PL100966B1 - Sposob otrzymywania n-glikozylowych pochodnych makrolidow polienowych oraz ich soli,zwlaszcza soli n-metyloglukaminowej - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymy¬ wania N-glikozylowych pochodnych makrolidów polienowych oraz ich soli, zwlaszcza soli N-metylo¬ glukaminowej.Znany sposób otrzymywania N-glikozylowych pochodnych makrolidów polienowych i ich soli polega na tym, ze na makrolid Ipolienowy zawie¬ rajacy grupe aminowa, w srodowisku rozpuszczal¬ nika organicznego liuib mieszaniny tfozjpuszczalników dziala sie monio- lub oligisaoharydeim szeregu aldoz lub ketoz. Uzyskana pochodna i ndeprzereagowany cukier wyodrebnia sie ze srodowiska reakcji przez wytracenie i przemycie eterem etylowym, wysu¬ szenie pod zmniejszonym cisnieniem, a nastepnie oddzielenie pochodnej od cukru i ewentualne prze¬ prowadzenie jej w sól.Niedogodnoscia opisanego wyzej sposobu jest koniecznosc stosowania drogich i latwopalnych rozpuszczalników oraz prowadzenie szeregu dodat¬ kowych operacji w celu oddzielenia nadmiaru nieprzereagowanego cukru. Poza tym, uzyskiwa¬ ne w ten sposób sole miimo, ze rozpuszczaja sie w wodzie, nie daja klarownych roztworów, co znacznie ogranicza ich zastosowanie.Sposób otrzymywania N-glikozylowych pochod¬ nych makrolidów polienowylch oraz zwlaszcza so¬ li N-metyloglukamkiowych polegajacy na; (tym, ze na makrolid polienowy zawierajacy grupe ami¬ nowa, w srodowisku rozpuszczalnika organicznego lub mieszaniny rozpuszczalników dziala sie mono- lub oligosacharydami szeregu aldoz lub ketoz, wedlug wynalazku charakteryzuje sie tym, ze wytworzona N-glikozylowa pochodna wytraca sie ze srodowiska reakcji woda luib wodnym roztwo¬ rem soli nieorganicznej, korzystnie siarczanu amo¬ nowego i oczyszcza przez krystalizacje z wyzsze¬ go alkanolu, korzystnie z n-fbutanOlu, a nastepnie przeprowadza sie ja w sól, korzystnie N-metyio- glukaminowa, 'po czym krystalizuje ja z wyzszego alkanolu, korzystnie z n-butanolu.Zaleta sposobu wedlug wynalazku jest mozli¬ wosc uzyskania miedzy innymi dotad nieznanych soli N-smetyloglukaminowych pochodnych N-gliko¬ zylowych, które w odróznieniu od antybiotyków wyjsciowych, N-glikozylowych pochodnych oraz znanych dotychczas ich soli wykazuja bardzo do¬ bra rozpuszczalnosc w wodizie dajac klarowne roz¬ twory, co pozwala na stosowanie ich do iniekcji, przy czym spektrum mikrobiologiczne N-glikozy¬ lowych pochodnych makrolidów polienowych jest identyczne, jak anybiotyków wyjsciowych. Ponad¬ to, proponowanym sposobem uzyskuje sie Nngliko- zylowe pochodne oraz ich sole z drobna wydaj¬ noscia, o duzej czystosci, z równoczesnym uprosz¬ czeniem technologii ich wytwarzania oraz wyeli¬ minowaniem drogich i latwopalnych rozpuszczal¬ ników, które nie moga byc stosowane w skali przemyslowej.Przyklad I. 1 g amfoterycyny B i 0,3 g bez¬ wodnej glukozy zawiesiza sie w 15 ml dwumettylo- 100 966100 966 formamidu i pozostawia na 16 godzin w tempera¬ turze 37°C. Do roztworu dodaje sie 200 ml desty¬ lowanej wody, wytracony osad odwirowuje sie, przemywa dwukrotnie '50 50 ml heksanu, suszy pod zmniejszonym cisnie¬ niem i ekstrahuje w temperaturze 50°C 100 ml metanolu przez 15 minut. Nierozpuszczcny osad odwirowuje sie i ponownlie ekstrahuje sie ta sa¬ ma objetoscia metanolu. Polaczone roztwory po¬ zostawia sde na noc w temperaturze —5°C. Wy¬ tracony osad odwirowuje, przemywa dwukrotnie 50 iml benzenu i jeden raz 50 ml heksanu oraz suszy zimlnieijiszionym cisnieniem.Otrzymano: 0,65 g krystalicznej N-glikozylowej pochodnej amfoterycyny B o Ej°(?m—1450 przy 381 nm, IC60=0,04 mcg/ml.Antybiotyk wyjsciowy: Ej cm= 15^0 Przy 381 nm i IC50=0,03 mgc/ml.'Przyklad II. 10 g polifunginy i 2,4 g glu¬ kozy rozpuszcza sie w 50 ml dwumetyloformamidu i pozostawia w temperaturze 32°C na okres 16 go¬ dzin. Pochodna wytraca sie przez dodanie 110,1 N wodnego roztworu chlorku sodowego, odwirowuje i przemywa 100 ml wody, po czym ekstrahuje osmiokrotnie po 100 ml metanolu. Do polaczonych ekstraktów dodaje sie 100 ml n-butanolu i za¬ geszcza pod zmniejszonym disniendem dio objetosci 50 ml, po czym pozostawia do krystalizacji w tem¬ peraturze —5°C. Wytracony osad odwirowuje sie, przemywa dwukrotnie acetonem i heksanem, po czym suszy.Otrzymano: 7,2 g N-glikozylowej pochodnej Ipoli- funginy o Efcm=710 Przy 304 nm» IC50=0,25 mcg/ml.Przyklad III. 5 g kandycydyny i 1,5 g glu¬ kozy zawiesza sie w 25 ml dwumetyloformamidu i pozostawia w temiperaturze 37°C na okres 20 godzin. Pochodna wytraca sie 200 ml 5tyo roztwo¬ ru siarczanu amonowego, przemywa dwukrotnie ml wody. Otrzymana w reakcji N^glikozylowa pochodna kandycydyny ekstrahuje stie 200 ml me¬ tanolu w temperaturze 36°C, po czym 200 ml mieszaniny metanol — n-butanol. Odparowuje sie metanol fi azeotropowo z butanolem wode, po czym pochodna krystalizuje sie z n-foutanoiu.Otrzymano: 1,14 g Nn^likozylowej pochodnej kandycydyny o Ej^m=210 przy 378 nm z frakcji metanolowej i 1,96 g pochodnej o Ej^m=270 przy 3178 nm z frakcji metanolowobutanolowej.IC50 N-glikozylowej pochodnej kandycydyny =0,004 mcg/ml. Antybiotyk wyjsciowy: Ej0£m= =210 przy 13718 nim, IC50=0,0025 mcg/iml.Przyklad IV. Sposobem opisanym w przy¬ kladzie III (przeprowadza sde reakcje kondensacji g aiureulfacyny o Ej'(?m=4il0 z 1,5 g glukozy.Otrzymano: 2,9i3 g N-glikozylowej pochodnej aureufacyny o Ejd(?m=320 przy 378 nm z frakcji metanolowo — n-butanolowej. IC50 Niglikozylowej pochodnqj aureufacyny=0,008 micg/ml. IC60 wyj¬ sciowego antybiotyku=0,006 imcg/iml.Przyklad V. 3 g aiureufacyny kondensuje sie z 0,9 g glukozy w 35 ml dwumetyloformamidu.Nierozpuszczone zanieczyszczenia odwirowuje sie, 13 a pochodna wytraca 200 ml 10% wodnego roztwo¬ ru siarczanu amonowego. Osad odsacza sie na warstwie celitu, przemywa 200 ml wody, 200 ml acetonu li pochodna eksitrahuje sie mieszanina chlorofcrmHmetianol-woda w .stosunku 10:10:1. Od¬ destylowuje siie chloroform i metanol oraz azeotro- powe z n4Dutanolem wode i pozostawia do krysta¬ lizacji z n-butanolu na noc w temp. —5°C Otrzymiano: 1,85 g pochodnej N-glikozylowej au- reufaicyny o E{°(!m=320 przy 378 nm i IC60=0,008 mcg/ml. IC50 wyjsciowego antybiotyku=0,006 mcg/ ml.Przyklad VI. 1 g amfoterycyny B i 0,3 glu¬ kozy zawiesza sie w 15 ml dwumetyloformamidu i pozostawia na 20 godzin w 'temperaturze 37°C.N^glikozylowa (pochodna wytraca sie 300 ml 5°/o wodnego roztworu siarczanu amonowego, przemy¬ wa 50 ml wody. Osad zawiesza sie w 50 ml meta- nolu i 40 ml n-,buitanolu i dodaje 0,1 mM weglanu sodowego w 10 ml wody. Oddestylowuje metanol i wode azeotropowo i pozostawia do krystalizacji.Otrzymano: 1,2 g soli sodowej N-glikozylowej pochodnej amfoterycyny B o Ej°£0m = 1200 przy 380 nm i IC50=0/5 mcg/ml.Przyklad VII. 1 g amfoterycyny B i 0,3 g glukozy zawiesza sie w H5 ml diwumeltyloforma- midu i pozostawia na 20 godzin w temperaturze 37°C. N-glikozylowa ipochodna wytraca s!ie 300 ml 5% ¦wodnego rozitworu siarczanu amonowego. Wy¬ tracony osad przemywa sie 50 ml wody, rozpuszcza w 50 ml metanolu i dodaje 1 mIM tris i 40 ml n-butanolu, nastepnie oddestylowuje sie metanol wode azeotropowo z butanolem i pozostawia do krystalizacji.' Otrzymano: sól triis N-glikozylowej pochodnej amfoterycyny B o E|°(!m = 1040 przy 380 nm i IC5O=0,0 mcg/ml.Przyklad VIII. 3 g ipolifunginy zawiesza sie w 15 mi dwumetyloforinamidu dodaje 0,9 glu¬ kozy i pozostawia w temperaturze 38°C na okres 24 godzin. Nierozpuszczalny osad odwirowuje sie i z roztworu wytraca sie ipochodna N-gltikozylowa 115% wodnego roztworu siarczanu amonowego.Osad odwirowuje sie i ekstrahuje trzykrotnie 40 ml metanolu w temperaturze 3"8°C. Do" roztwo¬ ru dodaje sie 3 mM tris, po czym dodaje sie 40 ml n-butanolu, oddestylowuje metanol i azeotropowo wode oraz ^pozostawia krystalizacja w temperatu¬ rze -^5°C.Otrzymano: 2,85 g solli tris pochodnej N-gliko¬ zylowej polifunginy o Ej°(!m=570 przy 304 nm i IC50=0,4 mcg/ml. 55 Wyjsciowy antybiotyk: Efcm = 660 przy 304 nm, ICm=0,15 mcg/ml.Przyklad IX. 20 g ipolifunginy i 6 g gluko¬ zy rozpuszcza slie w 100 ml dwumeltyloformamidu i pozostawia w temperaturze 36°C przez 18 go- 60 dzlin. Uzyskany roztwór saczy sie. Do przesaczu dodaje sie 400 ml SP/o wodnego roztworu siarcza¬ nu amonowego i pozostawia w temperaturze +4°C przez 2 gdzdiny. Wytracony osad saczy sie i prze¬ mywa woda a nastefpnie eksitrahuje trzykrotnie, 65 uzywajac kazdorazowo 800 mil (metanolu. 40 45100 96C 6 6 g N-metyloglukaminy rozpuszcza sie w 60 ml wody i dodaje do ekstraktów metanolowych. Do powstalego roztworu dodaje sie 1000 mi n-buta- nolu i calosc zageszcza w temperaturze 45°C pod zmniejszonym disndeniem, az do calkowitego usu- b ndecia metanod-u i wody. Pozostalosc pozostawia sie w "temperaturze +4°C do krystalizacji. Osad odsacza sie i przemywa n-butanolem, a nastep¬ nie eterem naftowym i suszy iw -temperaturze po¬ kojowej. 10 Otrzymano: 16,5 g solli NHmetyloglukaminowej pochodnej N-glikozylowej polifunginy o E{cm = =560 przy 304 nm li IC50=0,42 mcg/ml.!•/• Antybiotyk wyjsciowy: ££^=660 (przy 304 nm i ICW=0,16 mcg/ml.Przyklad X. 20 g nystatyny i 6 g glukozy rozpuszcza sie iw 100 ml diwumetyloformamadu i postepuje dokladnie, jak w przykladzie IX.Otrzymano: 18 g soli Nninetyloglukaminowej po- chodnej N-glikozylowej nystatyny o EJ^^SeO przy 304 nm d IC5o&0,45 mcg/ml.Wyjsciowy antybiotyk: Ej°(!m=790 iprzy 304 nm» IC6O=0yl8 mcg/iml.Przyklad XI. 20 g amfoterycyny B i 6 g 25 glukozy rozpuszcza sie w 200 ml dwiuimetyloforma- midu i pozosltawda w temperaturze 35°C na 18 godzin. Uzyskany rozitiwór saczy sie. Do przesaczu dodaje sie 500 ml q°/# iwodnego roztworu siarcza¬ nu amonowego i pozostawia w temperaturze +4°C 30 na 2 godziny. Wytracony osad saczy sie i prze¬ mywa woda. Do osadu dodaje sie 1500 ml meta¬ nolu o temperaturze 50°C i 6 g N-metyHogluka- miny rozpuszczonej w 60 ml wody, miesza sie 30 minut, nastepnie dodaje sie 1 1 n-butanolu. Ca¬ losc zageszcza sie w temperaturze 45°C pod zmniej¬ szonym cisnieniem az do usuniecia metanolu i wo¬ dy. Pozostalosc pozostawia sie w temperaturze +4°C do krystalizacji. Osad odsacza sie i prze¬ mywa n^butaholem, a nastepnie eterem nafto¬ wym d suszy w temperaturze pokojowej.Otrzymano: 18 g soli N-metyloglukaminowej pochodnej Nngllikozylowej aimfoterycyny B o Ej§(!m=1140 przy 380 non i ICW=0^1 (mcg/ml.Zastriaezenie patentowe Sposób otrzymywania N-iglikozyttowych pochod¬ nych makrolidów polienowych oraz ich soli zwlasz¬ cza soli N-metyioglukaminiOwych (polegajacy na tym, ze na makrolid poldenowy zawierajacy gru¬ pe aminowa, w srodowisku (rozpuszczalnika orga¬ nicznego lub mieszaniny rozpuszczalników dziala sie mono- lub oligosacharydami szeregu aldoz lub ketoz, znamienny tym, ze wytworzona N-glikozy- lowa pochodna wytraca sie ze srodowiska (reakcji woda lub wodnym roztworem sold nieorganicznej, korzystnie siarczanu amonu i oczyszcza przez krystalizacje z wyzszego adkanolu, korzystnie n- -butanolu, a nastepnie przeprowadza sie ja w sól, korzystnie N-meftyloglukaniinowa, po czyim krysta¬ lizuje ja z wyzszego aHcanolu, korzystnie z n-tou- tanolu. PL PL