PL180253B1

PL180253B1 - Pochodne N-metylo-N-glikozylowe estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych i ich sole oraz sposób ich otrzymywania PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL180253B1
Application number: PL95308583A
Authority: PL
Inventors: Edward Borowski; Jolanta Grzybowska; Pawel Sowinski; Jerzy Gumieniak; Andrzej Czerwinski
Original assignee: Politechnika Gdanska; Politechnika Gdaoska
Priority date: 1995-05-13
Filing date: 1995-05-13
Publication date: 2001-01-31
Also published as: EP0825995A1; MX9708637A; NZ307592A; CA2220771A1; IL118233A0; PL308583A1; JPH11504647A; WO1996035701A1; ZA963787B; AU5698396A; KR19990014843A; AU716883B2

Abstract

1. Pochodne N-metylo-N-glikozylowe estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych o wzorze ogólnym 1, gdzie M oznacza reszte antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, zas R oznacza fra- gment reszty cukrowej powstaly w wyniku reakcji tego antybiotyku z mono lub oligosa- charydem, korzystnie z D-glukoza lub L-glu- koza lub D-mannoza lub D-galaktoza lub laktoza lub maltoza, z przegrupowaniem Amadon. wzór 1 P L 180253 B 1 PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku sąpochodne N-metylo-N-glikozylowe estrów metylowych antybiotyków przeciwgrzybowych z grupy makrolidów polienowych o wzorze ogólnym 1, gdzie M oznacza reszty antybiotyków z grupy makrolidów polienowych, a R oznacza zmienną część fragmentu reszty cukrowej oraz ich sole o wzorze ogólnym 2, gdzie M oznacza reszty antybiotyków z grupy makrolidów polienowych, R oznacza zmienną część fragmentu reszty cukrowej, zaś A oznacza anion kwasu nieorganicznego lub organicznego, oraz sposób ich otrzymywania i wykorzystywania w lecznictwie.

Znane sąpochodne N-alkilowe antybiotyków z grupy makrolidów polienowych, to znaczy związki, w których grupa aminowa macierzystego antybiotyku jest podstawiona podstawnikami alkilowymi. Z publikacji J. Antibiotics 28,244 (1975), L. Falkowski, J. Golik, P. Kołodziejczyk, J. Pawlak, J. Zieliński, T. Zimiński, E. Borowski; Acta Polon. Pharm. 37, 517 (1980), L. Falkowski, J. Pawlak, J. Golik. P. Kołodziejczyk, B. Stefańska, E. Bylec, E. Borowski - znane sąpochodne N-glikozylowe makrolidów polienowych, w których grupa aminowa wyjściowego antybiotyku jest podstawiona resztą cukrową taką jak: reszta D-głukozy, D-mannozy, L-ramnozy, D-rybozy, maltozy. Związki te otrzymuje się w reakcji makrolidów polienowych z wymienionymi cukrami z równoczesnym przegrupowaniem Amadori. Posiadają one aktywność biologiczną zbliżoną do aktywności wyjściowych antybiotyków i tworzą rozpuszczalne w wodzie sole. Jednakże wykazują one wysoką toksyczność.

Innym typem pochodnych sąpochodne trimetyloamoniowe estrów metylowych makrohdów polienowych znane z publikacji - J. Antibiotics 32,1080 (1979), L. Falkowski, B. Stefańska, J. Zieliński, E Bylec, J. Golik, P. Kołodziejczyk, E. Borowski - w których grupa aminowa estru metylowego antybiotyku jest całkowicie zmetylowana z utworzeniem czwartorzędowej soli amoniowej Związki te otrzymuje się w reakcji wyczerpującego metylowania macierzystego antybiotyku za pomocąsiarczanu dimetylu. Pochodne te sąrozpuszczalne w wodzie i charakteryzują się aktywnością przeciwgrzybową porównywalną z aktywnością wyjściowych antybiotyków lecz są bardzo toksyczne i nietrwałe.

Kolejnym typem pochodnych N-alkilowych sąpochodne N-sukcynimidyłowe będące wynikiem reakcji antybiotyku z N-podstawionymi maleimidami takimi jak: N-etyłomaleimid, Ν,Ν'-heksametylenodimaleimid, N-(3-dimetyloaminopropylo)maleimid, zwanej addycją Michaela, znane z publikacji - J. Antibiotics 44, 979 (1991), A. Czerwiński, W. A. Konig, T. Zieniawa, P. Sowiński, V. Sinnwell, S. Milewski, E. Borowski. Związki takie są mniej toksyczne w porównaniu z macierzystymi antybiotykami, lecz ich aktywność przeciwgrzybową jest obniżona.

Ostatnią wreszcie znanągrupąpochodnych N-alkilowych makrolidów polienowych sąpochodne N-enaminowe i amidynowe, powstające w wyniku reakcji tych antybiotyków z acetyloacetonem, acetylooctanem etylu lub dimetyloacetalem dimetyloformamidu, które przedstawione są w publikacji - Acta Polonica Pharm. 45,71 (1988), B. Stefańska, J. Zieliński, E. Borowski, L Falkowski. Pochodne te wykazują aktywność przeciwgrzybową zbliżoną do macierzystych antybiotyków i polepszoną rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych, sąjednak nadal znacznie toksyczne a także bardzo nietrwałe.

Dotychczas nie są znane pochodne N-metylo-N-glikozylowe estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych oraz sposób ich otrzymywania. Nieoczekiwanie związki takie, zachowując aktywność przeciwgrzybową zbliżoną do macierzystych antybiotyków i tworząc z kwasami rozpuszczalne w wodzie sole wykazywały radykalnie obniżoną toksyczność. Wysoka toksyczność jest

180 253 podstawową niedogodnością wszystkich znanych dotąd N-alkilowych pochodnych makrolidów polienowych, której to niedogodności są pozbawione związki będące przedmiotem wynalazku.

Pochodne N-metylo-N-glikozylowe estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych według wynalazku są wzorem ogólnym 1, gdzie M oznacza resztę antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, zaś R oznacza fragment reszty cukrowej powstały w wyniku reakcji tego antybiotyku z mono lub oligosacharydem, korzystnie z D-glukoząlub L-glukoząlub D-mannozą lub D-galaktozą lub laktozą lub maltozą, z przegrupowaniem Amadori.

Korzystnie w tych pochodnych antybiotykiem z grupy makrolidów polienowych jest amfoterycyna B lub kandydyna lub kandydoina lub kandydynina lub mykoheptyna lub nystatyna lub pohfungina lub aureofacyna lub wacydyna lub trychomycyna lub kandycydyna.

Według wynalazku sole pochodnych N-metylo-N-glikozylowych estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych przedstawione są wzorem ogólnym 2, gdzie M oznacza resztę antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, zaś R oznacza fragment reszty cukrowej powstały w wyniku reakcji tego antybiotyku z mono lub oligosacharydem, korzystnie z D-glukoząlub L-glukoząlub D-mannoząłub D-galaktoząlub laktozą lub maltozą, z przegrupowaniem Amadori, zaś A oznacza amon kwasu organicznego lub nieorganicznego.

Korzystnie w tych solach antybiotykiem z grupy makrolidów polienowych jest amfoterycyna B lub kandydyna lub kandydoina lub kandydynina lub mykoheptyna lub nystatyna lub poiiftmgina lub aureofacyna lub wacydyna lub trychomycyna lub kandycydyna i również korzystnie A oznacza anion kwasu L-asparaginowego.

Sposób otrzymywania pochodnych N-metylo-N-glikozylowych estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych o wzorze ogólnym 1, gdzie M oznacza resztę antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, zaś R oznacza fragment reszty cukrowej powstały w wyniku reakcji tego antybiotyku z mono lub oligosacharydem, korzystnie z D-glukoząlub L-glukozą lub D-mannozą lub D-galaktozą lub laktozą lub maltozą, z przegrupowaniem Amadori, charakteryzuje się według wynalazku tym, że otrzymane w wyniku reakcji przegrupowania Amadori N-glikozylowe pochodne antybiotyków z grupy makrolidów polienowych przeprowadza się w zawiesinę przez wytrącenie rozpuszczalnikiem, korzystnie eterem dietylowym z roztworu tej pochodnej w rozpuszczalniku organicznym korzystnie w Ν,Ν-dimetyloformamidzie, a następnie działa się roztworem eterowym diazometanu w obniżonej temperaturze korzystnie w zakresie -5°C do +5°C i miesza się, po czym surowy produkt reakcji izoluje się przez odparowanie rozpuszczalników i wytrącenie z zagęszczonego roztworu korzystnie eterem dietylowym stosowanym w nadmiarze, a następnie surowy produkt oczyszcza się znanymi sposobami.

Sposób otrzymywania soli pochodnych N-metylo-N-glikozylowych estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych o wzorze ogólnym 2, gdzie M oznacza resztę antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, a R oznacza fragment reszty cukrowej powstały w wyniku reakcji tego antybiotyku z mono lub oligosacharydem, korzystnie z D-glukozą lub L-glukoząlub D-mannozą lub D-galaktozą lub laktozą lub maltozą, z przegrupowaniem Amadori, zaś A oznacza anion kwasu organicznego lub nieorganicznego charakteryzuje się według wynalazku tym, że otrzymane w wyniku reakcji przegrupowania Amadori N-glikozylowe pochodne antybiotyków z grupy makrolidów polienowych przeprowadza się w zawiesinę przez wytrącenie rozpuszczalnikiem, korzystnie eterem dietylowym z roztworu tej pochodnej w rozpuszczalniku organicznym korzystnie w Ν,Ν-dimetyloformamidzie, a następnie działa się roztworem eterowym diazometanu w obniżonej temperaturze, korzystnie w zakresie -5°C do +5°C i miesza się, po czym surowy produkt reakcji izoluje się przez odparowanie rozpuszczalników i wytrącenie z zagęszczonego roztworu, korzystnie eterem dietylowym stosowanym w nadmiarze, a następnie surowy produkt oczyszcza się znanymi sposobami, po czym otrzymaną pochodną w postaci osadu zawiesza się w niewielkiej ilości wody, dodaje się do zawiesiny kwas organiczny lub nieorganiczny w stosunku stechiometrycznym, a następnie z otrzymanego roztworu wytrąca się osad za pomocą nadmiaru rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą, korzystnie acetonu, osad przemywa się, korzystnie acetonem, a dalej, korzystnie eterem dietylowym, i suszy się, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem.

Sposób leczenia zewnętrznych i układowych infekcji grzybowych u ludzi i zwierząt charakteryzuje się według wynalazku tym, że do leczenia tych schorzeń stosuje się pochodne N-mety

180 253 lo-N-glikozylowe estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych o wzorze ogólnym 1, gdzie M oznacza resztę antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, zaś R oznacza fragment reszty cukrowej powstały w wyniku reakcji tego antybiotyku z mono lub oligosacharydem, korzystnie z D-glukoząlub L-glukoząlub D-mannoząlub D-galaktoząlub laktozą lub maltozą z przegrupowaniem Amadori.

Sposób leczenia zewnętrznych i układowych infekcji grzybowych u ludzi i zwierząt charakteryzuje się według wynalazku tym, że do leczenia tych schorzeń stosuje się sole pochodnych N-metylo-N-glikozylowych estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych o wzorze ogólnym 2, gdzie M oznacza resztę antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, zaś R oznacza fragment reszty cukrowej powstały w wyniku reakcji tego antybiotyku z mono lub oligosacharydem, korzystnie z D-glukozą lub L-glukozą lub D-mannozą lub D-galaktoząlub laktozą lub maltozą z przegrupowaniem Amadori, zaś A oznacza anion kwasu organicznego lub nieorganicznego.

Według wynalazku sposób otrzymywania N-metylo-N-glikozylowych pochodnych estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych prowadzi do otrzymania żądanego produktu bez zmian w strukturze pozostałej części cząsteczki macierzystego antybiotyku. Dowód struktury otrzymanych związków przeprowadzono metodami spektroskopowymi. Postępowanie dowodowe przykładowo ilustruje sposób ustalenia budowy estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfoterycyny B przedstawionego wzorem 3.

Identyczność elektronowego widma absorpcyjnego estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B z widmem wyjściowego antybiotyku, to jest amfoterycyny B, dowodzi, że opracowany sposób nie prowadzi do degradacji chromoforu polienowego, a wysoka wartość ekstynkcji (Ej^j = 1300 przy 382 nm) świadczy o wysokim stopniu czystości otrzymanego produktu. W widmie absorpcyjnym w podczerwieni estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B obserwuje się pasmo odpowiadające drganiom walencyjnym grupy karbonylowej estru metylowego przy 1730 cm’¹ oraz brak pasma odpowiadającego wolnej grupie karboksylowej, co świadczy o tym, że grupa karboksylowa została przekształcona w wyniku reakcji w ester metylowy. Kompletnych informacji o strukturze estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B dostarczyły widma magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Niezbędne dane uzyskane z widma *H (DQF-COSY, ROESY), ¹³C (DEPT) i heterokorelowanych (spektrometr Varian 300 MHz) pozwoliły na ustalenie struktury związku przedstawionego wzorem 3, którym jest struktura estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozylo amfotercyny B.

Najbardziej znaczące ‘H i ^l3C informacje są przedstawione odpowiednio w tabeli 1 i 2. Dane NMR dla aghkonu amfoterycyny B są w pełnej zgodności z danymi literaturowymi -Magn Reson. Chem. 30, 275 (1992), P. Sowiński, J. Pawlak, E. Borowski, P. Gariboldi. Przesunięcia chemiczne 'H (w rozpuszczalniku DMSO-MeOD) dla N-CH₃ (δ=2.35 ppm) 1H-1” (2.30 i 3.15 ppm) są charakterystyczne dla wpływu podstawnika aminowego. Po zakwaszeniu, δ zmienia się do 2.92 ppm dla N-CH₃ i do 3.64 dla H-l” w wyniku protonowania grupy aminowej (δ dla H-3’ zmienia się na 3.19 ppm). Te dane wspierają również efekty ROE między protonami NCH₃/H3 ’, NCH₃H2’, NCH₃/Hl”b i 1” a/H3’. Stałe sprzężenia i ROE wskazują na konformację ⁴Ci fragmentu mykozaminowego tak, j ak to zostało uprzednio znalezione dla wolnej amfoterycyny B.

W tabeli 1 przedstawione zostały przesunięcia chemiczne *H i efekty ROE we fragmencie disacharydowym estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B.

Tabela 1

proton	δ [ppm]	ROE do protonów	δ [ppm]	ROE do protonów
	pirydyna-dj metanol-d₄ 9:1	DMSO-ck metanol-d₄ 4:6
Γ	4 77	2’, 3’, 5’, 18b, COOMe	4 48	3’, 5’
2’	441	1’ 3’,NMe, 17, COOMe, 1” a?	4.04	3’,NMe, COOMe

180 253

c.d. tabeli 1

3’	2.06	Γ, 2’, 5’, NMe, 1” a, COOMe	1.89	l’,2’,NMe, l”b
4’	4.38	6’	3.80	6’
5’	3.61	l’,3’,6’	3.45	l’,3’,6’
6’	1 23	4’, 5’	1.27	4’, 5’
l”a	2.56	3’, 3” (2’)	2.30
l”b	3 58	NMe	3 15	3”, 3’
3”	441	l”a ?	3.65	l”b
4”	4 76		3.97
5”	4.41		3.63
6”a	4.21		3.57
6”b	4.36		3.76
NMe	2.29	2’, 3’, l”b, COOMe	2.35	2’, 3’, l”a, l”b, COOMe
COOMe	3 70	l’,2’, 3’,NMe. 16	3.77	2’, NMe

W tabeli 2 przedstawione zostały przesunięcia chemiczne ¹³C-NMR we fragmencie disacharydowym estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B i ich porównanie z danymi dla D-fruktozy.

Tabela 2

węgiel	δ [ppm]	dane dla fruktoz*)
β-D-fruktopyranoza	a-D-fruktofuranoza	β-D-fruktofuranoza
δ [ppm]	δ [ppm]	δ [ppm]
1’	98.3
2’	72.4
3’	66.4
4’	69.8
5’	72.3
6’	18.2
1”	62.2	64 1	62 1	63 9
2”	98 1	99 1	105.3	102 4
3”	66.9	70.5	83.0	76.5
4”	71 2	68.4	77.0	75 5
5”	72.2	70 0	82.2	81.5
6”	64.6	64.7	62.1	63.3
NMe	40.9
COOMe	51.6

*) S. N. Rosenthal & J. H. Fendler, Próg. Phys. Org. Chem. 13,280 (1976).

Porównanie danych ¹³C-NMR z tabeli 2 dla fragmentu fruktozylowego z danymi literaturowymi dla D-fruktozy wskazująna formę pyranozowąpodstawnika cukrowego. Obserwowane

180 253 sprzężenia J, przedstawione w tabeli 3, wskazują na konformację łódkową pierścienia fruktopyranozydowego przedstawioną wzorem 4. Jedynie taka konformacja tego pierścienia jest w pełnej zgodności ze zmierzonymi stałymi sprzężenia.

W tabeli 3 przedstawione zostały stałe sprzężenia J_{H H} protonów fragmentu disacharydowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B (Py-d₅:metanol-d₄ 9:1), przy czym przesunięcia chemiczne i stałe sprzężenia silnie sprzężonego układu spinowego H3”-H6” były udokładniane iteracyjnie poprzez jego komputerową symulację.

Tabela 3

protony	J [Hz]	protony	J [Hz]
l’,2’	~0	l”a, l”b	11.6
2’, 3’	2.2	3”, 4”	1.05
3’, 4’	9.5	4”, 5”	8.09
4’, 5’	9.2	5”, 6”a	5.76
5’, 6’	60	5”, 6”b	3.61
		6”a, 6”b	~ 10 86
		4”, 6”a	~0 1

Wyniki tych badań pozwoliły na potwierdzenie konformacji fragmentu fruktozylowego estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B, który przedstawiony jest wzorem 4.

Pozostałe pochodne N-metylo-N-glikozylowe estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych charakteryzowano w podobny do opisanego wyżej sposób.

Dla otrzymanych związków określano aktywność przeciwgrzybową a także toksyczność in vitro. Dla związku o najkorzystniejszych właściwościach, to jest asparaginianu estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B określono także toksyczność i aktywność in vivo.

Aktywność przeciwgrzybową związków określano posługując się standardową metodą stosowaną dla makrolidów polienowych. Płynne podłoże Sabourauda zaszczepiono 10⁴ komórek/ml organizmu testowego Candida albicans ATCC 262778 i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 30°C z badanym antybiotykiem (rozcieńczenia seryjne). Jako związek porównawczy stosowano amfoterycynę B. Związki rozpuszczano w DMF i odpowiednie ilości roztworów dodawano do podłoży. Dla określenia stopnia zahamowania wzrostu drobnoustroju stosowano metodę turbidymetryczną przy 660 nm. Stężenie antybiotyku, przy którym wzrost grzyba został zahamowany w 50% określano z krzywej zależności wzrostu od stężenia Otrzymana wartość IC₅₀ charakteryzuje aktywność przeciwgrzybową związku.

Toksyczność związków in vitro w stosunku do komórek zwierzęcych określano stosując standardowy test przyjęty dla makrolidów polienowych, jakim jest stopień hemohzy erytrocytów ludzkich. Ludzkie czerwone krwinki izolowane ze świeżej krwi z dodatkiem cytrynianu przemywano dwukrotnie zimnym roztworem soli fizjologicznej. Komórki rozcieńczano 250-krotnie solą fizjologiczną i przetrzymywano w 37°C przez 30 minut. Porcję krwinek inkubowano z różnymi stężeniami antybiotyków (roztwór bazowy w DMF) przez 30 minut w 37°C. Lizę erytrocytów określano, po wirowaniu, mierząc uwalnianą do roztworu hemoglobinę. Gęstość optyczną supematantu mierzono przy 550 nm. Wyniki wyrażano wartościami EH₅₀ jako stężęnie antybiotyku, przy którym ma miejsce 50% hemolizy. Wartości EH₅₀ odczytywano z krzywej zależności stopnia hemolizy od stężenia antybiotyku.

Toksyczność in vivo określono dla L-asparaginianu estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B. Określono najwyższą dawkę tolerowaną, MTD, oraz toksyczność ostrą LD₅₀. Dla określenia dawki MTD preparat rozpuszczano w 5% roztworze glukozy i podawano dożylnie oraz dootrzewnowe myszom rasy Balb/c, w dawce pojedynczej i wielokrotnej. Najwyższa

180 253 poj edyncza dawka tolerowana wynosiła 100 mg/kg przy podaniu dożylnym i powyżej 200 mg/kg przy podaniu dootrzewnowym. Najwyższa wielokrotna dawka tolerowana przy podawaniu dootrzewnowe 100 mg/kg przez 5 dni znacznie przekracza tę wartość. Przy takiej dawce nie stwierdzano żadnych toksycznych efektów do 20 dni obserwacji.

Toksyczność ostrą, LD₅₀, L-asparaginianu estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B określono dla samic myszy Swiss Webster o wadze przeciętnie 20 g. Zwierzętom podawano dożylnie różne ilości badanego preparatu i dla porównania amfoterycynę B w postaci preparatu Fungizon, rozpuszczone w 5% glukozie. Podawana objętość roztworu wynosiła 0.5 ml. Jako kontrolę podawano myszom 0.5 ml 5% roztworu glukozy. Każdą dawkę obu preparatów podawano grupie 5 myszy. Zwierzęta obserwowano przez 7 dni. Po tym czasie myszy przeżywające zabijano i badano niektóre wskaźniki w surowicy. Nie stwierdzono, w porównaniu z myszami kontrolnymi, zwiększonego poziomu aminotransferazy asparagmianowej czy kreatyniny. LD₅₀ dla L-asparaginianu estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B wynosiło 400 mg/kg, podczas gdy dla amfoterycyny B w formie Fungizonu wynosiło 6 mg/kg

Efektywność chemoterapeutycznąL-asparaginianu estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B określono na modelu uogólnionej kandydozy myszy. Candida albicans hodowano przez dobę na podłożu Sabourauda z glukozą w temperaturze pokojowej. Komórki grzybowe odwirowano i dwukrotnie przemyto 0.9% roztworem chlorku sodu, po czym komórki zawieszono w roztworze soli fizjologicznej. Samice myszy Swiss Webster o wadze 25 g inokulowano dożylnie 10⁵ komórek Candida w 0,2 ml 0.9% roztworu chlorku sodu. Początkowo infekcja jest uogólniona, lecz po 2 do 3 dniach lokalizuje się w nerkach. Nie leczone zwierzęta giną zwykle pomiędzy 7 a 14 dniem po infekcji. Trzy dni po zainfekowaniu zwierzęta leczono podając dożylnie preparat dwa razy dziennie w odstępach 5 do 6 godzin przez 5 kolejnych dni. Preparat podawano jako roztwór w 5% glukozie. Zwierzęta obserwowano przez 5 tygodni począwszy od dnia infekcji. Po tym czasie zwierzęta, które przeżyły zabijano, wyjmowano nerki, homogenizowano je w sterylnej wodzie i homogenat posiewano na płytkach agarowych z podłożem Sabourauda z glukozą i liczono wyrosłe kolonie Candida. Efektywność chemoterapeutyczną preparatu określono jako dawkę w mg/kg, która w powyższym teście spowodowała przeżycie 50% zwierząt lub pełne usunięcie Candida z nerek połowy myszy. Dawkę tę określanąjako ED₅₀ obliczano metodą podaną w publikacji w J. Hyg. 27, 493 (1938). Wartości ED₅₀ L-asparaginianu estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B wynoszą2.3 mg/kg biorąc pod uwagę wskaźnik przeżycia oraz 6 mg/kg biorąc pod uwagę wskaźnik sterylizacji nerek.

Pochodne N-metylo-N-ghkozylowe estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów pohenowych, ich sole oraz sposób otrzymywania ilustrują podane niżej przykłady.

Przykład I g Amfoterycyny B o E}^ = 1350 przy 382 nm w metanolu, rozpuszcza się w 15 ml Ν,Ν-dimetyloformamidu, dodaje 0.3 g D-glukozy i miesza się w ciemności przez 40 godz. w temp. 37°C. Po przereagowaniu mieszaninę reakcyjną schładza się i wytrąca się z niej osad przy pomocy nadmiaru eteru dietylowego. Osad odwirowuje się, przemywa dwukrotnie eterem diety lowym i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Celem usunięcia nadmiaru D-glukozy osad zawiesza się w 20 ml wody, odwirowuje, przemywa dwukrotnie niewielką ilością wody oraz dwukrotnie acetonem i następnie dwukrotnie eterem di etylowym. Produkt suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 0.98 g N-D-fruktozyloamfoterycyny B o E]’^ = 1200 przy 382 nm w metanolu. Produkt rozpuszcza się w 10 ml Ν,Ν-dimetyloformamidu mieszając. Do otrzymanego roztworu dodaje się mieszając 50 ml eteru dietylowego, co powoduje wytrącenie rozdrobnionej zawiesiny. Całość schładza się w łaźni lodowej o temp. 0-2°C i dodaje mieszając energicznie świeżo otrzymany roztwór diazometanu w eterze dietylowym w proporcji 2.5 mola diazometanu w 1 mmol N-D-fruktozyloamfoterycyny B. Przebieg reakcji kontroluje się metodą chromatografu cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym w układzie rozpuszczalników chloroformmetanol-woda 10:6:1 objętościowo. Po przereagowaniu, w ciągu około 2 godz., nadmiar diazometanu oraz eter dietylowy odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze nie wyższej niż 40°C. Z pozostałego roztworu surowy produkt wytrąca się nadmiarem eteru dietylo

180 253 wego, odwirowuje, przemywa dwukrotnie eterem dietylowym i następnie n-heksanem i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 0.95 g preparatu. Czysty ester metylowy N-metyloN-D-fruktozyloamfotercyny B wydziela się z surowego preparatu na drodze chromatografii kolumnowej z użyciem żelu krzemionkowego Silicagel 60,70-230 mesh firmy Merck oraz mieszaniny rozpuszczalników o składzie chloroform-metanol-woda w stosunku obj ętościowym 20:8:1. I tak 0.95 g surowego produktu zawiesza się w mieszaninie rozpuszczalników o podanym wyżej składzie, a jeśli napotka się trudności w rozpuszczaniu się produktu stosuje się mieszaninę o tym samym składzie, lecz zmienionym stosunku składników 10:6:1. Nierozpuszczoną część odwirowuje się, a supernatant nanosi się na kolumnę chromatograficzną i przemywa stosując podaną wyżej mieszaninę rozpuszczalników lecz w stosunku objętościowym 20:8:1. Eluat z kolumny analizuje się metodą chromatografu cienkowarstwowej na płytkach z sihcagelem stoując mieszaninę rozpuszczalników chloroform-metanol-woda w stosunku objętościowym 10:6:1. Płytki wizualizuje się odczynnikiem cerowym. Zbiera się frakcje o wartości R_f= 0,5-0,54 zawierające czystą N-metylo-N-D-fruktozylową pochodną estru metylowego amfoterycyny B. Połączone frakcje eluatu odparowuje się do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Suchąpozostałość rozpuszcza się w niewielkiej ilości Ν,Ν-dimetyloformamidu i wytrąca produkt nadmiarem eteru dietylowego, osad odwirowuje się, przemywa dwukrotnie eterem dietylowym i suszy w eksykatorze próżniowym. Otrzymuje się 0.137 g estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B oEj’^ - 1300 przy 382 nm w metanolu. Dowód struktury otrzymanego związku został podany w części opisowej. Aktywność przeciwgrzybowa związku względem Candida albicans określona metodą podaną w części opisowej wyraża się wartością IC₅₀ = 0.12 pg/ml, zaś toksyczność dla erytrocytów ludzkich określona według opisanej we wstępie metody wyraża się wartością EH₅₀powyżej 350 pg/ml. Dla porównania EH₅₀ dla wyjściowej amfoterycyny B wynosi 1.5 pg/ml. Dokładnej wartości EH₅₀ dla N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B nie można było określić, gdyż powyżej stężenia350 pg/ml związek jest już w warunkach metody testowej nierozpuszczalny

Przykład II

0.5 g kandydyny o E[°^ = 1175 przy 382 nm w metanolu 10.15 g D-glukozy rozpuszcza się w 10mlN,N-dimetyloformamiduimiesza się w temperaturze 37°C przez 36 godz. a dalej postępuje się analogicznie jak w przykładzie I. Otrzymuje się 0.43 g N-D-fruktozylokandydyny o Ejcl⁼ 1100 przy 382 nm w metanolu. Produkt poddaje się reakcji metylowania za pomocądiazometanu rozpuszczonego w eterze dietylowym w sposób analogiczny jak w przykładzie I. Uzyskuje się 0.4 g surowego produktu, z którego izoluje się czysty ester metylowy N-metylo-N-D-fruktozylokandydyny na drodze chromatografii kolumnowej według metody podanej w przykładzie I. Zbiera się frakcje zawierające czystą pochodną które w teście chromatografii cienkowarstwowej jak w przykładzie I wykazują R_f = 0.49-0.52. Po odparowaniu połączonych frakcji do sucha, rozpuszczeniu w niewielkiej ilości Ν,Ν-dimetyloformamidu, wytrąceniu osadu eterem dietylowym, odwirowaniu, przemyciu eterem dietylowym i wysuszeniu w eksykatorze próżniowym otrzymuje się 0.05 g estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozylokandydyny o Ej°^ = 1200 przy 382 nm w metanolu, IC₅₀ = 0.75 pg/ml i EH₅₀ powyżej 300 pg/ml. Strukturę związku określono metodami identycznymi jak w przypadku estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B.

Przykład III g nystatyny o Ej”^ = 870 przy 304 nm w metanolu i 0.6 g D-glukozy rozpuszcza się w 3 5 ml Ν,Ν-dimetyloacetamidu i w temperaturze 37°C miesza się przez 40 godz. Po przereagowamu wytrąca się surowy produkt, N-D-fruktozylonystatynę, za pomocą eteru dietylowego, odwirowuje i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie odmywa się nadmiar D-glukozy przez przemywanie osadu niewielką ilością wody i acetonu w stosunku objętościowym 1:1, następnie acetonem, eterem dietylowym i po odwirowaniu suszy w eksykatorze próżniowym. Otrzymuje się 1.2 g N-D-fruktozylonystatny o E}^ = 720 przy 304 nm w metanolu. Produkt poddaje się metylowaniu diazometanem tak jak w przykładzie I. Uzyskuje się 1.25 g surowego produktu, który oczyszcza się stosując chromatografię kolumnowąna żelu krzemionkowym jak w przykładzie I. Frakcje zawierające czysty ester metylowy N-metylo-N-D-fruktozylonystatynę o R_f= 0.65-0.67

180 253 w metodzie chromatografii cienkowarstwowej jak w przykładzie I, łączy się, odparowuje do sucha w temp. 30°C pod zmniejszonym ciśnieniem, rozpuszcza w niewielkiej ilości N,N-dimetyloacetamidu i wytrąca produkt eterem dietylowym, odwirowuje, przemywa eterem dietylowym i suszy w eksykatorze próżniowym. Otrzymuje się 0.17 g estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozylonystatyny o Ej^ = 900 przy 304 nm w metanolu. Strukturę związku ustalono według metody opisanej dla estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B. Dla otrzymanego związku określono IC₅₀ = 6.8 pg/ml i EH₅₀ powyżej 300 pg/ml.

Przykład IV

0.79 g wacydyny, głównego składnika kompleksu antybiotycznego aureofacyny, o E}°^ =900 przy 378 nm w metanolu i 0.22 g D-glukozy w 15 ml Ν,Ν-dimetyloacetamidu miesza się w temperaturze 37°C przez 18 godz. Po przereagowaniu mieszaninę reakcyjną schładza się i wytrąca osad za pomocą nadmiaru eteru dietylowego, odwirowuje, przemywa eterem dietylowym i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 0.8 g surowej N-D-fruktozylowacydyny ⁰ E]cm⁼ 720 przy 378 nm w metanolu. Otrzymaną pochodnąpoddaje się metylowaniu z zastosowaniem diazemetanu analogicznie jak w przykładzie I, uzyskując 0.5 g surowego preparatu. Czysty ester metylowy N-metylo-N-D-fruktozylowacydyny izoluje się na kolumnie chromatograficznej z żelem krzemionkowym podobnie jak opisano w przykładzie I z tym, że jako układ rozwijający stosuje się mieszaninę chloroformu, metanolu i wody w stosunku objętościowym 30'8'1. Zbiera się i łączy frakcje zawierające czystą pochodną wacydyny o Rf = 0.53-0.55 na chromatografii cienkowarstwowej z żelem krzemionkowym w układzie rozpuszczalników chloroform-metanol-woda w stosunku objętościowym 13:8:1. Dalej postępuje się jak w przykładzie ΙΠ. Otrzymuje się 0.07 g estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozylowacydyny o Efcm ⁼ 900 przy 378 nm w metanolu. Związek wykazuje IC₅₀ = 0.01 pg/ml i EH₅₀ = 170 pg/ml. Strukturę związku ustalono według metody opisanej dla estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B.

Przykład V

0.79 g kandycydyny D, głównego składnika kompleksu antybiotycznego kandycydyny, poddaje się postępowaniu identycznemu jak opisano w przykładzie IV. Otrzymuje się 0.1 g estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozylokandycyny D E}°^ = 920 przy 378 nm w metanolu. R_fzwiązku w chromatografii cienkowarstwowej w warunkach opisanych w przykładzie IV wynosi 0 49-0.52. Związek wykazuje wartości IC₅₀ = 0.01 pg/ml i EH₅₀ = 180 pg/ml. Strukturę związku ustalono według metody opisanej dla estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B.

Przykład VI

0.79 g głównego składnika kompleksu antybiotycznego trychomycyny poddaje się postępowaniu identycznemu jak opisano w przykładzie IV. Otrzymuje się 0.1 g estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozylotrychomcyny o Ej^ = 910 przy 378 nm w metanolu. R_f związku w chromatografii cienkowarstwowej w warunkach opisanych w przykładzie IV wynosi 0.49-0.52. Związek wykazuje wartości IC₅₀ = 0.013 pg/ml i EH₅₀ = 165 pg/ml. Strukturę związku ustalono według metody opisanej dla estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B.

Przykład VII

0.5 g amfoterycyny B o Ej^ = 1350 przy 382 nm w metanolu i 0.15 g L-glukozy w 8 ml Ν,Ν-dimetyloformamidu miesza się przez 40 godz. w temp. 37°C. Dalszy tok postępowania jest identyczny jak w przykładzie I. Otrzymuje się 0.065 g estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfoterycyny Β o E= 1280 przy 382 nm w metanolu. Związek wykazuje wartości IC₅₀= 0.42 pg/ml i EH₅₀ = ponad 200 pg/ml. Strukturę związku ustalono według metody opisanej dla estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B.

Przykład VIII

0.52 g amfoterycyny B o E{^ = 1350 przy 382 nm w metanolu 10.153 g D-mannozy rozpuszcza się w 10 ml Ν,Ν-dimetyloacetamidu i miesza przez 40 godz. w temp. 37°C. Dalej postępuje się jak opisano w przykładzie I. Czystą pochodną izoluje się metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym w sposób analogiczny jak w przykładzie I, zbierając frakcje o R_f = 0.5-0.53 w chromatografii cienkowarstwowej według metody opisanej wprzykładzie I. Dal

180 253 sze postępowanie jest identyczne jak opisano w przykładzie I. Otrzymuje się 0.08 g estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B o E¹^ =1210 przy 382 nm w metanolu. Związek wykazuje wartości IC₅₀ = 0.55 pg/ ml i EH₅₀ powyżej 200 pg/ml. Strukturę związku ustalono według metody opisanej dla estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloarnfotercyny B.

Przykład IX

0.5 g amfoterycyny B o Ej^, = 1350 przy 382 nm w metanolu i 0.3 g D-laktozy w 12 ml Ν,Ν-dimetyloformamidu miesza się w temp. 37°C przez 2 doby. Dalszy tok postępowania jest identyczny z opisanym w przykładzie I. Czysty związek izoluje się metodą chromatografii kolumnowej w sposób jak to podano w przykładzie I, zbierając frakcje eluatu wykazujące w chromatografii cienkowarstwowej w warunkach opisanych w przykładzie I Rf = 0.25-0.30. Otrzymuje się 0.08 g estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozylo-galaktozyloamfoterycyny B o Ej°^ = 1000 przy 382 nm w metanolu. Związek wykazuje wartości IC₅₀ = 6.0 pg/ml i EH₅₀ powyżej 200 pg/ml.

Przykład X

0.5 g estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B otrzymanego według przykładu I zawiesza się w 10 ml wody i do zawiesiny dodaje się 0.059 g kwasu L-asparaginowego rozpuszczonego w 2 ml wody. Roztwór kwasu dodaje się kroplami przy mieszaniu aż do momentu uzyskania roztworu. Otrzymany roztwór sączy się w celu usunięcia drobnej ilości pozostałej zawiesiny i do klarownego przesączu dodaje się nadmiar acetonu aż do kompletnego wytrącenia powstające soli. Powstały osad odsącza się lub odwirowuje i przemywa dwukrotnie acetonem, dwukrotnie eterem dietylowym i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymuje się 0.5 g L-asparaginianu estru metylowego N-metylo-N-D-fruktozyloamfotercyny B o E}^= 1100 przy 382 nm w metanolu. W chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym w rozpuszczalniku jak w przykładzie I R_f = 0.5-0.54. Produkt rozpuszcza się w N,N-dimetyloformamidzie, dimetylosulfotlenku, w 5% roztworze glukozy. W wodzie rozpuszcza się bardzo dobrze. Związek wykazuje wartości IC₅₀ = 0.125 pg/ml i EH₅₀ powyżej 350 pg/ml.

180 253

M—COOCH

H3C—N—CH2 θ ΗΟ^\ wzór 1 M—COOCH3 HoC—N—CHn ^ó I \ °\ ^H X) _ HO R/_ wzór 2 o^z Jb ^CH₃HO' O OH OH OH OH O^ II 1 1 1 1 B Jar U Λ JL 1 i 113 > OH OH wzór 3 OH HO^7 / / OH wzór 4

Ί ® Αθ — g / \YTVch₃ OH ν^-θπ ΠΒθΝγ· „ 6· OH Ί Ηθ\ζ~Ης^>Ι JL _xcooch₃ oh ^^OH

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Pochodne N-metylo-N-glikozylowe estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych o wzorze ogólnym 1, gdzie M oznacza resztę antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, zaś R oznacza fragment reszty cukrowej powstały w wyniku reakcji tego antybiotyku z mono lub oligosacharydem, korzystnie z D-glukozą lub L-glukozą lub D-mannozą lub D-galaktozą lub laktozą lub maltozą, z przegrupowaniem Amadori.
2. Pochodne według zastrz. 1, znamienne tym, że antybiotykiem z grupy makrolidów polienowych j est amfoterycyna B lub kandydyna lub kandydoina lub kandydynina lub mykoheptyna lub nystatyna lub polifungina lub aureofacyna lub wacydyna lub trychomycyna lub kandycydyna.
3. Sole pochodnych N-metylo-N-glikozylowych estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych o wzorze ogólnym 2, gdzie M oznacza resztę antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, zaś R oznacza fragment reszty cukrowej powstały w wyniku reakcji tego antybiotyku z mono lub oligosacharydem, korzystnie z D-glukozą lub L-glukozą lub D-mannozą lub D-galaktozą lub laktozą lub maltozą, z przegrupowaniem Amadori, zaś A oznacza anion kwasu organicznego lub nieorganicznego.
4. Sole pochodnych według zastrz. 3, znamienne tym, że antybiotykiem z grupy makrohdów polienowych jest amfoterycyna B lub kandydyna lub kandydoina lub kandydynina lub mykoheptyna lub nystatyna lub polifungina lub aureofacyna lub wacydyna lub trychomycyna lub kandycydyna
5. Sole pochodnych według zastrz. 3 albo 4, znamienne tym, że A oznacza anion kwasu L-asparaginowego.
6. Sposób otrzymywania pochodnych N-metylo-N-glikozylowych estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych o wzorze ogólnym 1, gdzie M oznacza resztę antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, zaś R oznacza fragment reszty cukrowej powstały w wyniku reakcji tego antybiotyku z mono lub oligosacharydem, korzystnie z D-glukozą lub L-glukozą lub D-mannozą lub D-galaktozą lub laktozą lub maltozą, z przegrupowaniem Amadori, znamienny tym, że otrzymane w wyniku reakcji przegrupowania Amadori N-glikozylowe pochodne antybiotyków z grupy makrolidów polienowych przeprowadza się w zawiesinę przez wytrącenie rozpuszczalnikiem, korzystnie eterem dietylowym, z roztworu tej pochodnej w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w Ν,Ν-dimetyloformamidzie, a następnie działa się roztworem eterowym diazometanu w obniżonej temperaturze korzystnie w zakresie -5°C do +5°C i miesza się, po czym surowy produkt reakcji izoluje się przez odparowanie rozpuszczalników i wytrącenie z zagęszczonego roztworu, korzystnie eterem dietylowym, stosowanym w nadmiarze, a następnie surowy produkt oczyszcza się znanymi sposobami.
7. Sposób otrzymywania soli pochodnych N-metylo-N-glikozylowych estrów metylowych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych o wzorze ogólnym 2, gdzie M oznacza resztę antybiotyku z grupy makrolidów polienowych, a R oznacza fragment reszty cukrowej powstały w wyniku reakcji tego antybiotyku z mono lub oligosacharydem, korzystnie z D-glukozą lub L-glukozą lub D-mannozą lub D-galaktozą lub laktozą lub maltozą, z przegrupowaniem Amadori, zaś A oznacza anion kwasu organicznego lub nieorganicznego, znamienny tym, że otrzymane w wyniku reakcji przegrupowania Amadori N-glikozylowe pochodne antybiotyków z grupy makrolidów polienowych przeprowadza się w zawiesinę przez wytrącenie rozpuszczalnikiem, korzystnie eterem dietylowym, z roztworu tej pochodnej w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w Ν,Ν-dimetyloformamidzie, a następnie działa się roztworem eterowym diazometanu w obniżonej temperaturze, korzystnie w zakresie -5°C do +5°C, i miesza się, po

180 253 czym surowy produkt reakcji izoluje się przez odparowanie rozpuszczalników i wytrącenie z zagęszczonego roztworu, korzystnie eterem dietylowym, stosowanym w nadmiarze, a następnie surowy produkt oczyszcza się znanymi sposobami, po czym otrzymaną pochodną w postaci osadu zawiesza się w niewielkiej ilości wody, dodaje się do zawiesiny kwas organiczny lub nieorganiczny w stosunku stechiometrycznym, a następnie z otrzymanego roztworu wytrąca się osad za pomocą nadmiaru rozpuszczalnika organicznego mieszającego się z wodą korzystnie acetonu, osad przemywa się, korzystnie acetonem, a dalej, korzystnie eterem dietylowym, i suszy się, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem.

* * *