JPS62138434A - アルフア−１−プロテイナ−ゼ阻害剤の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血漿または血漿分画からアルファー１−ブロ
テイナーゼ阻害剤（ＰＩ）および抗トロンビンーｍ　（
ＡＴ−ＩＩＩ）の少なくとも一方を分離する改良された
方法に関しかつその目的の１つとは前記方法を提供する
ことである。本発明の他の目的は、以下の説明から明ら
かとなるであろう。

以下の説明において、特記しないかぎり、部および百分
−（イは屯沿による。

アルファー１−プロテイナーセ１１＋１害剤は分子１′
１１が５４，０００の糖蛋白質である。この蛋白質は？
ｌ−・のポリペプチド鎖から成り、それにいくつかのオ
リゴｔｉｌ＋類のｒＩ＋、位が共有結合している。ヒト
Ｐ■は内因性セリンプロイテイナーゼ類による組織の破
壊の制御において１つの役割を演する。血漿中のトリプ
シン阻害容脅の９０％に及ぶＰＩの週休欠損は、肺気腫
のｌｉｊ期の発現に関連することが示された。気腫に関
連するエラスチンの劣化は、エラスチン分解酵素と天然
に産出する組織および血漿プロイテイナーゼ阻害剤との
局所的不均衡から生ずる。ＰＩはヒト１洋１藏および白
血球のエラスｄ、、Ｖｏ１．８８．Ｎｏ、２，３４６−
３５０．１９７９］。

ＰＩをを血漿からｒｔｉ−＃するために、ある数の力ｎ
、か用いられてきた。これらの力υ、の大部分は実験室
規模の単離に向けられてきており、−力他の方法は商業
的レベルの生産に関係する。

パンネル（Ｐａｎｎｅ　ｌ　ｌ）ら、ハイオケミス１−
’Ｊ　二（Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ）、Ｖｏｌ。

３．５４３９−５４４５．（１９７４）は、アルブミン
に劣った血漿をブールレ、そして固体の硫酸アンモニラ
ｚ、（０，６０〜０．８０飽和）で分別する方υ、を用
いた。生ず、る沈殿をＩＩｆ溶化し、透析し、そしてＤ
ＥＡＥ−セルロースのカラムに適用した。０　、０５〜
Ｏ、１５モルノＮ　ａＣｌの直線の勾配で溶離するＰＩ
の分画をプールし、ｅ縮し、透析し、次いでＤＥＡＥ−
セルロースのカラムニ適用した。０．０５〜０．２０モ
ルのＮａＣ１のｌＩ′１線の勾配で溶離するＰＩの分画
を束め、プールし、そしてｅｌｒｎ、てＰＩを得た６サ
クラトバラ（Ｓａｋ　Ｉ　ａｔ　ｖａ　ｌ　ａ）ら、バ
イオケミカル多ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ去、）、、
Ｖｏｌ、１５７，３３９−３５１　（１９７６）の方７
ノ：において、４Ｊｔｆｍアンモニウム（８０％の飽和
）を使用してヒト血漿を分画して沈殿を得、これを溶解
し、透析し、そしてＤＥＡＥ−セルロースのクロマトグ
ラフィーにかけた。０．５モルのＮａＣｌの抽出液をコ
ンカナ八リンＡ−セルロースのカラムに適用した。アル
ファーＤ−メチルグリコピラノシＩ・の溶離液をｅｌｉ
ｉＬ、そして＋ｔｊひＤＥＡＥ−セルロースのカラトに
適用した。

０．０〜０．２（ニルのＮａＣｌの溶摩液はＰＩを含有
した。

１、シアニ（Ｍｕｓｉａｎｉ）ら、バイオケミスート丈
二（Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、Ｖｏｌ、１５，７９８−８０
４ページ（１９７６）は、５５％の飽和の硫酸アンモニ
ウトの沈殿物を使用してＰＩに富んだ分画を分離し、そ
れをｕ（溶化し１次いでＤＥＡＥイオン交換体、コンカ
ナバリンＡ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、（
！７７デツクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１００および
免疫吸収カラムの連続的クロマトグラフィ一工程にかけ
て精製されたＰＩを得た。

とＩ・血漿からのＰＩの大規模精製は、クレス（Ｋ　ｒ
　ｅ　ｓ　ｓ）ら、調製／ヘイオケミストリ−（ヱｒｅ
ｐａｒａｔｉｖｅ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｖ
ｏ　Ｉ　、６．５４１−５５２　（１９７３）に開示さ
れている。ヒＩ・血漿の８０％の硫酸アンモニラ１、処
理からの沈殿物を透析し、そしてＤＥＡＥ−セルロース
のクロマトグラフィーにかけた。ｔｌｔられた濃縮物を
＋１ひ透析し、そしてセファデフクス（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘ）Ｇ−１００でケル離退しだ。ＰＩ含イｊ分画をＤＥ
−５２セルロースのクロでトゲラフイーに２回かけてＰ
Ｉを得た。

グレイザー（Ｇｌａｓｅｒ）ら、１ｂｉｄ、。

Ｖｏｌ、５．Ｎｏ、４，３３３−３４８ページ（１９５
７）は、コーンフラクションＩＶ−１からＰＩを３０％
の全体の収−（くで弔離した。Ｗｉ解したＩＶ−１をＤ
ＥＡＥ−セルロース、コンカナバリンＡ−セファロース
、コンカナバリンＡ−セファロース（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　
ａ　ｒ　ｏ　ｓ　ｅ）およびＧ−１５０セフアデツクス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）のクロマトグラフィーにかけてＰ
Ｉを得た。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づく統合された
血漿分画系は、へオ（Ｈａｏ）ら、１９７７年９Ｊｊ７
〜９［１に米国／ヘージニア州レストンついての技術に
関する国際研修会の会報（旦工Ａｏｎ）に開示された。

発表された方Ｖ、において。

コーン低温沈殿をＰＥＧと４０ｇ／Ｉのｊｌｉで混合し
た。すべてのｆｉ業は５°Ｃで実施した。

６０分間纜押した後、第１分画を遠心分離により除去し
た。追加の６０　ｇ／　ｌのＰＥＧを１：′Ｋｉみに添
加した（最Ｐ：濃度はぼ１０％）。次いで、プロトロン
ビン複合体（ＰＴＣ）を１０％のＰＥＧト澄みからＤＥ
ＡＥ−セルロースへの八ツチカ〃：に吸ノ、により抽出
し、そして追加のｇ／ｌのＰＥＧを添加して１０〜２０
％のＰＥＧ沈殿を得た。

このようにして得られた４つの分画は０〜４％のＰＥＧ
沈殿、４〜ｌＯ％のＰＥＧ沈殿、１０〜２０％のＰＥＧ
沈殿および２０％のＰＥＩ：澄みを１１ｔ、そして、そ
れぞれ分画Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと表示した。これらのＰ
ＥＧの濃度は低温−１−やみのもとの体積にノ、（づく
ことを指摘すべきである。

４つのＰＥＧ分画中の蛋白質類の分布は次の通りであっ
た：フィプリノゲンは分画Ａ中における１′要蛋白賀で
あり、アルブミンは１：、要ＩＩ′Ｊ染物質であった。

アルブミンそれ１゛１体はこれらの条件ドに沈殿しない
ので、分画Ａ、ＢおよびＣにおける汚染アルブミンの大
部分は−１−Ｋｌみの共沈および／またほの連行から得
られた。分画Ｂはプラスミノゲン、補体のＣ３成分、Ｉ
ｇＧおよびＩｇＭに冨んでいた。さらに、ヘーター脂賀
１１−白賀類はこの分画中にイｆ在した。分画Ｃは認ら
れうるＨ、Ｈのアルファ２マクログロブリンを含有し、
そしてプロトロンビンとプロトロンビン複合体を構成す
る他の１７）ＩＪ、＋因ｒ−とに富んでいた。ＰＴＣの
よりすぐれた収−４べは１０〜２０％のＰＥＧ沈殿より
もむしろ１０％のＰＥＧＩ：澄みから得ることかできる
ことを２渚は発見した。分画りはアルブミンに富むが、
またアルファー１−酸なＱ　ｎｒ白賀のすべてならびに
ＰＩ、抗トロンビン−ｍ　（ＡＴ　　ｍ）　、セルｒｙ
フラスミン（Ｃｐ）、ハフトゲロブリン、トラノスフェ
リン（Ｔｆ）およびＣ１エストラーゼ阻害剤（ＣＩ阻害
剤）の大部分を含有した。いくつかの追加の蛋白質類は
、また、プレアルブミン、レチノール結合性蛋白質（Ｒ
ＢＰ）、１−ランスコルチンおよびアイギオテンシノゲ
ンを包む分画りから単離された。一般に、より小さい大
部分は分画り中に存在した。

コーン（Ｃｏ　ａ　ｎ）およびブロックウェイ（Ｂｒｏ
ｃｋｗａｙ）、米国特許第４，３７９，０８７号および
同第４．４３９，３５８ｔ３・は、血漿分画、例えば、
コーンフラクションＩＶ−１からアルファー１−プロテ
イナーゼ阻害剤を分離する方法を開示しており、この方
法において、血漿の水溶液をべ１ｉ備し、そしてこのよ
うな溶液を約６．５〜８．５のｐＨおよび約２〜５０℃
の温度に約０゜２〜２４時間保持し、前記溶液を、その
容へりにノ、（づいて約８−１Ｏ％〜約２３％（Ｗ／Ｖ
）の範囲のＪ、ｉのポリ縮合ポリグリコール、例えば、
ポリエチレングリコールと、約４．６〜約７．５のＰＨ
において混合し、ここでポリ縮合ポリグリコールの１．
ｉをｐＨの０．５の増加につき約２〜３％で増加させる
。好ましい実施態様において、前述の方法で４．６〜５
．７の範囲のｐＨにおいてコーンフラクションＩＶ−１
を含イｊする水溶液の１００ｍ１につき約ｌＯ〜１５ｇ
のポリ縮合ポリグリコールを使用し、ポリ縮合ポリグリ
コールの部対血漿分画の部の比は約２：１−１：ｌであ
る。ポリ縮合ポリグリコールの処理からの混合物を遠心
し、そして１―澄み溶液を回収し、得られた」二澄み溶
液をアニオン交換樹脂とｐＨ約５．５〜８．６において
接触させ、そして樹脂からアルファー１−ブロテイナー
ゼ阻害剤を選択的に溶離することによって、イ：Ｉられ
だ混合物からアルファー１−プロテイナーゼ阻害剤を分
離する。あるいは、混合物の初期の遠心後に、ポリ縮合
ポリグリコールをさらに添加して混合物からアルファー
１−プロテイナーゼ阻害剤を沈殿させることによって、
アルファー１−プロテイナーゼ阻害剤を分離することが
できる。

コーン（Ｃｏ　ａ　ｎ）らＣに記）が概説しているよう
に、フラクション■−■を用いて出発して、アルファー
１−プロテイナーゼｔＬＩ害剤を製造したとき、フラク
ションＩＶ−１の懸濁液中の平均の収率は出発のプール
した血漿からほぼ１８％である。ＰＥＧの中間の純粋な
ベースト（ＰＥＧ　　Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ　　Ｐ
ｕｒｉｔｙ　　Ｐａ５ｔｅ）の沈殿はわずかに８％を生
ずるのみである。追加の損失は、また、クロマトグラフ
ィーの精製および低温殺菌の間に発生する。これはプー
ルした血漿かられずかに４〜６％の最終の容器の収率を
′ｊ−えるだけである。

グレイサー（Ｇｌａｓｅｒ）らが完成した研究［アナリ
ティカル・／へイオケミスＩ・リ−（Ａｎａｌ、　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、）、上２４，３６４−３７１（１９８２
）］は、ココーンフラクション■−がすべての血漿のア
ルファー１−ブロテイナーゼ阻害剤の３０％を含有する
ことを示した。この低い収−（ぺは、フラクションＩＶ
−１の沈殿の間のアルファー１分子の変性に歴史的に起
因されてきた。この沈殿はほぼ２１％のアルコール濃度
および５．２のｐＨにおいて起こる。

市場におけるこの製品の潜在的要求のため、わずかに４
〜６％のこの収率は商業的に受けいられない。こうして
、より高い収−オペを得るために、アルファー１−ブロ
テイナーゼ阻害剤を源からｔｎ離および分離する方法を
改良することが必要である。

抗トロンビン−ＩＩＩ　（ＡＴ−ｍ）は、次の工程から
成る５工程の方法で血漿またはコーンフラクションＩＶ
−１から調製された：　（ａ）ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）を使用して不必要な蛋白質類を沈殿させるこ
とによる部分的精製；　（ｂ）ヘパリン−コンカナバリ
ンＡ−セファロースへのバッチ式の吸着および溶離によ
るＰＥＧ上澄みがらのＡＴ−ｍの単離；　（Ｃ）溶離さ
れたＡＴ−Ｉ［１の濃度および限外濾過による脱塩、（
ｄ）０．５モルのクエン酸ナトリウムの存在下の６０℃
およびｐＨ７，５におけるｅ縮物の１０時間の加熱によ
るＡＴ−Ｈの低温殺菌；および（ｅ）滅菌症過、充填お
よび低温乾燥。［Ｃ、Ａ　、ウィンカーハウザー（Ｗｉ
　ｅｋｅ　ｒｈａｕｓｅ　ｒ）ら９本エクス・サングイ
ニス（Ｖｏｘ　　Ｓａｎｇ、）、３旦、２８１−２９３
　（１９７９）］。

Ｌ、−０，アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、米国
特許第３，８４２，０６１号は、ＡＴ−ｍ含有血液物質
１例えば、血漿からＡＴ−Ｉｌｌを単離する方法を開示
しており、この方法はＡＴ−ｍ含有血液物質を水不溶性
の架橋した硫酸化多糖類のゲルマトリックスと接触させ
てＡＴ−ＩＩＩを吸着させ、次いでＡＴ−ＩＩＩをこの
吸着剤から分離することを含む。

より大きい容１１Ｙが溶解度を増加させるかどうかを見
るために、溶解用ｗ検液の合判を増加して開始してフラ
クションＩＶ−１の溶解の化学を研究することにより、
われわれはＰＩの全体の収−ｆ＜の増加を観ｌ１１１し
、そしてまた、溶解用緩衝液のｐＨかペース：・の添加
後と同じように多く減少しないことを観ａ］１シた。溶
解用緩衝液のｐＨを増加することにより回収＋ｉｌ能な
収−オペへのｐＨの影響をさらに検査すると、従来人〔
１１ｆ能と考えられていたよりも多くのＰＩがフラクシ
ョン■　ＩＱ％液から回収された。こうして、使用する
溶解用緩衝液のｐＨおよび容Ｉ１１は従来考えられたよ
りも臨界的であることをわれわれは発見した。コーン（
Ｃｏａｎ）の方法をグレイサー（Ｇｌａｓｅｒ）の初期
のωＦ究とほぼ同じｐＨおよび容１１トにおいて実施し
た。溶解用緩衝液のｐＨおよび容沿を増加することによ
り、われわれはプールした血漿中に存在するアルファー
１−プロテイナーゼ阻害剤のほぼ５０％をフラクション
■−１中に回収して、最後の容器においてほぼ３０％の
全体の収−（ｉを得た。これはちと（ｙ）＋−７（ＣＯ
ａ　ｎ）　（１）方Ｕ：から５００％を越える収率の増
加を表わす。

さらに、フラクションＩＶ−１を前述の条件下に溶解し
、次いでアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓ。

ｎ）ら、米国特許第３，８４２，０６１号の手順に実質
的に従うことによりＡＴ−ＩＩＩを分離することによっ
て、従来法に従いより少州の緩衝液中に溶解したフラク
ションＩＶ−１から出発した収率を約１５０〜２００％
越える収率の増加が得られることをわれわれは発見した
。

Ｉｔ’１１　ｅｌｉに述べると、本発明はアルファー１
−プロテイナーゼ阻害剤（文献中で［アルファー１抗ト
リプシン」としても知られている）をそれを含イ１する
水溶液、例えば、血漿または血漿分画から、従来開示さ
れたよりも高い収率および純度で分離する改良された方
法である。まず、血漿分画を２０−１００容ｒｌｉの生
理学的に許容されうる緩衝液に溶解し、そしてｐＨを約
９．０〜１１．０に調節する。次いで、ＰＩおよび／ま
たはＡＴ−ＩＩＩを従来の技術により沈殿剤または吸ｒ
ｉ剤を使用して分離する。

１つの特定の面において、ここの記載する本発明は、工
程： （ａ）抗トロンビン−■を含イＪする血漿または血漿分
画の群の一方の水溶液を、水不溶性の架橋した硫酸化多
糖類のゲルマトリックス吸着剤と接触させて、抗トロン
ビン−ｍを吸、γｉし、（ｂ）’ｌ二程（ａ）からの吸
ｒｉ剤から抗トロンビン−■を溶離し、そして （Ｃ）、ｆ：程（ｂ）からの溶離液から抗トロンビン−
ｍを回収する、 を含んでなる抗トロンビン−■を含イＪする血漿蛋白質
類の水溶液から抗トロンビンー■を分離する方υ、にお
いて、 （１）工程（ａ）において使用するため、使用する血漿
または血漿分画の屯Ｈ，Ｈにつき２０〜１００容、ｌ、
；の緩衝溶液の中に溶解した血漿または血漿分画の一方
の水溶液を準備し、そして（２）工程（ａ）において使
用する１ｔｊに、前記緩衝溶液および工程（１）から得
られる血漿または血漿分画の水溶液の一方を調節して、
得られた溶油のｐＨを９．０〜１１．０にする、を含ん
でなることを特徴とする方法である。

他の特定の面において、ここに記載する木発す１は、工
程： （ａ）アルファー１−プロテイナーセ阻害剤を含有する
血漿または血漿分画の一方の水溶液を、前記水溶液の容
１１Ｙに基づいて約８％〜２３％（Ｗ／Ｖ）のポリエチ
レングリコールおよびポリプロピレングリコールから選
択されたポリ縮合ポリフルキレングリコールと、約り℃
〜約５０℃の温度において約０．２〜２４時間の間接触
させ、前記溶液からアルファー１−プロテイナーゼ阻害
剤を沈殿させないで不必要な蛋白質類を選択的に沈殿さ
せて、不必要な蛋白質類を含まないアルファー１−プロ
テイナーゼ阻害剤を含有する混合物を得、 （ｂ）１°ｆ−″（ａ）から混合物を回収し、そして（
Ｃ）、工程（ｂ）において回収された混合物からアルフ
ァー１−プロテイナーゼ阻害剤を分蕩する。

を含んでなるアルファー１−プロテイナーゼ阻害剤を含
有する血漿蛋白質類の水溶液からアルファー１−ブロテ
イナーゼ阻害剤する方υ：において、（１）工程（ａ）
において使用するため、使用する血漿または血漿分画の
一方のＢ　ＨＨにつき２０〜１００容１１′Ｌの緩衝溶
液の中に溶解した血漿または血漿分画の一方の水溶液を
ぺｒ４備し、そして （２）工程（ａ）において使用する前に、前記緩衝溶液
および血漿または血漿分画の得られる水溶液の一方のｐ
Ｈを調節して、得られた溶液のＰＨを９．０〜１１．０
にする、 を含んでなることを特徴とする方法である。

本発明の方法による方法におけるアルファーｌ−プロテ
イナーゼ阻害剤および抗トロンビン−■の出発源は、コ
ーンフラクション（Ｃｏｈｎ　　Ｆｒａｃｔ　ｉ　ｏｎ
）　■−１，コーンフラクション■、コーンフラクショ
ン■およびＩＶ−１の＋Ｉｆ　／Ｊｌｌ　Ｊｌ物（ｒ　
ｅｗｏ　ｒ　ｋ）　、およびコーンエフルエント（Ｃｏ
ｈｎ　　Ｅｆｆ　１ｕｅｎｔ）ＩＩＩ［、Ｄ−７エフル
エント■、および低温上澄み溶液（ｃｙ。

５ｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　　５ｏｌｕｔｉｏｎ）から成
る血漿分画の群から選択されるアルファー１−ブロテイ
ナーゼｌｉｌ’ｌ害剤および抗トロンビン−■の少なく
とも一方を含イ１する血漿または血漿分画である。

本発明による方法の第１の利点は、先行技術において報
告されている多くの方法により得られるＰＩまたはＡＴ
−ＩＩＩと比較したとき、血漿中のＰＩまたはＡＴ−Ｉ
ＩＩの合計量からの収−（ｌに関して、ＰＩまたはＡＴ
−［の回収率が高いことである。

他の利点は、先行技術において不必要な汚染物質として
ＰＩまたはＡＴ−ＩＩＩと一緒に頻繁に回収される他の
血漿蛋白質類の分箸を本発明による方Ｖ：が増大させる
という７α味において１本発明による方法により得られ
るＰＩまたはＡＴ−ＩＩＩの純度である。

１１０述のように、本発明による方法の出発物質は、ア
ルファー１−プロテイナーゼ阻害剤および抗トロンビン
−■の少なくとも一方を含有する血漿または血漿分画で
ある。好ましくは、ＰＩを含有する水溶液は、コーンフ
ラクション■−１，おヨヒコーンエフルエントＩＩ−Ｎ
ＩＩ、コーンエフルエン）Ｉおよび低温」二澄み溶液か
ら成る血漿分画のイＩＹから選択される。コーンフラク
ションＩＶ−１、およびコーンエフルエントｎ＋ｍおよ
びコーンエフルエン）Ｉは、コーン（Ｃｏｈｎ）エタノ
ール分画技術またはその変法に従い血漿を分画すること
により得ることができる。例えば、Ｅ、Ｊ。

コーン（Ｃｏ　ｈ　ｎ）ら、ジャーナル嗜オブ・アメ（
１９４６）；Ｅ、Ｊ、コーン（Ｃｏｈｎ）、米国特許第
２．３９０．０７４号−オンクレイ（ＯＣｈｅｍ、　　
Ｓｏｃ、）、７ユ、５４１　　（１９４９）；および「
血漿蛋白質類（Ｔｈｅ　　Ｐｌａｓｍａ　　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ）Ｊ、Ｖｏｌ、ＩＩＩ、５４８−５５０ページ、
アカデミツク・プレス、ニューヨーク州ニューヨーク（
１９７５）　参ｐ（＋。

低温」；澄み溶液は、新鮮な凍結された血漿を５°Ｃ以
下において融解し、残留する沈殿［「低温沈殿物（ｃｙ
ｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）」と呼ぶ］を許通の手段、
通常遠心分離により除去し、そして本発明による方法に
おいて使用するために上澄み溶液を（「低温上澄み溶液
」と呼ぶ）を保持することによって得ることができる。

例えば、Ｇ。

ミトラ（Ｍｉｔｒａ）ら、米国特許第４，３０６．０６
８号参照。より好ましくは、出発物質として使用するＰ
ＩまたはＡＴ−ＩＩＩを含有する水溶液は、コーンフラ
クションＩＶ−１，コーンエフルエントＩＩ＋ｍおよび
コーンエフルエント工から選択される。最も好ましくは
、ＰＩまたはＡＴ−ｍを含イｊする出発水溶液はコーン
フラクションＴＶ−１である。以ドの説明において、例
示のために強調はコーンフラクションＩＶ−１に向けら
れるが、これに限定されない。

本発明による方７Ｊ、の第１工程は、溶媒として比較的
大きい８針の緩衝溶液中の血漿または血漿分画の水溶液
を得ることである。コーン（Ｃｏａｎ）ｃｒ＋米国特許
（米国特許第４．３７９．０８７−）および同第４，４
３９，３５８号）の実施例１を参照すると認められるよ
うに、特許された方法はフラクションｒＶ−１の呈（重
ｉ、ｉ−）に基づいて約８〜１０容量の緩衝溶液を使用
し、そして得られた溶液を約６．５〜８．５のｐＨに保
持することを開示している。

本発明によれば、本発明の改良の１つの面は。

出発血漿または血漿分画の重ｈ）につき２０〜１ＯＯ１
より好ましくは２０〜５０容星、なおより好ましくは２
０〜３０容呈、最も好ましくは２４容州の緩衝溶液を使
用することを必要とする。本発明による方Ｖ、に従い定
められるｐＨ範囲において任、・五の生理学的に許容さ
れうる緩衝溶液を使用できるが、トリス−（ヒドロキシ
メチル）アミンメタン［トリス（ＴＲＩＳ）］の使用は
好ましい。

生理学的に許容されうる塩、例えば、Ｊ１！化ナトリウ
ムは血漿または血漿分画、代表的にはコーンフラクショ
ン■−１の生ずる水溶液中に０．０〜０．２０モルのの
範囲のＣ度を！トえる。

本発明の改良の他の面は、緩衝溶液および血漿および血
漿分画、代表的にはコーンフラクションＩＶ−１の得ら
れた水溶液の一方のｐＨを調節して、得られた溶液のｐ
Ｈを９．０〜１１．０にすることを必要とする。この調
節は、ペレットの形態または水溶液の形態の十分な塩基
１例えば、水酸化ナトリウムを、最初の緩衝溶液または
最初のｗ！衝溶液中の血漿または血漿分画の最初の溶液
に添加することにより達成できる。あるいは、このＰＨ
の調節は、１−分な水酸化ナトリウムを最初の緩衝溶液
に添加してｐＨを１０．０〜１１．０にすることによっ
て達成できる。好ましいＰＨを有する最初の緩衝溶液中
のコーンフラクションＩＶ−１の得られる水溶液のＰＨ
は、９．０〜１Ｏ９５である。

フラクション■−１の得られる水溶液が保持される時間
および温度は臨界的であると考えられないが、ＨＩ３間
と温度との間に逆の関係が存在し、ここで温度のｌＯ’
Ｃ！ごとのＬシ１において、保持時間は６分だけ減少す
べ５であり、好ましい柔性はコーンのＦ順に記載されて
いるようなものであり、すなわち、約４５°Ｃにおいて
約０．５時間または約５°Ｃにおいて約８時間である。

実際の賽柄として、本発明による改良の実施における保
持時間は２４容ｊ、；二の緩衝液中のｐＨ９，０〜１０
，０のフラクションＩＶ−１の得られる水溶液を約２〜
１０°Ｃ１例えば、５°Ｃにおいて約２〜３１ｆ！ｐ　
１ｉｆｌ　、例えば、２，５時間保持し、次いで３０〜
４５°Ｃにおいて約０．５〜２時間、例えば、１〜１．
５時間保持することを包含する。

フラクションＩＶ−１は直接使用することができ、ある
いはそれをまず処理して、例えば、「冷たい（ｃｏｌｄ
）Ｊアセトン、エーロシル、カルシウムおよび硫酸デキ
スＩ・ランなどと接触させることにより、その中に含有
されている脂質を除去することができる。例えば、ＩＶ
−１のペースＩ・をアセトンとフラクションＩＶ−１の
１部につき約１０〜４０部のアセＩ・ンの比率で混合す
ることができる。この処理中の温度は、冷たいアセトン
の出発温度の約−３０〜−３５℃に維持する。アセトン
は、また、フラクションＩＶ−１のペーストから水を除
去し、これにより汁通の手段によりアセトンを除去する
と、ＰＩの実質的にすべてを含有する乾燥した粉末が得
られる。

本発明による条件下にこの保持期間が経過した後、フラ
クションＩＶ−１の得られた水溶液を、コーンらが記載
するような汀通の方法より、ポリ縮合ポリアルキレング
リコールで処理して不必要な蛋白質類を沈殿させ、そし
て不都合な蛋白質類を含まないＰＩを含イｊする混合物
を得、このＰＩ含イ１況合物を回収し、モしてＰＩを回
収された混合物から分離する。

好ましくは、ポリ縮合ポリアルキレングリコールはポリ
エリレンゲリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレング
リコール（ＰＰＧ）から逍択される。いずれを使用する
こともできるが、ＰＥＧは、例えば、ニオオン・カーバ
イド・コーボレーシ、ン（Ｕｎｉｏｎ　　Ｃａｒｂｉｄ
ｅ　　Ｃｏ　　ｒｐ、）から人手ｒｒ（能であるので好
ましい、ＰＥＧは約２００〜２０．０００、好ましくは
約２，０００−１０，０００．より好ましくは約３，０
００〜８，０００．最も好ましくは約３．０００〜４．
０００の範囲の分子量を有することができ、そして粘性
溶液のｉｉｊ、に基づいて約８〜２３（ｗ／Ｖ）の範囲
で使用することができる。この処理は約２〜５０°Ｃに
約０．２〜２４時間保持することができる。

形成する沈殿物は、不必要な蛋白質類を含有し、背進の
１段、例えば、遠心分離および濾過により分離すること
ができる。不都合な蛋白質類を含まないＰＩを含有する
混合物を回収し１次いでそれからＰＩを分離するために
処理する。あるいは、ＰＥＧ処理からの混合物は不都合
な蛋白質類の沈殿物を含有し、そのＰＨを生理学的に許
容されうる酸、例えば、酢酸、クエン酸、ｎ１酸および
リン酸の添加により４．６〜５．７、好ましくは５．１
〜５．２の範囲内に調節することができる。沈殿した混
合物はできるたけ短時間、通常約１〜６０分間保持して
不必要な蛋白質類を溶液からさらに沈殿させる。なぜな
ら、ＰＩの収率はこれらの条件下に時間とともに減少す
るからである。形成する沈殿物は、不必要な蛋白質類を
含有し、再び背進に１段により分離する。

残留する溶液のｐＨを、生理学的に許容されうるアルカ
リ性物質、例えば、氷耐化ナトリウムの添加により約５
．５〜８．６．好ましくは約６゜５のｐＨに調節する。

次いで、そのように調節した物質は、ＰＥＧを溶液のｌ
ｏｏｍｌにつき約１０〜３０ｇの呈で添加することによ
り、さらに分画する。ＰＩを含有する沈殿物を溶液から
分離する。沈殿物をリン酸ナトリウム緩衝液中に溶解し
、そして得られた溶液を７ニオン交換媒体１例えば、Ｄ
ＥＡＥ−セフアゾ、クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、ＱＡＥ
−セファデックス、ＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａ
ｃｅ　Ｉ）、ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セフｙ
ロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）などと接触させる。種々
の条件をこの特定の上程に使用できる。前記媒体との接
触はバッチ式または連わ２的に実施することができる。

最良の結果のためには、アニオン交換媒体をクロマトグ
ラフィーのカラム中に配置し、モしてＰＩをそれから溶
離する。−鮫に、アニオン交換媒体をまずｐＨ約５．５
〜８．６の緩衝溶液中で１１衡化する。次に、アニ才゛
　　ン交換媒体を１−のＰＩ含イ１后液と、交換体の１
容ｊ１１−につき約１０−１５容ｒＩｉの溶液の比−（
ｌで接触させる。アニオン交換媒体を＋＋ｊひ緩衝溶液
１通常］二と回−の緩衝溶液で洗Ｍｌする。この洗浄溶
液の１１１は一般に交換体の１容ｊ１；、につき３〜１
０容州である。

ＰＩは勾配溶離または段階的溶離によりアニオン交換媒
体から、それを０．０〜０．３モルの１１！化ナトリウ
ム、０．Ｏ１〜０．１２モルののリン酸二すトリウムな
どまたはそれらの組み合わせを含右するｐＨ５，５〜８
．６の緩衝溶液と接触させることによって除去する。

ＰＩを含有する溶液を、例えば、アニオン交換媒体から
、分離した後、この溶液を慣用り段、例えば、透析濾過
、限界症過、凍結乾燥など、あるいはそれらの組み合わ
せにより、処理してその水分を減少しかつイオンの組成
を変化させる。

本発明の方法によって得られたＰＩは、沈殿物としてお
よび緩衝溶液中で再構成して、あるいは溶液またはその
濃縮物として、プロテアーセ阻害右効ｉＩ′ＬのＰＩお
よび製薬学的にｌｉｌ容されうる１１１体を含右する製
薬学的製剤に配合し、治療１診断または他の目的に使用
することができる。、り脈内投り°−のための＋ｉｉｊ
記製剤全製剤するためには、Ｍ１成物を生理学的に適合
性の物質、例えば、１１！化すＩ・リウム、グリシンな
どを含有しかつ生理学的条ヂ１と適合する緩衝したｐＨ
を有する水の中に通常Ｍ解する。一般に、静脈内に役′
Ｆする組成物のためのガイ１ニラインは政府の条例によ
り確ヴされる。

ＰＩ濃縮物は感染性微生物１例えば、肝炎およびエイズ
（ＡＩＤＳ）のウィルスに関して非感染性であることが
望ましい、これに関して、ｅ縮物を処理してこのような
微生物を不活性化し、そして前記微生物に対する感染性
を減少する。これは、例えば、緘Ｉ”ＡＮ過、紫外線照
射、化学的ウィルス不活性化剤との処理、凍結乾燥した
状態における熱処理（例えば、６０〜８５°Ｃ）、ある
いは「低温殺菌」の１または２以上によってよって達成
することかできる。低温殺菌は、ＰＩ含含有液をＰＩを
肝炎に非感染性とするために十分な温度にかつ十分な時
間、例えば、約６０°Ｃ以」二の温度に約１０時間まで
の期間の間加熱することである。この低温殺菌または「
湿式」熱処理の間Ｐ１、　を安定化するために、クエン
酸イオン源を加熱の間ＰＩを安定化するために１−分な
１１）で添加する。

−・般に、約２０ｍｇの合１；１の蛋白質がＰＩの濃縮
物中に存在する場合、その溶液のクエン酸イオンを約０
．２５〜０．５モルとする。この加熱上程の間のこの混
合物のｐＨは好ましくは約６．０〜７．０であるべきで
ある。

加熱の間のＰＩの最大の安定化を達成するために、安定
剤として炭水化物を？ド独であるいはり工ｌ酸ナトリウ
ムと組み合わせて使用することが望ましい。この１］１
的のために、炭水化物として、？１１１１１類、三糖類
および三糖類、例えば、アラビノース、グルコース、ガ
ラクｉ・−ス、マルト−ス、フルクト−ス、リポース、
マンノース、ラムノース、スクロースなど、あるいは糖
アルコール、例えば、ソルビト−ルおよびマンニト−ル
などをＰＩ溶液の１ｍｌにつき約０　、５〜２　、４　
ｇ（ｒ）ｊ、＋Ｌテ使用することができる。

＋ｉｉｉ述のように、本発明の低温殺菌した生成物は治
療の［１的のために使用できる製薬学的製剤中に混入す
ることができる。しかしながら、　「製薬学的製剤］と
いう用品は、治療の目的のみならず、またこの分野にお
いて知られている試薬または診断の［目的にあるいは組
織培養に使用する本発明に従う蛋白質組成物を含イｊす
る製剤を包含する。治療の用途を意図する製薬学的製剤
は、治療学的ｊ１１のＰｌ、例えば、予防手段または？
ｌｉ′Ｉ療的廿康の手段のために必要なプロテイナーゼ
阻害州のＰＩを含有するべきである。製薬学的製剤を試
薬または診断剤として使用しようとする場合、それは試
薬！１ｉまたは診断剤１１℃のＰＩを含有すべきである
。

火り刻 前述の発明を以ドの例示的実施例によりさらに明らかに
する。

コーンフラクションＴＶ　−１ハ、　前述のコーンフラ
クション技術に従う分画により１１Ｉた。

アッセイ ＰＩはそのエラスターゼ阻害容、ｌ、ｉ、により、エラ
スターゼのための色、も原基質を使用して［１一定する
。Ｎ−スクシニル−し−７ラニルーＬ−アラニル−Ｌ−
アラニル−ｐ−二トロアニリド（Ｓ　Ａ３ｐＮＡ）をエ
ラスターゼで加水分解すると、４０５ｎｍにおける吸収
が増加する。この増加を３７°Ｃにおいて通常連続的に
監視する。試料（ＰＩ）の存在下および不存在下に時間
とともの吸収の直線変化を比較する。次いで、阻害剤の
星をエラスターゼおよびＰＩの既知の分子品：、既知の
１；ｌの化学量論および使用したエラスターゼの既知；
；′Ｌに基づいて計算する。

ＰＩは、また、同様な方法においてそのトリプシン阻害
容量により推定することができる。

として使用してロウリイ（Ｌｏｗｒｙ）ｆｆｌ白賀アン
セイを用いた［ロウリイ（Ｌ　ｏ　ｗ　ｒ　ｙ）ら。

１、Ｖｏｌ、１９３，２６５−２７５ページ］。

ごらに、抗トロンビンｅ度を２８０ｎｍにおける吸収か
ら６．５の吸光１１１数を使用して計算した。

実施例１ アルファー１−プロテイナーゼ阻害剤法立支Ｕ Ｄ−ン（Ｃｏａｎ）ら、米国特許第４．３７９．０８７
号の実施例１に概説されているアルファー１−プロテイ
ナーゼ１ｌｒｉ害剤の単離についての分画「、順に実質
的に従い、フラクションＩＶ−１のペーストを、０．１
モルのトリスおよび０．０２モルの塩化ナトリウムを含
有するｐＨ８，２の緩衝溶液の８容星中に溶解した。得
られた懸濁液または混合物を５°Ｃにおいて２．５１１
ν間纜拌し、４０〜４５°Ｃに加熱し、そして１−１．
５時間保持し、そしてアッセイ前に５℃に冷却した。こ
れを「試ネ゛ｉＡＪと表示した。

フラクションＩＶ−１からのアルファー１−プロテイナ
ーゼ阻害剤の溶解度を増加するために、フラクション■
−１のペーストを２４容量の０．１モルのトリス、０，
０２モルの塩化ナトリウム、ｐＨ８，２、の中に２．４
．４させた。−Ｌのように、得られた混合物を５℃で２
．５時間攪拌し、４０〜４５°Ｃに加熱し、そして１〜
１．５１１！？間保持し。

そして７ンセイ前に５°Ｃに冷却した。これを「試孝′
［Ｂ」と表示した。

ベースＩ・の添加前にトリス／１！１溶液のｗ検液（ｓ
ａｌｉｎｅ　　ｂｕｆｆｅｒ）のＰＨの調節についての
必要性を試験するために実験を実施した。フラクション
ＩＶ−１のペーストを２４容ｉｉｋの０．１モルのトリ
ス、０．０２モルの塩化すトリウム（ｐＨ＝ｌＯ，３〜
１０　、５）の中に溶解させた９ベースＩ・の添加後得
られたｐＨは９．３〜９．５であることかわかった。こ
れはペーストの添加後の７．７〜８゜０の範囲である１
、の２４容：１りの懸渇液に匹敵する。得られた混合物
を５°Ｃで２．５時間攪拌し、４０〜４５℃に加熱し、
そして１−１．５時間保持し、そしてアッセイ前に５°
Ｃに冷却した。これを「試料Ｃ」と表示した。

これらの３種類の条件を、また、０．１モルのトリス、
０．０２モルの塩化ナトリウム中に溶解し、ｐＨを混合
の間１０．０−１０．３に維持したフラクションＴＶ−
１のペーストと比較した。得られた混合物を５°Ｃで２
．５時間攪拌し、３０〜３５℃に加熱し、そして１〜１
．５時間保持し、そしてアッセイ前に５°Ｃに冷却した
。これを「試料ＤＪと表示した。

次いで、これらの試料、Ａ−Ｄ、は、ＰＥＧの添加によ
り不必要な蛋白質類を沈殿させ、ＰＩを７ニオン交換樹
脂に吸着させ、そしてＰＩを７ニオン交換樹脂から溶離
することによって、処理して、前述のように、その中に
含有されるＰＩを分離した。

前述のように調製した試料のアッセイの結果を、下表Ｉ
に要約する。

実施例２ 抗トロンビン−■法の変υ、 Ｃ，Ａ、ウィンカーハウザー（Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅ
ｒ）ら、ボックスφサングイニス（又ユｘ　　Ｓａｎｇ
、）、３６，２８１，２８４　（１９７９）に概説され
ている抗トロンビン−■の巾離についての手順に実質的
に従い、フラクション■−１のペーストを、０．１モル
のトリスおよび０．０２モルの塩化ナトリウＬ・を含有
するｐＨ８，２の緩衝溶液の８容１１″Ｌ中に溶解した
。得られた懸濁液または混合物を５℃において２．５時
間攪拌し、４０〜４５°Ｃに加熱し、モして１−１゜５
時間保持し、そしてアッセイ前に５°Ｃに冷却した。こ
れを「試料Ｅ」と表示した。

フラクションＩＴ−１からのアルファー１−ブロテイナ
ーゼ阻害剤の溶解度を増加するために、フラクション■
〜１のペーストを２４容量の０．１モルのトリス、０．
０２モルの塩化ナトリウム、ｐＨ８，２、の中にＰＨ濁
させた。上のように、得られた混合物を５°Ｃで２　、
５１１＋ｊ間撹拌し、４０〜４５°Ｃに加熱し、そして
１〜１．５時間保持し、そしてアンセイ＋ｉｉ＋に５°
Ｃに冷却した。これを「試ネ′］Ｆ」と表示した。

ペーストの添加前に）・リス／１に溶液の緩衝液（ｓａ
ｌｉｎｅ　　ｂｕｆｆｅｒ）（７）ＰＨ（７）訓諭につ
いての心安性を試験するために実験を実施した。フラク
ション■−工のペーストを２４　’ｉ’ｌ”ｊ、の０．
１モルのトリス、０，０２モルの塩化ナトリウム（ｐＨ
＝　１０．３〜１０　、５）の中に溶解させた。ペース
トの添加後得られたｐＨは９．３〜９．５であることが
わかった。これはペーストの添加後の７．７〜８．０の
範囲であるＬの２４容ムＹの＠濁液に匹敵する。得られ
た混合物を５°Ｃで２．５時間攪拌し、４０〜４５℃に
加熱し、そして１〜１．５時間保持し、そしてアッセイ
前に５°Ｃに冷却した。これを「試料Ｇ」と表示した。

これらの３種類の条件を、また、０６１モルのトリス、
０．０２モルの塩化ナトリウム中に溶解し、ｐＨを混合
の間１０．０−１０．３に維持したフラクション■−１
のペーストと比較した。得られた混合物を５℃で２．５
時１ｆｉｌ攪拌し、３０〜３５°Ｃに加熱しかつその温
度にｔ−ｔ、Ｓ時間保持し１次いでアッセイ前に５°Ｃ
に冷却した。これを「試お）ＨＪと表示した。

前述のように調製した試料のアッセイの結果を、ド表Ｉ
Ｉに要約する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： （ａ）使用する血漿または血漿分画の一方の重量につき
   ２０〜１００容量の生理学的に適合性の緩衝溶液の中に
   溶解したアルファ−１−プロティナーゼ阻害剤および抗
   トロンビン−IIIの少なくとも一方を含有する血漿また
   は血漿分画の群の溶液を準備し、 （ｂ）工程（ａ）から得られる溶液のｐＨを９．０〜１
   １．０に調節し、そして （ｃ）工程（ｂ）からの溶液を沈殿剤および吸着剤の一
   方と接触させることにより、工程（ｂ）からの溶液から
   アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤および抗トロンビ
   ン−IIIの少なくとも一方を分離する、 を含んでなることを特徴とするアルファ−１−プロティ
   ナーゼ阻害剤および抗トロンビン−IIIの少なくとも一
   方を含有する血漿蛋白質類の水溶液からアルファ−１−
   プロティナーゼ阻害剤および抗トロンビン−IIIの一方
   を分離する方法。 ２、工程： （ａ）抗トロンビン−IIIを含有する血漿または血漿分
   画の群の一方の水溶液を、水不溶性の架橋した硫酸化多
   糖類のゲルマトリックス吸着剤と接触させて、抗トロン
   ビン−IIIを吸着し、 （ｂ）工程（ａ）からの吸着剤から抗トロンビン−III
   を溶離し、そして （ｃ）工程（ｂ）からの溶離液から抗トロンビン−III
   を回収する、 を含んでなる抗トロンビン−IIIを含有する血漿蛋白質
   類の水溶液から抗トロンビン−IIIを分離する方法にお
   いて、 （１）工程（ａ）において使用するため、使用する血漿
   または血漿分画の重量につき２０〜１００容量の緩衝溶
   液中に溶解した血漿または血漿分画の一方の水溶液を準
   備し、そして （２）工程（ａ）において使用する前に、前記緩衝溶液
   および工程（１）から得られた血漿または血漿分画の水
   溶液の一方を調節して、得られた溶液のｐＨを９．０〜
   １１．０にする、を含んでなることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３、工程： （ａ）アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含有する
   血漿または血漿分画の一方の水溶液を、前記水溶液の容
   量に基づいて約８％〜２３％（ｗ／ｖ）のポリエチレン
   グリコールおよびポリプロピレングリコールから選択さ
   れたポリ縮合ポリアルキレングリコールと、約２℃〜約
   ５０℃の温度において約０．２〜２４時間の間接触させ
   、前記溶液からアルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を
   沈殿させないで不必要な蛋白質類を選択的に沈殿させて
   、不必要な蛋白質類を含まないアルファ−１−プロティ
   ナーゼ阻害剤を含有する混合物を得、 （ｂ）工程（ａ）から混合物を回収し、そして（ｃ）工
   程（ｂ）において回収される混合物からアルファ−１−
   プロティナーゼ阻害剤を分離する、 を含んでなるアルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含
   有する血漿蛋白質類の水溶液からアルファ−１−プロテ
   ィナーゼ阻害剤する方法において、（１）工程（ａ）に
   おいて使用するため、使用する血漿または血漿分画の一
   方の重量につき２０〜１００容量の緩衝溶液の中に溶解
   した血漿または血漿分画の一方の水溶液を準備し、そし
   て （２）工程（ａ）において使用する前に、前記緩衝溶液
   および血漿または血漿分画の得られた水溶液の一方のｐ
   Ｈを調節して、得られる溶液のｐＨを９．０〜１１．０
   にする、 を含んでなることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ４、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含有する血
   漿蛋白質類の水溶液が、コーンフラクションIV−１、コ
   ーンフラクションIV、コーンフラクションIVおよびIV−
   １の再加工物、およびコーンエフルエントII＋III、コ
   ーンエフルエント I 、および低温上澄み溶液から成る
   血漿分画の群から選択される特許請求の範囲第３項記載
   の方法。 ５、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含有する血
   漿蛋白質類の水溶液が、コーンフラクションIV−１、コ
   ーンフラクションIV、コーンエフルエントII＋IIIおよ
   びコーンエフルエント I から成る群より選択される特
   許請求の範囲第３項記載の方法。 ６、アルファ−１−プロティナーゼ阻害剤を含有する血
   漿蛋白質類の水溶液がコーンフラクションIV−１である
   特許請求の範囲第３項記載の方法。 ７、工程（１）において、血漿および血漿分画の一方の
   重量あたり２０〜５０容量の緩衝溶液を使用する特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 ８、工程（１）において、血漿および血漿分画の一方の
   重量あたり２０〜３０容量の緩衝溶液を使用する特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 ９、工程（１）において、血漿および血漿分画の一方の
   重量あたり２４容量の緩衝溶液を使用する特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 １０、緩衝溶液および得られる水溶液の一方のｐＨを調
   節して、得られる溶液のｐＨを９．０〜１０．５にする
   特許請求の範囲第７項記載の方法。 １１、緩衝溶液および得られる溶液の一方のｐＨを、調
   節して、得られる溶液のｐＨを９．０〜１０．５にする
   特許請求の範囲第８項記載の方法。 １２、緩衝溶液および得られる溶液の一方のｐＨを調節
   して、得られる溶液のｐＨを９．０〜１０．５にする特
   許請求の範囲第９項記載の方法。 １３、工程（ｃ）から得られるアルファ−１−プロティ
   ナーゼ阻害剤および抗凝固有効量の抗トロンビン−III
   の少なくとも一方を処理して、感染性微生物を不活性化
   しかつそのの感染性を減少し、アルファ−１−プロティ
   ナーゼ阻害剤をこのような感染性微生物に対して非感染
   性とし、これによりアルファ−１−プロティナーゼ阻害
   剤を治療および予防の目的に対して有用とする追加の工
   程を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 １４、特許請求の範囲第１項記載の方法により製造され
   たプロテアーゼ阻害有効量のアルファ−１−プロティナ
   ーゼ阻害剤および抗凝固有効量の抗トロンビン−IIIの
   少なくとも一方と、製薬学的に許容されうる坦体とを含
   んでなることを特徴とする製薬学的組成物。 １５、特許請求の範囲第１３項記載の方法により製造さ
   れたプロテアーゼ阻害有効量のアルファ−１−プロティ
   ナーゼ阻害剤および抗凝固有効量の抗トロンビン−III
   の少なくとも一方と、製薬学的に許容されうる坦体とを
   含んでなることを特徴とする製薬学的組成物。