DE1595866A1 - Verfahren zum Reinigen von Flavin-Adenin-Dinucleotid - Google Patents
Verfahren zum Reinigen von Flavin-Adenin-DinucleotidInfo
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Description
NWALT
Andrejewski Essen, den Jl. August 1966
Kettwiger Str. 36 (26 968/C-(
tbhhi
hn
TelefoQ
Patentanmeldung der Firma
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.,
No. k r 1 -chome >
Oiite «maehi, Chiyoda-ku,
Tokyo-to - J a p a n -
Verfahren zum Reinigen von Flavin-Adenin-Dinucleotid.
Vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum
Reinigen von Flavin-Adenin-Dinucleotid, aus deren wässriger
Lösung, besonders einer solchen wässrigen Lösung, die noch
Verunreinigungen, wie Proteine, Aminosäuren und/oder iiucleinsäurederivate enthält.
Es ist nun Gegenstand der Erfindung ein solches Verfahren g
zu schaffen, das für eine industrielle Verwendung geeignet
und wirtschaftlicher ist als vorher bekannte Verfahren.
Flavin-Adenin-Dinucleotid ist in vielen Substanzen vorhanden,
die in verschiedenen enzyraatischen Reaktionen im
lebenden Körper wichtig sind, es stellt eine der biologisch ,
aktiven Formen des Vitamins Bg (Riboflavin) dar. Flavin- ;
Adenin-Dinucleotid ist sowohl als Medikament wie auch als ·
Zusatzmittel zu Nahrungs- und Futtermitteln verwendet wor- ;
den. -- - . \
BAD OBiGiNAL
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Es ist beobachtet worden, daß Flavin-Adenin-Dinucleotid mit
Hilfe von Anionen-Austauscherharzen gereinigt werden kann.
Diese Methode zum Heinigen von Flavin-Adenin-Dinucleotid leidet jedoch an Nachteilen, wie einer zu geringen Ausbeute, Gefahren
bei der Herstellung und einer zu geringen Reinheit des erhaltenen Flavin-Adenin-Dinucleotids, außerdem an Sehwierigkeiten
beim Abtrennen der Verunreinigungen, z. B. der Nucleinsäuren, von dem gereinigten Flavin-Adenin-Dinucleotid, einer
möglichen Durchsetzung mit großen Mengen organischer Salze und einer Zersetzung des Flavin-Adenin-Dinucleotids.
Verfahren zum Reinigen von Flavin-Adenin-Dinucleotid mit Hilfe eines Kationen-Austaüscherharzes sind mit Ausnahme der Verwendung
eines schwach sauren Ionenaustauscherharzes vo» Carbonsäuretyp (Biochimica et Biophyeica acta, 16 - 424 (1955)) bisher
noch nicht vorgeschlagen worden. Jedoch ist diese Methode im industriellen Ausmaß nicht zur Verwirklichung geeignet, da
jeweils in einem bestimmten Zeitraum nur geringe Flavin-Adenin-Dinucleotid-Mengen
behandelt werden können. Ein verbessertes Verfahren zua Reinigen von Flavin-Adenin-Dinucleotid unter Verwendung
von Aktiv-Kohle und saurer Tonerde (terra alba) ist in
der japanischen Patentanmeldung 13944/1964 enthalten« aber derartige
Adsorbentien, wie Aktivkohle und Tonerde (terra alba) sind für industrielle Zwecke nicht geeignet, weil diese Mater!·
allen im allgemeinen nicht im großen Ausmaß behandelt werden können und sich auch noch verschiedene andere Probleee einstellen,
wenn sie Industriell verwendet werden sollen.
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Bs ist nun ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zum Reinigen von Flavin-Adenin-Dinucleotid
aus wässrigen Lösungen asu schaffen unter Anwendung eines Kationen«
Austausoherharzesj welches zur Reinigung von Flavin-Adenin-Dinu«
oleotld aus rohen, wässrigen Lösungen, wie z. B. Cell-Extrakten,
Feranentationsnährlösungen, FiItraten und dergl. besonders geeignet
ist. ' "
QemäS der vorliegenden Erfindung besteht das Verfahren zum Reinigen
von Flavin-Adenin-Dinucleotid in wässriger Lösung darin,- daß das Flavin-Adenin-Dinucleotid von einem phenolischen Kationen-Austausoherharz
bei einem pH von 1,0 bis 3,0 adsorbiert wird und daS sian das adsorbierte Flavin-Adenin-Dinucleotid mit einer
w&serigen Elulerlösung beim pH 3 - 10 elulert. Das Flavin-Adenin-Dinucleotid
wird dann in geeigneter Welse von dem erhaltenen Sluat abgetrennt.
Das Flavin-Adenin-Dinucleotid wird beim pH 1 - 3 adsorbiert. Dann ■
wird das Kationenaustauscherh&rz vorzugsweise mit einer wässrigen
Säurelösung oder einer wässrigen sauren Salzlösung gewaschen,bis "
im Wasohwaseer keine wesentliche Färbung (oder bedeutende UV-Absorption)
raehr beobachtet wird. Eine wässrige HCl- oder NaCl-LÖsung
wird für diesen Zweck besonders bevorzugt.
Das Flavin-Adenin-Dinucleotid wird darauf mit einer wässrigen
Eluierlösung vom pH 3,0 bis 10,o zwecks Erhalt einer wässrigen,
das gereinigte Flavin-Adenin-Dinucleotid enthaltenden Lösung eluiert. Das für diese Sluierung verwendete wässrige Medium
kann - falls gewünscht - ein organisches Lösungsmittel enthalten.
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Bevorzugte phenolische Kationen-Austauscherharze für das beanspruchte Verfahren sind z. B. solche mit Sulfonsäuren und
Methylsulfonsäureresten (wie Duolite C~5, Duolite C-I, Duolite
C-IO, Handelsnamen für-Kationen-Austauscherharze der Chemical
Process Co., USA - oder Dowex-30, ein Handelsname für ein Kationen-Austauscherharz der Dow Chemical Co., USA.).
Nach dem Eluieren des Flavin-Adenin-Dinucleotidskann das Kationen-Austausoherharz mit einer sauren oder alkalischen wässrigen
Lösung regeneriert werden, um das Harz ζ. B. in seine freie oder
in seine Na- oder NHh-Salz-Form überzuführen. Die Kationen-Austausoherharze sind sowohl in der freien wie auch in der Salz- -form geeignet, Flavin-Adenin-Dinucleotid zu adsorbieren, aber
da zur Erlangung guter Ausbeuten die Vermeidung einer Zersetzung des Flavin-Adenin-Dinucleotids wichtig ist, so wird die Salzform,
insbesondere die Na- oder NHj.*iSalz-Form vorgezogen. Obwohl die zu
reinigende Flavln-Adenin-Dinucleotid-Lösung durch irgendeine der
konventionellen Reinigungstechnik/enmit einem Austauscherharz
behandelt werden kann, ist es vorteilhaft, das Harz in eine
Kolonne zu packen, durch die man die Flavin-Adenin-Dinucleotid»
" Lösung hindurchschickt; denn auf diese Weise kann man beim Adsorbieren, Eluieren und Regenerieren bessere Ergebnisse erzielen.
Ehe man die wässrige Flavin-Adenin-Dinucleotid-Lösung die Harzkolonne passieren läßt, stellt man das dH.auf 1,0 bis3*0 ein.
Dieser pH^iert ist wichtig, da einnielirifererpH-Wert nachteilig für ein Durchsickern von,Flavin-Adenin-Dinucleotid durch die
Kolonne ist ι wKhrend ein höjwrer pH-*fer^ vermifdej^ werden muß,
um d|ie-fStabilität des. erlia^enen^jyj^n^de^^^ zu
gewährleJ-sten. Auch können,lingenügenje^ i
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Mengen durch das phenolische Kationen-Austauscherharz adsorbiert werden, wenn der pH-Wert der Lösung größer als 3,0 ist. Daher hat
die mit dem Harz behandelte Flavin-Adenln-Dinucleotid-haltige Lösung ein pH von etwa 1,0 bis 5,0, vorteilhaft von etwa 1,0
bis 2,5, Es wurde dabei gefunden, daß die Anwesenheit von gewissen
Mengen an Kationen in der Flavin-Adenin-Dinucleotid-Lö·»
sung die Abtrennung des Flavin-Adenln-Dinucleotide von den anderen
Verunreinigungen, wie z. B. den Nucleinsäure-Derivaten, erleichtert.
Aus diesem Grund wird vorzugsweise ein anorganisches
Salz, wie NaGl oder NH^Cl, in der wässrigen Flavin-Adenin-Dinucleotid-Lösung
gelöst, ehe sie mit dem Harz in Kontakt kommt. Das Salz kann z. B. in die wässrige Lösung mit einer Konzentration
von ca. 1 Mol/Liter eingebracht werden.
Unter den für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Eluiermitteln
gibt Wasser besonders gute Ergebnisse, weil in dem Falle
die danach erhaltenen Flavin-Adenin-Dinucleotid-Lösungen wenig
oder keine'anorganischen Salze enthalten, so daß das gereinigte
Flavin-Adenin-Dinucleotid durch Konzentrieren der Lösung oder
durch Zusatz eines geeigneten Lösungsmittels erhalten werden kann*
intionisiertes Wasser kann für die Sluierung des Flavin-Adenin-Dinucleötids
mit besonderem Vorteil verwendet werden, weil das Fia^itt«Äaenin*Dinüöleotid dann wirkungsvoll durch ein Elulermittel
mit einem höheren pH-Wert βIuiert werden kann. Ε« ist
auch möglich, eine schwach alkalische wässrige Lösung als
Eluiermittel zu verwenden, jedoch können - wenn der pH-Wert des
Elulermittela zu hooh (z, B. über 10) liegt - Verunreinigungen,
besondere färbender Natur, mit eluiert werden., wobei sie dann
ι/
aber die Reinheit des Flavin-Adenin-Dinucleotide senken und womöglich auch das Flavin-Adenin-Dinucleotid zersetzen. Daher wird
vorgezogen, entionisiertes Wasser oder ein Wasser« das auf ein
pH von 5,0 bis 10,0 eingestellt ist, au verwenden. Der pH-Wert
kann z. B. in diesem Bereich durch Zusatz einer geeigneten Säure (z. B. Salz- oder Essigsäure) eingestellt werden. Ebenso können
auch Pufferlösungen mit einem passenden pH-Wert für die Eluierung
des adsorbierten Flavin-Adenin-Dinucleotids verwendet werden.
Es ist auch möglich, ein wässriges organisches Lösungsmittel, z. B. ein Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren
organischen Lösungsmittel (wie Methanol, Äthanol, Aceton oder Pyridln) bei einem pH von 5,0 bis 10,0 zu verwenden. Bei
Verwendung dieser wässrigen organischen Lösungsmittel kann man Lösungen von hochgereinigtem Flavin-Adenin-Dinucleotid entsprechend einer bei der Verwendung von Wasser beschriebenen Methode
erhalten. Das anfallende Eluat kann leicht durch Verwendung eines Lösungsmittels mit einem niederen Siedepunkt konzentriert werden,
falls erwünscht unter reduziertem Druck und bei niedriger Temperatur.
Durch Zusatz eines geeigneten organischen Lösungsmittels, z. B. Äthanol, zum Konzentrat erhält man das Flavin-Adenin-Dinucleotid
in kristalliner Form.
Die Reinigung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen
Flavin-Adenin-Dinucleotid« kann von der Menge der im Ausgangsmaterial enthaltenen Verunreinigungen abhängen« jedoch zeigen die
üblicher Weise erhaltenen Flavin-Adenin-Dinuoleotid-Ausbeuten eine
Reinheit von Über 8o bis au 90 %» Durch einfaches Wiederholen des
•rfindung8ge«äßen Verfahren« kann man auch zu einem Flavin-Adenin-Dinucleotid
noch höherer Reinheit koneen. ,
S09881/168i
Zu» besseren Verständnis des erfindungsgeraäSen Verfahrens sollen
die nachfolgenden Beispiele dienen.
Man regeneriert 50 ml Duolite C-IO {Handelsname eines phenolisohen Kationen-Austausoherharzes der Chemical Process Co., USA)
zur freien Fora und packt es in eine Harzkolonne. Dann fügt man
1 Mol KaCl zu 210 mg eines Cell-Extrakts, der 20,1 mg Flavin-Adenin-Dinucleotid enthält, stellt die Lösung auf ein pH von
2,5 ein und schickt sie duroh die Harzkolonne. Das Verhältnis
der optischen Adsorbentien der rohen, Flavin-Adenin-Dinucleotid enthaltenden Lösung war 22,4 bei 450 nu und 260 m**-, verglichen
■it den entsprechenden Werten von 3*28 für eine reine Flavin-Adenin-Dinucleotid-Lösung, so daß auf diese Welse zu erkennen
war, daß die Lösung.wesentliche Mengen an Verunreinigungen enthält. Flavin-Adenin-Dinucleotid wurde duroh das Kationen-Austausoherharz adsorbiert, während ein großer Teil der Verunreinigungen, wie z. B. Nuoleinsäure-Derlvate, Zucker und färbende
Substanzen« ohne Adsorption hindurchgingen« Das Harzbett wurde
■it 1 Liter einer 0,02 η HCl-Löaung, die 1 Mol/l NaCl enthielt,
gewaschen und dann mit entionisiertem Wasser eluiert, wobei 210 ■1 Eluftt sit 18,5 "β Flavin-Adenin-Dinucleotid anfielen. Das
Adsörptioneverhältnis des Eluats war bei 450 mit und 260 op J,^l.
Das Bluat wurde bei unter 40° und unter reduziertem Druck konzentriert, dann «it der 9-fachen Menge Äthanol versetzt und zweoks .
Erhalt eines Niederschlags gekühlt. Nach de« Abtrennen trocknete man den Niederschlag in üblicher Welse. Ausbeute 1^,7 ng Flavin-Adenin-Dinucleotid einer Reinheit von 87,2 Ji. . . . ,-
9 0 9 8 81/16 81 . , BAD ORIGINAL
Beispiel 2: ; %
Eine Fermentations-Nährlösung wurde mit einem stark basischen Anionen-Austauscherharz unter Erhalt einer Lösung behandelt. Von
dieser enthielten 500 ml 51*3 mg Flavin-Adenin-Dinucleotid mit
einem Absorptionsverhältnis von 43,2 bei 450 mu und 260 np. Das
pH dieser Lösung wurde auf 2,0 eingestellt, und die Lösung wurde dann durch eine Harzkolonne geschickt, die zur Adsorption des
Flavin-Adenin-Dlnucleotids mit 100 ml Duollte C-IO (Handelsname
für einen phenollschen Kationen-Austauscher der ChemicalProcess
Co., USA) gepackt war. Das Austauscherharz war vorher, um es in
die Na-Form überzuführen, mit einer NaOH-Lösung und dann mit Wasser
gewaschen worden. Nach der Adsorption des Flavin-Adenin-Dinucleotids
wurde das Harz mit 2 Liter einer 0,02 η HCl-Lösung gewaschen, die 0,5 Hol/l NaCl enthielt, und anschließend mit
Wasser eluiert, das eine kleine Menge HCl enthielt und ein pH von 3,5 hatte, um so ein Flavin-Adenin-Dinucleotid enthaltendes
Eluat zu erhalten. Die erhaltene Lösung hatte ein Adsorptionsverhältnis
von 3,56 bei 450 nsi und 26o mti. 500 ml dieser Lösung
enthielten 46,2 mg Flavin-Adenin-Dinucleotid. Das Eluat wurde
in analoger Weise wie im Beispiel 1 behandelt und ergab 40,2 mg
Flavin-Adenin-Dinucleotid einer Reinheit von 89,2 % als Ausbeute.
Das pH einer in analoger Weise - wie im Beispiel 2 beschrieben Flavin-Adenin-Dinucleotid-haltigen
Lösung, wurde auf 2,5 eingestellt. Dann schickte man 250 ml dieser Lösung durch eine mit
300 ml Dowex-30 (Handelsname eines phenolischen Kationen-Austauscherharzes
der Dow Chemical Co., USA) bepackte Kolonne (in.
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der freien Form befindlich), wobei Flavin-Adenin-Dinucleotid von dem Kationen-Aüstausoherharz adsorbiert wurde. Das adsorbierte
Flavin-Adenin-Dinucleotid wurde anschließend mit einem Gemisch
aus 50 % Acetqn/Wasser ©luiert, wobei ein Eluat mit 29,3 ®&
Flavin-Adenin-Dinucleotid anfiel. Nach Entfernung des Acetone
war das Absorptionsverhältnis des Eluats bei 450 nil und 260 fipi
4,12. Das Eluat wurde analog der im Beispiel 1 beschriebenen
Weise behandelt und ergab eine Ausbeute von 20,1 mg Flavin-Adenin-Dinucleotid
einer Reinheit von 81,2 $,
250 ml Cell-Extrakt mit 20,1 mg Flavin-Adenin-Dinucleotid wurde
mit 50ml DuoIite C-IO (Handelsname eines phenolischen Kationen-Austauscherharzes
der Chemical Process Co., USA) behandelt, um Flavin-Adenin-Dinucleotid zu adsorbieren. Das Harzb^att wurde
mit 0,02 η HCl-Lösung^ di· 1 Mol/l NaCl enthielt, gewaschen und
dann mit einer KHgPO^-NagHPO^-»Puffer-Lösung (0,01 Mpl/l) vom pH
7,0 eluiert. 150 al des anfallenden Eluats «enthielten 19,3 ag
Flavin-Adenin-Dinucleotid. Das Ab*orption»v«rh*ltni» des Sluate
betrug bei 450 rau und 260 au 4,02. Nach des Entsalzen, Konzentrieren,
Kristallisieren und dergl. wurden 11,3 «8 Flavin-Adenin-Dinucleotid
mit einer Reinheit von 78,2 % erhalten,
Beispiel 5: '
In ähnlicher^ in Bejjglfl. 4 beschriebener Weis* wurden 80,1 ng
Flavln-Adenin-Dinuoleotid durch 50 ad Duolite G-IO (Bftnd«l»iia»e
eines phonoli»öh*n K*tionen*ust*uaoh«r}Ärae· d«r Cheaioal Procea*
Co., USA) adsorbiert. Das Au*tfcu»ch«rharz wurde «iteintr wässri-φ»η Aarooniaklöeung, di« auf «in pH το» 8,5 tin««»tf»llt war, «lu·
i«rt. 180 »1 des iluftt» enthitlten i8,4 a« »lavin-Adenin-Dimi-
/■■■-■■ "■>■'..■■■ ," '' ■ '■ . " " ' "' ' ■ .' . ,
909881/1681 v bad
- ίο -
cleotid. Bas Absorptionsverhältnis des Iluats war bei 450 am und
26o RBi 3,99. Das Eluat wurde dann bei einer Temperatur von nicht
mehr als 4o° und unter reduziertem Druck und einem pH von nicht über 10 konzentriert. Anschließend wurde es analog der im Beispiel 1 beschriebenen Welse behandelt. Die Ausbeute betrug 11,0
mg Flavin-Adenin-Dinucleotid einer Reinheit von 80,2 %.
Patentansprüche
ι
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Claims (1)
- Patentansprüche1, Verfalireii zum Reinigen von Flavin-Adenin-Dinucleotid in wässriger Lösung, dadurch gekennzeichnet« daß Flavin-Adenin-Dinucleotid von einem phenolischen Kationen-Austauscherharz beim pH 1«© bis 3,0 adsorbiert und anschließend mit einem wässrigen Kluleriaittel vom pH 3,0 bis 1O9O eluiert wird.2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Flavin-Adenin-Dinucleotid anschließend von dem erhaltenen Eluat abgetrennt wird.3« Verfattren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, d&S die wässrige Flavin-Adenin-Dinucleotid enthaltende Lösung zwecks Adsorption durch eine phenolische KatIonen-Austauscher~ geschickt wird.4. Verfatoen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, d&8 die Adsorption bei einem pH-Wert von etwa 1,0 bis 2,5 durchgeführt wird.5· Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennseI©Miet, daß in der wässrigen Lösung ein anorganisches Salz gelöst wird» ehe sie mit dem K&tionen-Austauscherharz behandelt wird, "6. VerfÄtoeji nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das anorganische Salz Natrium- oder Ammoniumchlorid ist.7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch^ gekennzeichnet* daß der aktive Rest des Kationen-Austauscherharzes ein Sülfoiisäure-, Methyl-SuIfonsSure- oder Methylen-Sulfonsäurerest ist.909 8 8 1 / 1 6 81θ. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Katlonen-Austausoherharz in Salzform alt der wässrigen Lösung behandelt wird.9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dafl das Katlonen-Austauscherharz alt der wässrigen Lösung in Form seines Ma- oder NH^HSalzes behandelt wird.10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das mit Flavin-Adenin-Dinucleotid beladene Kationen-Austausoherharz mit einer sauren, wässrigen Lösung mit einem pH unter etwa 3 vor der Eluierung gewaschen wird.11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die saure, wässrige Lösung Natrium- oder Ammoniumohlorid enthält.12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die saure, wässrige Lösung eine HCl- oder MaCl-Lösung ist.13· Verfahren nach einem der Ansprüche 10-12, dadurch gekennzeichnet, daß das Kationen-Austauscherharz mit der wässrigen sauren Lösung gewaschen wird, bis das Waschwasser farblos ist und keine nennenswerte UV^Absorption mehr zeigt.14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge· kennzeichnet, daß das Eluiermittel Wasser ist.15« Verfahren nach den Ansprüchen 1-13, dadurch gekennzeichnet, dal das Klulermlttel eine wässrige Lösung einer anorganischen Säure oder eines Gemisches aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel 1st.16. Verfahren nach Anapruoh 15, dadurch gekennzeichnet, daß das lluiereittel eine Pufferlösung ist.909881/1-68117· Verfahren nach Anspruch 15* dadurch gekennzeichnet, dad das Eluieraittel aus Salzsäure besteht.18. Verfahren nach Anspruch 15, daduroh gekennzeichnet, das da« Sluieraittel aus einen Gemisch aus Wasser und Methanol, Xfchanol, Aceton oder Pyridln besteht.19. Flavin-Adenin-Dinucleotid, dadurch gekennzeichnet, dafl es nach den Ansprüchen 1 - l8 hergestellt ist.Patentanwalt Dr. Andrejewskl909-8817 168 1
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| US3271386A (en) * | 1964-06-01 | 1966-09-06 | Pfizer & Co C | 5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside recovery process |
-
1966
- 1966-08-09 GB GB35682/66A patent/GB1093998A/en not_active Expired
- 1966-09-02 DE DE19661595866 patent/DE1595866A1/de active Pending
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| GB1093998A (en) | 1967-12-06 |
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