ES2332031B2 - Procedimiento para la obtencion a gran escala de inoculo miceliar de basidiomicetos. - Google Patents
Procedimiento para la obtencion a gran escala de inoculo miceliar de basidiomicetos. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la obtención a gran escala de
inóculo miceliar de basidiomicetos.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la obtención in vitro de micelio fúngico
en cultivo puro, aislado, tanto de los cuerpos fructíferos de
especies fúngicas de interés, como de secciones de raicillas de
plantas micorrizadas con dichas especies fúngicas.
Description
Procedimiento para la obtención a gran escala de
inóculo miceliar de basidiomicetos.
La presente invención se encuadra dentro del
campo general de agrobiotecnología y en particular se refiere a la
producción a gran escala de inóculo micelial de especies
fúngicas.
Hasta el presente, no hay referencias acerca de
la producción a gran escala de inóculo micelial de las especies
fúngicas Amanita caesarea y Boletus aereus. Existe
pues un gran interés en encontrar un procedimiento sencillo, rápido
y económico para la obtención de micelio en cultivo puro de dichas
especies, para su utilización en la producción en vivero de plantas
micorrizadas de especies forestales de interés comercial, con fines
de restauración forestal y recuperación de la producción micológica
en las zonas naturales, así como, para la producción controlada, en
vivero-plantación, de hongos comestibles de gran
importancia comercial.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la obtención in vitro de micelio fúngico
en cultivo puro, aislado, tanto de los cuerpos fructíferos de
especies fúngicas de interés, como de secciones de raicillas de
plantas micorrizadas con dichas especies fúngicas.
Así pues, en un primer aspecto, la presente
invención se refiere a un procedimiento para la obtención de
micelio fúngico en cultivo puro que comprende las siguientes
etapas:
- a)
- Aislamiento del micelio fúngico a partir de cuerpos fructíferos de hongos y/o secciones de raicillas de plantas micorrizadas,
- b)
- Inoculación del micelio aislado en la etapa a) en un medio de cultivo sólido de avena modificado (MOM),
- c)
- Purificación del micelio,
- d)
- Desarrollo del micelio purificado en la etapa c) en un medio de cultivo líquido BAF modificado,
- e)
- Obtención del inóculo miceliar
En un aspecto más particular de la presente
invención, el aislamiento del micelio fúngico se realiza a partir
de cuerpos fructíferos; en un aspecto más en particular, el hongo a
partir del cual se obtiene el micelio es seleccionado de la Clase
Basidiomicetos, en particular es seleccionado de entre los géneros
Amanita y Boletus. En otro aspecto más en particular,
el hongo a partir del cual se obtiene el micelio es Amanita
caesarea. En otro aspecto particular, el otro hongo a partir del
cual se obtiene el micelio es Boletus aereus.
En otro aspecto más en particular de la presente
invención, el aislamiento del micelio fúngico se realiza a partir
de secciones de raicillas de plantas micorrizadas, en un aspecto
más en particular, el micelio es seleccionado de entre los géneros
Quercus y Cistus.
En otro aspecto más en particular de la presente
invención, el medio de cultivo sólido MOM de la etapa b) contiene
como nutrientes calcio, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio,
cloro, azufre, sacarosa, levadura y agar. En un aspecto más en
particular, el medio de cultivo sólido de avena modificado de la
etapa b) contiene 0,5 g de Ca
(NO_{3})_{2}4H_{2}O;
0,2 g de PO_{4}KH_{2}; 0,1 g de SO_{4}Mg 7H_{2}O; 0,1 g de KCl; 5,0 g de sacarosa; 3,5 g de avena en polvo; 0,1 g de extracto de levadura y 8,0 g de agar.
0,2 g de PO_{4}KH_{2}; 0,1 g de SO_{4}Mg 7H_{2}O; 0,1 g de KCl; 5,0 g de sacarosa; 3,5 g de avena en polvo; 0,1 g de extracto de levadura y 8,0 g de agar.
En otro aspecto más en particular de la presente
invención, la purificación de la etapa c) se realiza en una placa
Petri (1) que contiene otra placa Petri (2) de menor diámetro en su
interior dejando un espacio entre ellas (3) en la que se deposita el
medio de cultivo MOM, que una vez solidificado el medio se retira
la placa Petri (2) de menor tamaño dejando un espacio central (4)
donde se deposita el inóculo de micelio.
En un aspecto más en particular de la presente
invención el medio BAF modificado de la etapa d) contiene como
nutrientes calcio, fósforo, potasio, magnesio, manganeso, zinc,
hierro, cloro, azufre, peptona, tiamina, biotina, inositol, ácido
fólico, glucosa y levadura. En un aspecto más en particular, el
medio BAF modificado de la etapa d) contiene
0,1 g de Cl_{2}Ca; 0,5 g de PO_{4}KH_{2}; 0,5 g de SO_{4}Mg 7H_{2}O; 0,005 g de SO_{4}Mn; 0,001 g de SO_{4}Zn; 0,01 g de Cl_{3}Fe 7H_{2}O; 2,0 g de peptona; 0,0005 g de tiamina; 0,00001 g de biotina; 0,05 g de inositol; 0,0001 g de ácido fólico; 5,0-20,0 g de glucosa y 0,2 g de extracto de levadura. En un aspecto más en particular, el medio BAF modificado de la etapa d) tiene un pH comprendido entre 5-6.5.
0,1 g de Cl_{2}Ca; 0,5 g de PO_{4}KH_{2}; 0,5 g de SO_{4}Mg 7H_{2}O; 0,005 g de SO_{4}Mn; 0,001 g de SO_{4}Zn; 0,01 g de Cl_{3}Fe 7H_{2}O; 2,0 g de peptona; 0,0005 g de tiamina; 0,00001 g de biotina; 0,05 g de inositol; 0,0001 g de ácido fólico; 5,0-20,0 g de glucosa y 0,2 g de extracto de levadura. En un aspecto más en particular, el medio BAF modificado de la etapa d) tiene un pH comprendido entre 5-6.5.
La figura 1 muestra dos perspectivas diferentes
1a y 1b del sistema utilizado para la purificación del micelio
fúngico.
La figura 1a corresponde a una placa de Petri de
un diámetro de 9 cm (1) en cuyo fondo se coloca de forma centrada
una placa (2) de 5 cm de diámetro, que se muestra con trazo
discontinuo. Como resultado de esta configuración entre ambas placas
se crea un espacio circular de 2 cm de ancho (3) en el que se
deposita el medio de cultivo fundido.
La figura 1b muestra el espacio central (4) que
queda cuando, una vez enfriado el medio, se retira la placa
interpuesta. En dicho espacio vacío central es donde se sitúa el
inóculo del micelio, que se desarrolla hasta alcanzar la sección
periférica (3) donde se encuentra el medio para la purificación,
liberándose así de la posible presencia de bacterias, las cuales
quedan retenidas en la sección central de las placas, al no poder
desarrollarse por ausencia de nutrientes.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención in vitro de micelio en
cultivo puro, aislado, tanto de los cuerpos fructíferos de especies
fúngicas, como de secciones de raicillas de plantas de alcornoque
(Quercus suber) y de jara pringosa (Cistus ladanifer)
micorrizadas con hongos.
En la presente invención cuando nos referimos a
especies fúngicas de interés comercial nos referimos en general a
especies fúngicas de Basidiomicetos como Clytocybe sp. o
Macrolepiota sp., y en particular a Amanita caesarea y
Boletus aereus.
El proceso se inició aislando, en cámara de
flujo laminar, pequeñas secciones de la parte más interna del
himenio del píleo de carpóforos maduros de Amanita caesarea y
de Boletus aereus, por separado, a los que se les había
eliminado previamente la pellis. Seguidamente, se procedió a la
inoculación de dichas secciones, en condiciones de máxima asepsia,
en cámara de flujo laminar, en placas Petri de plástico de 5 cm de
diámetro, previamente esterilizadas en autoclave, a las que se
adicionó con anterioridad el medio nutritivo a utilizar: medio de
cultivo sólido de avena modificado (MOM) cuya composición/litro de
medio fue: 0,5 g de Ca(NO_{3})_{2}4H_{2}O; 0,2 g
de PO_{4}KH_{2}; 0,1 g de SO_{4}Mg 7H_{2}O; 0,1 g de KCl;
5,0 g de sacarosa; 3,5 g de avena en polvo; 0,1 g de extracto de
levadura y 8,0 g de agar. Estas placas se mantuvieron en cámara a
20ºC hasta que el micelio se desarrolló, llegando a ocupar toda la
superficie de la placa.
El proceso anteriormente descrito se realizó
igualmente utilizando como inóculo, secciones de raicillas aisladas
de ejemplares de las citadas especies vegetales que previamente
habían sido micorrizados con Amanita caesarea y Boletus
aereus, y en las que mediante examen al microscopio óptico se
había comprobado la existencia de micorrizas de dichos hongos.
Posteriormente, el micelio obtenido en ambos
casos, se sometió a un proceso de purificación, con objeto de
eliminar la posibilidad de existencia de contaminación bacteriana,
utilizándose para ello placas Petri de 9 cm de diámetro en las que
el medio de cultivo (el medio MOM anteriormente descrito) se
dispuso solamente en una sección circular periférica de 2 cm
(placas preparadas con la ayuda de placas de 5 cm de diámetro, tal
como se muestra en la figura 1). En la parte central de estas placas
se colocaron secciones de 1x1 cm del medio sólido de crecimiento
MOM conteniendo el micelio fúngico. Estas placas se mantuvieron en
cámara a 20ºC hasta que el micelio se desarrolló ocupando toda la
superficie de la placa.
Una vez purificado el micelio se transfirió una
pequeña porción de éste, para su desarrollo a gran escala, a
matraces erlenmeyer conteniendo medio de cultivo líquido BAF
modificado, con una composición/litro de medio: 0,1 g de Cl_{2}Ca;
0,5 g de PO_{4}KH_{2}; 0,5 g de SO_{4}Mg 7H_{2}O; 0,005 g
de SO_{4}Mn; 0,001 g de SO_{4}Zn; 0,01 g de Cl_{3}Fe
7H_{2}O;
2,0 g de peptona; 0,0005 g de tiamina; 0,00001 g de biotina; 0,05 g de inositol; 0,0001 g de ácido fólico; 5,0-20,0 g de glucosa, y 0,2 g de extracto de levadura, el cultivo se mantuvo bajo condiciones controladas: 25ºC, oscuridad, pH 6 y agitación constante a 120 rpm.
2,0 g de peptona; 0,0005 g de tiamina; 0,00001 g de biotina; 0,05 g de inositol; 0,0001 g de ácido fólico; 5,0-20,0 g de glucosa, y 0,2 g de extracto de levadura, el cultivo se mantuvo bajo condiciones controladas: 25ºC, oscuridad, pH 6 y agitación constante a 120 rpm.
En 5 días se obtuvo un crecimiento masivo
(1:10^{6}) del micelio en cultivo puro dispuesto para la
inoculación de las plantas a micorrizar.
Este proceso es susceptible de desarrollarse
fácilmente en biorreactores de tipo industrial para una rápida
producción, en condiciones controladas, de grandes cantidades de
inóculo micelial purificado.
Claims (13)
1. Procedimiento de obtención in vitro de
micelio fúngico en cultivo puro que comprende las siguientes
etapas:
- a)
- Aislamiento del micelio fúngico,
- b)
- Inoculación del micelio aislado en la etapa a) en un medio de cultivo sólido de avena modificado (MOM)
- c)
- Purificación del micelio,
- d)
- Desarrollo del micelio purificado en la etapa c) en un medio de cultivo Biotina-Aneurina-Ácido Fólico (BAF) modificado,
- e)
- Obtención del micelio fúngico
2. Procedimiento de obtención de micelio fúngico
según la reivindicación 1, donde el aislamiento del micelio fúngico
se realiza a partir de cuerpos fructíferos de hongos.
3. Procedimiento de obtención de micelio fúngico
según la reivindicación 2, donde el hongo a partir del cual se
obtiene el micelio es seleccionado de entre los géneros
Boletus y Amanita.
4. Procedimiento de obtención de micelio fúngico
según la reivindicación 3, donde el hongo a partir del cual se
obtiene el micelio es Amanita caesarea.
5. Procedimiento de obtención de micelio fúngico
según la reivindicación 3, donde el hongo a partir del cual se
obtiene el micelio es Boletus aereus.
6. Procedimiento de obtención de micelio fúngico
según la reivindicación 1, donde el aislamiento del micelio fúngico
se realiza a partir de secciones de raicillas de plantas
micorrizadas.
7. Procedimiento de obtención de micelio fúngico
según la reivindicación 6, donde las plantas a partir de las cuales
es obtenido el micelio es seleccionado de entre los géneros
Quercus, o Cistus.
8. Procedimiento de obtención de micelio fúngico
según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el medio
de cultivo sólido de avena modificada (MOM) de la etapa b) contiene
como nutrientes calcio, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio,
cloro, azufre, sacarosa, levadura y agar.
9. Procedimiento de obtención de micelio fúngico
según la reivindicación 8, donde el medio de cultivo sólido de
avena modificado de la etapa b) contiene entre 0,5 g de
Ca(NO_{3})_{2} 4H_{2}O; 0,2 g de
PO_{4}KH_{2}; 0,1 g de SO_{4}Mg 7H_{2}O; 0,1 g de KCl; 5,0 g
de Sacarosa; 3,5 g de avena en polvo; 0,1 g de extracto de levadura
y 8,0 g de agar.
10. Procedimiento de obtención de micelio
fúngico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde
la purificación de la etapa c) se realiza en una placa Petri (1)
que contiene otra placa Petri (2) de menor diámetro en su interior
dejando un espacio entre ellas (3) en el que se deposita el medio
de cultivo MOM que una vez solidificado el medio se retira la placa
Petri (2) de menor tamaño dejando un espacio circular (4) donde se
deposita el inóculo de micelio.
11. Procedimiento de obtención de micelio
fúngico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde
el medio líquido BAF modificado de la etapa d) contiene como
nutrientes calcio, fósforo, potasio, magnesio, manganeso, zinc,
hierro, cloro, azufre, peptona, tiamina, biotina, inositol, ácido
fólico, glucosa y levadura.
12. Procedimiento de obtención de micelio
fúngico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde
el medio BAF modificado de la etapa d) contiene 0,1 g de
Cl_{2}Ca; 0,5 g de PO_{4}KH_{2}; 0,5 g de SO_{4}Mg
7H_{2}O; 0,005 g de SO_{4}Mn; 0,001 g de SO_{4}Zn; 0,01 g de
Cl_{3}Fe 7H_{2}O; 2,0 g de peptona; 0,0005 g de tiamina; 0,00001
g de biotina;
0,05 g de inositol; 0,0001 g de ácido fólico; 5,0-20,0 g de glucosa, y 0,2 g de extracto de levadura,
0,05 g de inositol; 0,0001 g de ácido fólico; 5,0-20,0 g de glucosa, y 0,2 g de extracto de levadura,
13. Procedimiento de obtención de micelio
fúngico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde
el medio líquido BAF modificado de la etapa d) tiene un pH
comprendido entre 5-6.5.
Priority Applications (5)
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| ES200930246A ES2332031B2 (es) | 2009-06-02 | 2009-06-02 | Procedimiento para la obtencion a gran escala de inoculo miceliar de basidiomicetos. |
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| ES200930246A ES2332031B2 (es) | 2009-06-02 | 2009-06-02 | Procedimiento para la obtencion a gran escala de inoculo miceliar de basidiomicetos. |
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2011
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| MOLINA, R.; PALMER, J.G. Isolation, maintenance and pure culture manipulation of ectomycorrhizal fungi. Methods and Principles of Mycorrhizal Research. N.C. Schenck, Universidad de Florida. 1982. Páginas 115-129. ISBN-10: 1890540462. ISBN-13: 978-0890540466. * |
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| TORRES, P.; HONRUBIA, M. Descripción de algunos hongos ectomicorrícicos en cultivo puro. Boletín Sociedad Micológica de Madrid. 1993. N$^{o}$ 18, páginas 163-170, especialmente páginas 163 y 164. ISSN: 0214-140X. * |
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