FI95136C

FI95136C - Menetelmä anneksiinien puhdistamiseksi

Info

Publication number: FI95136C
Application number: FI903508A
Authority: FI
Inventors: Gerhard Bodo; Christiaan Reutelingsperger
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 1989-07-15
Filing date: 1990-07-11
Publication date: 1995-12-27
Also published as: US5258497A; IE902563A1; CA2021147A1; KR0159275B1; DK0409053T3; AU5901590A; IL95082A0; DE4021979A1; NO177787C; NO903149L; EP0409053B1; NZ234492A; NO177787B; FI95136B; IL95082A; KR910002893A; DE59002895D1; PT94674B; EP0409053A1; DD297977A5

Description

95136

Menetelmä anneksiinien puhdistamiseksi. - Förfarande för rengöring av annexiner.

Useimmilla nisäkkäillä esiintyy proteiineja, joilla on veren hyytymistä estäviä vaikutuksia. Nämä proteiinit voidaan jakaa kolmeen ryhmään, jolloin jako perustuu erilaisiin vaikutusmekanismeihin.

1. Proteiinit, jotka muodostavat hyytymistekijän kanssa kompleksin ja tekevät siten hyytymistekijän tehottomaksi. Näihin kuuluvat proteiinit: a) Antitrombiini-III [Thromb. Res. 5, 439 - 452 (1974)], b) c^-proteaasi-inhibiittori [Ann. Rev. Biochem. 52, 655 -709 (1983), c) a2-makroglobuliini [Ann. Rev. Biochem., 52, 655 - 709 (1983)], d) C^-inhibiittori (Biochemistry 20, 2738 - 2743 (1981)], e) Proteaasi neksiini (J. Biol. Chem. 258, 10439 - 10444 (1983)].

2. Proteiinit, jotka hajottavat hyytymistekijän proteolyyt-tisesti kappaleiksi ja siten inaktivoivat hyytymistekijän. Tämän lajin ainota proteiinia on kuvattu tähän mennessä proteiini C:nä (J. Biol. Chem. 251, 355 - 363, (1976)].

3. Proteiinit, jotka suojaavat ja/tai hydrolysoivat negatiivisesti varautuneita fosfolipidejä siten, että fosfoli-pidistä riippuvaiset verenhyytymismekanismin reaktiot estyvät. Tähän mennessä on kuvattu vain fosfoiipaaseja, : jotka on eristetty erilaisista käärmeenmyrkkylajeista [Eur.

J. Biochem. 112, 25 - 32 (1980)].

2 95136

Vaiheittain tapahtuvaa hyytymisjärjestelmää on viime vuosina tutkittu intensiivisesti. Sillä ymmärretään itsestään voimistuvaa erilaisten toisiinsa sitoutuneiden proteolyyt-tisten reaktioden monivaiheista järjestelmää! jossa entsyymi muuttaa käytebakteerin aktiiviseen muotoon [vrt. Jackson C. M., Nemerson Y., Ann. Rev. Biochem. 49, 765 - 811 (1980)]. Tämän reaktion nopeutta lisää ratkaisevalla tavalla fosfo 1ipidien ja muiden kofaktoreiden, kuten faktori lAin ja faktori VIII, :n läsnäolo. Prokoagulaatioreaktioita säätelevät in vivo erilaiset inhibitiomekanismit, jotka ehkäisevät herkästi puhkeavan tromboottisen trauman hyyty-misasteen vähäisen aktivoinnin jälkeen.

Hyytymistä vastustavat mekanismit voidaan jakaa seuraavasti [Rosenberg, R. D., Rosenberg, J. S., J. Clin. Invest. 74, 1-6 (1984)]: 1. Seriiniproteaasifaktori Xa ja trombiini inaktivoituvat seurauksena niiden sitoutumisesta antitrombiini III:een tai antitrombiinin ja hepariinin kompleksiin. Sekä protrombii-nin aktivointi että myös fibriinin muodostuminen voidaan estää tällä tavoin. Antitrombiini Ulin ohella on vielä muita erilaisia plasmaproteaasi-inhibiittoreita kuten esimerkiksi a2-makroglobuliini ja antitrypsiini, joiden vaikutus on ajasta riippuvainen.

2. Proteiini C:n keksiminen johti toisen hyytymistä vastustavan mekanismin julkituloon. Kun proteiini C on aktivoitu, se vaikuttaa proteiini-kofaktoreiden Va ja VIIIa selektiivisen proteolyysin kautta, joka inaktivoi veren hyytymistä vastustavana tekijänä protrombinaasin ja enstyymin, joka muuttaa faktori X:n.

3. Plasmiini pilkkoo monomeerista fibriini l:tä, tuotetta, joka muuttaa trombiinin fibrinogeeniksi, mikä estää liu- 95136

3 I

kenemattoman fibriinin muodostumisen [Nossel, H. L., Nature, 291, 165 - 167 (1981)].

Edellä mainituista, hyytymisprosessiin osallisista, elimistön omista proteiineista on tällä hetkellä vain antitrom- j biini III kliinisessä käytössä. Huomattavana haittapuolena on kuitenkin käynyt ilmi verenvuototaipumuksen lisääntyminen käytettäessä tätä proteiinia.

t i

Kaikki tähän mennessä veren hyytymistä estävinä tekijöinä j käytetyt aineet, jotka ovat luonteeltaan joko elimistön omia tai synteettisiä, tekevät jollakin tavalla hyytymistekijät tehottomiksi ja johtavat siten sivuvaikutuksiin, jotka voivat vaikuttaa haitallisesti hyytymisprosessiin.

Yllättäen on nyt voitu eristää näiden proteiinien ohella muita elimistön omia aineita, joilla on toivotut verenhyytymistä estävät ominaisuudet erityisissä olosuhteissa, mutta jotka eivät tällöin lisää verenvuodon vaaraa. Verenvuodon ollessa suuri nämä proteiinit menettävät verenhyytymistä estävät ominaisuutensa eikä niiden käyttö häiritse siten tällaisissa tapauksissa elintärkeitä hyytymisproses-seja. Koska ne eristettiin ensimmäisen kerran voimakkaasti . suonittuneesta kudoksesta, nimettiin ne nimellä "vascular anticoagulating proteins", eli VAC (verisuonten veren hyytmistä estävät proteiinit).

Voimakkaasti suonittuneista kudoksista, kuten napanuoran suonista ja istukasta eristettyjen proteiinien molekyyli-

O O O

paino on noin 70 x 10 , noin 60 x 10 , noin 34 x 10 ja noin 32 x 10^, joista aineet, joiden molekyylipaino on 34 tai 32 x 10^, koostuvat yhdestä ainoasta polypeptidiketjus-ta. Näiden proteiinien tarkka luonnehdinta, sekä niiden eristäminen ja puhdistus ilmenevät patentista EP-A-0 181 465.

95136

Proteiinit, joilla on VAC-aktiivisuus, ovat luonnollisia veren hyytymistä estäviä aineita, jotka osallsituvat veren-hyytymisvaiheissa kahteen kohtaan.

Ensimmäisen kerran ne inhiboivat faktoreiden IXa ja Villa katalysoimaa faktorin X aktivoitumista Xa:ksi, toisen kerran ne estävät protrombiinin pilkkoutumisen trombiinik-si, mitä tekijät Xa ja Va välittävät. Molemmille aktivoin-tivaiheille on yhteistä se, että ne tarvitsevat kalsium-ioneja ja fosfoiipidejä. Ilmeisesti VAC-proteiinit voivat samoin esiintyä fosfoiipidien kanssa vuorovaikutuksessa ja tämä sidos estää hyytymistekijöiden aktivoitumisvaiheet.

Kuten myöhemmin on käynyt ilmi, on olemassa kokonainen perhe, jotka sitoutuvat kuten VAC fosfoiipideihin kalsiumista riippuen ja häiritsevät fosfoiipidipinnoista riippuvaisia prosesseja.

Tähän perheeseen, jonka jäseniä kutsutaan myös anneksii-neiksi, kuuluvat lipokortiini I:n, kalpaktiini I:n, proteiini II:n, lipokortiini III:n, p67-kalelektriinin ohella myös IBC, PAP, PAP I, PP4, endoneksiini II ja lipokortiini V.

Anneksiinien yhteiset rakenteelliset tunnusmerkit ovat n· todennäköisesti perusteena niiden samanlaisille Ca :n ja fosfoiipidien sitoutumisominaisuuksi 11 e. Vaikka tämä yleinen ominaisuus koskee kaikkia anneksiineja, ne ovat selvästi yksilöllisiä Ca^+:aan ja erilaisiin fosfolipidilajeihin kohdistuvan af finiteettinsa suhteen.

Anneksiinien fysiologiset tehtävät koskevat membraaneihin liittyviä prosesseja. VAC:n verenhyytymistä estävän vaikutuksen perusmekanismi tunnistettiin fosfo 1ipidien katalyyttisen kapasiteetin estämisenä, mikä aiheutui VAC:n sitou 5 95136 tuessa fosfoiipidien pinnalle, minkä avulla estetään veren hyytymistä edistävän kompleksin muodostuminen niiden pinna1 la.

Myös muut anneksiinit voivat estää veren hyytymistä, mutta VAC näyttää kuitenkin olevan tehokkain inhibiittori.

Sitoutumistutkimukset ovat osoittaneet, että VAC liittyy kalsiumista riippuen prokoagulaatioon vaikuttaviin fosfo-lipideihin palautuvasta.

Myös muut kaksiarvoiset kationit ryhmästä, johon kuuluvat Cd24^ Zn2+, Mn2+ ja Co2+, vaikuttavat positiivisesti 1iittymiseen, mutta eivät kuitenkaan siinä määrin kuin Ca2+.

Ominaisuudet tekevät näistä proteiineista mielenkiintoisia, farmakologisesti äärimmäisen arvokkaita vaikuttavia aineita. Geenitekniset menetelmät, joiden avulla on ollut mahdollista valmistaa VAC-proteiineja, on kuvattu patentissa EPÄ 293 567, jonka opetus otetaan tässä nimenomaan huomioon .

Tämän keksinnön tehtävä oli parantaa patentissa EPÄ 293 367 kuvattua menetelmää VAC-proteiinien eristämiseksi ja puhdistamiseksi .

Patentista EPÄ 293 567 tunnetussa menetelmässä mainittujen proteiinien eristämiseksi ja puhdistamiseksi suspendoitiin jäädytetty biomassa sopivaan 1iuotuspuskuriin. Solut hajotettiin seuraavaksi mekaanisesti käyttäen esimerkiksi Manton-Gaulin -puristinta. Ei-proteiinisten aineosien saostusaineen, kuten polyetyleeni-imiinin lisäämisen jälkeen kiinteät aineosat poistettiin esimerkiksi sentrifugoi-malla. Edullisesti ammoniumsulfaattifraktionnin avulla 6 95136 tapahtuneen proteiinien saostamisen, sakan liuottamisen, saostusaineen poistamisen ja liuoksen selkeyttämisen jälkeen saatu uute saatettiin erilaisiin kromatografisiin puhdistusvaiheisiin. Proteiinien saostamisen asemesta voidaan raaka VAC-uute esipuhdistaa kromatografisesti siten, että se voidaan seuraavaksi saattaa puhdistuskier-toon. Sopivaksi esipuhdistuksen pyiväsmateriaaliksi on osoittautunut esimerkiksi Si02» mutta sopivia ovat myös muut materiaalit, joilla on samanlaiset ominaisuudet. Keksinnönmukaisesti käytettiin Grace -yhtiön piidioksidika-talyyttiä Silica Catalyst, Carrier, Grade 953 W.

Keksinnönmukaisten proteiinien puhdistamiseen sopiva kromatografinen puhdistuskierto koostuu esimerkiksi DEAE-Fast-Flow-Sepharose -kromatografiästä, Sephacryl S-200 High Resolution -kromatografiästä ja Q-Sepharose-Fast-Flow -kromatografiästä. Näin saatujen keksinnönmukaisten proteiinien puhtaus määritettiin SDS-PAGE:n, Western Blot, geeli-läpäisy-HPLC:n, vastavirta-HPLC:n ja isoelektrisen poltto-pisteytyksen avulla.

Tämän menetelmän mukaisesti suoritetussa solujen liuotukse-sa ja uutossa saatiin edelleen puhdistettavan materiaalin saannoksi noin 50 %.

Parantamalla tätä menetelmän vaihetta tämän keksinnön mukaisesti on yllättäen mahdollista, että tämän vaiheen jälkeen lisääntynyt saanto on yli 80 %.

. Tämä parannus saavutettiin yllättäen asettamalla liuotettu jen solujen homogenoidun suspension pH-arvo 9 - 10:ksi, edullisesti arvoon 9,0. Erityisen edullinen vaikutus saavutetaan, kun seuraavaksi lisätään kaksiarvoisia kationeja, erityisesti Ca^+-ioneja ja fosfolipidejä, kuten kefaliinia ja lesitiiniä, edullisesti lesitiiniä. Tämän toimenpiteen 7 95136 avulla adsorboituvat homogeenisessa suspensiossa olevat VAC-proteiinit isäntäorganismin, edullisesti E. colin, solumembraanei1le. Tämä adsorptiovaihe in situ sallii yllättäen homogeenisen suspension häiritsevien liukoisten aineosien poistamisen yksinkertaisesti pesemällä. Kiinteään "kantajaan" sitoutuneiden VAC-proteiinien desorptio tapahtuu kelatoivien aineiden, edullisesti EDTA-pitoisen puskurin avulla.

Tämän keksinnön yksi näkökohta on menetelmän tuottaminen anneksiinien puhdistamiseksi, menetelmän ollessa tunnettu siitä, a) että liuotettujen solujen homogeenisen suspension pH-arvo säädetään 6,0 - 10:ksi, b) että lisätään kaksiarvoista kationia, joka on valittu ryhmästä, joka sisältää Ca^+:n, Cd^+:n, Zn^+:n, Mn^+:n ja Co^+:n, c) että lisätään fosfolipidi, d) että liukoiset aineosat poistetaan pesemällä solujäännös ja e) että proteiinit uutetaan solujäännöksestä kelatoivien aineiden avulla.

Fosfoiipidien lisäys (vaihe C) voi tapahtui kerralla tai ’’ vaiheittain.

Edullisesti voidaan käyttää kaksiarvoisten kationien seos-ta, esimerkiksi Ca‘ :aa yhdessä Zn :n kanssa, jolloin kationien molaarinen suhde asetetaan siten, että anneksii-. nien, esim. VAC:n adsorptio solujen pinnalle on maksimaa lista.

Puhdistettaessa E. colin avulla esille saatuja anneksiineja voitiin yllättäen selvästi vähentää E. colin proteiinien (ECP) osuutta lisäämällä BPA:ta (Bioprocessing Aids, yhtiö θ 95136 TOSOHAAS). Tämän lisäksi EDTA-uuton jälkeen saatuun raaka-uutteeseen lisättiin BPA:ta, esimerkiksi BPA-1000:tta, BPA-1050:ttä tai BPA-2100:aa, edullisesti BPA-1000:tta, ja sekoitettiin. Lisätty määrä voi olla 1-20 tilavuus-%:a, edullisesti 5-10 tilavuus-%:a ja erityisen edullisesti 10 tilavuus-%:a. Sakka sentrifugoidaan pois. Siihen liittyvät proteiinien seostaminen ja kromatografiavaiheet. Lisäämällä BPA:ta voitiin ECP:n pitoisuus laskea jo tässä vaiheessa 2 %:iin lähtöarvosta. VAC:n pitoisuus väheni sitävastoin vain 6 %:a.

Toinen saannon parannus voitiin yllättäen saavuttaa, kun käymisannoksen solut inaktivoitiin ennen solujen liuottamista. Inaktivointiaineina voidaan käyttää yksinkertaisia aromaattisia yhdisteitä, mm. bentsolia, toluolia, fenolia, ksylolia tai kresolia. Erityisen edullista on m-kresolin käyttäminen.

Esikytkemällä tämä inaktivointivaihe muun edellä kuvatun menetelmän vaiheen yhteyteen uutossa saatava saanto lisääntyy yli 98 %:n.

Patentista EPÄ 293 567 tunnetut puhdistusvaiheet liittyvät adsorptio/desorptiovaiheeseen. Tässä tarvittavat paramet- « rit, kuten lämpötila, määräsuhteet, yksittäisten vaiheiden suoritusjärjestys, pH-arvot, erityiset reagenssit jne ovat hyvin ammattimiehen tiedossa. Seuraavassa esitettäviä esimerkkejä voidaan haluttaessa muunnella sopivalla, ammattimiehelle tutulla tavalla. Erityisesti mainittakoon, että . esimerkit eivät aseta rajoituksia puhdistettaville proteii neille. Anneksiinien yhteisten rakenteellisten tunnusmerkkien sekä yleisten ominaisuuksien perusteella keksinnönmu-kainen menetelmä on käyttökelpoinen myös muiden anneksiinien puhdistamiseen, erityisesti se sopii IBC-, PAP-, PAP I-, PP4-, endoneksiini-, lipokortiini V-ja VAC-anneksiinien 9 95136 puhdistamiseen.

Yleensä keksinnönmukainen menetelmä on käyttökelpoinen eristettäessä ja puhdistettaessa anneksiineja voimakkaasti suonittuneista kudoksista.

Käytettyjä reagensseja koskevat tiedot ovat vain esimerkinomaisia alkuperätietoja eivätkä aseta mitään rajoituksia.

Kuvien selitykset

Kuva 1: Phenyl-Sepharose Fast Flow -kromatografiän eluoin-tiprofiili (<- -> * VAC-pooli)

Kuva 2: Q-Sepharose Fast Flow -kromatografiän eluointipro-fiili (<- -> * VAC-pooli).

Esimerkki 1

Ca++:n ja lesitiinin lisääminen, pesu ja uutto

Suspendoitiin sulamisen jälkeen sekoittamalla (noin 1 tunti, jäähdytys jään avulla) 122 g jäädytettyä ei-inakti-voitua solumassaa, joka oli peräisin kloonista E. coli • HB101/pRH291 käymisestä no. 524, 500 m:aan 1iotuspuskuria ja sitten suspensio homogenoitiin Ultra-Turrax T 45/6:n avulla (noin 1 min., jäähdytys jään avulla).

Liuotuspuskuri: 100 mM TRIS 12,14 g/1000 ml, Merck Θ382 1 mM EDTA 0,37 g/1000 ml, Titriplex III, Merck 8418 200 mM NaCl 11,69 g/1000 ml, Merck 6404

Liuotuspuskurin pH-arvo asetetaan 9,0:ksi 32 %:sen HCl:n « avul1 a.

10 95136

Suspensio homogenoidaan kolme kertaa noin 41400 kPa:n paineessaa Manton Gaulin Presse Type 15 M 8TA-puristimen avulla, jolloin tuotteen keräysastia jäähdytetään jään avulla. Laite pestään seuraavaksi kaksi kertaa käyttäen kummallakin kerralla 150 - 200 ml 1iuotuspuskuria (uutteen kokonaistilavuus: 1000 ml).

2. Ca++:n ja lesitiinin lisääminen VAC:n adsorboimiseksi 1iukenemattomaan so 1ujäännökseen.

Homogenoituun tuotteeseen lisätään tuoreena 0,55 g kalsium-kloridia (Merck 2083) - loppukonsentraatio 5 mM - ja 6,1 ml les itiini 1iuosta (200 mg/ml kloroformia). Loppukonsentraatio 1 g lesitiiniä / 100 g biomassaa.

Seosta homogenoidaan 1 minuutin ajan Ultra Turraxin avulla ja sekoitetaan 60 minuuttia jäähauteessa.

Lesitiini: Soijapapujen lesitiini, käyttökelpoinen, Serva 57556.

Sitten suspensioon lisätään 110 ml:aa 5 %:sta polymiini1i-uosta (valmistettu 50 %:sesta Polymin P:stä, Serva 33141, laimennettu 5 %:seeksi ja neutraloitu pH-arvoon 8 5 N HCl:n avulla) ja sekoitetaan vielä 30 minuutin ajan. Loppukonsentraatio 0,5 X. Seuraavaksi suspensio sentrifugoidaan kirkkaaksi (sentrifugi Beckman High-Speed Zentrifuge J2-21, roottori JA 10, 8000 rpm, 30 min., säätö 2 °C:n lämpötilassa) .

Jäännös I: 1020 ml (4,25 mg proteiinia/ml; 0,05 mg VAC/ml).

Il 11 95136 3. Solujäännöksen pesu liukoisten aineosien poistamiseksi

Solujäännös suspendoidaan 600 ml:aan pesupuskuria Ultra-Turraxin avulla ja sitä sekoitetaan sitten 30 minuutin ajan.

Pesupuskuri: 100 mM Tris 200 mM NaCl 5 mM CaC^

Pesupuskurin pH-arvo säädetään 9,0 + 0,l:ksi 32 %:sen HCl:n avulla.

Solujäännös saadaan sentrifugoimalla kuten edellä.

Jäännös II: 580 ml (1,35 mg proteiinia/ml; 0,04 mg VAC/ml).

Suspension sekoittaminen 350 ml:aan pesupuskuria, seuraava homogenointi ja sekoittaminen toistetaan vielä. Seuraavaksi tuote sentrifugoidaan.

Jäännös III: 340 ml (0,93 mg proteiinia/ml; 0,02 mg VAC/ml).

4. VAC:n uutto EDTA-pitoisella puskurilla

Rakeet homogenoidaan 900 ml:aan uuttopuskuria UItra-Turra-: xissa ja tuotetta sekoitetaan yön yli jäähdytyshuoneessa.

Uute sentrifugoidaan kuten edellä on kuvattu ja saadaan kirkas liuos = raakauute.

Raakauute: 915 ml (1,98 mg proteiinia/ml; 0,65 mg VAC/ml).

12 95136

Uuttopuskuri:

20 mM TRIS 50 mM EDTA

Uuttopuskurin pH-arvo säädetään 7,5 + 0,l:ksi 5 N NaOH:n avulla.

Katsaus pesutoimintaan ja uuttoon: Jäännös I 1020 ml 4335 mg proteiinia 49 mg VAC:tä Jäännös II 580 ml 783 mg proteiinia 22 mg VAC:tä Jäännös III 340 ml 316 mg proteiinia 5 mg VAC:tä 5434 mg proteiinia 76 mg VAC:tä (11%)

Raakauute VAC 915 ml 1816 mg proteiinia 594 mg VAC:tä 122 g:ssa solumassaa VAC:n kokonaismäärä 670 mg (89 %).

Esimerkki 2 Yleiskatsaus: 1. Inaktivointi 2. Solujen liuottaminen 3. Ca++:n ja lesitiinin lisääminen VAC:n adsorboimiseksi liukenemattomaan solujäännökseen 4. Solujäännöksen pesu liukoisten aineosien poistamiseksi 5. VAC:n uuttaminen EDTA-pitoisella puskurilla 6. 35 %:sen kyllästetyn ammoniumsulfaatin lisääminen ja sakan poistaminen 7. Pheny1-Sepharose Fast Flow -kromatografia . 8. VAC-poolin dialyysi ja Q-Sepharose Fast Flow -kromato- grafia 1 9. VAC-poolin väkevöinti ja Sephacryl S-200 HR -kromatograf ia.

1! ’ i : i ! ί i * i 9513$ 13 1. Inaktivointi Käyminen saadaan päätökseen noin 17 tunnin kuluttua siitä, kun fosfaatti on lisätty väliaineeseen. Sitten lisätään 10 mM CaCl2:ta ja lämpötila säädetään siten, että jäähtyminen tapahtuu mahdollisimman nopeasti 5-8 eC:seen. Muut säädellyt parametrit (kuten tuuletus, sekoitus, pH-arvo, paine jne) pysyvät samoina. Noin 10 minuutin kuluttua lisätään 7 ml/1 m-kresolia, sitten säädetään paine, tuuletus ja pH ja sekoitusta vähennetään siten, että kresolin avulla saavutetaan hyvä käymis1iuoksen sekoittuminen, mutta vaahdonmuodostus rajoittuu. Näissä olosuhteissa tapahtuu inaktivointi vähintään 3 tunnin, maksimaalisesti 15 tunnin kuluessa (lämpötila edelleen 5-8 °C).

2. Solujen liuottaminen

Ca++:n ja lesitiinin lisääminen, pesu ja uuttaminen

Sulatuksen jälkeen suspendoidaan sekoittaen 286 g m-kresolin avulla inaktivoitua solumassaa, joka on peräisin kloonista HB 101/pGN25, 750 ml:aan liuotuspuskuria (noin 1 tunti, jäähdytys) ja sitten suspensio homogenoidaan Ultra-Turrax T 45/6:n avulla (noin 1 min., jäähdytys jään avulla).

»

Liuotuspuskuri: 100 mM TRIS 1 mM EDTA 200 mM NaCl

Liuotuspuskurin pH-arvo säädetään 9,0 + 0,l:ksi 32 %:sen HC1:n avulla.

Suspensio homogenoidaan 3 kertaa noin 41 400 kPa:n paineessa käyttäen Manton Gaulin Presse Type 15 M 8TA -puristinta, 14 95136 jolloin keräysastia jäähdytetään jään avulla. Laite pestään seuraavaksi kaksi kertaa käyttäen kummallakin kerralla 150 - 200 ml 1iuotuspuskuria: Homogenoidun tuotteen tilavuus 1400 ml.

2. Ca++:n ja lesitiinin lisääminen VAC:n adsorboimiseksi liukenemattomaan solujäännökseen

Homogenoituun tuotteeseen lisätään 0,55 g CaCl2:a (Merck 2083)/1000 ml (loppukonsentraatio 5 mM) (liuotettu noin 10 ml:aan H20:ta) ja 1 g lesitiiniä/100 g biomassaa, joka on liuotettu kloroformiin (noin 0,2 g/ml).

Seosta homogenoidaan 1 minuutin ajan Ultra-Turraxin avulla ja seekoitetaan sitten 60 minuutin ajan jäähauteessa.

Lesitiini: Soijapapujen lesitiini, käyttökelpoinen, Serva 57556.

Seuraavaksi suspensioon lisätään 0,11 tilavuus-%:a poly-miiniliuosta (valmistettu 50 %:sesta Polymin P:stä, Serva 33141, laimennettu 5 l:seksi ja neutraloitu pH-arvoon 8 5 N HCl:n avulla) ja sitä sekoitetaan vielä 30 minuuttia. Loppukonsentraatio 0,5 %. Seuraavaksi suspensio sentrifu-goidaan kirkkaaksi (sentrifugi Beckman High-Speed Zentri-fuge J2-21, roottori JA 10, 8000 rpm, 30 min, säätö 2 °C:n lämpötilassa).

Jäännös I: 1200 ml (5,8 mg proteiinia/ml; 0,01 mg VAC:tä/- ml).

3. Solujäännöksen pesu liukoisten aineosien poistamiseksi

Solujäännös suspendoidaan noin 1000 ml:aan pesupuskuria Ultra-Turraxin avulla ja sitä sekoitetaan seuraavaksi 30 li 15 95136 minuutin ajan.

Pesupuskuri: 100 mM TRIS 200 mM NaCl 5 mM CaC^

Pesupuskurin pH—arvo säädetään 9,0 + 0,l.'ksi 32 sen HCl:n avulla.

Solujäännös otetaan talteen kuten edellä sentrifugoinnin avulla.

Jäännös II: 1000 ml (1,94 mg proteiinia/ml; 0,01 mg VAC:-tä/ml).

1000 ml:n pesupuskurissa olevan suspension homogenointi ja sekoittaminen toistetaan jälleen ja seuraavaksi suspensio sentrigfugoidaan.

Jäännös III: 1000 ml (0,79 mg proteiinia/ml; 0,01 mg VAC:-tä/ml).

*; 4. VAC:n uuttaminen EDTA-pitoisella puskurilla

Rakeet homogenoidaan 1350 ml:aan uuttopuskuria Ultra-Turra-xissa ja saatua tuotetta sekoitetaan yön yli jäähdytyshuo-neessa. Uute sentrifugoidaan kuten edellä on kuvattu ja saadaan kirkas liuos = raakauute.

Raakauute: 1350 ml (3,35 mg proteiinia/ral; 1,46 mg VACitä/-ml).

16 95136

Uuttopuskuri :

20 mM THIS 50 mM EDTA

Uuttopuskurin pH-arvo säädetään 7,5 + 0,l:ksi 5 N NaOH:n avu 11a.

Katsaus pesutoimenpiteeseen ja uuttoon: Jäännös I 1 200 ml 6 960 mg proteiinia 12 mg VAC:tä Jäännös II 1 000 ml 1 940 mg proteiinia 10 mg VAC:tä Jäännös III 1 000 ml 790 mg proteiinia 10 mg VAC:tä 9 690 mg proteiinia 32 mg VAC:tä (2 %).

Raakauutto VAC 1 350 ml 4 522 mg proteiinia 1 971 mg VAC 266 g:ssa solumassaa VAC:n kokonaismäärä 2 003 mg (98 l).

5. - 6. Seostaminen 35 %:sessa kyllästetyssä ammoniumsul-faatissa ja Phenyl-Sepharose Fast Flow -kromatografia.

Saostaminen ammoniumsulfaatilla

Raakauutteeseen lisätään 209 g/1 kiinteätä ammoniumsui faat-tia (Merck 1217) hitaasti sekoittaen. Tämä tuottaa 35 %:sen kyllästysasteen. Kun liusta on sekoitettu vähintään yhden tunnin ajan jäähdytyshuoneessa, se sentrifugoidaan kirkkaaksi (olosuhteet kuten edellä) ja sakka heitetään pois. Li-os pumpataan nopeudella 8-10 ml/min FPLC-laitteeseen, etukäteen valmistetulle Phenyl-Sepharose FF -täytteelle.

Kirkkaaksi sentrifugoitua 35 %:sta kyllästettyä ammonium-sulfaattijäännöstä käsiteltiin edelleen 2:ssa suunnilleen samanlaisessa osassa ja kaikki seuraavat puhdistusvaiheet suoritettiin kaksi kertaa peräjälkeen.

li 17 95136

Pylvään esivalmistelu

Pharmacia-pylväs, joka on tyyppiä XK 26/40 (täytetilavuus noin 200 ml), täytetään Phenyl-Sepharose Fast Flow -täytteellä (Pharmacia, koodin no 17-0965) ja tasapainotetaan puskurilla A. Siihen tarvitaan 2-3 pylvään tilavuutta (CV) puskuria. Pylväs kytketään FPLC-laitteeseen. Kromato-grafia kokonaisuudessaan tapahtuu huoneenlämpötilassa.

Puskuri A:

50 mM TRIS

Puskurin pH-arvo säädetään 7,2 + 0,l:ksi väkevän HCl:n avulla. Siihen lisätään sitten 209 g/1000 ml kiinteätä am-moniumsulfaattia (Merck 1217).

Puskuri B:

Kuten puskuri A, mutta ilman ammoniumsulfaattilisäystä. Kromatografia

Eluaattia kontrolloidaan mittaamalla 0D 280 nm. Kun näyte on viety pylvääseen, pestään puskurilla A, kunnes 0D 280 nm palaa alkuperäiseen arvoonsa. Sitten käytetään gradient-• tia puskuri A - puskuri BO- 100 %:iin B:tä 5 pylvään tilavuutta (1000 ml) sitoutuneen VAC:n eluoimiseksi. VAC on ensimmäinen huomattava piikki gradientin alkamisen jälkeen (katso eluointidiagrammia; kuva 1). Läpikulkevan, VAC-poolin ja mahdollisesti muiden 0D-profiilin piikkien näytteet tutkitaan SDS-PAGE:n avulla. VAC-poolin testaus: proteiinimääritys, VAC-testaus, SDS-PAGE.

Pylvään regenerointi:

Phenyl-Sepharose -täyte regeneroidaan 2 tilavuudella 6 M ureaa. Urean pesemisen jälkeen (1 pylvään tilavuus tislat- 18 95136 tua vettä) se varastoidaan 24 %:sessa etanolissa.

Pylvään yläpäässä värjäytyneiden aineosien poistamiseksi tai välttämiseksi käytetään toista laajennettua pesu— ja regenerointimenetelmää: 1. 1 pylvään tilavuus tislattua vettä 2. 2 pylvään tilavuutta 6 M ureaa (Merck 8487) 3. 1 pylvään tilavuus tislattua vettä 4. 1 pylvään tilavuus 0,1 M NaOH:ta 5. Peseminen ja varastointi, 24 %:nen etanoli 6. Ennen käyttöä tasapainotus 3:11a pylvään tilavuudella puskuria A.

7. Q-Sepharose Fast Flow -kromatografia

Jotta VAC-poolin dialyysissä ei käytettäsi liian paljon puskuria Q-Sepharosen puskuria vastaan, haihdutetaan pooli ensin AMICON-ultrasuodatuskammiossa käyttäen YM 10 -suodatinta: noin 150 ml:ksi. Sitten suoritetaan dialyysi puskuria A vastaan.

Puskuri A: 20 nM bis-TRIS.

Puskurin pH-arvo säädetään 6,3 + 0,l:ksi 5 N HCl:n avulla.

Puskuri B: Puskuri A + 0,35 M NaCl 20 mM bis-TRIS 350 mM NaC1

Puskurin pH-arvo säädetään 6,3 + 0,l:ksi 5 N HCl:n avulla.

: Pylvään esivalmistelu:

Pylväs, joka on tyyppiä HR 16/50 Pharmacia (pylvään tilavuus 100 ml), liitetään FPLC-järjestelmään ja täytetään Q—Sepharose Fast Flow -täytteellä (Pharmacia). Pylväs tasapainotetaan 2 pylvään tilavuudella puskuria A. Kromato-grafia tapahtuu huoneenlämpötilassa.

ii 19 95136

Kromatografia: Näytteen lisääminen pylvääseen tapahtuu nopeudella 4 ml/min. Sitten pestään puskurilla A, kunnes eluaatin OD 280 nm -arvo putoaa alkuperäiseen arvoonsa. Gradienttioh-jelma on seuraava:

0,5 pylvään tilavuutta 0 - 30 % B

8,0 pylvään tilavuutta 30 - 70 % B (tässä toteutetaan erottaminen) noin 1,0 pylvään tilavuutta 100 % B Pesuohjelma:

Kun 100 %:ssa B:tä ei enää eluoidu UV-aktivoitua ainetta, alkaa pesuohjelma: 2 pylvään tilavuutta tislattua vettä 2 pylvään tilavuutta 0,5 N NaOH:a 2 pylvään tilavuutta tislattua vettä

Varastointi: 24 %:nen etanoli.

Ennen käyttöä pestään 2 - 3:11a pylvään tilavuudella puskuria A: Kontrolli-pH 6,3.

Epäpuhtaudet eluoidaan ohjelmassa ennen VAC:tä. Eluointi-* profiili esitetään liitteessä (kuva 2).

8. Sephacryl S-200 HR -kromatografia VAC-pooli haihdutettiin AMICON-ultrasuodattimella YM 10 noin 10 ml:ksi. Tällöin kävi ilmi, että VAC voidaan väke— vöidä ilman ongelmia 100 mg:aan saakka ml:aa kohden (Bio-Rad) ilman ongelmia.

95136.

20

Pylvään esivalmistelu:

Pharmacian K 26/100 -pylväs, jonka täytteen tilavuus on noin 400 ml, täytetään ohjeen mukaan Sephacryl S-200 High Resolution -täytteellä (Pharmacia) ja tasapainotetaan eluointipuskuri1 la (2 pylvään tilavuutta).

Eluointipuskuri: 20 mM NA-fosfaattia, pH s 7,2 150 mM NaC1:a tai 20 mM Bernsteinhapon Na2-suolaa (pH = 7,0) 0,01 % Tween 20:ta

Puskurin pH-arvo säädetään 7,0 + 0,1:ksi 1 N HCl:n avulla. Kromatografia:

Kromatografia tapahtuu jäähdytyshuoneessa. Virtausnopeus on 80 ml/h. OD 280 nm -arvon osoittama piikki kerätään.

Näin puhdistetun VAC:n puhtaus oli > 99 % (RP-HPLC-analyy-si).

Sephacryl-pyivään regenerointi:

Pesuohjelma: 1 pylvään tilavuus tislattua vettä 2 pylvään tilavuutta 0,5 N NaOH:a (+ varastointi joitakin « päiviä) (Pitempiaikaisessa varastoinnissa suositellaan: 1 M NaCl + 0,0025 % NaOH).

Regeneroiminen: 1 pylvään tilavuus tislattua vettä 2 pylvään tilavuutta eluointipuskuria

II

21 95136

Kokonaiskatsaus puhdistukseen:

Puhdistusvaihe Tilavuus Proteiinix VAC-alfaxx (ml) (mg) (mg) Jäännös I 1 200 6 960 12 Jäännös II 1 000 1 940 10 Jäännös III 1 000 790 10

Raakauute 1 350 4 522 1 971 Jäännös, 35 %:nen kyllästetty Am2S0^ 1 500 4 500 2 098

Phenyl-Seph. FF-pooli 975 3 050 2 041

Load Q-Seph. FF 355 3 062 2 277 Q-Seph. FF-pooli 475 2 660 2 082

Load Seph. S-200 HR 23,7 2 446 - (1 859)xxx

Seph. S-200 HR-pooli 192 2 477 2 126 (1 883) x) Biorad -proteiininmääritys (standardi: naudan seerumi albumiini).

xx) VAC-alfa-määritys: Trombiinin muodostumisen estäminen protrombiinista (Reutelingsperger, Hornstra ja Hemker,

Eur. J. Biochem. 151, 625 - 629; 1985). Vertailuna toimi puhdistetu VAC-alfa-preparaatti.

xxx) Proteiinipitoisuus määritetty mittaamalla O.D. 280 nm käyttäen puhtaan VAc-alfan määritettyä tekijää: O.D.

280 nm x 1,277 s mg/iul Vac-alfaa.

Esimerkki 3 EDTA-raakauutteen puhdistus BPA:n avulla.

Esimerkeissä 1 ja 2 kuvattu puhdistus suoritettiin EDTA-pi-toisen puskurin uuttoon saakka (vaihe 4). Lähtöaine oli kerran 295 g ja toisen kerran 240 g biomassaa.

22 95136

Kun raakauute oli saatu» siihen lisättiin 10 tilavuus-%:a BPA 1000:ta ja seosta sekoitettiin 10 minuutin ajan. Muodostunut sakka poistettiin sentrifugoimalla (sentrifugi Beckman -yhtiön High Speed Zentrifuge J2-21, roottori JA 10, 8000 rpm, 30 min 2 °C:n lämpötilassa).

Muu puhdistaminen tapahtui kuten on kuvattu: Kiinteän ammoniumsulfaatin lisääminen 35 l:sen kyllästämisen saavuttamiseksi ja kromatografia edelleen käyttäen Pheny1-Sepha-rose Fast Flow -täytettä (katso edellä).

VAC-alfan tulokset Lähtöaineena oli 295 g biomassaa (Charge B005001)

Vaihe Tilavuus Proteiini VAC-alfa ECP

ml mg/ml mg/ml (tot.) ppm

Raakauute 700 4,0 1,87 (1309) 126000 BPA 1000:n jälkeen 700 2,7 1,77 (1239) 11700

Phenyl-Sepharose ei

Fast Flow -pooli 215 3,23 A,23 ( 909) tehty Q-Sepharose

Fast Flow -pooli 169 3,83 4,70 ( 794) 39

Sephacryl S-200 HR

-pooli (lopputuote) 59,7 10,4 10,9 ( 651) 41 23 95136 VAC-alfan tulokset Lähtöaineena oli 240 g biomassaa (Charge B005001)

Vaihe Tilavuus Proteiini VAC-alfa ECP

ml mg/ml mg/ml (tot.) ppm

Raakauute 680 3,20 1,58 (1074) 776000 BPA 1000:n jälkeen 680 2,00 0,95 ( 646) 19600

Pheny1-Sepharose

Fast Flow -pooli 205 3,73 2,86 ( 586) 2370 Q-Sepharose

Fast Flow -pooli 150 4,55 3,40 ( 510) 45

Sephacryl S-200 HR

-pooli (lopputuote) 56,0 7,10 10,9 ( 414) 35

Claims

95136

1. Menetelmä anneksiinien puhdistamiseksi, tunnettu siitä, a) että liuotetun solumassan homogenoidun tuotteen pH-arvo säädetään välille 8,0 - 10,0, b) että lisätään vähintään yhtä kaksiarvoista kationia ryhmästä, joka sisältää Ca21·^, Cd2+:n, Zn2+:n, Mn2+:n ja Co2·1· :n, c) että lisätään fosfolipidi, d) että liukoiset ainesosat poistetaan pesemällä solujäännös e) että solujäännöksestä uutetaan proteiinit kelatoivien aineiden avulla, ja f) uutetut proteiinit puhdistetaan sinänsä tunnetulla tavalla saostamalla ne ja seuraavaksi käyttämällä proteiinin puhdis-tusvaiheita.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pH-arvo säädetään 9,0:ksi.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään kaksiarvoisena kationina Ca2+:aa ja/tai Zn2+:aa.

4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään fosfolipidinä lesitiiniä.

5. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kelatoivana aineena käytetään EDTA:ta.

6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solut inaktivoidaan edeltäkäsin.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu 95136 siitä, että inaktivointiaineena käytetään yksinkertaisia aromaattisia yhdisteitä, erityisesti bentsolia, toluolia, fenolia, ksylolia tai kresolia, erityisen edullisesti kresolia.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että inaktivointiaineena käytetään m-kresolia.

9. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettava suonen veren hyytymistä vastustava proteiini on VAC tai sitä vastaava proteiini. 26 95136