DE2026040C3 - Imidazolribosylcyclophosphate - Google Patents

Description

(H)

in der X die Bedeutung CO oder SO₂ hat, umsetzt und danach das Produkt mit starker Lauge erhitzt, die so erhaltene Carbonsäure gegebenenfalls in üblicher Weise verestert oder in das Amid überfuhrt, oder lnosin-2'-O-acetyl-3': 5'-monophosphat in einem polaren organischen Lösungsmittel mit einem Metallhydrid und dann mit Chlordimethylälher umsetzt und das erhaltene N'-Methoxymethylinosin-2'-O-acetyl-3':5-monophosphat mit starker Lauge erhitzt, oder AICAR-5'-phosphat mit Morpholino - N,N - dicyclohexylcarboxamidiniumsalz in Pyridin-Wasser-Gemisch löst, das Wasser durch Erhitzen entfernt und die Pyridinlösung mit Dicyclohexylcarbodiimid bei erhöhter Temperatur umsetzt.

3. Verwendung der Verbindung gemäß Anspruch 1 als antilipolytisch wirkendes Mittel.

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen definierten Gegenstand. Das phosphorsäurefreie Grundgerüst mit R = Wasserstoff ist unter der Kufzbezeichnung AICAR bekannt. Zur Vereinfachung Werden daher die erfindungsgemäßen Verbindungen im folgenden als ÄfCARO^S'-cyclophosphate bzw. -V:S^monophosphate (AICAR-3': 5'-MP) bezeichnet.

Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen simd

AlCAR-3':5'-r00Bophosphal(R = H),

Carboxyäthyl-AiCAR-3': S'-monophosphat
(R = (CH₂J₂- COOH).

SuifonyIoxyäthyi-AICAR-3': 5-monophosphait (R=(CHj)₂-SO₃HJ,

Carboxypropyl-AICARO': 5'-monophosphat
(R = (CHj)₃-COOH),

Carboxyathylmetfaylat-AICAR-3': 5-monophosphat (R = CHj)₂ — COOCH₃),

CarboxyäthylhexyIat-AICAR-3': S'-monophosphat (R = (CHj)₂-COO- Hexyl),

Propionamidocarboxyäthyl-AICAR-3': S'-monophosphat (R = (CH₂)J-CONHC₃H₇),
¹S Carboxvpropylmethylat-AICAR-3':5'-MP.

Carboxypropylhexyiat-AICAR-S':5-MP und

Propionamidocarboxypropyl-AICAR-3':5'-MP.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden aus-

gehend von Inosin-3': 5'-monophosphat oder einem

in Stellung 2' acylierten Derivat unter Spaltung des

Purinringes zum entsprechenden 4-Imidazol-5-aininocarboxamiddenvat hergestellt.

Bei den Verbindungen der Formel II handel» es sich um Lactone bzw. Sultone wie Propiolacton. Butyrolacton, Propiosulton und Butyrosulton.

Die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zweckmäßig bei Temperaturen zwischen O und 50 C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt. Zur Umsetzung w ird ein inertes Lösungsmittel verwendet, vorzugsweise Dioxan.

Die 7weite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch Erhitzen in Alkalilauge durchgeführt. Dauer und Temperatur der Umsetzung hängen von der Konzentration der verwendeten Lauge ab. die zwischen etwa 0.2 und 5,0 N, vorzugsweise 0.5 bis 2 N. liegen kann.

Die Reinigung wird zweck mäßig auf einem Anionenaustauscher. beispielsweise einem schwachbasischen

Anionenaustausch, vorgenommen.

Zur Herstellung der Verbindung der allgemeinen Formel I, in der R ein Wasserstoffatom darstellt, wird Inosin-2'-O-acetyl-.V: 5'-monophosphat in einem polaren organischen Lösungsmittel zuerst mit einem Metallhydrid in mindestens äquimoiarer Menge und dann mit Chlort'^wethyläther umgesetzt und das erhaltene N ■ - Methoxymethylinosin - 2 - O - acetyl-3': 5-monophosphat mit Alkalihydroxyd erhitzt.

Als Lösungsmittel wird vorzugsweise Dimethylformamid verwendet. Als Metallhydride kommen die üblicherweise für Hydrierungen verwendeten Verbindungen, wie z. B. Lilhiumhydrid, Lithiumaluminiumhydrid, Kaliumhydrid, in Frage. Bevorzugt wird Natriumhydrid. Die Umsetzung mit dem Metallhydrid und mit dem Chlordimethyläther wird bei Temperaturen zwischen O und 50 C. vorzugsweise bei Raumtemperatur, durchgeführt.

Die alkalische Erhitzung, bei der eine Ringöffnung stattfindet, wird zweckmäßig in einem niedrigen Alkohol oder Keton als Lösungsmittel durchgeführt. Die Hydrolyse erfolgt vorzugsweise durch Erhitzen zum Rückfluß.

Die Reinigung des erhaltenen Produktes kann nach üblichen Reinigungsverfahren erfolgen. Zweckmäßig

wird über einen Ionenaustauscher Chromatographien.

Alternativ werden die Verbindungen der allgemeinen

Formel I mit R = Wasserstoff hergestellt, indem man AICAR-5'-phosphat mit Morpholino-N.N-dicyclo-

aoxamidioiuinsalz in c'oem Pyridin-Wasser-B löst, das Wasser entfernt und die erhaltene

mit mindestens 2 Moläquivalenten Dicyclorbodiiaiid bei erhöhter Temperatur umsetzt.

weise wird das Wasser durch Eindampfen nt uad die Umsetzung in der Siedehitze durch-

, Reinigung des Produktes erfolgt zweckmäßig & Abtrennung des gebildeten Dicyclohexylharn- MS aus konzentrierter wäßriger Lösung und Reinibas über Ionenaustauscher.

^e erfindungsgemäßen Verbindungen beeinflussen ^L Lipolyse und zeigen hierbei eine ausgeprägte Irtüipolytische Wirkung, die bei Applikation eine üutllche Senkung des Gehaltes an freien Fettsäuren Lie des Gesamtglycerins im Blut bewirkt. Eine -artige Wirkung konnte bei der chemisch nächsthenden bekannten Verbindung, dem AICAR, nicht efunden werden.

MDie antüipolytische Wirkung zeigt sich sowohl η vitro wie auch in vivo, ohne daß hierbei eine Aktivierung der Lipolyse beobachtet wird, die bei bekannten antüipolytischen Substanzen zumeist auf-

^triAls antilipolytisch wirksam werden solche Substan-

bezeichnet, die die natürlich ablaufende Lipolyse zu hemmen vermögen. Als Folge tritt eine Senkung der Lipidkonzentration im Blut ein. Diese Wirkung ist durch die Inhibierung der Arteriosklerose therapeutisch und präventiv von hohem Interesse.

Line antüipolytische Wirkung war bisher bei etlichen Nucleosiden, insbesondere Adenosin. bekannt. Bei überführung dieser Nucleoside in die korrespondierenden Nucleotide geht gewöhnlich die antüipolytische Wirkung verloren. Nur ausnahmsweise wurde gefunden daß auch das Nucleotid noch eine, wenn auch sehr verringerte, antüipolytische Wirkung aufweist

Demgegenüber weisen die den erhndungsgemaßen Nucleotiden zugrunde liegenden Nucleoside keinerlei antüipolytische Wirkung auf, so daß die antihpolyti-Se Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen äußerst überraschend ist und auf einen anderen Wir-TunSm^hanismus als bei den bisher bekannten antilipolytisch wirksamen Nucleosiden bzw. zugehörigen Nucleotiden zurückzuführen ist. Be. den bisher bekannten antilipolytisch wirksamen Substanzen cr-Sgte eine EiniiAung bei der überführung von ATP vermittels Adenylcyclase zu Adenos.n-3:5-cycloohosphat. Bei gleichzeitiger Aktivierung mit Adenosin-V s-cyclophosphat tritt keine Linolysehemmung mehr auf Die erfindungsgemäßen Verbindungen wirken demgegenüber auch bei gleichzeitiger Aktivierung mi, Adenosin-3:5-cyclophos_Phat »niiliHyiiJch und können daher als Arzneimittel auch in solchen Fallen terwendet herden, in denen die bisher bekannten Sipolytisch wirksamen Nucleoside und Nucleotide versag. .>.» -ssen. Die Wirkung der erhndungsgemaßen Verbindungen in dieser Hinsicht ist darauf zuruckzufuh.cn daßsiedievonAdenosin-35-cyclophosphal ; geheuerte überführung von inaktiver Lipase in aktive aktiviert. Die in 30 Minuten freigesetzten Fettsauren wurden extrahiert und nach D ο 1 e und M ei η e r t ζ (J. BioL Chem., 235, 2595 [I960]) «nert .Eine antilipolytische Wirkung wird durch Verminderung der Lipolysegeschwindigkeit festgestellt. .

Die folgende Tabelle I zeigt, auf wieviel Prozent die Lipolvsegeschwindigkeit durch Zusatz der ernndungsgemäßen Verbindungen vermindert wird, wobei diedtrchi^J'-O-Dibutyryl-AO-S'-MPbzw.Adrena-

Hn stimulierte Lipolyse auf 100%, die Spontanlipolyse als Blindwert auf 0% gesetzt wird.

Tabelle I
a) Rizack-System

Substanz

AICAR-3': 5'-monophosphat

Zum Vergleich:
AICAR

95%

100% b) Rodbell-System

Substanz

10 * M

60%

I 10 "M	105M
100%	100%
20%	20%
I 85%	70%
	80%
	45%
	28% !

10 ^JM

40%

20°

32%

%TSsfw?de in vitro im homogenen System J* RiTack (J. Biol. Chem 239, 39|Ϊ [1964]) sowie in isolierten Fettzellen nach Rod bell (J. »'o·· Chem 239, 375 [1964]) gemessen. Durch Zusatz von™' ΙΟ"" N^ft,2'-O-Dibutyryl-adenos.n-3':5'-monophosphat (beim Rizack-System) bzw. 1 & 'ml Adrena-SnSm Rodbeli-System) wurde die Lipolyse maximal AICAR-3':5'-mono-

phosphat

Carboxyäthyl-AICAR-

3': 5'-monophosphat

Carbomethoxyäthyl-AlCAR-3':5-mono-

phosphat

Propionamidocarboxy-

äthyl-AlCAR-

3':5'-monophosphat
Sulfonylpropyl-AICAR-

3': 5'-monophosphat
Carboxypropyl-AICAR

3': 5-monophosphat

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

AICAR-3':V-MP; R = H

a) 4,8mMol = 1.625g AlCAR-5-Phosphorsäure und4,8mMol = l^gMorpholino-KN-dicyclohexylcarboxamidiniumsalz werden zusammen in 15 ml Pyridin und 2 ml H₂O gelöst. Die erhaltene Lösung wird eingedampft, 3mal mit je 15 ml Pyridin zur Trocknung eingeengt und der Rückstand in 500 ml wasserfreiem Pyridin gelöst.

b) Im 2-1-Kolben werden 500 ml Pyridin vorgelegt, 9,6 mMol = 2 g Dicyclohcxylcarboxamid werden zugesetzt und die Mischung zum Rückfluß erhitzt. Die nach a) erhaltene Lösung wird nun im Laufe von 3,5 Stunden zugetropft. Die klare Reaktionslösung wird weitere 3 Stunden nachgekocht.

Dann wird das Pyridin nahezu vollständig abdestilliert, der Rückstand mit 50 ml H₂O versetzt, vom abgeschiedenen Dicyclohexyl-Harnstoff abgesaugt und der Filterrückstand 3mal mit H₂O gewaschen. Nach erneutem Eindampfen, Filtrieren und Extrahieren mit Äther wird die wäßrige Phase auf Dowex 1 χ 2 in Forrhiatform gezogen und mit verdünnter Ameisensäure eluiert. Das saure Eluat wird eingedampft.

«lter Abscheidung von krist- AICAR-3';5':MP. Das ijistallisat wird abzentrißjgiert, 2mal mit je 1 ml eiskaltem H₂O, abschließend lmal mit Alkohol gewateten und über P₂O₅ im Vakuum getrocknet. Man erhall so 275 mg = 18% der Theorie der öbengenanntea Verbindung in Form eines schvachrosastichigen kristallisierten Produktes von* Fp. (nach Braun-

Molgewicht:;
Elementaranalyse für C₉H₁₂O₇N₄P:

Berechnet ... C 33,9, H 3,8, N 17,5, P 9,7%;
gefunden .... C 33,7, H 4,0, N 17,2, P 9,4%.

Beispiel 2

AICAR-3':5'-MP durch Spaltung von
Inosin-3':5'-MP;R = H

al Darstellung von Inosin-2'-O-acetyl-3':5-MP

10 g Inosin-3':5 -MP- in Form der freien Säure werden in 300 ml Pyridin. 8,5 g Triäthylamin und 18,7 g Essigsäureanhydrid gelöst und anschließend 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die gelbe Lösung wird zum öligen Rückstand konzentriert, mit etwa 200 g Eis versetzt und anschließend bis zur Trockne eingedampft. Dieser Vorgang wird noch 2mal mit je 100 g Eis wiederholt. Der Rückstand wird in etwa 300 ml Wasser aufgenommen, amgeäthert, mit einem Asbestflocken-Filterhilfsmittel geklärt und anschließend gefriergetrocknet. Die erhaltene Substanz wird über P₂O< im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 14,4g Inosin-3':5'-MP-2'-O-acetyl-triäthylammoniumsalz (100% der Theorie).

b) Umsetzung von Inosin-2'-O-acetyl-3':5-MP mit NaOH und Chlordimethyläther

14,4 g Inosin-2'-O-acety)-3':5'-MP <|MGW 471, 30,SmMoI) werden in 300 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst und mit 1,6 g NaH (50% öldispersion, 30,5 mMol + 10% Überschuß) 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die DMF-Phase mit 49 g Chlordimethyläther versetzt und 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Chromatogramrr (Äthanol/1-m NH₄-Acetat 5:2. pH 7) zeigt quantitative Umsetzung zu N'-Methoxymethylinosin-3': 5'-M P. Das Reaktionsgemisch wird anschließend an der Ölpumpe bei 50 C Badtemperatur bis zur Trockne eingeengt. Der ölige Rückstand wird in 200 ml 2 n-KOH versetzt und anschließend die Lösung 30 Minuten unter Rückfluß gekocht, wobei unter Ringspaltung der Methoxymethylrest und das C-Atom in Stellung 2 eliminiert werden.

Die heiße, alkalische Lösung wird sofort mit etwa 200 ml Wasser versetzt, gekühlt und mit Dowex-50 H⁺-Austauscher der pH-Wert auf 3 bis 4 gebracht. Der Ionenaustauscher wird abgesaugt, mit Wasser extinktionsfrei gewaschen; die vereinigten Filtrate werden stark eingeengt.

Das erhaltene Konzentrat wird anschließend bei pH 4 bis 5 über eine Kohlesäule entsalzt und mit Äthanöl/H₂Ö/NH₃ = 10:10:0,06 eluiert Das konzentrierte Kohleeluat wird anschließend an Dowex 1x2 „in Formiatform (50 bis 100 mesh,, 250 ml Austauschvolumen) chromatographiert, Dk Verunreinigungen werden mit 0,05 bzw. 0,1 η-Ameisensäure ausgewaschen. AlCAR-3':5'-MP wird dann mit 0,5 n-Ameisensäure von dsr Säule eluiert. Das Eluai wird bis auf 30 bis 50 ml konzentriert, mit etwa 20 m! Alkohol versetzt und über Nacht bei 4 C im Kühlschrank auskristallisieren gelassen. Die Kristalle werden abgesaugt und im ölpumpenvakuum bei Raumtemperatur getrocknet.

Ausbeute: etwa 5 g AICAR-3':5'-MP (54% der Theorie).

Das Produkt ist identisch vext dem nach Beispiel 1 gewonnenen.

Beispiel 3

Carboxyäthyl-AICAR-3':5'-MP; η = 2; A = COOH

500 mg Inosin-3':5'-MP (1,4 mMol) werden mit verdünnter KOH neutralisiert und in einem Gemisch von 15 ml K₂CO₃ und 15 ml Dioxan unter Rühren mit 1,5 ml Propiolakton versetzt und 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird mit Perchlorsäure auf pH 3 eingestellt, das ausgefallene Kaliumperchlorat abfiltriert und mit 95°oigem Äthanol gewaschen. Filtrat und Waschlösung werden eingedampft, der Rückstand mit 15 ml Wasser aufgenommen, mit 1 N-KOH der pH-Wert auf 7 eingestellt und das gleiche Volumen an 1 N-Kalilauge zugesetzt. Anschließend wird 30 Minuten auf 100 C erhitzt und mit Dowex 50 H⁺ auf pH 7 gebracht. In der Regel findet man einen fast quantitativen Umsatz. Zur Nachreinigung wird die Lösung auf eine Säule mit Diäthanolaminoäthylgruppen enthaltendem Ionenaustauscher auf Dextranbasis (25 χ 2,5 cm) in Acetatform aufgezogen und mit einem linearen Gradienten von 1 1 Wasser, 1 1 0,5-m Ammoniumacetat. pH 6, eluiert. Nach einigen kleineren Vorgipfeln folgt der Hauptgipfel, der etwa 90% des gesamten UV-absorbierenden Materials beinhaltet. Nach Entsalzung durch Absorption an Aktivkohle und Elution mit Äthanol/H₂O/NHj = 50: 50:1 werden 450 mg (etwa 80% der Theorie) an chromatographisch reinem Carboxyäthyl-AlCAR-3':5'-MP-Ammoniumsalz erhalten Die Eigenschaften zeigt Tabelle II.

Das Verfahren wurde unter Verwendung von Propiosulfon bzw. Butyrolakton an Stelle von Propiolakton wiederholt, wobei die entsprechenden Sulfonyloxypropyl- bzw. Carboxypropylverbindungen erhalten wurden.

Beispiel 4

Carbomethoxy-äthyl-AICAR-?':5'-MP; 11 = 2;
A = COOCH₃

10* Extinktionseinheiten (bei 268 nm) von Carboxyäthyl-AlCAR-3':5'-MP-Pyridiniumsalz werden an der ölpumpe mit 2mal 2C ml trockenem Pyridin wasserfrei gemacht, der Rückstand in 10 ml trockenem Methanol gelöst und 550 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur werden 25 ml Wasser zugesetzt, nach 30minütigem Stehen bei Raumtemperatur wird ausgeäthert und die wäßrige Phase klarfiltriert. Das Produkt wird über Dowex 50 in Natriumform in das Natriumsalz überführt und anschließend gefriergetrocknet.

Ausbeute: 350 mg (etwa 94% der Theorie).

Die Eigenschaften zeigt Tabelle II.

Beispiel 5

Propionamidocarboxyäthyl-AICAR-S': 5-M P; η = 2; A = CONHC₃H₇

hydrochlorid 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das entstandene Propionamido-Derivat wird auf s Whatman Nr. 3 MM-Papier im Laufmittel Isopropa-250 mg Carbomethoxy-äthyl-AICAR-3': 5'-M P wer- nol/Wasser/Ammoniak = 7:2:1 gereinigt,
den mit 1 ml n-Propylamin und 30 mg n-Propylamin- Die Eigenschaften zeigt Tabelle 11.

Tabelle II

	Neutral	max.	P	min.	max.
Verbindung	O1OS-Ri 1	262,5	225	265
			245
Carboxyäthyl-AI CAR	263,5	223,5	266
S': 5'-MP			245,
Carbomethoxyäthyl-	263.5	221,5	266,
AlCAR-3':5'-MP			245
n-Propionamido-carboxy-	262.5	227,5	262
äthyl-A!CAR-3':5'-MP			245
Sulfonyloxypropyl-
A1CAR-3':S'-MP I

Sauer 0,1 η-HO

Alkalisch 0.1 n-NaOH

254
220

254
219,5

253,5
217,5

257
226

max.
264

264,5
265,5
262,5

mm.

222.5

235,5

Verbindung

Carboxyäthyl-AICAR-

3':5'-MP

Carbomethoxyäthyl-AICAR-

3':5'-MP

n-Propionamidocarboxyäthyl-

AICAR-3':5'-MP

Sulfonyloxypropyl-AICAR-

3':5'-MP

260

0,81 0,81 0,81 0,79

neutral 280 260

0,54 0,60 0,61 0,56

UV-Quotienten

290 260

0,14 0,20 0,19 0,20

	sauer
250	280
260	260
0,98	0.73
0,98	0,73
058	0,79
LO	0,71

290 260

0,31 0,34 0.35 034

tkktroph. Mobilität

1,80 0,92 0,86 1,87

Chromat. in Lösungsmittel A

0.25 0.75 0,78 0,39

Claims (2)

1. Patentansprüche:
   1. lioidazolribosylcydophosphat« der Formell

   O
   R—NH-C

   H₃N

   in der R ein Wasserstoffatom oder der Rest (CH₂), —A sein kann, worin η die Zahl 2 oder 3 und A die SO₃H-, COOH-, COOR'- oder die CONHCjH₇-Gruppe bedeutet und R' eine C,- bis Q-Alkylgruppe darstellt.
2. 2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Inosin-3': 5'-monophosphat mit einer Verbindung der Formel II