DE1670884A1

DE1670884A1 - Verfahren zur Herstellung von Nucleosiden

Info

Publication number: DE1670884A1
Application number: DE19671670884
Authority: DE
Inventors: Guenter Dr Luenzmann; Gerhard Prof Dipl-Chem Schramm
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1967-06-24
Filing date: 1967-06-24
Publication date: 1971-02-18
Also published as: GB1239449A; AT285829B; BE717054A; US3541079A; CH491118A; FR1569465A

Description

Verfahren zur Herstellung von Nucleosiden

Es ist bereits bekannt« daß man Nucleoside erhält, wenn «an Zucker und Stickstoffbasen in Gegenwart von Polyphosphorsäureäthylester erhitzt (DBP 1 206 907). Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß es schwierig zu reproduzieren ist und nicht immer befriedigende Ergebnisse liefert. Außerdem kann bei Vorhandensein freier Aminogruppen in den Stickstoffbasen eine unerwünschte Alkylierung stattfinden.

Es wurde nun gefunden, daß man Nucleoside in einfacher Weise und in guter Ausbeute erhält, wenn man einen Zucker oder ein Zuckerderivat mit freier Carbonylfunktion und eine heterocyclische Stickstoffbase mit mindestens einem nukleophilen N-Atom im Ring in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines

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Polyphosphorsäurephenylesters, dessen Phenylreste auch niedere Alkylgruppen oder Halogenatose enthalten können, aufeinander einwirken läAt.

Als Zucker eignen sich für das Verfahren geaäfl der Erfindung sowohl Aldosen, wie Trlosen. Tetrösen, Pentosen, Hexosen und Heptosen als auch die entsprechenden Ketosen. Beispielsweise seien Arabinose, Ribose, Xylose, Lyxose, Fruetose. Glucose, Allose, Altrose, Gulose, Talose, Hanno·«, Idöse, Psicöse. Sorbose, Galactose, Mannoheptulose, GaIaheptulose, Erythrose und Threose genannt.

AuAer diesen einfachen Zuckern kosawn Zuckerderirate, die eine freie Carbonylfunktlon aufweisen, wie Desoxyzucker, z.B. Rhasnose, Digitalose, Fucose und Desoxyribose, acylierte Aminozucker, z.B. If-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosaain und H-Acetylaannosamin und Oligosaccharide wie Lactose, Gentiobiose, Mellblose und Maltose sowie Monocarbonsäuren von Zuckern, z.B. Glucuronsäure und Galacturonsäure, in Fon ihrer Ester alt Alkoholen wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Benzylalkohol in Betracht. Selbstverständlich können auch solche Zuckerderivate, in denen eine oder Mehrere Hydroxylgruppen insbesondere mit Methylgruppen veräthert oder z.B. alt Essigsäure, Benzoesäure und p-Nitrobenzoesäure verestert sind, als Ausgangsstoffe eingesetzt werden. Es sei besonders erwähnt, daß als Zuckerkoaponente auch Apurinsäuren, die bekanntlich (J. Biol. Chee. JL95 (1952), Seite 49) dadurch entstehen, dafi man aus nucleinsäuren in schwach saurer Lösung die Purinreste abspaltet und die Aldehydfunktion der Ribose bzw. Desoxyribose freilegt, ohne da» dabei der Polyaerisationsgrad der Nucleinsäuren beeinträchtigt wird, verwendet werden können.

Als zweite Beaktionskosponente kommen H-haltige Heterocyclen in Betracht, die Mindestens ein nucleophiles M~Atoe (durch nucleophile Agenzien substituierbares N-AtoaO im Ring enthalten. Als

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Beispiel seien Derivat· des Pyrimidine, vie Uracil, Dihydrouracll und 2,4-Dläthoxypyrimidln, Cytosin, Thymin, Orotsäure sowie Barbltursäure und andere cyclische Ureide und solche, die sich το« Imldazol ableiten, wie Purin, 2-Amlnopurln, 6-Methylaainopurin, 6-Dimethylaminopurln, 2-Methyladenin, 2,6-Dlaminopurin, Hypozanthin, Isofuanln, 2,8-Dlhydroxyadenin, Mercaptopurln, 6-Mercapto-2-aminopurin, Theophyllin, 2-Aza-adenln, 8-Aza-adenin, 8-Aza-e-Bercaptopurln, 8-Aza-guanin, 8-Azaisoguanln, 8-Aza-Bypoxanthin, 8-Aza-2,6-diaminopurin, Desazaadenin. Adenin und Guanin, genannt. Ferner selen genanntt Die Derivate des Pyrazole_a Triazole, sowie die Derivate des Pyrazine, wie z.B. die Piperidine.

Als Kondensationsmlttel eignen sich Insbesondere Polyphosphersäurephenylester (PPP), doch können auch solche Ester verwendet werden, die sich von PPP durch Ersatz eines oder Mehrerer Vasserstoffatoae in den Phenylresten durch nlederaolare Alkylgruppen oder Ralogenatoae ableiten. Genannt seien z.B. das Tri-p-chlorphenylpolyphosphat und das Trl-p-tolylpolyphosphat.

Die erfindungsgeaaB als Kondensatlonaaltte1 verwendeten Polyphoephorsäurephenylester erhält aan, indes aan Phosphorpentozid alt Triphenylphosphat bzw. Tri-alkylphenyl- oder Trl-halogenphenylphosphatenbei Teaperaturen oberhalb ca. 2OO°C erhitzt. Die Reaktionsdauer richtet sich nach der Temperatur: Bei 200° ist die Umsetzung nach etwa 15 bis 40 Stunden, bei 3O0° nach 2 bis 5 Stunden beendet. Es ist nicht erforderlich, die Komponenten In molarem Verhältnis einzusetzen; vorteilhaft verwendet man Triphenylphosphat im überschuA bis zu 2,5 zu 1. Die Reaktionsprodukte bilden je nach dem Mengenverhältnis bei Raumtemperatur klare, glasige bis hochviskose Massen, die sich jedoch bei 50°C leicht handhaben lassen. Sie sind in Chloroform, Dimethylformamid, Dimethylsulfozid und Dloxan sehr gut löslich, schwer löslich dagegen in Xther, Petroläther, Benzol und Wasser.

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Der vermutliche Reaktionsverlauf sei am Beispiel der Herstellung von Adenoein schematisch wiedergegeben.

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Die Synthese der Nucleoside kann auf zwei Wegen stattfinden. Entweder kann zuerst der Zucker phosphoryliert und anschließend ■it der Base umgesetzt werden, oder es wird zuerst die Base phosphoryliert und anschließend ait de« Zucker umgesetzt. Die letztgenannte Methode ist vorzuziehen. Die Ausführung des Verfahrens gemäß der Erfindung erfolgt zweckmäßig in der Weise, daß man die Stickstoffbase in einem inerten Lösungsmittel mit dem Polyphosphorsäureester und einigen Tropfen Säure reagieren läßt, dann die Lösung des Zuckers hinzugibt, das Lösungsmittel ▼erdampft und das verbleibende homogene Reaktionsgemisch erwärmt. Da die Ausbeuten umso höher liegen, je mehr Base eingesetzt wird, arbeitet man im allgemeinen so, daß man auf 1 Teil Zucker etwa 1,5 bis 20 Teile Base einwirken laßt. Zwar kann man die erfindungsgemäßen Umsetzungen auch mit molaren Mengen an Zucker und Base durchführen, muß dann jedoch einen Verlust des eingesetzten Zuckers durch Nebenreaktionen in Kauf nehmen. Der Überschuß an Base kann ohne weiteres über das oben angegebene Verhältnis, z.B. bis zum Hundertfachen, erhöht werden, ohne dass dadurch eine wesentliche Verbesserung der Ausbeute erzielt wird. Die zu wählenden Temperaturen und H -Ionen-Konzentrationen sind naturgemäß von den Eigenschaften und dem Reaktionsvermögen der Reaktionspartner abhängig. Vorzugsweise arbeitet man bei Tempera-

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türen zwischen etwa 50 und 10O⁰C und einem pH (genessen in Dimethylformamid) zwischen 0,5 und 3.

Als Lösungsmittel für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich solche, in denen die Zucker und die Basen gut löslich sind und die selbst nicht mit den Reaktionskomponenten reagieren. In Frage kommen insbesondere Ester und Alkylamide verschiedener Säuren, z.B. Diäthylphosphit, Phosphorsäure-tris-dimethylamid, Dimethylsulfoxyd, Formamid oder besonders Dimethylformamid. Die Gegenwart kleiner Mengen Wasser stört nicht.

Die Isolierung der Verfahrensprodukte erfolgt zweckmftßigerweise so, daß man das Reaktionsgemisch in Wasser löst und die Lösung neutralisiert. Dabei bleibt nicht verbrauchter Polyphosphorsäuren ester ungelöst zurück und kann durch Abfiltrieren entfernt werden. Aus der wäßrigen Lösung kann das Nucleosid durch Säulenchromatographie an Dowex -formiat und Elution mit Ammoniumformiatlösung oder durch einfaches Konzentrieren erhalten werden.

Die Verwendung von PPP bzw. der genannten substituierten PPP anstelle von Polyphosphorsäureäthylester hat den Vorteil, daft keine Alkylierung des Reaktionsproduktes zu befürchten ist. Ferner sind die PPP erheblich leichter herstellbar und wesentlich stabiler, so daß die Herstellung der Nucleoside vereinfacht, die Ausbeute verbessert und die Bildung von Zersetzungsprodukten unterdrückt wird.

Die Verfahrensprodukte können auf Grund ihrer pharmakodynamischen Wirkung teils direkt als Arzneimittel, teils als Zwischenprodukte zur Herstellung von Pharmazeutika »wndet werden. So dienen z.B. Adenosin als Kreislaufmittel und Psicofuranin sowie Arabinosyladenin und Arabincsylcytosin

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(S.S. Cohen, Proer. Nucleic Acid Research S, 1 (1966)) als Cytostatica, während 2-(2^>-Desaay-D-ribofuranosyl)-6-Mthylasy»-triazin-3,5-(2,4)dion (Azathyaidin, J.Am.Chea.Soc. Bd. 8O (1958), Seite 1138) als Inhibitor der DNS-Synthese wirkt. Die bei Verwendung τοη Apurinsäuren nach dea Verfahren geaiA der Erfindung erhältlichen Nucleinsäuren haben erheblichen BinfluA auf den Zellstoffwechsel und können als Cytostatlka, x.B. als Inhibitoren τοη Bakterien, oder nir Transformation rom Organisaen« z.B. zur Herstellung ron Yirus-Hutanten_# »ewndet en.

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Beispiel 1 Darstellung de» Phenylpolyphosphorsäurcesters

44,93 g Phosphorpentexid (0,158 Mol) wurden in 131,5 g (0,4O4 Mol) geschaolzenes Tripbeny!phosphat (Schmelzpunkt 49%) eingewogen und bei Zimmertemperatur gut verrührt, bis sich aus der anfänglichen Suspension eine steife Masse gebildet hatte und die Wäi entwicklung abgeklungen war. Dann wurde der Kolben in einer

Heizhaube auf 300°C erwärmt. Nach 2,5 Stunden etwa war alles Phoephorpentoxid gelöst und es entstand ein homogenes Produkt. Dieses wurde dann noch 15 Minuten bei 300°C gerührt.

Beispiel

dl- und ft-9-D-Rlbofuranosyl-adenln

5 g Adenin (37 aMol) wurden in 5OO ■! frisch destiliiertem Dimethylformamid, dem 3 al konzentrierte Salzsäure zugefügt waren, aufgelöst. In der Lösung wurde alt einer Glaselektrode ein pH-Wert τοη weniger als 1 gesessen. Nach Zugabe von 16 g Polyphosphorsäurepnenyleeter wurde die Mischung 5 Minuten lang auf 50°C erhitzt. Dann wurde 1 g Ribose (7,4rtfol) in 250 el Dimethylformamid hinzugegeben und das Lösungsmittel unter veraindertea Druck bei 100⁰C in eines Rotationsverdampfer abdestilliert. Es hinterblieb ein gelber gummi artiger Rückstand, der 2 bis 3 Minuten auf 98° erhitzt und nach des Abkühlen in etwa 25 «1 Wasser gelöst wurde, wobei der pH-Wert Mittels 2 n-Na0H auf 7 eingestellt wurde. Ia Kühlschrank setzte sich nach kurzer Zeit ein aus Adenin und Phenylpolyphosphat bestehender Niederschlag ab, der abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde eingeengt und alt 25 %igea Aaaoniak auf pH 11 eingestellt. Zur Isolierung der Nukleosldfraktion wurde eine alt Dowex-lxlO-Formlat gefüllte Säule, (50 χ 3,6 ca) verwendet, die ait 0,Ol aolarer Aaaoniuaforalatlösung äqullibrlert worden war. Das Filtrat wurde auf diese Säule aufgegeben ucd bei pH 10,2 alt 0,01 aolarer

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Aamoniumformi at lösung eluiert. Das E Iu at wurde in Fraktionen yon 20 al aufgefangen und in jeder Fraktion die UV-Abeorption bestimmt. Die Fraktionen 41 bis 65 enthielten hauptsächlich d-Adenosin, die Fraktionen 66 bis 153 hauptsächlich A-Adenosin.

Zur weiteren Reinigung wurden die beiden Hauptfraktionen an einer Dowex-lx2-OH Säule (5O χ 3,6 cn) unter Verwendung von 60 %igem Methanol als Elutionsmlttel abemals chroaatograpaiert. Die Fraktionen 66 bis 153 der Dowex-Formlatsäule, die in der Hauptsache A-Adenosln enthielten, wurden eingedampft und in der oben erwähnten Weis« chroaatographiert. Die Fraktionen 78 bis 100 enthielten das restliche d-Adenosin; das A-Adenosin erschien in den Fraktionen 165 bis 22Ο. Letztere wurden eingedampft und der Trockenruckstand wurde in Methanol aufgelöst. Aus der eingeengten Lösung kristallisierte das A-Adenosin aus. Nach abermaliger Umkriatallisation aus Methanol schmolz die Verbindung bei 234 bis 235°C. Die spezifische Drehung /ecjj betrug -61,6°. Diese Angaben stlasen mit den in der Literatur berichteten Werten übe rein. Zur Reinigung des OC-Adenosins wurden die Fraktionen 41 bis 65 der Dowex-Formiatsäule an Dowex-lx2-0H Chromatographie rt, das Eluat wurde in 20 ml Fraktionen aufgefangen. Der Verlauf der Chromatographie wurde papierchromatographisch und UV-spektroskopisch verfolgt. Reines (Χ-Adenosin erschien in der Mähe der Fraktion 80, reines A-Adenosin folgte später. Die das Of-Adenosln enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und eingedampft, der Rückstand in Methanol aufgelöst und die Lösung auf ein Volumen von 1 bis 2 ml eingeengt. Durch Zusatz von etwa 10 ml Xthylather wurde das dL-Adenosin In kristalliner Form ausgefällt. Nach Omkristallisation aus Methanol/Xthyläther schmolz es bei 2Ol bis 2O2°C, der Drehwert ^ÖfJ_O betrug 29,5° (in Wasser).

Ot- und A-Adenosin wurden in annähernd gleichen Mengen erbalten. Die gesamte Ausbeute der beiden Anomeren betrug 18 bis 20 %, bezogen auf Riboae_;

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Beispiel 3

ot- und ß-9-D-Desoxyribofuranosyladenln

5OO mg (3,7 »Mol) Adenin wurden in 100 »1 Dimethylformamid, de« 0,3 Ml konzentrierter HCl zugeseben waren, gelost. Nach Zugabe von 1,3 g Polyphosphorsäurephenylester wurde die Mischung fünf Minuten lang auf 50° erhitzt, dann wurden O,1 g 2^f-Desoxyribose (0,67 sMol) in 50 al Dimethylformamid zugegeben und der pH-Wert durch Zugabe von etwa 0,33 Ml Triäthylamin auf 2 bis 2,5 eingestellt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck in eine« Rotationsverdampfer bei einer Badtemperatur von 5O°C abdestilliert und der schwach gelbliche Rückstand wurde weitere 10 Minuten lang auf 50° erwärmt. AnschlieOend wurde er in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 2 n-NaOH neutralisiert. Beim Abkühlen im Kühlschrank fiel nach kurzer Zeit unverbrauchtes Phenylpolyphosphat aus, das durch Filtration entfernt wurde. Das Filtrat wurde mit 25 %igem Ammoniak auf pH 10,5 eingestellt. Die Lösung wurde an einer Dowex-lxlO-Formiatsäule (28 χ 2,6 cm) bei pH 9,6 chromatographiert, das Eluat wurde in 15 ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen 11 bis 60 enthielten ein Gemisch von*- und O-Desoxyadenosin, wie durch Papierchromatographie in Butanol/Wasser festgestellt wurde.

Zur weiteren Reinigung wurde das Anomerengemisch auf ein Volumen von 3 bis 5 ml eingeengt und an einer Dowex-lx2-0H-Slule unter Verwendung von 30 %igem Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Das Eluat wurde in 20 ml Fraktionen aufgefangen. Reines ct-Desoxyadenosin erschien in den Fraktionen 46 bis 6O. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wurde es in einer kleinen Menge Methanol aufgelöst, mit Äthyläther ausgefällt und abschlieAend aus Methanol umkristallisiert. Der Schmelzpunkt betrug 2O9 bis 211°C, die spezifische Drehung /5t7_D betrug 71° (in Wasser).

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A-Adenosin erschien in den Fraktionen 77 bis 9O. Nach dea Abdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand aus 1,5 al

Wasser unter Zusatz einiger Tropfen Assmnlak «kristallisiert. Das so gereinigte A-Desoxyadenosin schaolz bei 188 bis 189°C und zeigte eine spezifische Drehung ^fc7_D von -26°C.

Die Gesuntausbeute toooC- und β-Desoxyadenosin betrug 35 bis 40 %, bezogen auf Desoxyribose. Der Anteil an 06-Desoxyadenosin war etwas höher als der an A-Desoxyadenosin.

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Claims

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Patentanspruch ι

Verfahren zur Herstellung von Nucleotiden, dadurch gekennzeichnet, daA aan einen Zucker oder ein Zuckerderlvat Hit freier Carbonylfunktlon und eine heterocyclische Stickstoffbase, die la Ring Mindestens ein nucleophiles K-Atosi enthält, in eines inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Polyphosphorsfturephenylesters, dessen Phenyl res te auch niedere Alkylgruppen oder Ha logen at om enthalten können, aufeinander einwirken IaAt.

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