FI60877C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt aktiva i vatten laett dispergerbara polyenmakrolidantibiot-n-glykosylderivat - Google Patents

Description

RÄ5r*l ΓΒΐ mxKWWLUTUSJULKAISU ,nftn„ *®Γα lBJ utlAggningsskrift oUö f / C (45) Patentti myönnetty 13 04 1982 i£PV2r Patent neddelat ’ (51) Kv.ik.3/IM.CI.3 C 07 H 17/08 SUOMI —FINLAND (21) PaMnttlh.k.mu» —PM*ntan»öknlr.f 2187/72 (22) Hakamltpiiva —Aiwekfllnpdic 07.08.72 * ' (23) AlkupUvI—Giklgh«t>dag 07.08.72 (41) Tullut fulkbuk·! — Bllvlt offantllg ^ . 02 .7 3

. . , . . , (44) NthtfvUulpanon ja kuuL|ulkal*un pvm. — Q

Patent· och registerstyrelsen ' ' An«<Uun utUgd och uti.sknft·» publtcarad 31.12.81 (32)(33)(31) Pyydetty atuolkatii — Begird prioritet 13·θ8.71 0U.05.72 Puola-Polen(PL) P-li+9991», P-155167 (71) Politechnika Gdafiska, Gdafisk, Puola-Polen(PL) (72) Leonard Falkovski, Gdansk, Miroslav Bobrovski, Bialystok, Helena Buluk, Bialystok, Elzbieta Rylec, Gdafisk-Oliva, Barbara Cybulska, Sopot,

Jerzy Golik, Sopot, Pavel Kolodziejczyk, Gdansk, Jan Pavlak, Gdansk-Wrzeszcz, Andrzej Rudovski, Gdafisk, Jan Zielinski, Gdansk-Oliva,

Tadeusz Zimifiski, Gdynia, Edvard Borovski, Gdansk, Puola-Polen(PL) (7!») Oy Jalo Ant-Wuorinen Ab (5U) Menetelmä terapeuttisesti aktiivisten, veteen helposti dispergoituvien polyeenimakrolidiantibiootti-N-glykosyylijohdannaisten valmistamiseksi - Förfarande för framställning av terapeutiskt aktiva, i vatten lätt dispergerbara polyenmakrolidantibiot-N-glykosylderivat Tämän keksinnön kohteena on menetelmä polyeeni-makrolidiryh-mään kuuluvien antibiootti-sokerijohdannaisten valmistamiseksi.

Nykyisin tunnetaan joukko polyeeni-makrolidiryhmään kuuluvia antibioottisia aineita, kuten nystatiini, amfoterisiini B, trikomy-siini, kandisidiini, joilla on laaja käyttö dermatomykoosien lääkintähoidossa. Tunnetaan myös niiden ehkäisevä vaikutus prostatan eli eturauhasen suurenemiseen sekä kolesteriinipitoisuuden kasvuun veressä. Näiden antibioottisten aineiden epäedulliset ominaisuudet johtuvat ennenkaikkea niiden liukenemattomuudesta veteen, mikä epäkohta voidaan poistaa vain osittain muodostamalla komplekseja desok-sikoleiinisoodan kanssa sekä N-asyylijohdannaisia. Näiden aineiden pääasiallinen epäkohta johtuu kuitenkin siitä, että ne eivät muodosta mitään aitoja liuoksia vaan ainoastaan kolloidaalisia liuoksia. Amfoterisiini B:n kompleksi desoksikoleiinisoodan kanssa, ts. fungi-siini, aiheuttaa lisäksi erytrosytolyysin, jolloin tällä aineella käsitellyissä organismeissä voidaan jälkivaikutuksena todeta anemiaa.

60877

Lisäksi se sisältää aineosia, jotka eivät ole soveliaita elävälle organismille. N-asyylijohdannaisilla on myös huomattavasti alhaisempi biologinen aktiviteetti verrattuna substituoimattomiin polyee-neihin.

Julkaisusta Muftic, M; Quart. J. Crude Drug Res (1968) 8 (3), 1274-80, ref. Chemical Abstracts 76, 22885 q, tunnetaan polyeeni-makrolidiantibioottien saattaminen veteen dispergoituviksi liuoksiksi kompleksoimalla niitä vesiliukoisten steroidien kanssa.

Keksinnön kohteena on polyeeni-makrolidiryhmään kuuluvien antibiootti johdannaisten valmistus, joilla on parempia terapeuttisia ominaisuuksia - erityisesti mitä dermatomykoosien käsittelyyn tulee -ja jotka lisäksi vastustavat prostatarauhasen suurenemista ja alentavat kolesteriinipitoisuutta veressä.

Keksintö koskee näin ollen menetelmää terapeuttisesti aktiivisten, veteen helposti dispergoituvien polyeenimakrolidiantibioot-tien N-glykosyylijohdannaisten, joiden kaava on R-NH-CI^-B, jossa R on polyeenimakroliditähde ja B on sakkariditähde, ja niiden suolojen valmistamiseksi, joka menetelmä tunnetaan siitä, että vapaan alifaattisen aminoryhmän sisältävä, kaavan R-Nl·^ mukainen polyeeni-makrolidiantibiootti, jossa R tarkoittaa samaa kuin edellä, ryhmästä pimarisiini, rimosidiini, nystatiini, polyfungiini, amfoterisii-ni B, kandidiini, mykoheptiini, kandisidiini, perimysiini, triko-mysiini ja aureofasiini, Amadori-Heyn'in- mukaisesti saatetaan reagoidaan sakkaridin kanssa ryhmästä glukoosi, maltoosi, riboosi, fruktoosi, ramnoosi, asetyyliglukoosi ja glukoronihappo, inertissä liuottimessa, mahdollisesti suolan muodostukseen sopivan emäksen läsnäollessa, tuote eristetään ja mahdollisesti puhdistetaan tunnettujen menetelmien mukaisesti, ja saatu vapaa yhdiste haluttaessa muutetaan emäksen suolaksi tai saatu suola haluttaessa muutetaan vapaaksi yhdisteeksi.

Keksinnön mukaisesti käytetyt polyeeni-makrolidiantibiootit, paitsi perimysiini, sisältävät molekyylissään glykosidisesti sitoutuneen amino-sokeriryhmityksen, 3-amino-3,6-dideoksi-D-mannoosi-ryhmän (mykosamiini), kun taas perimyysiini sisältää 4-amino-4,6-dideoksi-D-mannoosi-ryhmän (perosamiini). Näissä yhdisteissä amino-sokeri-ryhmä sijaitsee identtisessä allyylisessä asemassa ja niillä on samat kemialliset ominaisuudet. Seuraava kaava esittää amino-sokeri-ryhmityksen ja sitä ympäröivän molekyyliosan rakennetta poly-eenimakrolideissa.

3 60877 \^ν*"ΝΗ*^= \ X u*2

cooh vyv^cooH

' ' 0H i„ 'pc^l

«^r— \ 0-^. OH OH

' , 'ΓοΗ^ίΗ C 3

Keksinnön mukaisen menetelmän olosuhteissa polyeenimakrolidin sokeriryhmän vapaa aminoryhmä reagoi hiilihydraattireagenssin ano-meerisen hiiliatomin kanssa Amadori-Heyn-tyyppisessä reaktiossa seuraavasti :

R - NH2 + A -> R - NH - CH2 - B

jossa R tarkoittaa polyeenimakrolidin tähdettä yhdistettynä vapaaseen aminoryhmään, A sakkaridireagenssia, B sakkaridireagenssin tähdettä Amadori-Heyn-reaktion jälkeen.

Seuraavassa esitetään esimerkkinä tämäntyyppisestä reaktiosta nystatiinin reaktio glukoosin kanssa H0^ifiH0R'H) * Η0^^0Η'Ηί

OH

?H3 I

HO. JL . . ^ yO—k. OH

f0"3 OH 0^Η^Ϊη-ΟΗ27<;

Il I I |^X'^|^]f^rsC00H 0H

0 OH OH OH OH o OH

4 60877

Saaduissa johdannaisissa hiilihydraattiosat ovat siis kulloinkin edellä esitettyä tyyppiä ja johdannaiset eroavat toisistaan lähinnä vain reagoimattoman makrolidiosan suhteen. Amadori-Heyn-tyyp-pisiä reaktioita on käsitelty seuraavissa julkaisuissa: H.Simon, A.Kraus: Mechanistiche Untersuchungen Uber Glykosylamine Zuckerhydra-zone, Amadori Umlagerungsprodukte und Osazone. Fortschr.Chem.Forsch. 14, 430, 1070 ja L.Falkowski et ai: N-glycosyl derivatives of polyene macrolide antibiotics. J.Antibiot. 28, 244, 1975.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä lähtöaineena käytettävät antibiootit ovat osaksi kaupallisia tuotteita, joilla on laaja terapeuttinen käyttö. Niinpä nystatiinia ja amfoterisiiniä B valmistaa E.R.Squibb and Sons, pima-risiiniä valmistaa Mycofarm, Delft, ja polifungiinia valmistaa Pharmaceutical Works "Polfa". Seuraavat antibiootit valmistettiin kokeellisesti ja niitä toimittivat seuraavat lääkevalmistajat: rimo-sidiinia toimitti Pfizer Pharmaceuticals, perimysiiniä toimitti H. Lundbeck, Kööpenhamina, kandisidiinia toimitti Calbiochem, kandidiinia ja aureofasiinia toimitti Pharmaceutical Works "Polfa", mykoheptiinia toimitti Ali Union Research Technological Institute of Antibiotics and Enzymes, Leningrad ja trikomysiiniä toimitti Fujisawa Pharmaceuticals Co, Osaka. Menetelmiä näiden antibioottien valmistamiseksi on yksityiskohtaisesti selitetty seuraavissa kirjallisuusviitteissä: J.M.T.Hamilton-Miller: Chemistry and Biology of the Polyene Mac-rolidi Antibiotics. Bacteriogical Reviews 37, 166, 1973; A.H.Thomas: Analysis and Assay of Polyene Antifungal Antibiotics. The Analyst 101, 322, 1976; S.Waksman, H.A.Lechavelier: The Actinomycetes. Wiliams and Wilkins, Maltimoren 1962.

Antibiootit amfoterisiini B, pimarisiini, rimosidiini ja my-koheptiini esiintyvät yksittäisinä yhdisteinä ja niiden rakenne on selitetty seuraavissa kirjallisuusviitteissä: W.Mechlinski and ai: Structure and absolute configuration of the polyene macrolide antibiotic amphotericin B. Tetrahedron Letters 3873, 1970; S.T.Golding and al: The structure of the macrolide antibiotic pimaricin. Tetrahedron Letters 2615, 1964; L.Falkowski and al: The Structure of Rimo-cidin. J.Antibiot. 29, 197, 1976; E.Borowski and al: The structure of mycoheptin, a polyene macrolide antifungal antibiotic. J.Antibiot. 31, 117, 1978; L.Falkowski and al: The structure of rimocidin and polyfungin B. Polisch Chem.Soc.Meeting, Warsaw 1976.

Polyfungiini, kandidiini, trikomysiini, kandisidiini, aureo-fasiini ja perimysiini ovat läheisiä ominaisuuksia omaavien yhdisteiden seoksia, joista pääkomponentin rakenne on määritetty, vrt.

5 60877

Int.Symp. on Antibiotics, Weimar 1979: The structures of trychomycin A and B, the heptane macrolide antibiotics; J.Zielifiski et al: The structure of levorin A2 and candicidin D. Tetrahedron Letters 1971, 1979; P.Kolodziejczyk et al: The structure of the antibiotic peri-mycin A. Tetrahedron Letters 3603, 1976; T.Zimifiski et al: The structure of vacidin A, a main component of antifungal antibiotic aureo-facin. Int.Symp. on antibiotics, Weimar 1979; E.Borowski et al: The structure of candidin, a polyene macrolide antifungal antibiotic. Tetrahedron Letters 1987, 1971.

Polyeeni-makrolidiryhmään kuuluvien antibioottisten aineiden sokerijohdannaisia käytetään lääkeaineina dermatomykoosien hoidossa, sekä eturauhasen suurenemista ehkäisevinä ja veren kolesterii-nipitoisuutta alentavina aineina.

Saatujen johdannaisten aktiviteetti sieni-ihottumaa vastaan in vitro tutkittiin käyttämällä kahta menetelmää: a) Antibioottisten aineiden ja niiden johdannaisten mikrobiologisen aktiviteetin määrittäminen kiinteillä elatusalustoilla - taulukko 1, b) antibioottisten aineiden ja niiden johdannaisten mikrobiologisen aktiviteetin määrittäminen nestemäisillä elatusalustoilla -taulukko 2.

Mikrobiologinen aktiviteetti kiinteillä elastusalustoilla määritettiin käyttämällä sarjamaisia laimennuksia seuraavasti: 1 mg antibioottista ainetta liuotettiin 1 ml:aan dimetyylisulfoksidia ja laimennettiin 9 ml:11a steriiliä vettä. Suoritettiin sarjalai-mennus vedessä ja pienin konsentraatio, joka esti Candida albicans-ja Saccharomyces cerevisiae-standardikantojen kasvun määritettiin sekoittamalla petrimaljoissa, joiden halkaisija on 10 cm, 0,5 ml antibioottiliuosta ja 9,5 ml Sabouraud-elatusalustaa noin 60°C:n lämpötilassa. Sekoitettiin huolellisesti, substraatin annettiin jähmettyä ja mikrobit ympättiin pintaan, minkä jälkeen pidettiin 24 tuntia lämpökaapissa 36°C:n lämpätilassa. Pienin estävä konsentraatio määritettiin tarkastelemalla mikrobien kasvun lakkaaminen. Taulukossa 1 esitetään arvot nystatiinille ja sen glukoosijohdannaiselle.

6 60877

Taulukko 1

Pienin kasvua estävä konsentraatio

Valmiste (μβ/π,1)

Candida albicans'ia S. cerevisiae'ta vas- vastaan__taan_ nystatiini 2 2 nystatiini- glukoosi-joh- dannainen 2 2

Antibioottisten aineiden ja niiden johdannaisten mikrobiologinen aktiviteetti nestemäisillä elatusalustoilla määritettiin käyttämällä sarjamaisia antibioottilaimennuksia edellä selitetyllä tavalla, sekä sekoittamalla 0,5 m] antibioottiliuosta ja 4,5 ml mikro-organismeilla tartutettua, Sabouraud'in mukaan valmistettua alustaa, ilman agaria, ja lisäämällä 25 mg tarkosyliiniä litraa kohti. Liuokset säilytettiin 48 tuntia 32°C;n lämpötilassa.

Pienin mikrobien kasvua estävä konsentraatio määritettiin samennuksen aiheuttamasta ekstinktion kasvusta 660 nm:ssa ja tulokset on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2

I Antibiootti MIC Yhdiste MIC

(yg/ml) (yg/ml) 1. pimarisiini 2,5 NGL pimarisiini 5,0 2. rimosidiini 2,5 NGL rimoaidiini 2,5 3. nystatiini A^ 0,5 NGL nystatiini A]_ 1,0 NML nystatiini 2,5 NRL nystatiini 2,0 4. polyfungiini 0,5 NGL polyfungiini 1,0 NGU polyfungiini 5,0 5. amfoterisiini B 0,05 NGL amfoterisiini B 0,2 NGU amfoterisiini B 0,5 6. kandidiini 0,2 NGL kandidiini 1,0 7. mykoheptiini 2,5 NGL mykoheptiini 2,5 8. kandisidiini 0,001 NGL kandisidiini 0,005 9. trikomysiini 0,001 NGL trikomysiini 0,005 10. kandisidiini 0,05 NGL kandisidiini 0,2 11. aureofasiini 0,005 NGL aureofasiini 0,025 NGU aureofasiini 0,025 7 60877 MIC * pienin estävä konsentraatio NGL = glukoosijohdannainen NML = maltoosijohdannainen NRL * riboosijohdannainen NGU = glukuronijohdannainen

Kuten edellä olevista arvoista käy ilmi on polyeeni-makrolidiryhmään kuuluvien antibioottijohdannaisten aktiviteetti dermatomykooseja vastaan samaa suuruusluokkaa kuin lähtöaineantibioottien, Määritettiin myös nystatiiniglukoosijohdannaisen aktiviteetti, nystatiiniin verrattuna, eräitä patogeenisiä Candida- ja Geotrichum-kantoja vastaan, jotka oli eristetty tartutetuista ihmiselimistö. Tutkimustulokset on esitetty taulukossa 3,

Polyfungiinijohdannaisten kahden glukoosivalmisteen myrkyllisyys (LD^q) tutkittiin biologisesti hiirillä, joiden paino oli noin 24 g. Antibioottinen aine annettiin eläimille vatsakalvon kautta fysiologisena keittosuolaliuoksena tilavuudessa 1,0 ml. Polyfungiinijohdannaisena verrattiin natriumsuolan ja imid-atsoli-glukoosisuolan myrkyllisyydet. Molemmat valmisteet annettiin hiirille kerran seuraavissa annoksissa: 4 mg/kg, 12 mg/kg, 36 mg/kg, 60 mg/kg, 80 mg/kg ja 300 mg/kg eläimen painoa.

Kussakin ryhmässä oli kuusi hiirtä.

Taulukko 3

Mikro- Tutkittujen Lukumäärä kantoja, joiden kasvu voitiin estää organismi ku^arä*1 ^ nystatiinilla nystatiini-glukoosijohdannaiselli 1,56 3,12 6,25 12,5 25,0 50,( 3,12 6,25 12,5 25,0 50,0 (Ug/ml) (Ug/ml)

Candida albicans 24 tunnin jälkeen 12 1 11 0 0001 11 000

Candida albicans 48 tunnin jälkeen 12 0 2 10 0000 01200

Candida sp.

24 tunnin jälkeen 8 2 31 2002 5010

Candida sp.

48 tunnin jälkeen 9 0 31 3100 2321

Geotrichum sp.

24 tunnin jälkeen 12 0 2 10 0000 5700

Geotrichum sp.

48 tunnin jälkeen 12 0 05 7000 0930 I - 24 ja 48 tuntia ruiskuttamisen jälkeen laskettiin kuolleet eläimet, 8 60877 määritettiin kuolleiden ja eloonjääneiden eläinten prosenttiluvut ja sen jälkeen määritettiin LD^q probiteettimenetelmän mukaisesti. Tulokset on esitetty taulukossa 4.

Taulukko 4

Antibiootti- Glukoosi-polyfungiinijohdannaisen vaikutuksesta kuolleet eläimet annos --—---—---- mg/kg Havaittu 24 tunnin jälkeen Havaittu 48 tunnin jälkeen

Natriumsuola Imidatsolisuola Natriumsuola Imidatsolisuola 4 0 0 0 0 12 0 0 1 0 36 0 0 0 2 60 0 0 0 0 80 3 3 4 3 100 4 3 5 5 300 6 6 6 6 LD50 85 mg/kg 89 mg/kg 80 mg/kg 74 mg/kg

Polyfungiinin glukoosijohdannaisen natrium- ja imidatsolisuolan myrkyllisyydet, ilmaistuna Löpinä, ovat samanlaiset ja vaihtelevat arvoon 80 mg/ kg asti. Natriumsuola on hieman myrkyllisempi kun annokset määritetään 24 tunnin havaintoajan jälkeen. 48 tunnin havaintoajan jälkeen näyttää polyfungiinin imidatsolisuolan olevan myrkyllisempi. Berents-asteikolla on glukoosi-polyfungiinijohdannaisen natriumsuolan myrkyllisyys 54,7 mg/kg ja imidatsolisuolan 52,5 mg/kg.

Veteen liukenemattoman polyfungiinin ja polyfungiinijohdannaisen veteen liukenevan glukoosisuolan aktiviteetit dermatomykooseja vastaan verrattiin in vivo tutkimuksissa, joissa käytettiin "Porton"-rotuun kuuluvia valkoisia hiiriä, joiden paino oli noin 30 g, Hiiret tartutettiin Candida albicans no. 4477-kannalla ruiskuttamalla hännän suoneen 0,2 ml 3,3 x ΙΟ** Candida albicans-soluja sisältävää suspensiota, joka oli saatu viljelemällä 48 tuntia Sabouraud-agarilla.

Polyfungiinijohdannaisen glukoosisuolavalmiste liuotettiin 0,9%:seen natriumkloridiliuokseen, liukenematon polyfungiini sitävastoin suspensoitiin samanlaiseen liuokseen. Molemmat antibioottiset aineet annettiin hiirille niiden vatsakalvoon. Käytettiin seuraavia antibioottiannoksia: 1 mg/kg, 1 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 16 mg/kg kehonpainoa.

Kontrolliryhmälle ei annettu mitään antibioottista ainetta. Kukin ryhmä koostui kuudesta hiirestä. Alkaen neljäntenä päivänä tartunnasta laskettuna, tapettiin kustakin ryhmästä yksi hiiri joka toinen päivä katkaisemalla 9 60877 sen selkäydin, suoritettiin ruumiinavaus ja määritettiin C. albicans-solujen lukumäärä 1 g:ssa munuaista. Munuaiset punnittiin ja homogenoitiin bakteriologisissa lasihuhmareissa. Saadut homogenaatit laimennettiin sarjamaisesti fysiologisessa keittosuolaliuoksessa, jolloin kustakin homogenaatista, kuten myös laimennuksista ympättiin 0,1 ml kiinteille Sabouraud-alustoille. 48 tunnin inkubaation jälkeen 30°C:ssa muodostuneet pesäkkeet laskettiin ja määritettiin Candida albicans-solujen lukumäärä tutkittujen eläinten 1 g:ssa munuaista. Tutkimustulokset on esitetty taulukossa 5.

Taulukko 5

Antibiootti Antibiootin Päiviä tartunnan jälkeen päivittäinen -..... — -------------------------------------- - —- annos mg/kg 4 6 8 10 12 14

Candida albicans-solujen lukumäärä 1 g:ssa munuaista 0 8,0xl04 1,9xIOA 1,8x106 5,0x10? 1,4x107 Ι,ΟχΙΟ6 1 4,5xl04 5,3xl04 7,6x106 1,4x106 2,4x10? 1,9x106

Polyfungiini- 2 Ι,ΟχΙΟ4 Ι,βχΙΟ5 1,5χ105 Ι,ΟχΙΟ5 Ι,ΟχΙΟ6 4,9xl05

glukoosi- 4 2,0x10A 3,4χ10Α 1,2x10A 2,9χ10Α 1,1x103 4,1x10A

johdannainen ai a 8 1*1x10** 1,3xlOJ O 2,5xl04 0 0 16 9,5xl03 O 0 0 O 0 1 3,3xl04 8,2x105 7,9x10A 5,2x106 1,4x105 5,2x106

Poly" 2 l,7xl06 8,2xl05 2,3xl05 l,7xl06 2,6xl06 4,3xl05 funguni 4 8,6xl05 4,4xl05 Ι,ΟχΙΟ4 4,lxl03 l,5xl06 l,2xl06 8 2,2xl04 3,7xl04 3,7xl03 6,4xl04 6,3xl04 l,3xl03 16 2,0xl06 3,9xl04 3,9xl03 4,3xl03 Ι,ΙχΙΟ4 l,6xl03

Suoritettujen tutkimusten tuloksista voidaan nähdä että veteen liukenevalla polyfungiiniglukoosijohdannaisen natriumsuolalla on huomattavasti suu rempi aktiviteetti in vivo kuin varsinaisella antibioottisella aineella hiiren lääkinnällisessä hoidossa yleistä keskivahvaa Candidiase'a vastaan.

Käytettäessä liukoista polyfungiiniglukoosijohdannaista 8-16 mg/kg:n annoksina aikaansaadaan hiirimunuaisten täydellinen steriloituminen. Tämä tulos ei ole saavutettavissa liukenemattomalla polyfungiini11a.

Polyeeni-makrolidien sokerijohdannaisilla, jotka ovat muodostuneet näistä antibioottisista aineista ja mono- ja oligosakkarideista ja niiden johdannaisista, on se etu, että ne dispergoituvat helposti veteen, jolloin sellaisilla polyeeni-makrolideilla ja niiden johdannaisilla, joissa on hapan ryhmä, on taipumus melkein neutraalissa väliaineessa muodostaa stabiilisuoloja kationien kanssa, jotka liukenevat hyvin veteen.

10 60877

Erilaiset johdannaiset, erilaiset polyeeni-makrolidit ja erilaiset sokerit sekä niiden erilaiset suolat kationien kanssa liukenevat veteen muodostaen liuoksia, jotka vaihtelevassa määrin koostuvat hyvin dispergoituneista kolloideista ja aidoista liuoksista, Monet näistä aineista, kuten esim, glukoosi- tai maltoosi-nystatiinijohdannaisen natriumsuolat, muodostavat kolloidi-vapaita, aitoja liuoksia. Polyeeni-makrolidien näillä liukoisilla ja stabiileilla sokerijohdannaisilla ja niiden suoloilla on suuri biologinen aktiviteetti. Niiden mikrobiologinen spektri on identtinen lähtöaineantibiootin spektrin kanssa. Päinvastoin kuin fungisonit eivät nämä yhdisteet myöskään aiheuta erytrosyto-lyysiä.

Aminoryhmän sisältävän polyeeni-makrolidin reaktio sokerin kanssa tapahtuu lievissä olosuhteissa, jopa ilman katalysaattoria, jonka käyttö jouduttaisi reaktion kulkua, mutta reagoivaa sokeria ei kuitenkaan tarvitse aktivoida etukäteen koska sokeri reagoi erittäin helposti polyeeni-makrolidien aminoryhmien kanssa.

btenetelmä polyeeni-makrolidien sokerijohdannaisten valmistamiseksi ja niiden puhdistus havainnollistetaan seuraavassa esimerkeillä.

Esimerkki I

1Z

3.0 g nystatiinia (E^ 560; 304 nm), 3,0 g glukoosia ja 0,5 g imidatsolia liuotetaan 50 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan olla lämpö-kaapissa 36°C:n lämpötilassa kaksi päivää. Tänä aikana on kaikki antibioottinen aine reagoinut käytännöllisesti katsoen loppuun. Saatu johdannainen ja liukenematon glukoosi saostetaan etyylieetterillä, pestään liuottimelle ja kuivataan tyhjössä. Saadaan 6,1 g raakaa johdannaista imidatsolisuolan muodossa,

1Z

E, - 260; 304 nm.

1 cm ’

Esimerkki II

. 1Z

3,0 g nystatiinia (E^ cm 560; 304 nm) ja 3,0 g glukoosia liuotetaan 50 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan olla 2 päivää 36°C:n lämpötilassa.

Käsitellään edelleen kuten esimerkissä I, Saadaan 5,6 g raakaa glukoosi-. . 1Z

johdannaista, E^ = 280; 304 nm,

Esimerkki lii 1% 10.0 g polyfungiinia (E, * 825; 304 nm) liuotetaan 50 ml:aan dimetyyli- I cm formamidia, sen jälkeen lisätään 3,0 g glukoosia ja 0,1 § askorbiinihappoa ja pannaan kahdeksi päiväksi lämpökaappiin 36°C:ssa. Käsitellään edelleen kuten

1Z

esimerkissä I. Saadaan 12,9 g raakaa johdannaista, E. 570; 304 nm.

’ ° J 1 cm

Esimerkki IV

1Z

0,5 g nystatiinia (E^ ^ * 640; 304 nm) ja 0,5 g maltoosia liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan olla kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa. Käsitellään edelleen kuten esimerkissä I. Saadaan 0,9 g raakaa johdannaista, 60877 1 1 e}% - 310; 304 nm.

1 cm

Esimerkki V

. . 1% 1.0 g amfotensiinia B (Ej^ * 1420; 382 nm) ja 0,3 g glukoosia suspensoidaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan olla kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa. Jatketaan kuten esimerkissä I. Saadaan 1,3 g raakaa 1% johdannaista, E^. 1050; 382 nm.

Esimerkki VI

17 ],0 g amfoterisiini B:tä (E^* M 1420; 382 nm) ja 0,6 g maltoosia liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan seistä kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa. Jatketaan kuten esimerkissä I. Saadaan 1,5 g raakaa 1% johdannaista; E, * 960; 382 nm. i cm

Esimerkki VII

1% 1.0 g kandisidiiniä (E^ * 430; 378 nm) ja 1,0 g glukoosia sekä 0,5 g imidatsolia liuotetaan 50 ml:aan pyridiiniä ja annetaan olla huoneen lämpötilassa 7 päivää. Käsittely jatkuu kuten esimerkissä I, Saadaan 2,1 g . . . 17 raakaa johdannaista orgaanisen emäksen suolan muodossa, E, * * 200; 378 nm, * 1 cm ’

Esimerkki VIII

1% 0,5 g kandisidiiniä (E^ cm = 750; 378 nm) ja 0,3 g maltoosia liuotetaan 10 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan olla kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa.

Käsitellään edelleen kuten esimerkissä I. Saadaan 0,7 g raakaa johdannaista, E.1Z = 410; 378 nm.

1 cm

Esimerkki IX

1Z

0,5 g pimarisiinia (E^ = 800; 304 nm), 0,5 g riboosia ja 0,5 g imidatsolia liuotetaan 100 ml:aan metanolia ja annetaan olla 24 tuntia 36°C:n lämpötilassa, jolloin metanoli tislataan pois tyhjössä 10 ml:n tilavuuteen, raaka johdannainen seostetaan ja pestään etyylieetterillä. Saadaan 1% 1.0 g raakaa tuotetta, E, 0 340; 304 nm , imidatsolisuolan muodossa.

’ 1 cm ’ ’

Esimerkki X

.... 1% 1.0 g pimansiima, E^ cm 800; 304 nm, ja 0,6 g maltoosia liuotetaan 10 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan olla kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa, Käsitellään edelleen kuten esimerkissä I. Saadaan 1,4 g raakaa johdannaista, 1% E. - 530; 304 nm.

1 cm

Esimerkki >XI

i % 0,5 g polyfungiinia (E^ 700; 304 nm), 0,5 g maltoosia ja 0,1 g imidatsolia liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan seistä kaksi päivää 360C:n lämpötilassa. Käsitellään edelleen kuten esimerkissä I. Saadaan

1Z

1.1 g raakaa johdannaista imidatsolisuolan muodossa, E^ 318; 304 nm).

1% 12 60877

Esimerkki XII

0,5 g trikoroysiiniä (E^ * 500; 378 tun) ja 0,15 g glukoosia liuotetaan 0,8 tnl:aan dimetyyliformamidia ja annetaan seistä kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa. Käsitellään edelleen kuten esimerkissä I. Saadaan 0,55 g raakaa 17 johdannaista, = 360; 378 nm.

Esimerkki XIII

1% 1.0 g trikomysiiniä, E^ * 500; 378 nm, ja 0,6 g miltoosia liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan seistä kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa.

Käsitellään edelleen kuten esimerkissä I. Saadaan 1,4 g raakaa johdannaista, eJZ * 320; 378 nm.

1 cm

Esimerkki XIV

1% 0,5 g pimarisiinia (E^ cm * 800; 304 nm), 0,5 g fruktoosia ja 0,1 g imidatsolia liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidin ja metanolin 2:l-seosta ja annetaan seistä kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa. Käsitellään edelleen kuten esimerkissä I. Saadaan 1,0 g raakaa johdannaista imidatsolisuolan tnuo- 12 dossa, E, * 370; 304 nm.

1 cm ’

Esimerkki XV

17 0.1 g kandisidiinia (E. = 800; 378 nm) ja 0,1 g glukoosia liuotetaan 1 cm 2,0 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan seistä kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa. Käsitellään edelleen kuten esimerkissä 1. Saadaan 0,2 g raakaa joh- . 1% dannaista, E, = 370; 378 nm.

1 cm ’

Esimerkki XVI

—————— 17 0,5 e kandisidiinia (E,0 = 800; 378 nm) ja 0,3 g maltoosia liuotetaan 20 ml:aan dimetyyliformamidin ja pyridiinin 2:l-seosta ja annetaan seistä kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa. Käsitellään edelleen kuten esimerkissä I, Saadaan 1% 0,7 g raakaa johdannaista, E. * 520; 378 nm.

i cm

Esimerkki XVII

1% 1.0 g rimosidiinia (E^ · 500; 304 nm), 1,0 g glukoosia ja 0,2 g imidatsolia liuotetaan 15 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan seistä kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa. Käsitellään edelleen kuten esimerkissä I, 1%

Saadaan 2,0 g raakaa johdannaista. E, - 230; 304 nm.

1 cm

Esimerkki XVIII

1.0 g kandisidiinijohdannaisen raakaa glukoosia imidatsolisuolan muodossa, joka on valmistettu esimerkin VII mukaisesti, liuotetaan 20 ml:aan vettä, hapotetaan etikkahapolla ja ravistellaan 20 ml:n kanssa butanolia. Kun kerrokset ovat erottuneet,vesikerros heitetään pois ja jäljelle jäävä, antibioottijohdannaista sisältävä butanolikerros pestään useita kertoja vedellä, joka on kyllästetty butanolilla, ja hapotettu etikkahapolla, 10 ml:n annoksina kunnes imidatsoli 13 60877 on täydellisesti poistettu. Clukoosi-kandisidiinijohdannaisen jäljelle jäävä butanoliliuos, joka johdannainen on vapautettu imidatsolisuolastaan, väkevöidään tyhjössä kunnes atseotrooppinen vesi on täydellisesti poistettu.

Jäljelle jäävästä liuoksesta seostetaan johdannainen etyylieetterillä, Saadaan 1% 0,5 g tuotetta, joka ei sisällä lainkaan iraidatsolia, E, * 300, Vastaavalla tavalla vapautetaan imidatsolisuolastaan kaikkien muiden polyeeni-makrolidien sokerijohdannaiset.

Esimerkki XIX

10 g nystatiinin reaktiosta glukoosin kanssa (esimerkki II) saatua tuotetta liuotetaan 100 mitään etyyliasetaatin, butanolin, metanolin ja veden 20:10:5:35-seosta. Liuos suodatetaan Cellit-kerroksen läpi ja sijoitetaan vastavirtalaitteen viiteen elementtiin, minkä jälkeen suoritetaan 100 yläfaasin siirtoa ja vuorotellen kulloinkin 50 ylä- ja alafaasin siirtoa. Antibioottisen aineen sijainti määritetään valoabsorptiomittauksilla 304 nmtssa sen jälkeen kun yläfaasista otettu näyte on laimennettu metanolilla. Niistä elementeistä, jotka vastaavat antibiootin vastavittajakokäyrän sijaintia, erotetaan tuote, joka puhdistetaan tilaamalla liuotinta pois samalla lisäten butanolia, pieneen tilavuuteen tyhjössä, ja joka seostetaan jäännöksestä etyylieetterillä, 1%

Saadaan 1,5 g tuotetta, E. 720, 304 nm, l cm

Esimerkki XX

200 mg esimerkissä XVIII saatua kandisidiinijohdannaisen glukoosia liuotetaan 2,0 ml:aan kloroformin, metanolin ja veden 10:5:l-seosta ja viedään 7,0 g:lla Sephadex LH-20 täytettyyn pylvääseen, ja antibiootin eluointi käyrä määritetään valoabsorptiomittauksilla 378 nm:ssa. Eluaatista, joka sisältää puhdistettua antibioottia, saadaan puhdas tuote haihduttamalla liuotin pois tyhjössä käyttäen butanolilisäystä, seostamalla etyylieetterillä, pese-

1Z

mällä sakka ja kuivaamalla tyhjössä. Saadaan 60 mg tuotetta, ^ * 700. Esimerkki XXI

0,5 g esimerkissä II saatua nystatiinijohdannaisen raakaglukoosia puhdistetaan pylväskromatografoimalla käyttäen vedellä suhteessa 1:1 kyllästettyä piigeeliä, tyyppiä Merck, raesuuruus alle 0,08 nm . Käyttämällä kloroformin, metanolin ja veden 10:10:3-seosta määritetään antibiootin eluointi-käyrä valoabsorptiomittaamalla 304 nm:ssa. Puhdistettu tuote erotetaan eluaatista haihduttamalla liuotin pois tyhjössä käyttäen butanolilisäystä, saoetamalla etyylieetterillä, pesemällä sakka tällä liuottimelle ja kuivaamalla tyhjössä. Saadaan 0,12 g valmistetta, E^cm “ 715; 304 nm.

14 60877

Esimerkki XXII

0,5 g:aan nystatiinijohdannaisen puhdistettua glukoosia, joka on saatu esimerkissä XIX,lisätään 10 ml vettä samalla voimakkaasti sekoittaen ja jäähdyttäen jäähauteessa, sen jälkeen neutraloidaan grammamoolilla 0,1 N nat- riumbikarbonaattiliuosta, minkä jälkeen liuos jäähdytyskuivataan. Saadaan 0,5 g • 17 glukoosi-nystatiinijohdannaisen natriumsuolaa, E,' = 710; 30A nm.

1 cm

Esimerkki XXIII

0,5 g amfoterisiini B:n glukoosijohdannaista, joka on saatu esimerkissä V

1% ja joka on puhdistettu esimerkin XIX mukaisesti, E^‘ * 1370,dispergoidaan 10 ml:aan vettä, jäähdytetään ulkopuolisesti jäillä ja neutraloidaan samalla voimakkaasti hämmentäen pH-arvoon 7,2 0,1 N vesipitoisella natriumhydroksidiliuok- sella. Saatua kirkasta suolaliuosta lyofilisoidaan. Saadaan 0,5 g amfoterisiini . 1% B:n glukoosijohdannaisen natriumsuolaa, E^ = 1335; 382 nm.

Esimerkki XXIV

... 1% 1.0 g pimarisuniä, E^ 800, 304 nm ja 0,6 g ramnoosia liuotetaan 100 ml:aan metanolia ja annetaan seistä 2 päivää 36°C:n lämpötilassa. Metanoli tislataan pois noin 10 ml:n tilavuuteen ja raaka johdannainen erotetaan saos-tamalla ja pesemällä etyylieetterillä. Saadaan 1,5 g johdannaista. cm * 550; 304 nm.

Esimerkki XXV

1% 1.0 g pimarisiiniä, E^ - 800; 304 nm, ja 0,6 g 6-asetyyliglukoosia liuotetaan 100 mitään metanolia ja annetaan seistä kaksi päivää 36°C:n lämpötilassa. Käsitellään edelleen kuten esimerkissä XXIV. Saadaan 1,55 g raakaa 1% johdannaista, jonka E^ * 540; 304 nm.

Esimerkki XXVI

1,5 g antibiootti-sokerijohdannaista suspensoidaan 20 ml:aan vettä, sen jälkeen lisätään 10 mg imidatsolia, suodatetaan Sephadex G-15 läpi ja lyofi-lisoidaan.

Esimerkki XXVII

1.0 g antibiootti-sokerijohdannaista suspensoidaan 20 ml:aan vettä, sen jälkeen lisätään 84 mg natriumbikarbonaattia, suodatetaan Sephadex G-15 läpi ja lyofilisoidaan.

Esimerkki XXVIII

1 g antibiootti-sokerijohdannaista suspensoidaan 20 rol:aan vettä, sen jälkeen lisätään 120 mg 2-amino-2-(metyloli)-propaani-1,3-diolia, suodatetaan Sephadex G-15 läpi ja lyofilisoidaan.

Esimerkki XXIX

1 g antibiootti-sokerijohdannaista suspensoidaan 20 ml:aan vettä, sen jälkeen lisätään 84 mg natriumkarbonaattia tai 100 mg imidatsolia, vesi tislataan pois alennetussa butanolipaineessa ja johdannaisen suola seostetaan 60877 kuivalla etyylieetterillä.

Esimerkki XXX

200 mg aureofasiinia 50 mg:n kanssa glukuronihappoa suspensoidaan 10 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan olla yli yön 32°C:n lämpötilassa.

Liukenematon aine sentrifugoidaan ja antibiootti seostetaan kuivalla etyyli- 1% eetterillä. Saadaan HO mg glukuronijohdannaista, * 370; 380 nm.

Esimerkki XXXI

200 mg amfoterisiini B:tä ja 50 mg glukuronihappoa suspensoidaan 10 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan olla yli yön 32°C:n lämpötilassa .Muodostunut

johdannainen seostetaan kuivalla etyylieetterillä. Saadaan 240 mg glukuroni-1Z

johdannaista, E, * 940, 382 nm.

J 1 cm ’

Esimerkki XXXII

200 mg polyfungiinia ja 50 mg glukuronihappoa suspensoidaan 10 ml:aan dimetyyliformamidia ja annetaan seistä yli yön 32°C:n lämpötilassa, Muodostunut johdannainen seostetaan kuivalla etyylieetterillä, Saadaan 156 mg glukuroni-1% johdannaista, E,° = 480, 304 nm.

1 cm

Esimerkki XXXIII

1% 100 mg pimarisiinia, ' 710; 380 nm, liuotetaan 5 ml:aan dimetyyli formamidia, sen jälkeen lisätään 30 mg D-glukuronihappoa ja annetaan olla 24 tuntia 38°C:n lämpötilassa. Raaka johdannainen seostetaan 100 ml:11a kui-

1Z

vaa etyylieetteriä. Saadaan 100mcrtuotetta, E, * 690; 380 nm.

^ 1 cm