DE4004633A1

DE4004633A1 - Verfahren zur herstellung von hefebiomasse

Info

Publication number: DE4004633A1
Application number: DE4004633A
Authority: DE
Inventors: Katsuya Miki; Frank Dr Hill; Khue Dr Tran-Dinh
Original assignee: Huels AG; Chemische Werke Huels AG
Current assignee: Huels AG
Priority date: 1990-02-15
Filing date: 1990-02-15
Publication date: 1991-08-22
Also published as: JPH05176757A; JP2992091B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hefebiomasse, wobei man Hefen mit einem hohen Gehalt an Ribonucleinsäuren (RNA) aus hochkonzentrierten Fermentationsbrühen einsetzt.

Hefebiomasse ist Ausgangsprodukt für die Herstellung bzw. Isolierung von RNA, woraus wiederum 5′-Nucleotide, wie 5′-Adeninmonophosphat (5′-AMP), 5′-Guanosinmonophosphat (5′-GMP) oder 5′-Inosinmonophosphat (5′-IMP), hergestellt werden können. Diese Produkte werden für pharmazeutische Zwecke sowie als Aroma- und Geschmacksstoffe in Lebensmitteln verwendet. Es können auch Hefehydrolysate hergestellt werden, die diese 5′-Nucleotide enthalten.

RNA-reiche Hefen sind aus der Literatur bekannt.

So kann man nach US 39 09 352 Hefen der Gattung Candida mutieren und dann die Stämme isolieren, die gegen KCl empfindlich sind. Mit diesen Stämmen können Hefebiomassen hergestellt werden, die nicht weniger als 12% RNA enthalten.

Nach EP-A-02 99 078 werden RNA-reiche Hefen von Candida utilis zur Herstellung natürlicher Hefeextrakte eingesetzt. Dabei werden die Hefen erhitzt, um hefeeigene Ribonucleasen zu desaktivieren, worauf die RNA-Komponenten extrahiert und dann mit Hilfe von 5′-Phosphodiesterase hydrolysiert werden. Vor der Wärmebehandlung weisen die Hefen RNA-Gehalte von bis zu etwa 17% auf.

Die genannten Hefestämme von Candida sind für die Gesundheit von Mensch und Tier nicht immer harmlos. Das ist zu beachten, da die Produkte als Lebensmittel und als Futteradditive verwendet werden. Die hohen RNA-Gehalte werden außerdem nach dem genannten Stand der Technik nur bei geringen Hefemengen in der Fermentationsbrühe erzielt. Die maximalen Trockensubstanzgehalte der Hefen liegen bei nicht mehr als 21 bzw. 15 g/l.

Dem entspricht die allgemeine Beobachtung, daß der RNA-Gehalt einer Hefe sein Maximum in der Anfangsphase der Kultivierung erreicht. Bei bekannten Bäckerhefen liegt der RNA-Gehalt, wenn man hohe Bio massegehalte von 30 bis 50 g/l Trockensubstanz eingestellt hat, allgemein bei etwa 5%, wobei in einzelnen Fällen auch RNA-Gehalte von bis zu 8% erreicht werden.

Hohe Biomassegehalte und gleichzeitig hohe RNA-Anteile sind noch nicht bekannt.

Es bestand daher die Aufgabe, Hefebiomasse mit einem RNA-Gehalt von über 10% herzustellen, wobei der Trockensubstanzgehalt der Hefen bei über 30 g/l, bezogen auf die Fermentationsbrühe, liegen sollte.

Die Aufgabe wird wie in Anspruch 1 angegeben gelöst.

Bei dem angegebenen Verfahren werden im allgemeinen ansatzweise Fermentationen und mindestens eine Zulauffermentation durchgeführt. Vorzugsweise werden 1 bis 4 Zulauffermentationen in Folge ausgeführt. Bei diesen Zulauffermentationen stellt man durch ein begrenztes Nährstoffangebot, wobei man für einen Zuckergehalt von unter 100 mg/l Fermentationsbrühe sorgt, eine Mangelsituation ein, durch die der Gärungsstoffwechsel unterdrückt wird. Die spezifische Wachstumsrate liegt dann unter 0,18 h^-1, wobei vorzugsweise mindestens während der Hälfte der Zeit der Zulauffermentation die spezifische Wachstumsrate unter 0,13 h^-1 liegt.

Für die Fermentation wird der Bäckerhefestamm Saccharomyces cerevisiae DSM 5616 eingesetzt. Dieser Stamm erreicht auch in der Anfangsphase der Fermentation, in der logarithmischen Wachstumsphase, den maximalen RNA-Gehalt von über 13%. Während der folgenden Zulauffermentation bei geringem Wachstum fällt der RNA-Gehalt jedoch nur geringfügig ab und bleibt bei über 10%.

Nach dem Screening von Bäckerhefestämmen in einem Nährmedium auf Melassebasis wurde der Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 5615 gefunden. Der RNA-Gehalt liegt hier anfangs bei über 13% der Trockenmasse, fälle jedoch bei geringem Wachstum und hohen Biomassege halten auf unter 8% ab. Aus diesem Stamm erhält man durch Wachstum mit Kaliumacetat als Hauptkohlenstoffquelle und Isolierung von ein zelnen Sporen den haploiden Stamm Saccharomyces cerevisiae DSM 5616.

Bei Saccharomyces cerevisiae DSM 5616 fällt der RNA-Anteil auch bei hohen Trockensubstanzgehalten von über 30 g/l nicht unter 10% ab.

Aus der gewaschenen Hefebiomasse können nützliche Produkte hergestellt werden. So kann man die Zellwände zerstören und die RNA isolieren. Man kann die RNA auch zu Nucleotiden hydrolysieren. Die Hefezellen können auch enzymatisch hydrolysiert werden, wobei Würzstoffe mit intensivem Aroma entstehen. Verantwortlich für das intensive Aroma sind RNA-Hydrolysate mit 5′-GMP, 5′-AMP und 5′-IMP, die bei der Hydrolyse mit 5′-Ribonucleotid bildender Ribonuclease in hohen Konzentrationen entstehen.

Bei der Durchführung des Verfahrens wird Saccharomyces cerevisiae DSM 5616 beispielsweise in 3 Stufen, durch eine ansatzweise Fermentation und durch zwei Zulauffermentationen, kultiviert. In den ersten beiden Stufen wird die geerntete Hefe mit Wasser gewaschen und dann als Inoculum für die folgende Fermentation verwendet. Die Fer mentationsarten:

(a) Aerobe ansatzweise Fermentation:
Während dieser Fermentation kann die Hefe eine Zeitlang eine maximale Wachstumsrate erreichen. Deshalb wird bei dieser Fermentation Ethanol gebildet.
(b) Erste aerobe Zulauffermentation bei begrenzter Zugabe von Nährstoff:
Während dieser Fermentation wird die Hefe bei reduzierter Wachstumsrate kultiviert. Die gebildete Biomasse, bezogen auf das Gewicht des eingesetzten Zuckers, ist maximal (etwa 0,5 g/g). Ethanol wird nur in geringen Mengen gebildet.
(c) Zweite aerobe Zulauffermentation bei begrenzter Zugabe von Nährstoff:
Die Fermentation wird meist unter den gleichen Bedingungen wie bei (b) durchgeführt.

Die spezifische Wachstumsrate µ wird definiert durch die Formel

Für t = 1 h wird aus dieser Formel

µ = 1 n (P₁/P₀) (2)

Die spezifische Wachstumsrate kann aus der Hefemenge, die als Inoculum eingesetzt wurde, und aus der Menge an Melasselösung, die pro Stunde in den Fermenter gegeben wird, bei Kenntnis der theoretischen Ausbeute an Biomasse, bezogen auf den verbrauchten Zucker, berechnet werden. Die Berechnung erfolgt dann nach der Formel (2).

Beispiel 1

In einem 10-l-Fermenter wird Saccharomyces cerevisiae DSM 5616 durch eine ansatzweise Fermentation und durch zwei Zulauffermentationen kultiviert.

Das Nährmedium für die ansatzweise Fermentation besteht aus:

700 g Rübenmelasse
47 g (NH₄)₂SO₄
18 g (NH₄)₂HPO₄
  0,4 g ZnSO₄ · 7 H₂O
  2 ml Ethylenoxid-propylenoxid-blockcopolymer (Polyethylenoxidblock- polypropylenoxid) (Entschäumer J 673, Fa. Schill & Seilacher, D-2000 Hamburg)
  7 l Wasser

Das sterilisierte Nährmedium wird mit 500 ml einer geschüttelten, wäßrigen Kultur von Saccharomyces cerevisiae DSM 5616 inokuliert.
Fermentationsbedingungen:
Rührung mit 600 Upm, 1 vvm Luft (vvm = Liter Luft pro Liter Reaktor volumen und Minute), 32°C, pH 5,5, Inkubationszeit 14 Stunden.

Die Analyse der Kulturbrühe ist in Tabelle 1 angegeben.

Nach beendeter Fermentation werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und einmal mit sterilisiertem Wasser gewaschen. 250 g feuchte Zellen werden als Inoculum für die nun folgende erste Zulauffermentation eingesetzt.
Dazu werden zunächst 4,5 l Medium, das

40 g (NH₄)₂SO₄
20 g KH₂PO₄
0,5 g ZnSO₄ · 7 H₂O
1,5 g MgSO₄ · 7 H₂O
2 mg Biotin
5 ml Ethylenoxid-propylenoxid-blockcopolymer (Entschäumer J 673)

enthält, in den Fermenter gefüllt. Nach Sterilisation der wäßrigen Lösung wird das Inoculum in dieser Lösung suspendiert. Anschließend werden 2 l Lösung aus 1 kg Rübenmelasse in Wasser und außerdem 650 ml 5%ige Ammoniaklösung kontinuierlich zugegeben.
Fermentationsbedingungen:
600 Upm, 32°C, 1 vvm Luft, pH 5,5.

Die Lösungen werden gemäß Tabelle 2 über einen Zeitraum von 14 Stunden zudosiert.

Der Trockensubstanzgehalt steigt auf 42 g/l, die Biomasse enthält am Ende 60,5% Protein und 11,0% RNA.

Mit den hier erhaltenen gewaschenen Zellen wird die gleiche Zulauf fermentation noch einmal durchgeführt. Am Ende dieser Fermentation liegt die Trockensubstanz an Hefebiomasse bei 39 g/l, bezogen auf die Fermentationsbrühe. Der RNA-Gehalt beträgt 11,5%, bezogen auf die Trockensubstanz.

Tabelle 1

Analysen der Kulturbrühen

Tabelle 2

Spezifische Wachstumsrate µ in Abhängigkeit von der Zugabe der Melasse- Lösung und der Ammoniaklösung bei der ersten Zulauffermentation

Aus Tabelle 2 geht hervor, daß die spezifische Wachstumsrate konti nuierlich mit zunehmender Fermentationsdauer abnimmt. Während des größten Teils der Fermentation liegt die Rate unter 0,15 h^-1, was etwa 50% der maximalen spezifischen Wachstumsrate von Saccharomyces cerevisiae DSM 5616 entspricht. Während 7 von 14 Stunden liegt die spezifische Wachstumsrate unter 0,121 h^-1.

Beispiel 2 Isolierung von RNA

Hefebiomasse, geerntet nach der zweiten Zulauffermentation gemäß Beispiel 1, wird als 200-ml-Suspension mit einem Feststoffgehalt von 16% mit 16 g NaCl versetzt. Die Suspension wird 30 Minuten auf 95°C erhitzt, auf Raumtemperatur gekühlt und dann zentrifugiert. Das Sediment wird einmal mit 50 ml warmer 8%iger NaCl-Lösung gewaschen. Die beiden klaren überstehenden Lösungen werden vereinigt, mit 0,1 g Protease (Papain, Fa. Sigma, D-8024 Deisenhofen) inkubiert und 6 Stunden auf 60°C erwärmt.

Die Brühe wird anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt, mit HCl auf pH 5 angesäuert und dann zentrifugiert. Die klare überstehende Lösung wird auf pH 2 angesäuert und dann 12 Stunden bei 4°C gehalten. Der dabei anfallende Niederschlag wird zentrifugiert, mit Methanol gewaschen und dann getrocknet.

Ergebnis:
1,65 g rohe RNA
85,6% Reinheit (berechnet aus dem Phosphatgehalt nach Veraschung)
42% der RNA der Hefezellen

Beispiel 3 Herstellung eines Hefeextrakts

Hefebiomasse, geerntet nach der zweiten Zulauffermentation gemäß Beispiel 1, wird als 200-ml-Suspension mit 16% Feststoffgehalt mit 6 N NaOH auf pH 10 eingestellt. Die Suspension wird 3 Stunden bei 50°C gerührt. Dann wird mit 6 N HCl auf pH 6 angesäuert. Anschließend werden 20 mg Phosphodiesterase (Nuclease P1, Fa. Sigma) und 50 mg Protease (Papain, Fa. Sigma) zugesetzt, worauf die Suspension 17 Stunden bei 65°C gerührt wird.

Unlösliche Hefezellwände werden anschließend abzentrifugiert und einmal mit Wasser gewaschen. Die überstehenden Flüssigkeiten werden vereinigt und gefriergetrocknet.

Ergebnis:
17 g trockenes Pulver, das 4,9% 5′-GMP enthält (enzymatisch bestimmt).

Eine 2%ige Lösung dieses Hefeextrakts in heißem Wasser hat einen intensiven, angenehmen Fleischgeschmack.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Biomasse aus Hefen mit einem Trockensubstanzgehalt von über 30 g/l, bezogen auf die Fermentationsbrühe, wobei über 10% der Trockensubstanz aus Ribonucleinsäuren (RNA) bestehen, durch ansatzweise Fermentation und Zulauffermentation, dadurch gekennzeichnet, daß man den Hefestamm Saccharomyces cerevisiae DSM 5616 einsetzt und die spezifische Wachstumsgerate bei der Zulauffermentation durch ein geringes Nährstoffangebot auf unter 0,18 h^-1 begrenzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für mindestens die Hälfte der Zulauffermentationszeit eine spezifische Wachstumsrate von unter 0,13 h^-1 einstellt.

3. Hefestamm Saccharomyces cerevisiae DSM 5616.

4. Verwendung der Biomasse nach Anspruch 1 zur Herstellung von RNA und RNA-Hydrolysat enthaltenden Produkten.