DE1445471B2

DE1445471B2 - Verfahren zur herstellung von 5'-nucleotiden

Info

Publication number: DE1445471B2
Application number: DE19641445471
Authority: DE
Inventors: Shunji; Sowa Tsuneo; Yamada Hiraku; Tsunoda Kozo; Tokio; Kurihara Masakazu Warabi; Senoo Saburo Tokio; Ouchi (Japan)
Original assignee: Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1963-12-19
Filing date: 1964-12-18
Publication date: 1973-01-18
Also published as: GB1042839A; US3375244A; DE1445471A1; NL6414742A

Description

CH₃ CH₃

in der B den Rest einer in Nucleotiden üblichen Purin- oder Pyrimidinbase bedeutet, durch Umsetzen der entsprechenden 2',3'-IsopropyIidennucleoside mit Phosphoroxychlorid in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer organischen Base bei niedrigen Temperaturen und anschließender Behandlung mit Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Acetonitril, Nitromethan, Aceton, Dichlormethan oder Tetrahydrofuran als Lösungsmittel und in einem Molverhältnis von Ausgangsnucleosid zu organischer Base zu Phosphoroxychlorid wie etwa 1: (1 bis 3): (1,5 bis 3) bei Temperaturen bis höchstens 30° C ausgeführt wird.

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden (d. h. Nucleosid-S'-monophosphaten) der allgemeinen Formel Aceton, Dichlormethan oder Tetrahydrofuran Lösungsmittel und in einem Molverhältnis von A gangsnucleosid zu organischer Base zu Phosph oxychlorid wie etwa 1: (1 bis 3): (1,5 bis 3) bei Tem raturen bis höchstens 30° C ausgeführt wird.

Es ist bereits bekannt, 5'-Nucleotide der allgemein Formel I durch Phosphorylierung von entsprechenc Nucleosiden unter Verwendung von Phosphoro: chlorid herzustellen. So erhielten L e ν e η e u T i ρ s ο n. Journal of Biological Chemistry, 111 (192 S. 313 bis 323, 2',3'-Isopropyliden-inosin-5'-mor phosphat, indem sie 2',3'-Isopropyliden-mosin r. Phosphoroxychlorid unter Verwendung einer groß Menge Pyridin als Lösungsmittel phosphoryliem In analoger Weise erhielten Michelson und Tod Journal of the Chemical Society (1949), S. 2476 b 2486, 2',3 '-Isopropyliden-guanosin-S'-monophosph und ähnliche Verbindungen. Diese Verfahren sir jedoch nicht für eine Anwendung im industriell;. Maßstab geeignet, da sie die Verwendung groß Mengen des kostspieligen Pyridins erfordern, b Verwendung großer Pyridinmengen die Reaktion b niedrigen Temperaturen von etwa —20° C durc. geführt werden muß und die Ausbeute an 5'-Nucle tiden lediglich 20 bis 30% beträgt.

Es wurde nun gefunden, daß die Umsetzung zvsehen einem in 2',3'-Stellung durch die Isopropylide gruppe geschützten Nucleosid und Phosphorox chlorid in wirtschaftlicher, bequemer und nahei quantitativer Weise durchgeführt werden kann, wer. man an Stelle eines basischen Lösungsmittels Acet; nitril, Nitromethan, Aceton, Tetrahydrofuran od. Dichlormethan verwendet und dem Reaktionsgemisc eine kleine Menge einer organischen Base zusetzt.

In dem erfindungsgemäß verwendeten organische Lösungsmittel bleibt das als Ausgangsmaterial ve wendete Nucleosid in Suspension, während das a. Zwischenprodukt entstehende Nucleotid der allgi meinen Formel

(I)

CH₃ CH₃

in der B den Rest einer in Nucleotiden üblichen Purin- oder Pyrimidinbase bedeutet, durch Umsetzen der entsprechenden 2',3'-Isopropyliden-nucleoside mit Phosphoroxychlorid in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer organischen Base bei niedrigen Temperaturen und anschließender Behandlung mit Wasser. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Acetonitril, Nitromethan, CH₃ CH₃

gelöst wird. Diese organischen Lösungsmittel werdein einer Menge von nicht mehr als 5 1 je 1 Mol de als Ausgangsmaterial eingesetzten Nucleosids un. vorzugsweise in einer Menge von etwa 11 je Mc verwendet.

Um die Wirkung der Lösungsmittel im Vergleic mit erfindungsgemäß nicht brauchbaren Lösungsmit teln zu veranschaulichen, werden in der folgende: Tabelle die Ausbeuten an 5'-Guanylsäure (GMF Guanosin (Gs) und Guanin (Gn) in verschiedene: Lösungsmitteln gegenübergestellt, die sich auf Gruni der Analysen des Reaktionsgemisches nach Abtren nung der Isopropylidengruppe ergeben. Es wurde: jeweils 1 Mol 2',3'-IsopropyIiden-guanosin, 1 Mol Py ridin. 3 Mol Phosphoroxychlorid und 11 des en; sprechenden Lösungsmittels verwendet.

Tabelle	GMP	1	Gs	Gn	Unbe kannter Stoff
Verwendetes Lösungsmittel	94,9 84,3 93,8 82,4 0 8,5 21,3 36,6	2,5 12,1 3,7 13,9 93,5 82,3 70,5 11,2	2,1 1,5 1,5 2,0 6,5 9,5 6,3 1,8	1,5 2,1 1,0 1,7 0 0 1,9 50,4
Erfindungsgemäß geeignet Acetonitril Tetrahydrofuran .. Nitromethan Dichlormethan Erfindungsgemäß nicht geeignet Dimethylformamid Tetrachlorkohlen stoff
Toluol
Pyridin

Das Phosphoroxychlorid wird als Phosphorylierungsmittel in einer Menge von 1,5 bis 3,0 Mol je Mol des als Ausgangsmaterial eingesetzten Nucleosids verwendet. Eine Menge von weniger als 1,5 Mol führt zu einer zu geringen Ausbeute an den gewünschten 5'-Nucleotiden, während Mengen von mehr als 3,0 Mol keine besseren Ausbeuten bewirken und daher ohne Vorteil sind.

Als organische Base kann z. B. jedes beliebige tertiäre Amin verwendet werden; Pyridin liefert die besten Ergebnisse. Die verwendete Basenmenge beeinflußt die Reaktionsgeschwindigkeit. Die Base wird vorzugsweise in einer dem als Ausgangsmaterial eingesetzten Nucleosid (II) äquimolaren Menge verwendet. Auf jeden Fall soll jedoch die molare Menge der Base die molare Menge des Phosphoroxychlorids nicht überschreiten. Wenn die molare Menge der Base größer als die molare Menge an Phosphoroxychlorid ist, wird nicht nur die Reaktionsgeschwindigkeit beschleunigt, sondern es gewinnen auch konkurrierende Nebenreaktionen an Bedeutung, die sich dann lediglich durch eine starke Herabsetzung der Reaktionstemperatur unter Kontrolle halten lassen.

Die Wirkung der verwendeten Pyridinmenge, der bevorzugten organischen Base, läßt sich aus der folgenden Tabelle 2 ablesen.

Tabelle 2

ς,Η₅Ν/ροα₃ (Mol verhältnis)	C₅H₅NAGs (MoI- ^v verhältnis)	GMP (%)	Gs (%)	Gn (%)	Unbe kannter Stoff (%)
0	0	45,3	53,7	1,0	0
0,1	0,3	65,4	32,6	1,0	1,0
0,2	0,6	92,4	4,1	2,0	1,5
0,4	1,2	93,8	2,1	1,5	2,6
1,0	3,0	89,1	0,5	1,3	9,1
5,0	15,0	74,6	1,5	2,5	21,4

Anmerkung:

Es wurden jeweils 1 Mol 2\3'-Isopropyliden-guanosin, 3 Mol Phosphoroxychlorid und 1 1 Acetonitril verwendet, die Reaktion j wurde 2 Stunden durchgeführt. Die Ausbeuten an GMP, Gs und

' Gn ergeben sich wie in der Tabelle 1 nach Abspaltung der Iso-

: propylidengruppe. Die Reaktionsbedingungen zur Abtrennung der

Isopropylidengruppe sind denen des folgenden Beispiels 1 ähnlich.

j Die Verbindung wird in Wasser bei pH 2,0 bis 2,5 und 70 bis 8O⁰C

j 1 Stunde der Reaktion unterworfen.

Die gewünschte Phosphorylierungsreaktion läßt sich in einem Gemisch mit der oben beschriebenen mengenmäßigen Zusammensetzung bei einer Temperatur von —10 bis 30° C durchführen. Die erforderliche Reaktionszeit beträgt 30 Minuten bis 4 Stunden.

Die Tatsache, daß die erfindungsgemäß verwendeten Lösungsmittel einen ausgezeichneten Lösungsmitteleffekt bei der Umsetzung zwischen einem 2',3'-O-Isopropyliden-nucleosid und Phosphoroxychlorid ausüben, war bisher nicht bekannt Durch die Verwendung dieser Lösungsmittel ist es möglich, die Reaktion in nahezu quantitativer Weise bei Raumtemperatur durchzuführen, so daß die Reaktion leicht unter Kontrolle gehalten werden kann. Darüber hinaus können durch die Verwendung einer Base in einer bestimmten Menge die Reaktionstemperatur und Reaktionszeit in geeigneter Weise eingestellt werden. Auch bezüglich der Wiedergewinnung des verwendeten Lösungsmittels bestehen erfindungsgemäß gegenüber bekannten Verfahren Vorteile. Nach Phosphorylierung mit Phosphoroxychlorid muß nämlich das Phosphorylierungsgemisch mit Wasser gemischt werden, um folgende Reaktion einzuleiten:

Cl O

P-OH₁C

Cl

(Π)

HO O

Wasser \ || O

► P-OH₂C / \ B + 2HCl

HO

(D

Bei den bekannten Verfahren mit basischem Lösungsmittel wird dieses zurückgewonnen, indem zu der wäßrigen Lösung gemäß obiger Reaktion eine mehr als äquivalente Menge Natriumhydroxid zugegeben wird, um den bei der Reaktion gebildeten Chlorwasserstoff zu binden, wonach destilliert wird.

Die erfindungsgemäß erhältlichen 2',3'-Isopropyliden-nucleosid-5'-monophosphate(I) lassen sich unter geeigneten sauren Bedingungen zu den freien 5'-Nucleotiden hydrolysieren (siehe z. B. Anmerkung zu Tabelle 2) und stellen somit Zwischenprodukte zu deren Herstellung dar.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, in denen die Abspaltung der Isopropylidengruppe und die Isolierung der entstehenden freien 5'-Nucleotide nach üblichen Arbeitsweisen erfolgt.

Beispiel 1

20 ecm Acetonitril, 1,6 g (2OmMoI) Pyridin und 9,0 g (etwa 60 mMol) Phosphoroxychlorid werden miteinander vermischt und bei 0 bis 5° C gehalten. Zu der Mischung werden unter Rühren 6,5 g (20 mMol) 2',3'-Isopropyliden-guanosin gegeben. 1 Stunde später wird die Reaktionslösung in etwa 500 ecm eines Eis-Wasser-Gemisches gegossen. Diese wäßrige Lösung enthält das 2',3'-Isopropyliden-guanosin-5'-monophosphat in einer Ausbeute von 95%. Sie wird mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxyd versetzt, um den pH-Wert auf 2,0 bis 2,5 einzustellen, und zur Abspaltung der Isopropylidengruppe 1 Stunde auf 70 bis 80⁰C erhitzt. Die erhaltene wäßrige Lösung wird unter Rühren mit 35 g Aktivkohle versetzt, wonach filtriert und der Filterrückstand mit Wasser gewaschen wird. Die Aktivkohle wird in 300 ecm einer Lösung, die 2,8% Ammoniak und 10% Äthanol enthält, suspendiert, worauf gerührt und filtriert wurde. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt, wobei Ammonium-5'-guanylat erhalten wird. Die Ausbeute beträgt 6,5 g (90%), bezogen auf freie 5'-Guanylsäure.

Beispiel 2 ²S

Unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 wird an Stelle des Acetonitrile 25 ecm Dichlormethan verwendet, wobei 6,2 g (85%) 5'-Guanylsäure erhalten werden.

Beispiel 3

40 ecm Acetonitril, 18 g Phosphoroxychlorid und 3,2 g Pyridin werden miteinander vermischt und bei 0 bis 2°C gehalten. Das Gemisch wird unter Rühren mit 12,5 g 2',3'-Isopropyliden-inosin versetzt. 1 Stunde später wird das Reaktionsgemisch in 11 einer Eis-Wasser-Mischung eingegossen und der pH-Wert durch Zugabe einer Natriumhydroxydlösung auf 1,5 eingestellt. Diese wäßrige Lösung wird dann 2 Stunden auf 55° C erhitzt, um die Hydrolyse der Isopropylidengruppe durchzuführen. Nach Behandlung der Lösung mit etwa 60 g Aktivkohle wird mehrere Stunden gerührt und dann filtriert. Der Aktivkohle-Filterrückstand wird mit etwa 600 ecm einer Lösung, die 3% Ammoniak und 10% Äthanol enthält, vermischt und filtriert. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt und nach der Entfernung des Ammoniaks und des Äthanols mit einer geeigneten Menge Wasser versetzt. Diese wäßrige Lösung wird dann durch ein Kationenaustauschharz (H-Form) geschickt und die aus der Austauschersäule herausfließende Lösung mit einer Natriumhydroxydlösung auf den pH-Wert auf 7,7 eingestellt. Sodann wird bis zur Sirupkonsistenz eingeengt. Zu dem erhaltenen Sirup wird ein organisches Lösungsmittel gegeben und abkühlen gelassen, worauf schöne nadelförmige Kristalle erhalten wurden. Beim Abfiltrieren und Trocknen der Kristallabscheidung werden 14,4 g (92%) Dinatrium-5'-inosinat erhalten.

Beispiel 4

Ein Gemisch aus 40 ecm Nitromethan, 15 g Phc phoroxychlorid und 4,0 g Pyridin wird bei 0 bis 5' gehalten und unter Rühren mit 12,5 g 2',3'-Isopropy den-inosin versetzt. Nach 30 Minuten wird das Rea tionsgemisch in 800 ecm eines Eis-Wasser-Gemisch gegossen. Die nach der Entfernung des Nitromethar das sich am Boden des Geiaßes- abscheitjeti-?erhalter wäßrige Lösung wird in" der gleichen Weise wie i: Beispiel 3 weiterbehandelt, wobei 14,2 g (90,5%) E natrium-5'-inosinat erhalten werden.

Beispiel 5

Es wird unter den gleichen Bedingungen wie ir Beispiel 3 gearbeitet, doch werden an Stelle de 2',3'-Isopropyliden-inosins 12,3 g 2',3'-Isopropylider. adenosin verwendet, wobei 12,8 g (84%) Dinatriurr 5'-adenylat erhalten werden.

Beispiel 6

15 ecm Acetonitril, 3,0 g Phosphoroxychlorid un 1,2 g Pyridin werden vermischt und bei 5⁰C gehalter Zu der Mischung werden 2,9 g 2',3'-Isopropylider. uridin unter Rühren gegeben. Nach etwa 1 stündiger. Rühren wird das Reaktionsgemisch in 500 ecm eine Eis-Wasser-Mischung eingegossen. Danach wird ii genau der gleichen Weise wie im Beispiel 3 weiter gearbeitet. Es werden 3,2 g (86%) Natrium-5'-uridyla erhalten.

Beispiel 7

30 ecm Aceton, 12,0 g Phosphoroxychlorid und 4 l Triäthylamin werden miteinander vermischt und be 5° C gehalten. Zu dem Gemisch werden unter Rührer. 13,0 g 2',3'-Isopropyliden-guanosin gegeben. Nach etwa 2stündigem Rühren wird das Reaktionsgemisch in 11 eines Eis-Wasser-Gemisches gegossen, wonach in genau der gleichen Weise wie im Beispiel 1 weitergearbeitet wird. Das auf diese Weise erhaltene Ammonium-5'-guanyIat wird in 500 ecm Wasser gelöst unc die Lösung mit einer wäßrigen Bariumacetatlösune versetzt. Es wird über Nacht stehengelassen und der gebildete Niederschlag abfiltriert und getrocknet, wobei 16,2 g (84%) Barium-5'-guanylat erhalten werden.

Beispiel 8

20 ecm Tetrahydrofuran, 9 g Phosphoroxychlorid und 1,6 g Pyridin werden miteinander vermischt und bei 5°C gehalten. Zu dem Gemisch werden unte: Rühren 6^2 g 2',3'-Isopropyliden-inosin gegeben. Nach lstündigem Rühren wird das Reaktionsgemisch ir 500 ecm kaltes Wasser eingegossen. Die wäßrige Lösung wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 2 weiterbehandelt, wobei 6,6 g (84%) Dinatrium-5'-inosinat erhalten werden.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden der allgemeinen Formel I

HO O

\ll ο

P-OH,C / \ B

/
HO