt, daß in 1 bis 2 Stunden mehr Eiweiß gewonnen werden kann als bei der Schweine- oder Rindermast in 4 bis 8 Wochen.

   Einige Schwierigkeiten stehen dieser Art der Eiweißgewinnung jedoch noch entgegen: 1. Zur Züchtung der Mikroorganismen ist ein sehr großer technischer Aufwand (riesige Fermenter) erforderlich; 2. die Abtrennung der Organismen aus den Kulturbrühen bereitet in der erforderlichen Größenordnung technische Schwierigkeiten; 3. unerwünschte Inhaltsstoffe (z.B. Nucleinsäuren und Toxine) müssen aus den Mikroorganismen entfernt werden.

   Trotz dieser Schwierigkeiten werden Mikroorganismen bereits jetzt in großem Stil für die Fütterung von Haustieren gezüchtet (Futterhefe). Für die menschliche Ernährung wurde dieses Eiweiß aus Mikroorganismen aber bisher nicht oder nur in beschränktem Maß eingesetzt. Der hohe Ribonucleinsäure-Gehalt dieses Eiweißes stellt nämlich ein ernstes Problem dar.

   Ribonucleinsäure (RNA) wird im Säugerorganismus zu Harnsäure abgebaut, die ihrerseits wieder Gicht verursachen kann. Der RNA-Gehalt von Mikroorganismeneiweiß muß daher unter 2% liegen, vorzugsweise unter 0,5%.

   Eines der wichtigsten Ziele ist es daher, das mikrobielle Eiweiß frei von Ribonucleinsäure herzustellen. Dies gelingt bis heute nicht befriedigend. Es wurde bereits versucht, Mikroorganismen mit besonders niederem RNA-Gehalt zu züchten. Diese Mikroorganismen haben jedoch den Nachteil, daß sie erheblich langsamer wachsen. Es ist bekannt, daß Mikroorganismen mit hohem RNA-Gehalt schneller wachsen als solche mit niederem RNA-Gehalt. Dadurch entsteht ein echter Zwiespalt; das gewünschte schnelle Wachstum der Mikroorganismen ist gleichzusetzen mit hohem RNA-Gehalt Wird eine Produktionsverzögerung in Kauf genommen, können Mikroorganismen mit niederem RNA-Gehalt gezüchtet werden.

   Die zweite Möglichkeit der Entfernung der RNA aus dem Mikroorganismeneiweiß, welches häufig als Einzellerprotein [Singel Cell Protein (SCP)] bezeichnet wird, beruht auf der Extraktion der RNA und anschließender Abtrennung des unlöslichen Eiweißes.