JP2992091B2 - 酵母菌体の製造方法 - Google Patents
酵母菌体の製造方法Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高濃縮発酵液から得た
リボ核酸(RNA) 含量の高い酵母を使用して行う酵母菌体
の製造方法に関する。
リボ核酸(RNA) 含量の高い酵母を使用して行う酵母菌体
の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】酵母菌体はRNAの製造又は分離のための
素材製品であり、このRNAから 更に5'−ヌクレオチド
例えば一燐酸5'−アデニン（5'−AMP）、一燐酸5'−グ
アノシン（5'−GMP）又は一燐酸5'−イノシン（5'−IM
P）を製造することができる。
素材製品であり、このRNAから 更に5'−ヌクレオチド
例えば一燐酸5'−アデニン（5'−AMP）、一燐酸5'−グ
アノシン（5'−GMP）又は一燐酸5'−イノシン（5'−IM
P）を製造することができる。
【０００３】これらの製品は薬物用に、また食品の香料
及び調味料として使用される。またこの5'−ヌクレオチ
ドを含む酵母水解物を製造することもできる。
及び調味料として使用される。またこの5'−ヌクレオチ
ドを含む酵母水解物を製造することもできる。
【０００４】RNA に富む酵母は文献で知られている。例
えば米国特許第3909352 号によれば、カンディダ種の酵
母を突然変異させてKClに敏感な菌株を分離することが
できる。この菌株を用いて12％以上のRNA を含む酵母菌
体を製造することができる。欧州特許A0299078号によれ
ば天然酵母抽出物の製造のためにカンディダ・ウティリ
ス（Candida Utilis）の酵母が使用される。その場合酵
母固有のリボヌクレアーゼを不活性化するために酵母を
加熱し、その上でRNA 分を抽出して、5'−ホスホジエス
テラーゼで加水分解する。熱処理の前に酵母のRNA含量
は約17％に及ぶ。
えば米国特許第3909352 号によれば、カンディダ種の酵
母を突然変異させてKClに敏感な菌株を分離することが
できる。この菌株を用いて12％以上のRNA を含む酵母菌
体を製造することができる。欧州特許A0299078号によれ
ば天然酵母抽出物の製造のためにカンディダ・ウティリ
ス（Candida Utilis）の酵母が使用される。その場合酵
母固有のリボヌクレアーゼを不活性化するために酵母を
加熱し、その上でRNA 分を抽出して、5'−ホスホジエス
テラーゼで加水分解する。熱処理の前に酵母のRNA含量
は約17％に及ぶ。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記のカンディダ酵母
菌株は人畜の健康に対して必ずしも無害でない。製品が
食品及び餌料添加物として使用されるので、このことを
留意しなければならない。また上記の先行技術によれ
ば、発酵液中の酵母量が少ない場合にしか高いRNA含量
が得られない。酵母の最大固形物含量は21又は15ｇ／ｌ
以下である。
菌株は人畜の健康に対して必ずしも無害でない。製品が
食品及び餌料添加物として使用されるので、このことを
留意しなければならない。また上記の先行技術によれ
ば、発酵液中の酵母量が少ない場合にしか高いRNA含量
が得られない。酵母の最大固形物含量は21又は15ｇ／ｌ
以下である。
【０００６】酵母のRNA 含量は培養の初期段階で最大に
達するという一般的観察はこれと一致する。
達するという一般的観察はこれと一致する。
【０００７】公知の製パン酵母で固形物30ないし50ｇ／
ｌの高い乾燥菌体含量の場合、RNA含量は一般に約５％
であり、高い場合でも８％RNA含量が得られるにすぎな
い。高い乾燥菌体含量及びそれと共に高いRNA 含量はま
だ知られていない。
ｌの高い乾燥菌体含量の場合、RNA含量は一般に約５％
であり、高い場合でも８％RNA含量が得られるにすぎな
い。高い乾燥菌体含量及びそれと共に高いRNA 含量はま
だ知られていない。
【０００８】そこでRNA 含量が10％を超える酵母菌体を
製造することが課題であった。その際酵母の固形物含量
は発酵液基準で30ｇ／ｌを超えなければならない。
製造することが課題であった。その際酵母の固形物含量
は発酵液基準で30ｇ／ｌを超えなければならない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この課題は請求項１に示
すようにして解決される。
すようにして解決される。
【００１０】示した方法においては一般にバッチ式発酵
と少なくとも１回の流加式発酵が行われる。１ないし４
回の流加式発酵を順次実施することが好ましい。これら
の流加式発酵では糖含量を発酵液ｌ当り100mg 未満とし
て限られた栄養物供給により不足状態を作り、それによ
って発酵代謝を抑制する。その場合比成長率は0.18h-1
未満であり、流加式発酵時間の少なくとも半期の間に比
成長率が0.13h-1であることが好ましい。
と少なくとも１回の流加式発酵が行われる。１ないし４
回の流加式発酵を順次実施することが好ましい。これら
の流加式発酵では糖含量を発酵液ｌ当り100mg 未満とし
て限られた栄養物供給により不足状態を作り、それによ
って発酵代謝を抑制する。その場合比成長率は0.18h-1
未満であり、流加式発酵時間の少なくとも半期の間に比
成長率が0.13h-1であることが好ましい。
【００１１】発酵には製パン酵母菌種サッカロミセス・
セレビジエ(Saccharomyces cerevi-siae)DSM5616を使用
する。この菌株は発酵の初期段階即ち対数成長段階で13
％を超える最大RNA含量に到達する。しかし成長が少な
い以後の流加式発酵でRNA含量が僅かに低下するだけで
引き続き10％を超える。
セレビジエ(Saccharomyces cerevi-siae)DSM5616を使用
する。この菌株は発酵の初期段階即ち対数成長段階で13
％を超える最大RNA含量に到達する。しかし成長が少な
い以後の流加式発酵でRNA含量が僅かに低下するだけで
引き続き10％を超える。
【００１２】糖蜜ベースの栄養培地中の製パン酵母菌株
をスクリーニングしたところサッカロミセス・セレビジ
エ菌株DSM5615が認められた。この場合RNA含量は当初は
固形物の13％を超えているが、僅かな成長と高い乾燥菌
体含量のもとで８％以下に低下する。この菌株から、主
炭素源としての酢酸カリウムによる成長と個々の胞子の
分離により単相菌株サッカロミセス・セレビジエDSM561
6が得られる。
をスクリーニングしたところサッカロミセス・セレビジ
エ菌株DSM5615が認められた。この場合RNA含量は当初は
固形物の13％を超えているが、僅かな成長と高い乾燥菌
体含量のもとで８％以下に低下する。この菌株から、主
炭素源としての酢酸カリウムによる成長と個々の胞子の
分離により単相菌株サッカロミセス・セレビジエDSM561
6が得られる。
【００１３】サッカロミセス・セレビジエDSM5616の場
合は30ｇ／ｌを超える高い固形物含量でもRNA 分が10％
以下に低下しない。
合は30ｇ／ｌを超える高い固形物含量でもRNA 分が10％
以下に低下しない。
【００１４】成長する酵母増殖酵母菌体から有用製品を
製造することができる。例えば細胞膜を破壊してRNAを
分離することができる。またRNAを加水分解してヌクレ
オチドとすることができる。酵母細胞を酵素で加水分解
することもできる。その場合は強い芳香がある調味料が
生じる。強い芳香の原因は5'−GMP,5'−AMP及び5'−IMP
を含むRNA水解物である。これは5'−リボヌクレオチド
を産出するリボヌクレアーゼにより加水分解の際に高い
濃度で発生する。
製造することができる。例えば細胞膜を破壊してRNAを
分離することができる。またRNAを加水分解してヌクレ
オチドとすることができる。酵母細胞を酵素で加水分解
することもできる。その場合は強い芳香がある調味料が
生じる。強い芳香の原因は5'−GMP,5'−AMP及び5'−IMP
を含むRNA水解物である。これは5'−リボヌクレオチド
を産出するリボヌクレアーゼにより加水分解の際に高い
濃度で発生する。
【００１５】方法の実施の際にサッカロミセス・セレビ
ジエDSM5616は３段階で１回のバッチ式発酵と２回の流
加式発酵により培養される。初めの２つの段階では収集
した酵母を水で洗浄してから次の発酵のための接種材料
として使用する。発酵方式は次の通りである。
ジエDSM5616は３段階で１回のバッチ式発酵と２回の流
加式発酵により培養される。初めの２つの段階では収集
した酵母を水で洗浄してから次の発酵のための接種材料
として使用する。発酵方式は次の通りである。
【００１６】(A) 好気バッチ式発酵 この発酵の間に酵母はしばらくの間最大成長率に達す
る。従ってこの発酵でエタノールが生成される。
る。従ってこの発酵でエタノールが生成される。
【００１７】(B) 限られた栄養物添加のもとでの第１の
好気流加式発酵 この発酵の間に酵母は低下した成長率で培養される。産
出される菌体は使用する糖に対して最大（約0.5ｇ／
ｇ）である。エタノールは少量しか産出されない。
好気流加式発酵 この発酵の間に酵母は低下した成長率で培養される。産
出される菌体は使用する糖に対して最大（約0.5ｇ／
ｇ）である。エタノールは少量しか産出されない。
【００１８】(C) 限られた栄養物添加のもとでの第２の
好気流加式発酵 発酵はたいてい(b) と同じ条件で行われる。
好気流加式発酵 発酵はたいてい(b) と同じ条件で行われる。
【００１９】比成長率μは式
【００２０】
【数１】
【００２１】で定義される。
【００２２】ｔ＝１時間のときこの式から μ＝ｌn （Ｐ1 ／Ｐ0 ） (2) となる。
【００２３】消費した糖に対する菌体量の理論収量が分
かれば、接種材料として使用した酵母量と発酵槽に毎時
送る糖蜜液の量から比成長率を計算することができる。
次に式(2) で計算を行う。
かれば、接種材料として使用した酵母量と発酵槽に毎時
送る糖蜜液の量から比成長率を計算することができる。
次に式(2) で計算を行う。
【００２４】実施例１ 10ｌ発酵槽でサッカロミセス・セレビジエDSM5616を１
回のバッチ式発酵と２回の流加式発酵で培養する。
回のバッチ式発酵と２回の流加式発酵で培養する。
【００２５】バッチ式発酵のための栄養培地は下記から
成る。
成る。
【００２６】700ｇ ビート糖蜜 47ｇ (NH4)2SO4 18ｇ (NH4)2HPO4 0.4ｇ ZnSO4・7H2O ２ml 酸化エチレン・酸化プロピレンブロック共重合体
（ポリ酸化エチレンブロックポリ酸化プロピレン） （消泡剤J673, シル・ウント・ザイラッヒャー社〔Schi
ll & Seila−cher〕、D-2000ハンブルク） ７ｌ 水 滅菌した栄養培地にサッカロミセス・セレビジエDSM561
6の500mlの振とうした培養液を接種する。
（ポリ酸化エチレンブロックポリ酸化プロピレン） （消泡剤J673, シル・ウント・ザイラッヒャー社〔Schi
ll & Seila−cher〕、D-2000ハンブルク） ７ｌ 水 滅菌した栄養培地にサッカロミセス・セレビジエDSM561
6の500mlの振とうした培養液を接種する。
【００２７】発酵条件：600回転毎分で攪拌、空気１vvm
（vvm＝反応容積リットル当りの毎分通気リットル）、3
2℃、pH5.5、培養時間14時間。
（vvm＝反応容積リットル当りの毎分通気リットル）、3
2℃、pH5.5、培養時間14時間。
【００２８】培養液の分析を表１に示す。
【００２９】発酵の終了の後、細胞を遠心分離して収集
し、殺菌水で１回洗浄する。250ｇの湿潤細胞を次の第
１の流加式発酵のための接種材料として使用する。
し、殺菌水で１回洗浄する。250ｇの湿潤細胞を次の第
１の流加式発酵のための接種材料として使用する。
【００３０】そのためにまず 40ｇ (NH4)2SO4 20ｇ KH2PO4 0.5ｇ ZnSO4・7H2O 1.5ｇ MgSO4・7H2O ２mg ビオチン ５ml 酸化エチレン・酸化プロピレン共重合体（消泡剤
J673） を含む培地4.5ｌを発酵槽に充填する。水溶液を殺菌し
た後、この液に接種材料を懸濁させる。続いて１kgのビ
ート糖蜜の水溶液２ｌと更に650mlの５％アンモニア溶
液を連続的に加える。
J673） を含む培地4.5ｌを発酵槽に充填する。水溶液を殺菌し
た後、この液に接種材料を懸濁させる。続いて１kgのビ
ート糖蜜の水溶液２ｌと更に650mlの５％アンモニア溶
液を連続的に加える。
【００３１】発酵条件：600回転毎分、32℃、空気１vvm
、pH5.5 。
、pH5.5 。
【００３２】表２に従って溶液を14時間にわたって供給
する。
する。
【００３３】固形物含量が42ｇ／ｌに上昇し、乾燥菌体
中には最終的に60.5％の蛋白質と11.0％のRNAを含む。
中には最終的に60.5％の蛋白質と11.0％のRNAを含む。
【００３４】ここで得た、洗浄した細胞で同じ流加式発
酵をもう一度行う。この発酵の終りに酵母菌体の固形物
含量は発酵液に対して39ｇ／ｌである。RNA含量は固形
物に対して11.5％である。
酵をもう一度行う。この発酵の終りに酵母菌体の固形物
含量は発酵液に対して39ｇ／ｌである。RNA含量は固形
物に対して11.5％である。
【００３５】
【表１】
【００３６】
【表２】
【００３７】表２で明らかなように、比成長率は発酵時
間の増加と共に減少する。大部分の発酵の間に率は0.15
h-1未満である。これはサッカロミセス・セレビジエDSM
5616の最大比成長率の約50％に相当する。14時間中７時
間の間に比成長率が０．１２１ｈ−１未満である。
間の増加と共に減少する。大部分の発酵の間に率は0.15
h-1未満である。これはサッカロミセス・セレビジエDSM
5616の最大比成長率の約50％に相当する。14時間中７時
間の間に比成長率が０．１２１ｈ−１未満である。
【００３８】実施例２ ＲＮＡの分離 実施例１による第２の流加式発酵の後に収集した酵母菌
体を固形物含量16％の200mlの懸濁液として16ｇのNaCl
と混合する。懸濁液を95℃に30分熱し、室温に冷却して
から遠心分離する。沈澱物を50mlの８％NaCl温溶液で１
回洗浄する。２つの透明上澄み液を一緒にし、0.1ｇの
プロテアーゼ（パパイン・ジグマ社〔Sigma〕、D-8024
ダイゼンホーフェン）を添加し、60℃に６時間熱する。
体を固形物含量16％の200mlの懸濁液として16ｇのNaCl
と混合する。懸濁液を95℃に30分熱し、室温に冷却して
から遠心分離する。沈澱物を50mlの８％NaCl温溶液で１
回洗浄する。２つの透明上澄み液を一緒にし、0.1ｇの
プロテアーゼ（パパイン・ジグマ社〔Sigma〕、D-8024
ダイゼンホーフェン）を添加し、60℃に６時間熱する。
【００３９】次に液を室温に冷却し、HClでpH５に酸性
化する。透明な上澄み液をpH２に酸性化し、次に４℃に
12時間保つ。その際に沈降する沈澱物を遠心分離し、メ
タノールで洗浄してから乾燥する。
化する。透明な上澄み液をpH２に酸性化し、次に４℃に
12時間保つ。その際に沈降する沈澱物を遠心分離し、メ
タノールで洗浄してから乾燥する。
【００４０】結果： 粗RNA 1.65ｇ 純度 85.6％（灰にした後の燐酸塩含量から計算） 酵母細胞のRNA 42％実施例３ 酵母抽出物の製造 実施例１による第２の流加式発酵の後に収集した酵母菌
体を固形物含量16％の200mlの懸濁液として６Ｎ NaOHに
よりpH10に調整する。懸濁液を50℃で３時間攪拌する。
次に６Ｎ HClでpH６に酸性化する。続いて20mgのホスホ
ジエステラーゼ（ヌクレアーゼP1、ジグマ社）と50mgの
プロテアーゼ（パパイン、ジグマ社）を加えてから懸濁
液を65℃で17時間攪拌する。
体を固形物含量16％の200mlの懸濁液として６Ｎ NaOHに
よりpH10に調整する。懸濁液を50℃で３時間攪拌する。
次に６Ｎ HClでpH６に酸性化する。続いて20mgのホスホ
ジエステラーゼ（ヌクレアーゼP1、ジグマ社）と50mgの
プロテアーゼ（パパイン、ジグマ社）を加えてから懸濁
液を65℃で17時間攪拌する。
【００４１】不溶の酵母細胞膜を次に遠心分離で除き、
水で１回洗浄する。上澄み液を一緒にして冷凍乾燥す
る。
水で１回洗浄する。上澄み液を一緒にして冷凍乾燥す
る。
【００４２】結果：4.9％の5'−GMPを含む乾燥粉末17ｇ
（酵素で決定。） この酵母抽出物の２％熱湯溶液は強力かつ快適な肉の味
がする。
（酵素で決定。） この酵母抽出物の２％熱湯溶液は強力かつ快適な肉の味
がする。
【００４３】
【発明の効果】本発明により、高濃縮発酵液から得たリ
ボ核酸(RNA) 含量の高い酵母を使用して酵母菌体を製造
することが可能となる。
ボ核酸(RNA) 含量の高い酵母を使用して酵母菌体を製造
することが可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 19/34 Ｃ１２Ｒ 1:865） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 1/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】 酵母菌株を使用し、バッチ式発酵及び流
加式発酵により、固形分含量が発酵液基準で３０ｇ／ｌ
を超え、その固形物の１０％以上がリボ核酸（ＲＮＡ）
から成る酵母菌体を製造する方法において、酵母菌株と
してサッカロミセス・セレビジエＤＳＭ５６１６菌株を
使用し、流加式発酵時の発酵液中の糖含量を発酵液１当
たり１００ｍｇ未満として菌体の比成長率を０．１８ｈ
-1 未満に制限することを特徴とする酵母菌体の製造方
法。 - 【請求項２】 流加式発酵時間の少なくとも半期に対し
て０．１３ｈ-1未満の比成長率を調整することを特徴と
する請求項１に記載の酵母菌体の製造方法。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の製造方法で得られ
た酵母菌体の細胞膜を破壊した後、抽出することを特徴
とするＲＮＡの製造方法。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載の製造方法で得られ
た酵母菌体を酵素で加水分解した後、抽出することを特
徴とするＲＮＡ水解物の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4004633A DE4004633A1 (de) | 1990-02-15 | 1990-02-15 | Verfahren zur herstellung von hefebiomasse |
| DE4004633.8 | 1990-02-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176757A JPH05176757A (ja) | 1993-07-20 |
| JP2992091B2 true JP2992091B2 (ja) | 1999-12-20 |
Family
ID=6400174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3010746A Expired - Fee Related JP2992091B2 (ja) | 1990-02-15 | 1991-01-31 | 酵母菌体の製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2992091B2 (ja) |
| DE (1) | DE4004633A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2002272450A (ja) * | 2001-03-19 | 2002-09-24 | Sapporo Breweries Ltd | 高リボ核酸含有ビール酵母菌体およびその製造方法 |
| KR100442574B1 (ko) * | 2001-08-31 | 2004-08-02 | 주식회사농심 | Ｒｎａ 함량이 증대된 신규한 고핵산 효모 변이주 및 그 대량 제조방법 |
| JP4437218B2 (ja) * | 2002-11-26 | 2010-03-24 | 日生バイオ株式会社 | Ｒｎａ−プロタミン複合体、その製造方法およびそれを含む健康食品 |
| JP5102076B2 (ja) * | 2008-03-06 | 2012-12-19 | アサヒグループホールディングス株式会社 | サッカロマイセス・セレビシエ変異株、及び該変異株を用いたｒｎａ高含有酵母の製造方法。 |
| JP2010166886A (ja) * | 2009-01-26 | 2010-08-05 | Tablemark Co Ltd | 食品の香気改善方法 |
| CN102191301B (zh) * | 2011-03-31 | 2013-08-07 | 南通秋之友生物科技有限公司 | 高密度发酵高核热带假丝酵母生产核糖核酸的方法 |
| JP5848733B2 (ja) * | 2013-08-29 | 2016-01-27 | テーブルマーク株式会社 | 食品の香気改善方法 |
| CN107614682B (zh) | 2015-03-30 | 2021-11-09 | 绿光生物科技股份有限公司 | 核糖核酸的无细胞生成 |
| US20160376541A1 (en) * | 2015-06-23 | 2016-12-29 | Minn-Dak Farmers Cooperative | Process for saponin enhanced autoloysis of yeast |
| WO2017176963A1 (en) * | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Greenlight Biosciences, Inc. | Cell-free production of ribonucleic acid |
| CN106635851A (zh) * | 2016-11-18 | 2017-05-10 | 山东圣琪生物有限公司 | 一种高核酸酿酒酵母菌的选育方法 |
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1990
- 1990-02-15 DE DE4004633A patent/DE4004633A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-01-31 JP JP3010746A patent/JP2992091B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4004633A1 (de) | 1991-08-22 |
| JPH05176757A (ja) | 1993-07-20 |
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