CH620931A5

CH620931A5 -

Info

Publication number: CH620931A5
Application number: CH1194472A
Authority: CH
Inventors: Leonard Falkowski; Miroslaw Bobrowski; Helena Buluk; Elzbieta Bylec; Barbara Cybulska-Dutkiewicz; Jerzy Golik; Pawel Kolodziejczyk; Jan Pawlak; Andrzej Rudowski; Jan Zielinski; Tadeusz Ziminski; Edward Borowski
Original assignee: Politechnika Gdanska
Priority date: 1971-08-13
Filing date: 1972-08-11
Publication date: 1980-12-31
Also published as: NL7211001A; DE2239891C2; JPS4828487A; YU206272A; US4093796A; FR2150776B1; FI60877B; ES406311A1; DE2239891A1; GB1387187A; HU166615B; BE787531A; JPS527447A; FI60877C; DD100248A5; SE415262B; FR2150776A1; BG26812A3; JPS528318B2; JPS565369B2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Antibiotika.

Bisher war eine ganze Reihe von Makrolid-Antibiotika mit einer Polyen-Struktur bekannt, wie z.B. Nystatin, Amphotericin B, Trichomycin, Levorin und andere. Diese fanden bei der Behandlung von Mykosen im grossen Massstab eine praktische Anwendung. Ebenfalls ist die Eigenschaft dieser Antibiotika bekannt, das übermässige Wachstum der Prostata-Drüse zu unterdrücken sowie auch den Cholesterin-Spiegel im Blut herabzusetzen.

Ein Nachteil dieser erwähnten Antibiotika beruht auf der Tatsache, dass sie in Wasser nicht entsprechend löslich sind. Diese Wasserunlöslichkeit kann nur teilweise eliminiert werden, indem man Komplexe mit Natriumdesoxycholat oder mit N-Acylderivaten bildet. Ein anderer, sogar noch grösserer Nachteil beruht darauf, dass diese Substanzen keine richtige Lösung bilden können, man kann aus ihnen nur kolloidale Lösungen herstellen.

Der Komplex aus Amphotericin B mit Natriumdesoxycho-lan, das sogenannte Fungizon, ruft eine Lysis von Erythrociten hervor, und daher werden Organismen, die mit diesem Präparat behandelt wurden, Anaemie aufweisen. Der erwähnte Komplex enthält ebenfalls einen Bestandteil, der sich lebenden Organismen gegenüber nicht indifferent verhält.

Die mit den N-Acylderivaten gebildeten Komplexe zeigen ebenfalls eine bedeutend niedrigere biologische Aktivität im Vergleich zu den unsubstituierten Polyenen.

Es ist also ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Derivate von Makrolid-Antibiotika mit Polyen-Struktur herzustellen, die verbesserte therapeutische Eigenschaften besitzen, insbesondere inbezug auf die Behandlung von systemischen Mycosen. Ebenso sollen die erfindungsgemäss herstellbaren Antibiotika die Fähigkeit aufweisen, das übermässige Wachstum der Prostata-Drüse zu verhindern und den Cholesterinspiegel im Blut herabzusetzen.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Polyen-Makrolid-Antibiotikum, welches eine Aminogruppe aufweist, mit einem Saccharid der Gruppe Aldose-Monosaccharide, Ketose-Monosaccharide, Aldose-OIigosaccharide, Ketose-OIigosaccharide, bzw. ein durch Substitution mindestens einer Hydroxygruppe durch Acetoxy oder durch Substitution einer Hydroxymethylgruppe durch die Carboxygruppe gebildetes Derivat eines Saccharids in einem Lösungsmittel umsetzt und das erhaltene Produkt isoliert.

Das Ziel, derartige Antibiotika herzustellen wird also erreicht, indem man mindestens eine Aminogruppe, die in dem Makrolid-Molekül, z.B. Nystatin, Polifungin, Amphotericin B, Candicidin, Pimaricin, Trichomycin, Levorin, Rimocidin oder Candidin, enthalten ist, mit den weiter oben genannten Mono-oder Oligosacchariden umsetzt. Als Lösungsmittel kann man z.B. Dimethylformamid, Methanol, Dimethylsulfoxid, Pyridin und/oder Mischungen davon verwenden.

Die weiter oben genannten Antibiotika wurden in den folgenden Publikationen beschrieben:

1. J.M.T. Hamiltion-Miller «Chemistry and Biology of the Polyene Macrolide Antibiotics», Bacteriological Revues 37, 166-196,1973.

2. H.H. Thomas «Analysis and Essay of Polyene Antifungal Antibiotics», The Analyst 101,322-340,1976.

3. H. Umezawa «Index of Antibioticas from Actinomyce-tes», University Park Press, Univ. of Tokio Press, 1967.

4. T. Korzybski, Z. Kowszyk-Gindifer, W. Kurylowicz, Antibiotics PWN-Pergamon Press, 1978.

5. L. Falkowski, A. Mula und E. Borowski, Effect of Polyene Macrolide Antibiotics on Permeability of Liposomes, Proceedings of the Vllth International Congress of Chemothe-rapy, Prague, 1971.

6. E. Borowski, J. Golik et al, The Structure of Mycoheptin, a Polyene Macrolide Antifungal Antibiotic, The Journ. of Antibiotics 31,117, (1978), Japan Antibiotics Research Association.

Rimocidin wurde ausführlich von L. Falkowski, J. Goli, J. Zielinski, E. Borowski in «The Structure of Rimocidin», J. Antibiot., 29,197,1076 beschrieben, ebenfalls ist es in den oben angeführten Publikationen 1-4 erwähnt.

Polifungin wurde von D. Kotiuszko, H. Morawska, N. Porowska in «Polifungin, a New Antifungal Antibiotic», Acta Microbiol Polen, ser A 4,201,1972 beschrieben.

Man führt das erfindungsgemässe Verfahren vorzugsweise in Gegenwart einer Verbindung durch, die mit dem Derivat des Makrolid-Moleküls mit Polyen-Struktur ein Salz bilden kann, und man lässt anschliessend die Reaktionsmischung gewöhnlich bis zur beendeten Umsetzung stehen und schliesslich wird das erhaltene Reaktionsprodukt isoliert und gegebenenfalls in ein entsprechendes Salz überführt.

Die Zuckerderivate von Makrolid-Antibiotika mit Polyen-Struktur können als fungizid wirkende Mittel verwendet werden, ebenso kann man sie dazu anwenden, um das übermässige Wachstum der Prostata-Drüse zu verhindern und den Choleste-rin-Spiegel im Blut herabzusetzen.

Die fungizide Aktivität in vitro der erfindungsgemäss erhaltenen Verbindungen kann nach den folgenden zwei Methoden festgestellt werden:

a) Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität der Antibiotika sowie ihre Derivate in einem festen Nährmedium - siehe Tabelle I.

b) Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität von Antibiotika und ihre Derivate in einem flüssigen Nährmedium - siehe Tabelle II.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

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Die antimikrobielle Aktivität in einem festen Nährmedium konnte mit der Hilfe einer Methode von serienmässigen Verdünnungen folgendermassen bestimmt werden:

Man löste 1 mg des Antibiotikums in 1 ml Dimethylsulfoxid und verdünnte mit 9 ml sterilem Wasser. Man führte serienmäs-sige Verdünnungen in Wasser aus und man legte die minimale Konzentration fest, die nötig ist, das Wachstum von Standard-Stämmen von Candida albicans und Saccharomyces cerevisiae zu unterbinden, indem man 0,5 ml der Lösung des Antibiotikums in einer Petrischale, die einen Durchmesser von 10 cm hatte, mit 9,5 ml einer Sabouraud-Nährlösung mischte, wobei die Temperatur etwa 60° C betrug. Nach dem Mischen, dem Festwerden des Nährmediums und der Beimpfung mit dem Test-Mikroorganismus auf der Oberfläche, hielt man 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 36° C.

Die minimale Inhibitions-Konzentration konnte auf Grund der beobachteten Abwesenheit des Wachstums von Mikroorganismen festgestellt werden.

In der nachfolgenden Tabelle I werden Werte für Nystatin sowie dessen Glucosederivat angegeben.

Tabelle I Präparat

Minimale Inhibitions-Konzentration mcg/ml gegenüber Candida albicans S. cerevisiae 2 2

2 2

Nystatin Glcose-derivat von Nystatin

Die antimikrobielle Aktivität des Antibiotikums sowie auch seine Derivate in einem flüssigen Nährmedium konnte festgestellt werden, indem man serienmässige Verdünnungen des Antibiotikums in der weiter oben beschriebenen Weise ausführte und indem man 0,5 ml der Antibiotikumlösung mit 4,5 ml eines Mediums mischte, das mit einem untersuchten Mikroorganismus beimpft war und nach der Methode von Sabouraud hergestellt werden konnte. Bei dieser Bestimmung arbeitete man ohne Agar und mit einer Zugabe von Tarchocylin in einer Menge von 25 mg pro 1 Liter. Man liess die Lösungen 48 Stunden lang bei einer Temperatur von 32° C stehen.

Die minimale Konzentration, die das Wachstum von Mikroorganismen unterbindet, wurde auf Grund von Trübungen, bestimmt durch die Zunahme der Extinktion bei 660 mm, festgelegt ; die erhaltenen Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle II zusammengestellt.

Tabellen

Nr. Antibiotikum MIC Derivat MIC

mcg/ml mcg/ml

1 Pimaricin 2,5 NGL Pimaricin 5,0

2 Rimocidin 2,5 NGL Rimocidin 2,5

35

3

Nystatin A |

0,5

NGL Nystatin A,

1,0

NML Nystatin Aj

2,5

NRL Nystatin A,

2,0

4

Polifungin

0,5

NGL Polifungin

1,0

5

Ampho

0,05

NGL Amphotericin B

0,2

tericin B

NGU Amphotericin B

0,5

6

Candidin

0,2

NGL Candidin

1.0

7

Mycoheptin

2,5

NGL Mycoheptin

2,5

8

Candicidin

0,001

NGL Candicidin

0,005

9

Trichomycin

0,001

NGL Trichomycin

0,005

10

Levorin

0,05

NGL Levorin

0,2

11

Aureofacin

0,005

NGL Aureofacin

0,025

MIC — Minimum der Inhibitions-Konzentration

NGL - Glucose-Derivat

NML - Maltose-Derivat

NRL - Ribose-Derivat

NGU - Glucuronsäure-Derivat

20

Wie aus den weiter oben angeführten Bestimmungen hervorgeht, besitzen die Antibiotika-Derivate von Polyen-Makroli-den eine fungizide Aktivität, die in der gleichen Grössenord-nung liegt, wie diejenige der ursprünglichen Antibiotika.

Es wurden ebenfalls Versuche zur Bestimmung der Aktivität von Glukosederivaten von Nystatin, verglichen mit Nystatin alleine, durchgeführt, inbezug auf Serien von pathogenen Stämmen Candida und Geotrichum, die aus verunreinigten oder 30 vergifteten menschlichen Gliedern isoliert wurden. Diese Untersuchungen sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt.

Die aktuve Toxizität, nämlich LD50, von zwei Glukosepräparaten von Polifunginderivaten wurde mit Versuchen an Mäusen bestimmt, die etwa ein Gewicht von 24 g hatten.

Bei diesen Versuchen verabreichte man das Antibiotikum den Tieren intraperitoneal in einer physiologischen Kochsalzlösung in einer Menge von 1,0 ml. Man verglich die akute Toxizi-40 tät des Natriumsalzes und des Glukoseimidazolsalzes von Polifunginderivaten. Beide Präparate wurden den Mäusen einmalig mit den folgenden Dosen verabreicht: 4 mg/kg, 12 mg/kg, 36 mg/kg, 60 mg/kg, 80 mg/kg und 300 mg/kg des Körpergewichtes der Tiere. In jeder geprüften Gruppe befanden sich je 6 45 Mäuse. Nach je 24 und 48 Stunden nach der Injektion stellte man die Anzahl der toten Tieren fest und berechnete den gesamten Prozentsatz der toten sowie auch der überlebenden Tiere. Anschliessend bestimmte man die LD50 durch eine entsprechende Methode. Die Resultate sind in der folgenden so Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle III Mikroorganismen Anzahl der

Anzahl der Stämme, deren Wachstum durch die Einwirkung von Nystatin bzw. des Glukoseuntersuchten derivates von Nystatin unterbunden werden konnte Stämme

Nystatin Glukosederivat von Nystatin

1,56 3,12 6,25 12,5 25,0 50,0 3,12 6,25 12,5 25,0 50,0 mcg/ml mcg/ml

Candida albicans

nach 24 Stunden

12

1

11

0

1

11

0

Candida albicans

nach 48 Stunden

12

0

2

10

0

12

0

Candida sp.

nach 24 Stunden

8

2

3

1

2

0

2

5

0

1

0

Candida sp.

nach 48 Stunden

8

0

3

1

3

1

0

2

3

2

1

«

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Mikroorganismen Anzahl der Anzahl der Stämme, deren Wachstum durch die Einwirkung von Nystatin bzw. des Glukoseuntersuchten derivates von Nystatin unterbunden werden konnte Stämme

Nystatin

1,56 3,12 6,25 12,5 25,0 50,0 rncg/ml

Glukosederivat von Nystatin 3,12 6,25 12,5 25,0 mcg/ml

Geotrichum sp. nach 24 Stunden Geotrichum sp. nach 48 Stunden

12 12

2 0

10 5

7 9

50,0

0 0

Tabelle IV Dose der Antibiotika in mg/kg

Anzahl der durch die Einwirkung des Glukosederivates von Polifungin getöteten Tiere.

Beobachtung nach 24 Stunden

Beobachtung nach 48 Stunden

Natrium- Imidazol- Natrium- Imidazol-

salz salz salz salz

4

0

12

0

1

0

36

0

2

60

0

80

3

4

3

100

4

3

5

300

6

ld50

85 mg/kg 89 mg/kg

80 mg/kg

74 mg/kg

20

Die akute Toxizität sowohl des Natriumsalzes als auch des Imidazolsalzes von beiden Glukosederivaten von Polifungin, ausgedrückt als LD50, ist sehr ähnlich und bewegt sich in Grenzen von 80 mg des Präparates pro kg Körpergewicht. Das Natriumsalz wirkt etwas mehr toxisch, falls man die Dose nach 24 Stunden Beobachtung bestimmt, während sich das Imidazol-salz von Polifungin nach einer Beobachtungszeit, die 48 Stunden dauerte, mehr toxisch erwies.

Die Toxizität, nach der Skala von Berents, beträgt für das Natriumsalz des Glukosederivates von Polifungin 54,7 mg/kg hingegen für das Imidazolsalz 52,5 mg/kg.

Die fungizide Aktivität in vivo von unlöslichem Polyfungin sowie von dem in Wasser löslichen Natriumsalz des Glukosede-

30

35

45

rivâtes von Polifungin wurden auf Grund von Versuchen verglichen, die man mit weissen Mäusen der Rasse Porton ausführte und die ein Gewicht von etwa 50 g hatten. Diese Mäuse wurden mit Candida albicans Stamm Nr. 4477 auf intravenösem Weg infisziert, indem man in die Vene des Schwanzes 0,2 ml einer Suspension gab, die 3X3X10 Zellen von Candida albicans enthielt und aus einer 48 Stunden alten Kultur von Sabouraud Agar hergestellt werden konnte.

Das Präparat des Natriumsalzes von dem Glukosederivate von Polifungin wurde in einer 0,9%igen Lösung von Natriumchlorid aufgelöst, das unlösliche Polifungin hingegen wurde in der gleichen Lösung suspendiert. Man verabreichte den Mäusen jeden Tag auf intraperitonealem Weg beide Antibiotika in einer Menge von je 0,5 ml Lösung während der Durchführungsdauer der Versuche. Man verabreichte folgende Dosen der Antibiotika: 1 mg/kg, 2 mg/kg, 4 mg/kg, 8 mg/kg, 16 mg/kg des Körpergewichtes der Tiere. In jeder Gruppe befanden sich 6 Mäuse.

Angefangen von dem vierten Tage der Infektion tötete man jeden zweiten Tag eine Maus aus jeder Gruppe, indem man ihr das Rückgrat bracht. Anschliessend wurden diese getöteten Mäuse einer Sektion unterworfen und man bestimmte die Anzahl der Zellen C. albicans in 1 g von Nieren.

Diese Nieren wurden gewogen und in gläsernen bakteriologischen Mörsern homogenisiert. Man verdünnte die erhaltenen homogenisierten Stoffe serienmässig mit einer physiologischen Lösung von Kochsalz, anschliessend inoculierte man ein festes Nährmedium von Sabouraud mit 0,1 ml jedes hmogenisierten Derivates von Sabouraud mit 0,1 ml jedes homogenisierten Derivates sowie auch mit den Verdünnungen. Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden bei einer Temperatur von 30° C zählte man die entwickelten Kolonien und berechnete die Anzahl der Zellen von Candida albicans, die in 1 g von Nieren der untersuchten Tiere enthalten waren.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der nachfolgenden Tabelle V enthalten.

Tabelle V Antibiotikum tägliche Dosis des Antibiotikums in mg/kg

Tage seit der Infektion

10

12

Anzahl an Zellen von Candida albicans pro 1 g Nieren

14

« e •g '5b

•o 3

■Si vi *7?

J3 O« e

~~ o >

O

5

'5b c 3

o o-

0

8,0 X104

1,9 X104

1,8 X106

5,0 X107

1,4 X107

1,0X106

1

4,5 X104

5,3 X104

7,6 X106

1,4 X106

2,4 X107

1,9 X106

2

1,0 X104

1,6 X105

3,5 X105

1,0 X105

1,0X10"

4,9 X105

4

2,0 X104

3,0 X104

1,2 X104

2,9 X104

1,1 X103

4,2 X104

8

1,1 X104

1,3 X103

0

2,5 X104

0

9,5 X103

0

1

3,3 X104

8,2 X105

7,9 X104

6,2 X106

1,4 X105

5,2 X106

2

1,7 X106

8,2 X105

2,3 X105

1,7 X106

2,6 X106

4,3 X105

4

8,6 X105

4,4 X105

1,0 X104

4,1 X103

1,5 X106

1,2X106

8

2,2 X104

3,7 X104

3,7 X103

6,4 X104

6,3 X104

1,3 X103

16

2,0 X106

3,9 X104

3,9 X103

4,3 X103

1,1 X104

3,6 X103

5

620 931

Aus den durchgeführten Beispielen, auf Grund erhaltener Ergebnisse, folgt, dass das in Wasser lösliche Natriumsalz des Glukosederivates von Polifungin eine bedeutend grössere Aktivität in vivo als das ursprüngliche Antibiotikum bei der Heilung von Mäusen von allgemeiner subakuter Candidiasis aufweist. 5

Es ist möglich, nach erfolgter Verabreichung des löslichen Glukosederivates von Polifungin in einer Menge von 8 bis 16 mg/kg Körpergewicht eine vollständige Sterilisation der Niere der Maus zu erreichen. Hingegen kann nach der Verabreichung des unlöslichen Polifungins keine derartige Wirkung 10 erzielt werden.

Ein Vorteil der Zuckerderivate von Makroliden mit Polyen-Struktur, entwickelt durch die Verbindung dieser Antibiotika mit Mono- und Oligosacchariden und/oder ihren Derivaten beruht auf ihrer Leichtigkeit, eine Dispersion in Wasser zu 15 bilden; im Fall von Makroliden sowie auch ihren Derivaten mit Polyen-Struktur, welche eine Säuregruppe aufweisen, besteht auch die Leichtigkeit, in einem fast neutralen Medium feste Salze mit Kationen zu bilden, die sehr leicht wasserlöslich sind.

Die verschiedenen Derivate von verschiedenen Makroliden 20 mit Polyen-Struktur und verschiedenen Zuckern als auch ihre entsprechenden Salze mit Kationen, lösen sich in Wasser, wobei sie Lösungen bilden, die in grossem Massstab aus dem Kolloid mit einem hohen Dispersionsgrad sowie aus der richtigen Lösung bestehen. Eine grosse Menge dieser Substanzen, wie 25 z.B. das Natriumsalz eines Glukose- oder Maltosederivates von Nystatin, bilden eine richtige Lösung, die frei von Kolloiden ist. Derartige lösliche und stabile Zuckerderivate von Makroliden mit Polyen-Struktur sowie auch ihre Salze weisen eine sehr grosse biologische Aktivität auf. Ihr mikrobiologisches Spek- 30 trum ist identisch mit demjenigen, welches mit den Ausgangsantibiotika übereinstimmt. Ausserdem verursachen diese neuen Verbindungen, im Vergleich zu Fungizon, keine Zersetzung von Erytrozyten.

Die Umsetzung von Makroliden mit Polyen-Struktur, die 35 mindestens eine Aminogruppe enthalten, mit einem Zucker geht sehr leicht vor sich, sogar ohne Verwendung eines Katalysators. Falls man einen Katalysator anwendet, so dient dieser nur dazu, die Geschwindigkeit der Umsetzung zu erhöhen. Ausserdem, unter Berücksichtigung der leichten Umsetzung der40 Zucker mit den Aminogruppen von Makroliden mit Polyen-Struktur, ist es nicht nötig, die als Ausgangsprodukte verwendeten Zucker vorher zu aktivieren.

Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung von Zuckerderivaten von Makroli- 45 den mit Polyen-Struktur sowie ihre Reinigung sind in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.

Beispiel 1

3,0 g Nystatin (E j ^ = 560 bei 304 nm), 3,0 g Glukose 50

und 0,5 g Imidazol werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Man lässt die erhaltene Lösung in einem Thermostat bei einer Temperatur von 36° C 2 Tage lang stehen. Nach dieser Zeit hat sich praktisch die gesamte Menge des Antibiotikums umgesetzt. 55 Durch die Zugabe von Äthyläther werden das gewünschte Derivat sowie auch nicht umgesetzte Glukose ausgeschieden, man wäscht mit einem Lösungsmittel und trocknet anschliessend im Vakuum. Das erhaltene Produkt hat ein Gewicht von 6,1 g und zeigt als rohes Derivat in Form des Imidazolsalzes die 60 folgende Charakteristik auf:

Man lässt die erhaltene Reaktionsmischung 2 Tage lang bei einer Temperatur von 30° C stehen. Anschliessend wird weiter nach dem Verfahren von Beispiel 1 gearbeitet. Das erhaltene Produkt hat ein Gewicht von 5,6 g des rohen Glukosederivates und zeigt die folgende Charakteristik E J °^c = 280 bei 304 nm. Cm

Beispiel 3 1 %

10,0 g Polifungin mit E ^ cm = 825 bei 304 nm werden in

50 ml Dimethylformamid gelöst. Dann gibt man 3,0 g Glukose und 0,1 g Ascorbinsäure hinzu. Man lässt die erhaltene Reaktionsmischung in einem Thermostat 2 Tage lang bei einer Temperatur von 36° C stehen. Das weitere Verfahren wird ausgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Das erhaltene Produkt hat ein Gewicht von 12,9 g und das erhaltene rohe Derivat

1%

zeigt die folgende Charakteristik: E ^ cm = 570 bei 304 nm.

Beispiel 4 1%

0,5 g Nystatin mit E j cm = 640 bei 304 nm und 0,5 g

Maltose werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Man lässt die erhaltene Mischung 2 Tage lang bei einer Temperatur von 36° C stehen. Das weitere Verfahren wird ausgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Man erhält 0,9 g des rohen Derivates mitE^ = 310 bei 304 nm.

1 cm

Beispiel 5

1,0 g Amphotericin B mit E

1% 1 cm

1420 bei 382 nm und

1% 1 cm

260 bei 304 nm.

Beispiel 2

65

1 %

3,0 g Nystatin mit E ^ cm = 560 bei 304 nm sowie 3,0 g Glukose werden in 50 ml Dimethylformamid aufgelöst.

0,3 g Glukose werden in 20 ml Dimethylformamid suspendiert. Man lässt 2 Tage lang bei einer Temperatur von 36° C stehen. Das weitere Verfahren wird ausgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Man wird 1,3 g des rohen Derivates mit 1 %

einer E . = 1050 bei 382 nm erhalten.

1 cm

Beispiel 6 1%

1,0 g Amphotericin B mit E j cm = 1420 bei 382 nm und

0,6 g Maltose werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Man lässt die erhaltene Mischung 2 Tage lang bei einer Temperatur von 36° C stehen. Das weitere Verfahren wird ausgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Man wird 1,5 g des rohen 1%

Derivates mit E 1 = 9,60 bei 382 nm erhalten.

1 cm

Beispiel 7 1 %

1,0 g Candicidin mit E - = 430 bei 378 nm und & 1 cm

1,0 g Glukose sowie 0,05 g Imidazol werden in 50 ml Pyridin gelöst. Man lässt die erhaltene Mischung bei Zimmertemperatur im Dunkeln 7 Tage lang stehen. Das weitere Verfahren wird ausgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Man erhält 2,1 g des rohen Derivates in Form eines Salzes mit einer organischen

1%

Base. Die erhaltene Verbindung besitzt eine E , = 200 bei __0 6 1 cm

378 nm.

Beispiel 8

0,5 g Candicidin mit E j ^ = 570 bei 378 nm und

0,39 g Maltose werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Man inkubiert die erhaltene Mischung 2 Tage lang bei einer Tempe-

620 931

6

ratur von 36° C. Das weitere Verfahren wird ausgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Man erhält 0,7 g des rohen

Derivates mit einer E l % = 410 bei 378 nm.

1 cm

Beispiel 9 1%

0,5 g Pimaricin mit E , = 800 bei 304 nm und ö 1 cm

0,5 g Ribose sowie 0,5 g Imidazol werden in 100 ml Methanol gelöst. Man lässt die erhaltene Lösung 24 Stunden lang bei einer

Temperatur von 36° C stehen. Anschliessend wird das Methanol im Vakuum bis zu einem Volumen der Reaktionsmischung von

10 ml abgedampft. Durch Zugabe von Äthyläther kann ein rohes Derivat ausgeschieden werden und anschliessend wird mit

Äthyläther gewaschen.

und 0,5 g Fruktose sowie 0,1 g Imidazol werden in 20 ml Methanol und in einer Dimethylformamidmischung aufgelöst, mit einem Verhältnis von 2:1. Dann lässt man 2 Tage lang bei einer Temperatur von 363 C stehen. Die weitere Verarbeitung wird ausgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Man wird 1,0 g eines rohen Derivates in Form eines Salzes mit Imidazol erhalten, welches die folgende Charakteristik besitzt:

Man erhält 1,0 g einer rohen Substanz mit E

bei 304 nm in Form eines Salzes mit Imidazol.

Beispiel 10

1% 1 cm

= 340

1,0 g Pimaricin mit E ] °^c 6 1 cm

= 800 bei 304 nm und

0,6 g Maltose werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Man 25 lässt die erhaltene Lösung 2 Tage lang bei einer Temperatur von 36° C stehen. Anschliessend wird die Reaktionsmischung weiter verarbeitet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Man erhält 1,4 g

1%

eines rohen Derivates mit E , = 530 bei 304 nm.

1 cm

30

Beispiel 11

0,5 g Polifungin mit E

1% 1 cm

= 700 bei 304 nm,

Verbindung hat eine E

1% 1 cm

= 318 bei 304 nm.

40

Beispiel 12 1%

1 cm

Beispiel 13

1,0 g Trichomycin mit einer E

1% 1cm

= 500 bei 378 nm

1 cm

= 370 bei 304 nm.

Beispiel 15

0,1 g Levorin mit E , = 800 bei 378 nm und 0,1 g 6 1 cm b

Glukose werden in 2,0 ml Dimethylformamid aufgelöst. Man

15 lässt die erhaltene Lösung bei einer Temperatur von 36° C

stehen. Die weitere Verarbeitung wird ausgeführt, wie es in

Beispiel 1 beschrieben ist. Man erhält 0,2 g eines rohen Deriva-

\%

tes mit der folgenden Charakteristik E 378 nm.

0,5 g Maltose und 0,1 g Imidazol werden in 20 ml Dimethyl- 35 formamid bei einer Temperatur von 36° C während 2 Tagen gelöst. Anschliessend wird das Verfahren weiter ausgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Man erhält 1,1g des rohen Derivates in der Form eines Salzes mit Imidazol. Die erhaltene

0,5 g Trichomycin mit E J ^ = 500 bei 378 nm und 45

0,15 g Glukose werden in 0,8 ml Dimethylformamid aufgelöst. Man lässt die erhaltene Lösung 2 Tage lang bei einer Temperatur von 36° C stehen. Das weitere Verfahren wird ausgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Man erhält 0,55 g des rohen 50 1%

Derivates, das eine E , = 360 bei 378 nm besitzt.

55

1 cm

= 370 bei

Beispiel 16

0,5 g Levorin mit E

1% 1 cm

= 800 bei 378 nm und

0,3 g Maltose werden in 20 ml Pyridin und einer Dimethylformamidmischung aufgelöst (Verhältnis 2:1). Man lässt die erhaltene Lösung 2 Tage lang bei einer Temperatur von 36° C stehen. Die weitere Verarbeitung wird ausgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Man erhält 0,7 g eines rohen Deriva-

1%

tes mit der folgenden Charakteristik: E 378 nm.

1 cm

= 520 bei

Beispiel 17 1%

1,0 g Rimocidin mit E . = 500 bei 304 nm, 0 1 cm

1,0 g Glukose und 0,2 g Imidazol werden in 15 ml Dimethylformamid aufgelöst. Man lässt die erhaltene Lösung 2 Tage lang bei einer Temperatur von 36° C stehen. Die weitere Verarbeitung wird ausgeführt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Man erhält 2,0 g eines rohen Derivates mit der folgenden Charakte-1%

ristik E

1 cm

= 230 bei 304 nm.

und 0,6 g Maltose werden in 20 ml Dimethylsulfoxid aufgelöst. Man lässt die erhaltene Lösung 2 Tage lang bei einer Temperatur von 36° C stehen. Die weitere Verarbeitung wird ausgeführt, 60 wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Man wird 1,4 g des rohen Derivates erhalten, welches die folgenden Charakteristik besitzt e]% = 320bei378 nm.

1 cm

Beispiel 14 65

1%

0,5 g Pimaricin mit einer E . = 600 bei 304 nm 6 1 cm

Beispiel 18

1,0 g eines rohen Glukosederivates von Candicidin in der Form eines Salzes mit Imidazol, wie es in Beispiel 7 erhalten wurde, wird in 20 ml Wasser gelöst. Anschliessend säuert man mit Essigsäure an und schüttelt mit 20 ml Butanol. Man Hess solange stehen, bis sich 2 Schichten bildeten. Die wässrige Schicht wurde entfernt und die zurückbleibende, aus Butanol bestehende Schicht, die das Derivat des Antibiotikums enthielt, wurde einigemale mit Wasser gewaschen, das mit Butanol gesättigt war und schliesslich mit Essigsäure angesäuert, wobei man Portionen von 10 ml verwendete, bis das vorhandene Imidazol vollständig entfernt war. Zurückbleibende Butanollösungdes Glukosederivates von Candicidin, nachdem sie von dem Salz mit Imidazol befreit war, wurde im Vakuum solange konzentriert, bis alles Wasser vollständig auf azeotropem Wege entfernt werden konnte. Das gewünschte Derivat wird dann anschliessend aus der erhaltenen Lösung durch Zugabe von Äthyläther ausgeschieden. Man wäscht den erhaltenen Niederschlag mit dem gleichen Lösungsmittel und trocknet im Vakuum. Es werden 0,5 g des gewünschten Produktes erhalten, das kein Imidazol enthält, und die folgende Charakteristik 1%

aufweist E , = 300. Auf die gleiche, weiter oben beschrie-1 cm e bene Weise können auch andere Zuckerderivate der restlichen

7

620 931

Makrolide mit Polyen-Struktur von dem Imidazolsalz befreit werden.

Beispiel IV

10 g des rohen Produktes, welches durch die Umsetzung Nystatin mit Glukose erhalten wurde, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, werden in 100 ml einer Mischung gelöst, die Äthylacetat, Butanol, Methanol und Wasser in einem Verhältnis von 20:15:15:35 enthält.

Man filtriert die erhaltene Lösung durch eine aus Celit bestehende Schicht und gibt sie dann in 5 Elemente eines im Gegenstrom arbeitenden Verteilungsapparates. Anschliessend werden 100 Stufen der oberen Phase und abwechselnd 50 Stufen der oberen sowie auch unteren Phase ausgeführt. Die Lage der antibiotischen Substanz kann auf Grund von Messungen der Lichtabsorption bei 304 nm ausgeführt werden, nachdem vorher Proben der oberen Phase mit Methanol verdünnt wurden. Aus denjenigen Elementen, die der Lage der Kurve, die aus der Verteilung des Gegenstromes des Antibiotikums entsteht, entsprechen, kann man die gereinigte Substanz durch Abdestillieren der Lösungsmittel unter Zugabe von Butanol im Vakuum und Einengung auf ein kleines Volumen mit anschliessender Ausfällung durch Zugabe von Äther zu dem erhaltenen Rückstand abtrennen. Der erhaltene Rückstand wird mit Äthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 1,5 g 1%

eines Präparates mit E , = 720 bei 304 nm. r 1 cm

Beispiel 20

200 mg Glukosederivat von Candicidin, erhalten nach dem Verfahren von Beispiel 18, werden in 2,0 ml einer Mischung gelöst, die aus Chloroform, Methanol und Wasser in einem Verhältnis von 10:5:1 besteht. Anschliessend verteilt man die erhaltene Lösung auf einer Kolonne, die mit 7,0 g Sephadex LH-20 gefüllt ist. Die Kurve des Ausflusses des Antibiotikums wird auf der Basis von Messungen der Lichtabsorption bei 378 nm bestimmt. Man kann das gereinigte Antibiotikum aus der aus dem Abfluss erhaltenen Lösung durch Abdampfung der Lösungsmittel unter Zugabe von Butanol erhalten, durch Ausfällung des gewünschten Produktes durch Zugabe von Äthyläther, anschliessendem Waschen des Niederschlages mit Äther und schliesslich durch Trocknen im Vakuum. Man erhält 60 mg

1%

des Produktes mit der folgenden Charakteristik E ^ cm = 700.

Beispiel 21

0,5 g des rohen Glukosederivates von Nystatin, das nach dem Verfahren, welches in Beispiel 2 beschrieben wurde, erhalten wurde, wird durch die Methode der Verteilungschromatographie an einer Kolonne gereinigt, die mit Silikagel der Art Kieselgel von Merck gefüllt ist. Die Korngrösse sollte weniger als 0,08 mm betragen. Es wird mit Wasser in einem Verhältnis von 1:1 gesättigt. Man verwendet eine Lösungsmittelmischung, die aus Chloroform, Methanol und Wasser in einem Verhältnis von 10:10:8 besteht. Die Ausflusskurve des Antibiotikums aus der Kolonne wird durch eine Messung der Lichtabsorption bei 304 nm bestimmt. Das gereinigte Antibiotikum kann aus der Ausflusslösung gereinigt werden, indem man die Lösungsmittel unter Zugabe von Butanol im Vakuum abdampft, in dem erhaltenen Rückstand durch Zugabe von Äther das gewünschte Produkt ausfällt, den Niederschlag mit dem gleichen Lösungsmittel wäscht und im Vakuum trocknet. Man erhält 0,12 g der gewünschten Verbindung mit der folgenden Charakteristik 1 %

E. = 715 bei 304 nm.

1 cm

Beispiel 22

0,5 g des gereinigten Glukosederivates von Nystatin, erhalten nach dem Verfahren, welches in Beispiel 19 beschrieben ist,

werden zu 10 ml Wasser gegeben. Während dieser Zugabe wird gut gerührt und von aussen mit einem Eisbad gekühlt, durch Zugabe von einer Natriumbicarbonatlösung neutralisiert und anschliessend lyophilisiert. Man erhält 0,5 g des Natriumsalzes

1 %

des Glukosederivates von Nystatin mit E, = 710 bei

J 1 cm

Beispiel 23

0,5 g des Glukosederivates von Amphotericin B, erhalten nach dem Verfahren, welches in Beispiel 5 beschrieben ist, und gereinigt nach der Methode, die in Beispiel 19 angegeben 1 %

wurde, mit E ^ cm = 1370, werden in 100 ml Wasser disper-

giert. Man kühlt äusserlich durch Anwendung eines Eisbades. Unter heftigem Rühren wird auf einen pH-Wert von 7,2 durch Zugabe einer 0,1 normalen wässrigen Lösung von Natriumhydroxid neutralisiert. Anschliessend lyophilisiert man die erhaltene klare Lösung. Man erhält 0,5 g des Natriumsalzes des Glukosederivates von Amphotericin B mit der folgenden Cha-1%

rakteristik E 1 = 1335 bei 382 nm.

1 cm

Beispiel 24 1%

1,0 g Pimaricin mit E ^ cm = 800 bei 304 nm und

0,6 g Rhamnose werden in 100 ml Methanol gelöst. Man lässt die erhaltene Lösung 2 Tage lang bei einer Temperatur von 36° C stehen. Anschliessend dampft man das Methanol auf ein Volumen von etwa 10 ml ein und isoliert das erhaltene rohe Derivat durch Zugabe von Äther zu dem Rückstand, wobei es ausfällt, und dann wird mit Äther gewaschen. Man erhält 1,5 g

1%

des Derivates mit der folgenden Charakteristik E ! = 550 , .. ° 1 cm bei 304 nm.

Beispiel 25 1 %

1,0 g Pimaricin mit E jcm = 800 bei 304 nm und

0,6 g 6-Acetyl-D-glucose werden in 100 ml Methanol gelöst. Man lässt die erhaltene Lösung 2 Tage lang bei einer Temperatur von 36° C stehen. Die Reaktionsmischung wird weiter verarbeitet, wie es in Beispiel 24 beschrieben ist. Man erhält 1,55 g des gewünschten rohen Derivates mit der folgenden Charakteristik E \ = 540 bei 304 nm.

1 cm

Beispiel 26

1,5 g eines Zuckerderivates des Antibiotikums von Beispiel 24 werden in 20 ml Wasser suspendiert und dann gibt man 10 mg Imidazol hinzu. Man filtriert durch Sephadex G-15 und lyophilisiert.

Beispiel 27

1 g eines Zuckerderivates des Antibiotikums von Beispiel 24 wird in 20 ml Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension fügt man 84 ml einer Natriumbicarbonatlösung oder 100 mg Imidazol und Wasser hinzu, verdampft im Vakuum unter Zugabe von Butanol und kann anschliessend das gewünschte Salz des Derivates des Antibiotikums durch Zugabe von Äther ausfällen.

Beispiel 28

1 g des Zuckerderivates des Antibiotikums von Beispiel 24 wird in 20 ml Wasser suspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 120 mg 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-l,3-diol, filtriert durch eine Schicht von Sephadex G-15 und lyophilisiert anschliessend.

Kl i*

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

620 931

8

Beispiel 29

Man suspendiert 1 g des Zuckerderivates des Antibiotikums von Beispiel 24 in 200 ml Wasser, gibt 84 mg saures Natrium-carbonat oder 100 mg Imidazol sowie auch Wasser zu dieser Suspension hinzu, destilliert unter Zugabe von Butanol im 5 Vakuum und fällt das Salz des gewünschten Derivates durch Zugabe von trockenem Äthyläther aus.

Beispiel 30 10

200 mg Aureofacin und 50 g Glucuronsäure werden in 10 ml Dimethylformamid suspendiert. Man lässt die erhaltene Suspension über Nacht bei einer Temperatur von 32° C stehen. Unlösliche Substanzen werden durch Zentrifugieren abgetrennt und man kann das gewünschte Antibiotikum durch die Zugabe 15 von trockenem Äthyläther ausfällen. Man erhält 110 mg des Derivates der Glucuronsäure, das die folgende Charakteristik 1%

aufweist E. = 370 bei 380 nm.

1 cm nem Äthyläther zur Suspension ausgefällt werden. Man erhält 240 mg des Derivates der Glucuronsäure mit der folgenden 1%

Charakteristik E

1 cm

= 940 bei 382 nm.

Beispiel 32

200 mg Polifungin und 50 mg Glucuronsäure werden in 100 ml Dimethylformamid suspendiert. Man lässt die erhaltene Suspension über Nacht bei einer Temperatur von 32° C stehen. Das erhaltene, gewünschte Derivat kann durch Zugabe von trockenem Äther zu der Suspension ausgefällt werden. Man erhält 156 mg des Derivates der Glucuronsäure mit der folgen-1%

den Charakteristik E , = 480 bei 304 nm.

1 cm

100 mg Pimaricin mit E

Beispiel 33 1%

1 cm

= 710 bei 380 nm

Beispiel 31

200 mg Amphotericin B und 50 mg Glucuronsäure werden in 10 ml Dimethylformamid suspendiert. Man lässt die erhaltene Suspension bei einer Temperatur von 32° C über Nacht stehen. Das gewünschte Derivat kann durch Zugabe von trocke- 25 bei 380 nm.

werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung gibt man 30 mg D-Glucuronsäure und lässt bei einer Temperatur von 38° C 24 Stunden lang stehen. Das gewünschte rohe Derivat kann durch Zugabe von 100 ml trockenem Äthyläther zu der Lösung ausgefällt werden. Man erhält 100 mg einer Sub-

1%

stanz, die die folgende Charakteristik aufweist E

1 cm

= 690

C

Claims

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2

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Antibiotika, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Polyen-Makrolid-Antibiotikum, welches eine Aminogruppe aufweist, mit einem Saccharid der Gruppe Aldose-Monosaccharide, Ketose-Monosaccharide, Aldose-OIigosaccharide, Ketose-OIigosaccharide, bzw. ein durch Substitution mindestens einer Hydroxygruppe durch Acetoxy oder durch Substitution einer Hydroxymethylgruppe durch die Carboxygruppe gebildetes Derivat eines Saccharids in einem Lösungsmittel umsetzt und das erhaltene Produkt isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung in Gegenwart von anorganischen oder organischen Basen durchführt, welche mit dem Antibiotikum ein Salz bilden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Reaktionsprodukt durch Umsetzung mit organischen oder anorganischen Basen in das entsprechende Salz überführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyen-Makrolid-Antibiotikum aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Pimaricin, Rimocidin, Candicidin, Levo-rin, Nystatin, Polifungin, Amphotericin B, Candidin, Mycohep-tin, Trichomycin und Aureofacin.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,' dass das Saccharid aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Glucose, Maltose, Ribose, Fructose, Rhamnose, Glucuronsäure und Acetylglucose.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Dimethylformamid, Methanol, Dimethylsulfoxid, Pyridin sowie Mischungen davon.