DE1645979B2

DE1645979B2 - Verfahren zur Herstellung von Ribonucleosid-S'-monophosphaten

Info

Publication number: DE1645979B2
Application number: DE1645979A
Authority: DE
Inventors: Naohito Tokio Kameyama; Masakazu Saitama Kurihara; Saburo Tokio Senoh; Tuneo Miyazaki Sowa; Shunji Ouchi Hiraku Yamada
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1966-07-14
Filing date: 1967-06-19
Publication date: 1974-02-28
Also published as: IT1006508B; NL6708049A; US3475409A; DE1645979A1; NL150803B; GB1176930A; DE1645979C3

Description

OH OH

in der B den Rest einer Purin- oder einer Pyrimidinbase bedeutet, durch selektive Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe des entsprechenden, in 2'- und 3'-Stellung ungeschützten Ribonucleoside, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Ribonucleosid der allgemeinen Formel

HO-CH₂ O_v B

25

Es sind bereits Versuche bekanntgeworden, ungeschütztes Nucleosid zu phosphorylieren; beispielsweise haben Gulland und Hobday die Reaktion von Guanosin mit Phosphoroxychlond m Pyndin untersucht (vgL Journal of Chemical Society, 1940 S. 746 bis 752); Bark er und Foil haben ähnliche Untersuchungen am Adenosm durchgeführt (vgl. Journal of Chemical Society 1957, S. 3798 ^DfeTatsache, daß die Phosphorylierung; von ungeschütztem Nucleosid weder industriell noch nn Laboratoriumsmaßstab angewendet wird durfte auf die folgenden beiden Gründe zurückzuführen sein: Unter den bekannten Reaktionsbedingungen ist ungeschütztes Nucleosid einer Phosphorylierungsreaküon weniger zugänglich als geschütztes Nucleosid; die Umwandlungsgeschwindigkeit der Reaktion ist gering; außerdem führt die Phosphorylierung von ungeschütztem Nucleosid unter anderem zu 2- und 3'-Monophosphaten, 3' (oder T), 5'-Diphosphat und Dinucleosidphosphat als Nebenprodukte statt zu dem gewünschten 5'-Monophosphat und besitzt somit nur eine geringe Selektivität.

Um das gewünschte 5'-Monophosphat zu erhalten, hat man bisher ein Verfahren angewendet, das sich etwa durch die folgende chemische Gleichung wiedergeben läßt:

HOCH₂ O B

30

in der B die angegebene Bedeutung hat, in einem Reaktionsgemisch, das auf 1 Mol des Ribonucleosids 0,2 bis 3 1 Nitromethan, Nitroäthan. Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril, Propionitril oder Dichlormethan, 2 bis 12 Mol Phosphoroxychlorid, 2 bis 6 Mol Wasser und 1,5 bis 10 Mol Pyridin, Picolin, Lutidin oder Collidin enthält, bei einer Reaktionstemperatur von —30 bis +3O⁰C umsetzt, das Reaktionsgemisch gründ-Hch mit Wasser vermischt und nach Ablauf der Hydrolysereaktion das 5'-Monophosphat isoliert. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man weniger als die äquimolare Menge Wasser, bezogen auf das Phosphoroxychlorid, verwendet.

OH OH
HOCH₂ .0. B

(ID

O O

R R

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von Ribonucleosid-5'-monophosphaten der allgemeinen Formel

HO O

POCH₂ O. B

HO O

ll

P-O-CH₂ O

HO

55

60 (ΠΙ)

O O

R R

OH OH

in der B den Rest einer Purin- oder einer Pyrimidinbase bedeutet, durch selektive Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe des entsprechenden, in 2'- und 3'-Stellung ungeschützten Ribonudeosids.

HO O

P-O-CH₂ O B

^HO

(IV)

OH ΘΗ

vobei B eine Purin- oder eine Pyrimidinbase und R tine Alkyl-, eine Arylgruppe oder ein Wasserstoffatom bedeutet

Bei den oben erläuterten Reaktionen entspricht die Reaktion II einer Addition von schützenden Gruppen, z. B. von Aceton an die Hydroxylgruppen in der 2 - oder 3'-Stellung, während die Reaktion III die Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe und die Reaktion IV die Hydrolyse der schützenden Gruppen darstellt.

Beispiele fur diese bekannten Verfahren, bei denen vor der Phosphorylierung der 5'-H>droxylgruppe in Ribonucleosiden die 2'- und 3'-Hydroxylgruppen geschützt werden, geben die französischen Patentschriften 1434 511 und 1428 186. Bei diesen bekannten Verfahren wird in einem Fall das Nucleosid zum Schutz der sekundärem Hydroxylgruppen mit Aceton, im anderen Fall unter Komplexbildung mit Metaborsäure umgesetzt In einer weiteren Stufe wird dann erst die Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe und anschließend das Abspalten der schützenden Gruppen vorgenommen.

Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Herstellen von Ribonucleosid-5'-monophosphaten der allgemeinen Formel

HO O

HO

P-O-CH₂ O B

OH OH

35

in der B den Rest einer Purin- oder einer Pyrimidinbase bedeutet, durch selektive Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe des entsprechenden in T- und 3'-Stellung ungeschützten Ribonucleosids zugang-Hch zu machen, das in einfacher und wirtschaftlicher Weise durchgeführt werden kann und zu hohen Ausbeuten des Ribonucleosid-5'-monophosphats führt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein Ribonucleosid der augemeinen Formel

HO-CH, O

in der B die angegebene Bedeutung hat, in einem Reaktionsgemisch, das auf 1 Mol des Ribonucleosids 0,2 bis 31 Nitromethan, Nitroäthan, Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril, Propionitril oder Dichlormethan, 2 bis 12 Mol Phosphoroxychlorid, 2 bis 6 Mol Wasser und 1,5 bis 10 Mol Pyridin, Picolin, Lutidin, oder Collidin enthält, bei einer Reaktionstemperatur von —30 bis +30⁰C umsetzt, das Reaktionsgemisch gründlich mit Wasser vermischt und nach Ablauf der Hydrolysereaktion das 5'-Monophosphat isoliert.

Es ist offensichtlich, daß die bekannten Verfahren, bei denen geschützte Ribonucleoside eingesetzt werden, auch dann, wenn ohne Isolieren der Zwischenprodukte gearbeitet wird, komplizierter sind als die erfindungsgemäße selektive Phosphorylierung, da die in dem vorstehenden Fonnelschema gezeigten Reaktionen II und IV durchgeführt werden müssen.

Andererseits werden nach dem zitierten Verfahren von Barker und Foil 5'-, 3'- und 2'-Monophosphate in einem Verhältnis von 6:3:1 erhalten, und die Ausbeute an 5'-Monophosphat beträgt nur 6%, bezogen auf das Ausgangsnucleosid. Demgegenüber beträgt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Umwandlungsrate des Nucleosids nahezu 100% und die Selektivität der 5'-Phosphorylierung überschreitet immer 90%. Das erfindungsgemäße Verfahren kann im einzelnen wie folgt näher erläutert werden.

Zunächst werden innerhalb der angegebenen Grenzwerte liegende Mengen eines der angegebenen polaren organischen Lösungsmittel, nämlich Nitromethan, Nitroäthan, Tetrahydrofuran, Dioxan, Acetonitril, Propionitril oder Dichlormethan, Phosphoroxychlorid, Wasser und eines der angegebenen cyclischen tertiären Amine, nämlich Pyridin, Piccolin, Lutidin oder Collidin, miteinander vermischt; zu dem entstandenen Gemisch, das bei einer Temperatur innerhalb des angegebenen Bereichs gehalten wird, wird das Ribonucleosid unter Rühren gegeben.

Die Reaktionsmischung, die anfangs eine Suspension bildet, geht mit fortschreitender Reaktion allmählich in eine klare Lösung über. Das entstandene Reaktionsgemisch wird in eine große Menge kaltes Wasser oder auf Eiswasser gegossen, um eine wäßrige Lösung zu erhalten. Anschließend kann das Reaktionsgemisch mit den üblichen Methoden zum Abtrennen und Reinigen von Nucleosiden behandelt werden, z. B. unter Verwendung von Tierkohle und Ionenaustauscherharzen, wobei man Ribonucleosid-5'-monophosphat erhält.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind das Mischungsverhältnis der Bestandteile des Reaktionsgemisches sowie die Auswahl der oben angegebenen organischen Lösungsmittel und tertiären Aminen außerordentlich wichtig.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden polaren organischen Lösungsmittel sind Lösungsmittel mit einer hohen Dielektrizitätskonstante. Unter den angegebenen Substanzen werden Nitromethan und Acetonitril besonders bevorzugt.

Die Menge dieser Lösungsmittel bei dem erfindungsgemäßen Verfahren hängt von der Art des Lösungsmittels und dem Ausgangsnucleosid und ferner von den Mengen an Phosphoroxychlorid, organischer Base und Wasser ab. Die zu verwendenden Mengen liegen im Bereich von 0,2 bis 3 1 pro Mol Ausgangsnucleosid. Die Verwendung dieser Lösungsmittel in einer Menge von weniger als 0,21 pro Mol Nucleosid verursacht wegen der hohen Viskosität des Reaktionsgemisches unbequeme Arbeitsbedingungen, während bei Verwendung von mehr als 3 1 pro Mol Nucleosid die Menge an Phosphoroxychlorid und organischer Base erhöht werden müßte, was vom wirtschaftlichen Standpunkt aus unerwünscht ist. Diese organischen Lösungsmittel können einzeln oder als Gemisch von zwei oder mehreren Lösungsmitteln verwendet werden.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Menge an Phosphoroxychlorid steht in enger Beziehung zu der Art und Menge des organischen Lösungsmittels und den Mengen an cyclischem tertiärem Amin sowie Wasser. Die anzuwendende Menge an Phosphoroxychlorid beträgt 2 bis

12 Mol pro Mol Ausgangsnucleosid. Die Verwendung von Phosphoroxychlorid in geringeren Mengen als 2 Mol pro Mol Nucleosid ergibt eine sehr niedrige Umwandlungsrate für die Reaktion, während andererseits die Verwendung von mehr a^ls 12 Mol zu einer allmählichen Abnahme der Umwandlungsgescbwindigkeit der Reaktion und der Selektivität der 5'-Phosphorylierung fuhrt. Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten cyclischen tertiären Amine beeinflussen stark die Umwandlungsgeschwindigkeit und Selektivität der Reaktion. Als geeignete cyclische tertiäre Amine wurden Pyridin, Picolin, Lutidin, Collidin ermittelt. Die Verwendung von primären, sekundären Aminen und aliphatischen tertiären Aminen ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht ratsam.

Die angegebenen cyclischen tertiären Amine werden in einer Menge von 1,5 bis 10 Mol pro Mol Nucleosid verwendet Ein geringerer Überschuß an cyclischem tertiärem Amin über eine äquimolare Menge pro Mol Ausgangsnucleosid führt gewöhnlich zu einem mäßig befriedigenden Ergebnis.

Die Verwendung von weniger als einer äquimolaren Menge führt zu einer merklichen Verzögerung der Reaktionsgeschwindigkeit und Verringerung der Ausbeute an 5'-Nucleotid, während eine Menge von über 10 Mol nicht nur vom wirtschaftlichen Standpunkt aus erwünscht ist, sondern auch die Selektivität der 5-Phosphorylierung ungünstig beeinflußt. Die cyclischen tertiären Amine werden einzeln oder als Mischung verwendet.

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Wassermenge steht in enger Beziehung zu der Menge an Phosphoroxychlorid und organischer Base; innerhalb des genannten Mengenbereiches der beiden Bestandteile beträgt die Wassermenge 2 bis 6 Mol pro Mol Ausgangsnucleosid. Wenn mehr als 6 Mol Wasser verwendet werden, werden die unerwünschten Nebenreaktionen unterstützt und die Menge an Purinbase und anderer Nebenprodukte erhöht. Wenn die Wassermenge ungewöhnlich gering ist im Vergleich zur optimalen Menge, so läuft das Verfahren nicht immer reproduzierbar, und gleichzeitig wird die Ausbeute an 5'-Nucleotid herabgesetzt. Innerhalb der angegebenen Mengenbereiche ist eine geringere Wassermenge als die äquimolare Menge, bezogen auf Phosphoroxychlorid, vorzuziehen.

Es besteht keine' besondere Beschränkung hinsichtlich der Art und Weise, wie Wasser zugegeben wird, jedoch sind Zugabemethoden, welche eine sofortige Reaktion von Wasser mit Phosphoroxychlorid verursachen, z. B. die Zugabe eines Gemisches von tertiärem cyclischem Amin und Wasser zu Phosphoroxychlorid, nicht ratsam.

Auch die Reaktionstemperatur und -dauer sind wichtige Bedingungen für die Reaktion, wenn befriedigende Ergebnisse erzielt werden sollen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ähnlich wie bei anderen chemischen Reaktionen die Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Temperatur erhöht und mit fallender Temperatur verringert. Bei der Phosphorylierung von Nucleosid mit Phosphoroxychlorid sollte man berücksichtigen, daß beim überschreiten der optimalen Temperatur die Zersetzung des Ausgangsnucleosids und des gebildeten Nucleotids merklieh wird, Die Temperatur bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sollte in Verbindung mit der Menge an organischer Base bestimmt werden, sie liegt jedoch im Bereich von -30 bis +30⁰C. Bei höheren Temperaturen findet eine zu starke Zersetzungsreaktion statt, die das Verfahren uninteressant macht, während bei niedrigeren Temperaturen die Reaktionsgeschwindigkeit sehr gering wird und eine zu lange Reaktionsdauer benötigt wird. Unter Berücksichtigung der verschiedenen oben beschriebenen Reaktionsbedingungen beträgt die erforderliche Reaktionszeit gewöhnlich 30 Minuten bis 10 Stunden.

Obwohl die Reaktionstemperatur und -dauer einen gewissen Einfluß auf das Aussehen des Reaktionsgemisches und die Selektivität der 5'-Phosphorylierung haben, sind sie nicht von so großer Bedeutung wie die Mengen des Ausgangsmaterials.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Zu einem Lösungsgemisch, enthaltend 20 ml Acetonitril, 8 ml (0,087 Mol) Phosphoroxychlorid, 1 ml (0,056 Mol) Wasser und 7,9 ml (0,098 Mol) Pyridin, das bei 0 bis 20⁰C gehalten wurde, wurden 5,4 g (0,022 Mol) Inosin unter Rühren gegeben. Nach 4stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch in etwa 500 ml kaltes Wasser gegossen und das Rühren etwa 1 Stunde bei 0 bis 5⁰C fortgesetzt.

Die entstandene wäßrige Lösung wurde mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxyd versetzt, um den pH-Wert des entstehenden Gemisches auf etwa 1 einzustellen; es enthielt 99% Phosphatverbindungen und 96% Inosin-5'-monophosphat. Dann ließ man die Mischung durch eine Kolonne laufen, die 50 g Aktivkohle enthielt, wobei Inosinsäure adsorbiert wurde. Nachdem die Säule mit wäßriger 0,1 η-Salzsäure und einer kleinen Menge Wasser ausgewaschen war, wurde der Inhalt mit einem Lösungsgemisch von 3% Ammoniak und 10% Methanol in Wasser eluiert und das entstandene Eluat unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst, die Lösung wurde durch eine Kolonne geschickt, die etwa 20 ml eines Ionenaustauschers in der Η-Form enthielt, und die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen. Die abfließende Flüssigkeit und die Waschflüssigkeiten wurden mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxyd auf einen pH-Wert von 7,7 eingestellt. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck bis zu einem Sirup konzentriert. Nachdem man die konzentrierte Lösung über Nacht in einem Eisbehälter stehenließ, bildeten sich Kristalle, die abfiltriert und bei 110⁰C unter verringertem Druck getrocknet wurden; man erhielt 7,1 g Dinatriuminosin-5'-monophosphat in 98%iger Reinheit. Ferner wurde durch Zugeben von Alkohol und Stehenlassen der Mischung eine kleine Menge Natriuminosinat aus dem Filtrat erhalten.

Beispiel 2

Das Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung, daß 10 ml (0,102 Mol) a-Picolin an Stelle von Pyridin verwendet wurden Man erhielt 7,2 g Natriuminosinat in 95%iger Reinheit.

Beispiel 3

Zu einem Lösungsgemisch, bestehend aus 20 ml Acetonitril mit einem Gehalt von 10% Propionitril, 8 ml (0,087 Mol) Phosphoroxychlorid, 1 ml (0,056 Mol) Wasser und 8 ml (0,082 Mol) a-Picolin, wurden bei 0 bis 5°C 5,4 g (0,022 Mol) Inosin unter Rühren ee-

geben; die Reaktion wurde 5 Stunden lang fortgesetzt. Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wurden 7,1 g Natriuminosinat mit 97%iger Reinheit erhalten.

Beispiel 4

Zu einem Lösungsgemisch, enthaltend 60 ml Nitromethan 24 ml (0,262 Mol) Phosphoroxychlorid, 2,6 ml (0,144 Mol) Wasser und 23,7 ml (0,294 Mol) Pyridin, das bei etwa 5⁰C gehalten wurde, wurden 17 g (0,060 Mol) Guanosin unter Rühren gegeben. Nachdem man die Reaktion 5 Stunden lang laufen ließ, wurde das Reaktionsgemisch in etwa 21 kaltes Wasser gegossen und etwa 1,5 Stunden lang gerührt. Dann ließ man es stehen.

Die entstandene wäßrige Lösung, die 2% Guanosin, 1% Guanin, 92% Guanosin-S'-monophosphat und 5% andere Phosphate enthielt, ließ man durch eine Kolonne laufen, die 150 g Aktivkohle enthielt, und dann wurde mit Wasser gewaschen. Die Kolonne wurde dann mit 2,5 1 O,25n-wäßrigem Natriumhydroxyd eluiert. Das Eluat ließ man anschließend durch eine Kolonne mit etwa 50 ml eines Ionenaustauschers in der Η-Form laufen; die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen. Die abfließende Flüssigkeit und die Waschflüssigkeit wurden vereinigt, dann wurde mit Natriumbydroxyd der pH-Wert der entstandenen Mischung auf 7,6 eingestellt; die Mischung wurde unter verringertem Druck konzentriert, wobei man etwa 100 ml konzentrierte Lösung erhielt. Die entstandene konzentrierte Lösung wurde mit 300 ml Methanol versetzt; man ließ sie über Nacht in einem Kühlschrank stehen. Die gebildeten Kristalle wurden abfiltriert und getrocknet; man erhielt 20,6 g Dinatriumguanosin-5'-monophosphat, enthaltend 97% 5-Guanylat und 1% andere Phosphate.

Beispiel 5

Zu einem Lösungsgemisch, bestehend aus 60 ml Acetonitril, 24 ml (0,262 Mol) PhosphoroxychJorid, 2.6 ml (0,144 Mol) Wasser und 24 ml eines Gemisches, enthaltend α-, β-, y-Picolin und 2,6-Lutidin in einem Verhältnis von 7:1:1:1 (etwa 0,238 Mol Picolin und Lutidin), das bei 0 bis 2 C gehalten wurde, wurden 17 g (0,060 Mol) Guanosin gegeben, worauf man die Reaktion etwa 6 Stunden laufen ließ. Nach dem Verfahren des Beispiels 4 erhielt man 19.5 g Natriumguanylat, enthaltend 96% Guanosin-S'-monophosphat und 2% andere Phosphate.

Beispiel 6

Das Beispiel 4 wurde wiederholt mit der Abwei chung, daß Acetonitril und 16 g (0,061 Mol) Adenosin an Stelle von Nitromethan bzw. Guanosin verwende wurden. Als Ergebnis wurden 20 g Natriumadenylat mit einem Gehalt von 95% Adenosin-S'-monophosphat und 2% anderen Nebenprodukten erhalten.

Beispiel 7

Zu einem Lösungsgemisch, enthaltend 20 ml Dichlormethan, 10 ml (0,109 Mol) Phosphoroxychlorid 1,2 ml (0,067MoI) Wasser, 9,5 ml (0,117MoI) Pyridin, das bei 5 bis 7⁰C gehalten wurde, wurden 5,4 g (0,022 Mol) Inosin unter Rühren gegeben, und man ließ die Reaktion 4 Stunden lang laufen. Beim Arbeiten nach Beispiel 1 wurden 6,8 g Natriuminosinat mit einem Gehalt von 90% 5-Monophosphat und 3% anderen Phosphaten erhalten.

„ . , , „

Beispiel 8

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch 5,7 g (0,020 Mol) Xanthosin an Stelle von Inosin verwendet wurden. Man erhielt 6,6 g reines Natriumxanthosin-5'-monophosphat.

Beispiel 9

Zu einem Lösungsgemisch, enthaltend 20 ml Acetonitril, 8 ml (0,087 Mol) Phosphoroxychlorid und 7,9 ml (0,098 Mol) Pyridin, das bei 0 bis 2 C gehalten wurde, wurden 5,8 g (0,019 Mol) lnosindihydrat (0,038 Mol Kristallwasser) gegeben. Beim Arbeiten nach Beispiel 1 wurden 6,0 g 5'-Inosinat mit einer Reinhei von 90% erhalten.

Beispiel 10

Zu 15 ml Acetonitril wurden 6 ml (0,66 Mol) Phosphoroxychlorid, 0,72 ml (0.040 Mol) Wasser und 7,2 ml (0,074MoI) α-Picolin gegeben. Zu dem entstandenen Gemisch, das bei 0 bis 2° C gehalten wurde, wurden 3,7 g (0,015 Moll Cylidin unter Rühren gegeben. Beim Arbeiten nach Beispiel 1 wurden 5,0 g Dinatriumcytidin-5'-phosphat in 99%iger Reinheit erhalten.

Beispiel 11 Beispiel 10 wurde wiederholt, wobei jedoch 3,7 g

(0,015 Mol) Uridin an Stelle von Cytidin verwendet wurden. Man erhielt 5,1 g Dinatriumuridin-5'-phos phat in 97%iger Reinheit.

409509/43$

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen von Ribonucleosid-5-monophosphaten der allgemeinen Formel

HO O

\ll

P-O-CH₂ O B HO