DE2603122A1

DE2603122A1 - Verfahren zum herstellen von glykoproteinen sowie deren verwendung

Info

Publication number: DE2603122A1
Application number: DE19762603122
Authority: DE
Inventors: Hans H Dr Nagel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-01-28
Filing date: 1976-01-28
Publication date: 1977-09-15
Also published as: US4153686A; DE2603122C3; DE2603122B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Glykoproteinen aus Proteinen und Kohlenhydraten sowie weiterhin die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Glykoproteine.

Es ist bekannt, das Glykoproteine in der Natur weitverbreitet vorkommende, biologisch wichtige Substanzen sind, die aus einem Proteinanteil und kovalent an funktionelle Gruppen der Aminosäuren gebundenen Zuckern bestehen, welche laut Definition keine Nukleinsäuren sein sollen. Die Glykoproteine über als Transportproteine, Inhibitoren und Komplementfaktoren wichtige biologische Funktionen aus. Beispielsweise lässt sich in der Medizin bei akuten oder chronischen rheumatischen Erkrankungen und bei Hautkrankheiten häufig eine Beteiligung von Glykoproteinen feststellen.

Das Verhältnis von Protein zu Polysaccharid in den Glykoproteinen kann innerhalb weiter Grenzen schwanken. Glykoproteine, in denen das Kohlenhydrat einen verhältnismäßig großen Teil des Gesamtmoleküls bildet (mehr als etwa 10%), werden allgemein als Mucoproteine bezeichnet.

Es wurde ein besonders einfaches Verfahren zur Herstellung von synthetischen Glykoproteinen gefunden, welche bei geeigneter Stabilisierung praktisch unbegrenzt lagerfähig sind. Vollkommen überraschend zeigte sich darüber hinaus, dass die so gewonnenen Glykoproteine die verschiedensten Arzneimittelwirkstoffe hinsichtlich ihrer Wirkung ganz erheblich zu potenzieren vermögen und in vielen Fällen darüber hinaus eine Verbreiterung des Wirkungsspektrums herbeiführen.

Gegenstand der Erfindung ist einmal ein Verfahren zum Herstellen von Glykoproteinen aus Proteinen und Kohlenhydraten, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man in Anwesenheit von Monosacchariden Fermente von Hefen auf natives Eiweiß zur Einwirkung bringt und die dabei entstehenden Glykoproteine von dem Reaktionsmedium abtrennt.

Es war zwar bereits bekannt, dass sich Aminosäuren und dementsprechend Eiweißmoleküle mit Aldehyden und Acetalen unter Bildung unlöslicher Großmoleküle umsetzen. Es war jedoch überraschen, dass sich unter dem Einfluß von Hefefermenten Monosaccharide direkt mit Eiweiß zu löslichen Glykoproteinen umsetzen lassen.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann man vorteilhaft eine wässrige Aufschlämmung von Hefe verwenden. Die Umsetzung wird günstigerweise im Neutralbereich, das heißt bei pH-Werten von etwa 6 bis 7,5 und bei Raumtemperatur, das heißt etwa 18 bis 22°C durchgeführt.

Als Ausgangsmaterialien haben sich als Eiweißkomponente Milcheiweiß und Gelatine und als Monosaccharidkomponente Lactose und Glucose besonders bewährt.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind, wie experimentell einwandfrei festgestellt wurde, Hefefermente als Katalysatoren erforderlich. Welche der Hefefermente die Glykoproteinbildung aus dem nativen Eiweiß und den Monosacchariden katalysieren, ist noch nicht im einzelnen untersucht worden.

Die Aufarbeitung des Reaktionsproduktes zur Isolierung der gewonnen Glykoproteine kann nach den aus der Eiweißchemie an sich bekannten Methoden erfolgen. Vorzugsweise wird das Glykoprotein durch Dialyse von den Begleitstoffen abgetrennt und anschließend unter möglichst schonenden Bedingungen, zum Beispiel durch Zentrifugieren, Lösungsmittelextraktion oder vorzugsweise Lyophilisation (Gefriertrocknung) getrocknet. Die erhaltenen Glykoproteine sind wasserlöslich und lassen sich aus Wasser umlösen. Ihr durchschnittliches Molekulargewicht kann in weiten Grenzen schwanken, liegt jedoch besonders bevorzugt im Bereich von 55000 bis 65000.

Die erfindungsgemäß hergestellten reinen Glykoproteine sind nicht stabil, so dass für die Weiterverwendung eine Stabilisierung erforderlich ist. Es wurde gefunden, dass zur Stabilisierung sowohl anorganische Elektrolyte als auch Saccharid/Eiweiß-Gemische geeignet sind. Zur ersten Gruppe gehören insbesondere Salze der Metalle der ersten, zweiten und achten Gruppe des Periodensystems, zum Beispiel Chloride, Carbonate und Phosphate des Natriums, Kaliums, Magnesiums, Calciums und Eisens. Zur zweiten Gruppe gehören vorzugsweise Gemische aus Milcheiweiß, Lactose und Traubenzucker, obgleich auch andere Eiweißmaterialien und andere Aldehyd-Zucker verwendbar sind. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Stabilisierung in der Weise, daß der wässrigen Glykoproteinlösung die anorganischen Salze und eine Eiweiß/Zucker-Aufschlämmung zugefügt werden, worauf anschließend wie oben bereits beschrieben, unter schonenden Bedingungen getrocknet wird. Das Eiweiß/Zucker-Gemisch findet in einem großen Gewichtsüberschuß, bezogen auf das Glykoprotein Anwendung, vorzugsweise in einem Verhältnis von 10[hoch]3 bis 10[hoch]6:1, insbesondere von etwa 10[hoch]5:1. Das so erhaltene Glykoprotein ist stabil und für die weitere Verwendung geeignet.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten, vorzugsweise stabilisierten Glykoproteine zur Potenzierung von Arzneimitteln. Vollkommen überraschend wurde nämlich gefunden, dass die neuartigen Glykoproteine die Wirkung von Therapeutika, Hormonen und Chemotherapeutika zu steigern und zum Teil auch zu verbreitern vermögen. Zwar kann für diese Beobachtung keine vollständige Erklärung gegeben werden, doch kann angenommen werden, dass es sich um Effekte der Transportverbesserung handelt, da Glykoproteine Bestandteile der Zellmembranen sind. Beispielsweise könnte die Wirkungssteigerung bei Antibiotika auf einer verstärkten Hemmung spezifischer, bei der Bakterienzellwandsynthese notwendiger Transportpeptidasen beruhen.

Die potenzierende Wirkung wird bereits bei sehr niedrigen Glykoproteinkonzentrationen beobachtet, so dass diese vorzugsweise in einem Verhältnis von 1 Gewichtsteil Glykoprotein auf 10[hoch]2 bis 10[hoch]6 Gewichtsteile, vorzugsweise etwa 10 [hoch]4 Gewichtsteile Arzneimittelwirkstoff eingesetzt werden. Dabei ist die Wirkung gemäß den vorliegenden Beobachtungen dann optimal, wenn das durchschnittliche Molekulargewicht der Glykoproteine im Bereich von etwa 55000 bis 65000 liegt.

Wie durch die nachfolgenden Beispiele noch näher erläutert wird, liegen beispielsweise die MHK-Werte von erfindungsge- mäßen Glykoprotein/Ampicillin-Kombinationen wesentlich niedriger als die von Ampicillin allein. Darüber hinaus werden Resistenzbildungen nicht beobachtet und das Wirkungsspektrum erstreckt sich überraschenderweise nicht nur auf alle grampositiven und gramnegativen Erreger sondern auch auf Pilze und Viren, welche gegen Ampicillin allein resistent sind. Ähnlich überraschende Potenzierungseffekte zeigten sich auch bei anderen Antibiotika.

Glykoprotein/Dexamethason-Kombinationen zeigten die gleiche Wirkung wie die zehnfache Dosis von Dexamethason allein. Eine ähnliche Wirkungssteigerung wurde bei den Kombinationen Glykoprotein/Norfenefrin und Glykoprotein/Phenylbutazon gegenüber den Wirkstoffen allein beobachtet.

Zur näheren Erläuterung der Erfindung sollen die nachfolgenden Beispiele dienen, auf welche die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist.

Beispiel 1

Es wurden 10 g Milcheiweiß, 2 g Lactose und 1 g Hefe in 250 ml Wasser aufgeschlämmt und 24 Stunden lang in einem Dialysator bei 20°C gegen destilliertes Wasser dialysiert. Bereits nach 8 Stunden war Durchgang von Eiweiß mit Hilfe der Ninhydrinreaktion nachweisbar. Nach 24-stündiger Dialyse wurde das

Dialysat im Vakuum vorsichtig eingeengt und der feste Rückstand wurde aus wenig Wasser umgelöst, worauf die Kristalle in einem Exsikkator getrocknet wurden. Es wurde ein Glykoprotein mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 60000 erhalten.

Zur Stabilisierung wurde jeweils 1 mg des Glykoproteins zu einer Aufschlämmung von 65 g Eiweiß/Zucker (50% Milcheiweiß, 25% Lactose, 25% Traubenzucker) gegeben, welche ferner Spuren Natrium- und Kaliumchlorid, Calcium- und Eisencarbonat sowie Magnesiumphosphat enthielt. Nach gründlicher Durchmischung wurde die Aufschlämmung vorsichtig unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur eingeengt, worauf das Konzentrat durch Gefriertrocknung entwässert wurde. In dem so erhaltenen Pulver liegt das Glykoprotein in stabilisierter Form vor, so dass dessen potenzierende Wirkung unverändert bleibt.

In einem Kontrollversuch wurden 10 g Milcheiweiß und 2 g Lactose in 250 ml Wasser 24 Stunden lang in einem Dialysator bis 20°C gegen destilliertes Wasser in Abwesenheit von Hefe dialysiert. Auch nach dieser Zeit war kein Eiweiß in dem destillierten Wasser nachzuweisen; während sich die Zuckermenge annähernd gleichmäßig verteilt hatte: In Abwesenheit von Hefe findet somit keine Umsetzung statt.

Beispiel 2

Das Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei jedoch 10 g Gelatine im Laufe von drei Stunden unter Rühren bei 20°C in 200 ml destilliertem Wasser aufgequollen und dann mit 3 g Glucose und 2 g Hefe versetzt wurden. Nach 24 Stunden wurde die Mischung bei Zimmertemperatur der Dialyse gegen destilliertes Wasser unterworfen. Bereits nach einer Stunde ließ sich mit Hilfe der Bleiacetatfällungsreaktion der Durchgang von Eiweiß durch die Dialysemembran nachweisen. das Dialysat wurde wiederum im Vakuum bei 20°C eingeengt, worauf das erhaltene Rohprodukt umgelöst wurde. Das erhaltene Glykoprotein wies ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 55000 auf.

Die Stabilisierung des Glykoproteins erfolgte anschließend in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 3

Das gemäß Beispiel 1 hergestellte stabilisierte Glykoprotein wurde wie folgt mit D-(2-Amino-2-phenylacetamido)-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo-[3.2.0]-heptan-2-carbonsäure (Ampicillin) kombiniert, indem 13,75 Teile Ampicillin-Natrium mit 86,25 Gewichtsteilen des Eiweiß/Zucker-Gemisches trocken vermischt wurden, wobei letzteres 0,001375 Gewichtsteile Glykoprotein (Verhältnis Glykoprotein:Ampicillin = 1:10[hoch]4) enthielt.

In den nachfolgenden Vergleichsversuchen wurde das erfindungsgemäße Kombinationspräparat mit handelsüblichem Ampicillinnatrium verglichen.

A. Bestimmung der bakteriziden Wirksamkeit in vitro

Die bakterizide Wirkung wurde im Zylindertest mit Nährboden aus Agarfolie (PA) und beimpfter Agarfolie (PCA) nach 18-stündiger Bebrütung bei 37°C geprüft. Der Testagar wurde hergestellt, indem Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm mit 14 ml Grundagar (PA) gefüllt wurden. Nachdem der Boden fest geworden war, wurde er mit 4 ml beimpftem Agar (PCA) überschichtet. Der beimpfte Agar war vor Eingabe in die Petrischalen mit 0,1 ml einer unverdünnten Vorkultur der Testbakterien, die 18 Stunden lang bei 37°C gezüchtet worden waren, bei 40°C vermischt worden.

Nach einer Einwirkungszeit von 20 Minuten wurden sechs Stahlzylinder (Außendurchmesser 8 mm, Innendurchmesser 6 mm, Größe 10 mm) in die verfestigten Agarmassen eingedrückt. Je drei der zylindrischen Vertiefungen wurden mit der Vergleichssubstanz und der Testsubstanz in destilliertem Wasser gefüllt. Notwendig werdende Verdünnungen wurden mit Phosphatpuffer pH 7 vorgenommen. Die Diffusion wurde 18 Stunden lang bei 37°C durchgeführt. Anschließend wurde der Diffusionsbereich ermittelt und im Vergleich zu Standardproben die Empfindlichkeit anhand des Hemmhofes errechnet. Die gefundenen Werte sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. Es handelt sich jeweils um Durchschnittswerte aus drei Einzelmessungen.

Tabelle 1

Bakterizide in MHK in (nicht schreibbar) Ampicillin/ml

Bakterienstamm Testsubstanz

Ampicillin/

Ampicillin Glykoprotein

staphyloc.aur. ATCC 11522 0,06 0,001

staphyloc.aur. NCTC 6571 0,06 0,001

staphyloc.aur. ATCC 6538 P

(Penicillinasebildner) resistent 0,001

strept. pyogenes ATCC 8668 0,03 0,0005

strept. faecalis ATCC 8043 2,0 0,015

strept. faecalis ATCC 10541 1,0 0,015

strept. faecalis ATCC 19433 2,0 0,015

strept. pneumon. ATCC 6301 0,06 0,0005

strept. pneumon. ATCC 6302 0,06 0,0005

h. influencae ATCC 19418 0,25 0,004

ps. aeruginosa NCTC 10662 240 0,04

escherichia coli NCTC 10418 8 0,013

Die Zahlenwerte zeigen deutlich die um mindestens zwei Zehnerpotenzen verbesserte bakterizide Wirksamkeit des mit dem erfindungsgemäß hergestellten Glykoprotein potenzierten Ampicillins gegenüber Ampicillin allein. Das Glykoprotein zeigt allein keine bakterizide Wirksamkeit.

Die nachfolgende Tabelle 2 zeigt die MHK-Werte gegenüber unterschiedlichen Bakterienstämmen. Dabei sind nicht nur die niedrigeren MHK-Werte für die erfindungsgemäße Kombination auffallend, sondern besonders überraschend ist die Wirksamkeit auch gegenüber solchen Stämmen, welche Penicillinase bilden und gegen welche Ampicillin allein vollkommen wirkungslos ist.

Tabelle 2

B. Fungizide Wirksamkeit

Die MHK-Werte für die fungizide Wirksamkeit des Kombinationspräparates wurden nach der Vorschrift der American Soc. of Clinical Microbiology, Manual of Clinical Microbiology, 2. Auflage (Washington D.C.), bestimmt. Die in der nachfolgenden Tabelle 3 zusammengestellten MHK-Werte sind deshalb besonders überraschend, weil Ampicillin selbst keine praktisch verwertbare fungizide Wirksamkeit aufweist.

Tabelle 3

Teststamm MHK in (nicht schreibbar)/ml

Aspergillus fumigatum

flavus 0,05 - 0,1

Blastomyces dermatitidis 0,1 - 0,3

Candida ablicans

guillermondii

pseudotropicalis 0,05 - 0,1

stellatoides

Coccidioides immitis 0,05 - 0,1

Cryptococcus neoformans 0,05 - 0,1

Epidermophyton floccosum 0,1 - 0,3

Geotricum candidum 0,1 - 0,3

Histoplasma capsulatum

duboisii 0,05 - 0,1

Microsporum audouinii

fulvum

gypseum 0,05 - 0,1

persicolor

Nocardia asteroides 0,1 - 0,4

Rhodotorula glutinis

rubra 0,1 - 0,4

Sporotrichum schenkii 0,05 - 0,1

Torulopsis glabata

pintolopesii 0,05 - 0,3

Trichophyton tonsurans 0,1 - 0,4

Trichomonas vaginalis 0,1 - 0,3

Trichosporum cutaneum 0,05 - 0,3

C. Viruzide Wirksamkeit

Das erfindungsgemäße Ampicillin/Glykoprotein-Kombinationspräparat wurde klinisch bei folgenden Virusinfektionen getestet:

10 Fälle von Influenza A Virus

10 Fälle von Influenza B Virus

5 Fälle von Parainfluenza-Virus, Typ 1 (HA 2)

5 Fälle von Parainfluenza-Virus, Typ 2 (Greer)

5 Fälle von Parainfluenza-Virus, Typ 3 (HA 1)

10 Fälle von Respiratori syncytical Virus (Long)

10 Fälle von Adenovirus

Die Untersuchungen wurden mit Hilfe des Komplement-Fixationstests (Mikromethode gemäß J.L. Sever, J. Immunol. 88, 320-329 (1962)) durchgeführt. Die Sera wurden als antikörper-positiv angesehen, wenn eine vierfache positive Reaktion bei einer Verdünnung von mindestens 1:4 gefunden wurde.

Die Behandlung erfolgte mit Tabletten, welche jeweils 55 mg Ampicillin-trihydrat und 5,5 (nicht schreibbar) Glykoprotein in stabilisierter Form enthielten. Es wurden am ersten und zweiten Tag viermal täglich zwei Tabletten, sowie am dritten bis siebten Tag viermal täglich eine Tablette verabfolgt. 40 der behandelten Fälle waren nach vier Tagen, die übrigen 15 Fälle nach sieben Tagen vollständig symptomfrei.

Beispiel 4

Es wurde die potenzierende Wirkung von erfindungsgemäß hergestelltem Glykoprotein auf Dexamethason untersucht. Als Testsubstanzen fanden Dexamethason allein sowie Dexamethason in Kombination mit dem Glykoprotein (Gewichtsverhältnis 10[hoch]4:1) Verwendung.

In klinischen Versuchen wurden 10 Patienten, welche an primärer chronischer Polyarthritis litten, im Rahmen einer Vergleichsuntersuchung behandelt, wobei zur Bestimmung der Wirksamkeit der Behandlungen der BSG- und der ASLO-Titer herangezogen wurden.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 4 zusammengefaßt. Es zeigt sich überraschend, dass mit Hilfe des Kombinationspräparates gemäß Erfindung etwa die gleiche Wirkung erreicht wird, wie bei 10-fach höherer Dosierung von Dexamethason allein.

Tabelle 4

Beispiel 5

Es wurde die potenzierende Wirkung von erfindungsgemäß hergestelltem Glykoprotein auf Phenylbutazon untersucht. Die gleichen Patienten wie in Beispiel 4 wurden behandelt. Die in der folgenden Tabelle 5 zusammengestellten Ergebnisse des Reihenversuches zeigen eine unerwartete Wirkungssteigerung durch das Glykoprotein, welche es ermöglicht, die Dosis auf 1/10 zu reduzieren.

Tabelle 5

Beispiel 6

Es wurde die potenzierende Wirkung des erfindungsgemäß hergestellten Glykoproteins auf Norfenefrin klinisch untersucht, wobei 10 Patienten behandelt wurden, welche an Hypotonie litten. Die Wirkung der Testsubstanzen wurde durch Bestimmung des systolischen und des diastolischen Blutdruckes jeweils zur Mittagszeit ermittelt. Am 1. bis 7. Tag erfolgte keine Behandlung, vom 8. bis 14. Tag wurden täglich einmal 3,0 mg Norfenefrin verabreicht, vom 15. bis 21. Tag wurde die Behandlung wiederum unterbrochen (Verabreichung von Plazebos) und vom 22. bis 28. Tag wurden einmal täglich 0,3 mg Norfenefrin in Kombination mit Glykoprotein (Gewichtverhältnis 10[hoch]4:1) gegeben. Die Medikation erfolgte jeweils um 9.00 Uhr früh, also drei Stunden vor Bestimmung des Blutdruckes.

Die in der nachfolgenden Tabelle 6 zusammengefaßten Ergebnisse der Versuchsreihe zeigen, dass das Kombinationspräparat bei zehnfach niedrigerer Dosierung bezüglich des Norfenefrins etwa die gleiche Blutdruckerhöhung gibt.

Tabelle 6

Claims

1. Verfahren zum Herstellen von Glykoproteinen aus Proteinen und Kohlenhydraten, dadurch gekennzeichnet, dass man in Anwesenheit von Monosacchariden Fermente von Hefen auf natives Eiweiß zur Einwirkung bringt und die dabei entstehenden Glykoproteine von dem Reaktionsmedium abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Aufschlämmung von Hefe verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Monosaccharid Lactose oder Glucose verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Eiweiß Milcheiweiß oder Gelatine verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion bei Raumtemperatur durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktion bei pH-Werten von etwa 6 bis 7,5 durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Glykoproteine durch Dialyse abtrennt und unter schonenden Bedingungen trocknet.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die Glykoproteine durch Zugabe von anorganischen Elektrolyten und/oder von Saccharid/Eiweiß-Gemischen stabilisiert.

9. Verwendung der nach Anspruch 1 bis 8 hergestellten stabilisierten Glykoproteine zur Potenzierung von Arzneimitteln.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man auf 1 Gewichtsteil Glykoprotein 10[hoch]2 bis 10[hoch]6 Gewichtsteile Arzneimittelwirkstoff einsetzt.

11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Glykoprotein ein durchschnittliches Molekulargewicht von 55000 bis 65000 aufweist.