JP6928541B2

JP6928541B2 - 核酸高含有パン酵母及び酵母エキスの製造方法

Info

Publication number: JP6928541B2
Application number: JP2017220596A
Authority: JP
Inventors: 陽介東; 康二山田
Original assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Current assignee: Oriental Yeast Co Ltd
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2021-09-01
Anticipated expiration: 2037-11-16
Also published as: JP2019088247A

Description

本発明は、核酸高含有パン酵母及びこれを用いた酵母エキスの製造方法に関する。

酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）は、天然のビタミンＢ群、アミノ酸、ミネラル等をバランス良く含有しており、パン類や酒類の製造に使われる以外にも有効活用されている。例えば、乾燥酵母や酵母エキスは我が国において長年にわたってサプリメントや、食品原料、調味料などとして使われており、栄養価と安全性の高い素材である。

酵母エキスは天然の調味料であり、アミノ酸等を豊富に含むものであり、従来から、旨味やコクを付与するための総合呈味調味料としての認知が高まっている。その中でも、核酸高含有酵母エキスは旨味やコクを付与するだけでなく、これらの呈味をまとめる役割がある。

核酸高含有酵母エキスは、主として酵素法により製造される。即ち、核酸高含有酵母における旨味成分であるイノシン酸（ＩＭＰ）、グアニル酸（ＧＭＰ）は、ＲＮＡをヌクレアーゼで分解し、アデニル酸（ＡＭＰ）、ウリジル酸（ＵＭＰ）、ＧＭＰ、シチジル酸（ＣＭＰ）が生じた後、デアミナーゼによってＡＭＰをＩＭＰに変換して作られる。したがって、核酸高含有酵母エキスを製造するためには、核酸、特にリボ核酸（ＲＮＡ）含量が高い菌株を用いることが必要である。

これまでに、ビール酵母菌体に無機塩を作用させ、特定条件下で活性化処理を施すことで菌体重量当たりのＲＮＡ含有量が１０重量％以上である菌体を得る技術（例えば、特許文献１参照）や、ＲＮＡ含有量が高く、かつ増殖性が良好なサッカロマイセス・セレビシエ変異株であるサッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５９１株（ＦＥＲＭＢＰ−１０９２５）（例えば、特許文献２参照）が提案されている。

しかしながら、核酸を高含有することと、優れた増殖能との両立を十分に満足す酵母は未だ提供されておらず、その速やかな提供が求められている。

特開２００２−２７２４５０号公報特許第５１０２０７６号公報

本発明は、このような要望に応え、現状を打破し、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、優れた増殖能を有し、かつ、核酸を高含有することにより、酵母エキスとしたときに呈味性等に優れる新規核酸高含有パン酵母及びこれを用いた酵母エキスの製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、従来、ＲＮＡ含有量が高く、かつ増殖性が良好とされていたサッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５９１株（ＦＥＲＭＢＰ−１０９２５）は、培地中の酵母濃度が上昇すると菌体当たりの核酸量の低下が大きく、また、実用パン酵母と比べて増殖が遅いことを知見し、前記目的を達成するべく鋭意検討を行った結果、培地中の酵母濃度が１２質量％になるまで培養したときのパン酵母中の核酸量が、乾燥菌体質量当たり１０質量％超である核酸高含有パン酵母を見出した。

本発明は、本発明者らの前記知見等に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞培地中の酵母濃度が１２質量％になるまで培養したときのパン酵母中の核酸量が、乾燥菌体質量当たり１０質量％超であることを特徴とする核酸高含有パン酵母である。
＜２＞核酸高含有パン酵母が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＡ０４株（ＮＩＴＥＰ−０２５０４）である前記＜１＞に記載の核酸高含有パン酵母である。
＜３＞前記＜１＞又は＜２＞に記載の核酸高含有パン酵母を培養する工程及び前記培養したパン酵母からエキスを調製する工程を含むことを特徴とする酵母エキスの製造方法である。

本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、優れた増殖能を有し、かつ、核酸を高含有することにより、酵母エキスとしたときに呈味性等に優れる新規核酸高含有パン酵母及びこれを用いた酵母エキスの製造方法を提供することができる。

図１は、試験例３において、培地中の酵母濃度が１２質量％になるまで培養したときの各菌株の乾燥菌体当たりのＲＮＡ量（以下、「菌体ＲＮＡ含量」と称することがある）を示すグラフである。図２は、試験例３において、各菌株の培養時間当たりの酵母量を、実用パン酵母の培養終点の酵母量を１００としたときの相対値（％）で表したグラフである。

（核酸高含有パン酵母）
本願発明の核酸高含有パン酵母は、培地中の酵母濃度が１２質量％になるまで培養したときのパン酵母中の核酸量が、乾燥菌体質量当たり１０質量％超であるパン酵母である。

＜核酸量＞
前記パン酵母中の核酸量としては、培地中の酵母濃度が１２質量％になるまで培養したときに、乾燥菌体質量当たり１０質量％超であれば特に制限はなく、適宜選択することができるが、１１質量％以上が好ましい。記核酸量が好ましい範囲内であると、呈味性等に優れる核酸高含有酵母エキスをより効率良く製造することができる点で、有利である。

前記乾燥菌体質量とは、菌体を乾燥させた後の質量をいう。
前記乾燥菌体を調製する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。

前記核酸量の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、シュミットタンハウザー法などが挙げられる。

＜培養＞
前記培養における培地としては、特に制限はなく、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む通常サッカロマイセス・セレビシエ等の酵母の培養に用いられる培地の中から適宜選択することができる。

前記炭素源としては、特に制限はなく、通常の微生物の培養に利用されるものの中から適宜選択することができ、例えば、グルコース、蔗糖、酢酸、エタノール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記炭素源の培地における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができる。

前記窒素源としては、特に制限はなく、通常の微生物の培養に利用されるものの中から適宜選択することができ、例えば、含窒素無機塩、含窒素有機物などが挙げられる。具体的には、例えば、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、コーンスティプリカー（ＣＳＬ）、カゼイン、酵母エキス、ペプトンなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記窒素源の培地における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができる。

前記無機塩としては、特に制限はなく、通常の微生物の培養に利用されるものの中から適宜選択することができ、例えば、過リン酸石灰やリン安等のリン酸成分、塩化カリウムや水酸化カリウム等のカリウム成分、硫酸マグネシウムや塩酸マグネシウム等のマグネシウム成分や、亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記無機塩の培地における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができる。

前記培地には、必要に応じて、ビタミン、核酸関連物質などのその他の成分を添加することができる。
前記その他の成分の培地における含有量としては、特に制限はなく、適宜選択することができる。

前記培地の具体例としては、例えば、ＹＰＤ培地などが挙げられる。

前記培養の態様としては、特に制限はなく、培養スケールや得られた培養物の用途などに応じて適宜選択することができ、例えば、寒天平板培地に塗布して培養してもよいし、液体培地中で培養してもよい。
前記液体培地中で培養する態様としては、例えば、回分培養、流加培養、連続培養などが挙げられる。
例えば、継代培養の場合には、簡便であるため、寒天平板培地上で培養することや、適当な液体培地中で回分培養することが好ましい。また、工業的に核酸高含有酵母を製造し、培養物を量産する場合には、流加培養又は連続培養を行うことが好ましい。

前記培養における培養条件としては、特に制限はなく、サッカロマイセス酵母を培養する場合に一般的に用いられる条件の中から適宜選択することができる。
例えば、培養温度としては、２０〜４０℃であることが好ましく、２５〜３５℃であることがより好ましい。
また、培地のｐＨとしては、３．５〜８．０であることが好ましく、４．０〜６．０であることがより好ましい。特に、工業的に培養物を量産する場合には、培地中のｐＨを定期的に測定し、ｐＨ４．０〜６．０に維持するよう調整することが好ましい。
また、核酸高含有パン酵母は、好気的条件で培養することが好ましい。例えば、通気量の条件としては、０．５〜１０ｖｖｍであることが好ましく、０．８〜５．０ｖｖｍであることがより好ましい。

例えば、ＹＰＤ培地及び糖蜜を用いて、２５〜３５℃、撹拌数０〜４００ｒｐｍ、通気量０．８〜５．０ｖｖｍ、ｐＨ４．０〜６．０の条件で回分培養又は流加培養を行うことにより、培地中の酵母濃度が１２質量％になるまで培養したときの核酸高含有パン酵母中の核酸量を、乾燥菌体質量当たり１０質量％超にすることができる。

前記培地中の酵母濃度の測定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、乾燥菌体重量法、濁度法などが挙げられる。

前記核酸高含有パン酵母の具体例としては、後述する試験例に記載のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＡ０４株が好適に挙げられる。前記ＡＡ０４株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託申請し、ＮＩＴＥＰ−０２５０４として、２０１７年６月２９日に受託されている。

本発明の核酸高含有パン酵母は、増殖効率に優れ、かつ培地中の酵母濃度が上昇したときでも核酸を高含有するので、呈味性等に優れる核酸高含有酵母エキスの原料として、好適に用いることができる。

＜製造方法＞
本願発明の核酸高含有パン酵母の製造方法としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、核酸含量（主にＲＮＡ含量）や増殖性を指標として用い、これらが高い菌株を選抜したり、核酸アナログ耐性株を選抜したり、これらを組み合わせたりして製造する方法などが挙げられる。

−酵母−
前記製造方法に用いる酵母（以下、「親株」、「元株」と称することがある）としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、ミコトルラ（Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属などが挙げられ、具体的な菌株の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｕｖａｒｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｒｏｕｘｉｉ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓｕｔｉｌｉｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓｃａｎｄｉｄａ、Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａｊａｐｏｎｉｃａ、Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｃａｎｄｉｄａｓａｋｅ、Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａａｎｏｍａｌａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓｆｉｂｌｉｇｅｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｒｕｂｒａ、Ｐｉｃｈｉａｆａｒｉｎｏｓａなどが挙げられる。
前記製造方法に用いる酵母は、自然に存在するパン酵母を用いてもよいし、市販のパン酵母を用いてもよいし、突然変異処理したパン酵母を用いてもよいし、これらを混合して用いてもよい。
前記突然変異処理の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。

（酵母エキスの製造方法）
本発明の酵母エキスの製造方法は、本発明の核酸高含有パン酵母を培養する工程と、前記培養したパン酵母からエキスを調製する工程とを少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。

＜培養工程＞
前記培養工程は、本発明の核酸高含有パン酵母を培養する限り、特に制限はなく、公知の培養方法を適宜選択することができ、例えば、上記した（核酸高含有パン酵母）の＜培養＞の項目に記載した方法などが挙げられる。

＜エキス調製工程＞
前記エキス調製工程は、前記培養工程で得られた培養物から酵母エキスを調製する限り、特に制限はなく、酵母エキスを調製する場合に通常行われている調製方法を適宜選択することができる。
前記調製方法としては、例えば、酵母菌体内に本来あるタンパク質分解酵素等を利用して菌体を可溶化する自己消化法、微生物や植物由来の酵素製剤を添加して菌体を可溶化する酵素法、熱水中に一定時間浸漬することにより菌体を可溶化する熱水抽出法、種々の酸あるいはアルカリを添加して菌体を可溶化する酸・アルカリ分解法、凍結・融解を１回以上行うことにより菌体を破砕する凍結融解法、物理的な刺激により菌体を破砕する物理的破砕法などが挙げられる。
前記酵素法としては、例えば、前記培養物を加熱し、酵母が有している酵素を失活させた後、β−グルカナーゼを加え細胞壁を分解し、次いでヌクレアーゼを加えＲＮＡをヌクレオチドに分解し、その後デアミナーゼを加え、ＡＭＰをＩＭＰに変換する方法などが挙げられる。

＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

本発明の酵母エキスの製造方法は、本発明の核酸高含有酵母を用いるので、核酸を高含有する酵母エキスを簡易に効率良く製造することができる。

以下、試験例を示して本発明を説明するが、本発明はこれらの試験例に何ら限定されるものではない。

（試験例１：パン酵母のスクリーニング）
出願人が保有するパン酵母のライブラリー約１，０００株の中から、ＲＮＡ含量が高い株のスクリーニングを以下のようにして行った。
直径１６ｍｍの試験管にて、ＹＰＤ培地５ｍＬに酵母１白金耳を植菌し、約１６時間培養した。培養後の菌体を２回洗浄した後、純水を１ｍＬ加え、ＲＮＡ含量の測定試料とした。
シュミットタンハウザー法（生物化学実験法、核酸の一般的分離・定量法、水野重樹、東京大学出版会、１９６９年）により、前記測定試料からＲＮＡを抽出し、波長２６０ｎｍの吸光度（以下、「Ａｂｓ２６０」と称することがある）を測定し、乾燥菌体当たりのＲＮＡ量を算出した。
その結果、最もＲＮＡ含量が高い菌株として、Ｐ−１１１９株（二倍体）を見出した。

（試験例２：パン酵母の育種）
＜一倍体の選抜＞
前記Ｐ−１１１９株を常法にて胞子分離し、一倍体を取得した。
取得した一倍体を前記試験例１と同様にして試験管で培養し、増殖性に優れ、ＲＮＡ含量が高い一倍体として、Ａ３８（α型）とＡ７８（ａ型）を選抜した。

＜核酸アナログ耐性株（一倍体）の選抜＞
核酸アナログ物質として、５−フルオロウラシル（以下、「５−ＦＵ」と称することがある）又は５−フルオロシトシン（以下、「５−ＦＣ」と称することがある）を添加したＳＤ培地に上記で選抜した株を１０^６〜１０^７個程度を塗抹し、３０℃で培養した。
生育したコロニーを取得し、再度、５−ＦＵ又は５−ＦＣを添加したＳＤ培地に植菌し、生育した菌株を核酸アナログ物質耐性株とした。
得られた核酸アナログ物質耐性株の中から、元株と比較して、増殖性が同等で、ＲＮＡ含量が高い菌株（一倍体）を選抜した。

＜核酸アナログ耐性株（二倍体）の選抜＞
上記で得られた一倍体の菌株を常法により掛け合わせ、二倍体を作製した（表１−１参照）。
得られた二倍体について、前記試験例１と同様にして試験管で培養し、乾燥菌体当たりのＲＮＡ量を算出した。結果を表１−２に示す。

以上より、増殖性に優れ、ＲＮＡ含量が高い株として、ＡＡ０４株を取得することができた。
核酸アナログ物質耐性株を取得することで、フィードバック制御がかからない菌株を取得し、ＲＮＡ含量が高まることが期待されたが、表１−２に示されるように、核酸アナログ物質耐性株の中には、ＲＮＡ含量が低い株も含まれていた。

前記サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＡ０４株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託申請し、ＮＩＴＥＰ−０２５０４として、２０１７年６月２９日に受託された。

（試験例３：公知菌株との比較）
上記ＡＡ０４株（ＮＩＴＥＰ−０２５０４）のＲＮＡ含量と増殖性について、公知菌株である実用パン酵母（ＯＹＣ−１２５株（オリエンタル酵母工業株式会社製））及びサッカロマイセス・セレビシエＡＢＹＣ１５９１株（ＦＥＲＭＢＰ−１０９２５、特許第５１０２０７６号公報参照）と以下のようにして比較した。

＜培養＞
上記各株を以下の条件で培養し、経時的にサンプリングすることで、酵母量及び乾燥菌体当たりのＲＮＡ量を比較した。使用する糖は、糖蜜を用いて常に糖濃度が３５％となるように希釈して使用した。糖蜜は、マルチホルダー付きシリンジポンプＰＨＤ２０００（ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ社製）を用いて流加して、培養した。
−培養条件−
・培養容器：２００ｍＬメスシリンダー
・培養液量：１００ｍＬ
・種量：３ｇ
・培養温度：３２℃
・通気量：０．４Ｌ／分
・糖量：７．８ｇ
・窒素（Ｎ）源：ウレア
・Ｎ／炭素（Ｃ）：４．０
・リン（Ｐ）源：リン酸１ナトリウム
・Ｐ／Ｃ：０．４

＜評価＞
−ＲＮＡ含量−
培地中の酵母濃度が１２質量％になったときにサンプリングし、前記試験例１と同様にして、シュミットタンハウザー法により、乾燥菌体当たりのＲＮＡ量を算出した。結果を図１に示す。
なお、培地中の酵母濃度が１２質量％になるまでに要した培養時間は、以下のとおりであった。
・実用パン酵母・・・１２時間
・ＦＥＲＭＢＰ−１０９２５・・・１５．５時間
・ＮＩＴＥＰ−０２５０４・・・１２．３時間

図１の結果から、本発明のパン酵母の乾燥菌体当たりのＲＮＡ量は１１．１質量％であり、培地中の酵母濃度が１２質量％になるまで培養した場合でも、公知の酵母である実用パン酵母（８．７質量％）及びＦＥＲＭＢＰ−１０９２５（１０質量％）よりも核酸を高含有していることが確認された。
また、ＦＥＲＭＢＰ−１０９２５は培地中の酵母濃度が１２質量％になるまでに要した培養時間が長く、増殖効率が劣るものであることも確認された。

−増殖性−
各菌株について、培養時間当たりの酵母量を測定した。図２に、実用パン酵母の培養終点の酵母量を１００としたときの相対値（％）を示した。図２中、「◆」は実用パン酵母、「■」はＦＥＲＭＢＰ−１０９２５、「▲」はＮＩＴＥＰ−０２５０４の結果を示す。
図２の結果から、公知の菌株であるＦＥＲＭＢＰ−１０９２５は実用パン酵母より増殖性が劣るものであったのに対し、本発明の酵母は実用パン酵母と同等の増殖能を有していることが確認された。

以上の結果から、本発明の酵母は、核酸を高含有しつつ、更に増殖能にも優れる非常に優れた酵母であることが確認された。

（試験例４：酵母エキス）
前記試験例３と同様にして、ＦＥＲＭＢＰ−１０９２５及びＮＩＴＥＰ−０２５０４を培養し、乾燥菌体当たりのＲＮＡ量が９質量％の培養物をそれぞれ得た。
前記各培養物をクリームに調製した後、８０℃で３０分間加熱した。次いで、βグルカナーゼを添加して５５℃で１６時間保温した。１ＮＨ_２ＳＯ_４でｐＨを５に調整した後、ヌクレアーゼを添加して７０℃で２時間保温し、次いでデアミナーゼを添加して５０℃で２時間保温した。
得られた処理物を遠心分離し、上清を回収した。
前記上清中の核酸含量（ＩＭＰとＧＭＰの合計量（％）、２Ｎａ塩として）をＨＰＬＣにて測定したところ、いずれの菌株を用いた場合でも、核酸含量は６％程度であった。
したがって、本発明の酵母を用いることにより、呈味性に優れた酵母エキスを効率良く生産することができることが示された。

ＮＩＴＥＰ−０２５０４

Claims

サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＡ０４株（ＮＩＴＥＰ−０２５０４）であることを特徴とする核酸高含有パン酵母。
請求項１に記載の核酸高含有パン酵母を培養する工程及び前記培養したパン酵母からエキスを調製する工程を含むことを特徴とする酵母エキスの製造方法。