KR20010034309A - 피브리노겐 정제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 피브리노겐-강화 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다:

(ⅰ) 피브리노겐-함유 용액에 유효량의 설페이트화 다당류(SPS)를 첨가하여 피브리노겐-함유 침전물을 제조하는 단계; 및

(ⅱ) 적어도 0.1 M, 바람직하게는 적어도 0.2 M의 염을 함유하는 용액을 사용하여 단계 (ⅰ)에서 제조된 피브리노겐-함유 침전물로부터 피브리노겐을 추출하여 피브리노겐이 강화된 조성물을 제조하는 단계.

Description

피브리노겐 정제 {PURIFICATION OF FIBRINOGEN}

통상적으로, 사람의 피브리노겐은 전형적인 플라스마 분류법을 사용하여 분리되어 왔다. 에탄올(Blomback and Blomback, 1956), 암모늄 설페이트(Takeda, 1996), β 알라닌/글리신(Jakobsen and Kieruif, 1976), 폴리머(폴리에틸렌 글리콜) 및 이온화도가 낮은 용액(Holm, 1985) 중 하나를 사용하면 플라스마로부터 균질의 피브리노겐이 비교적 높은 수득율로 침전된다.

이온교환 크로마토그래피(Stathakis, 1978) 및 친화성 크로마토그래피 (Kuyas, 1990) 조건을 사용하면 피브리노겐 침전물을 추가 정제할 수 있다. 즉, 특정 오염물질을 흡수시켜 빼낼 수 있다. 예를 들면, 고정된 젤라틴을 사용하면 피브로넥틴이 흡수되고, 고정된 리신을 사용하면 플라스미노겐이 흡수된다(Vuento, 1979).

지난 수십년에 걸쳐 피브리노겐 분자의 전체적인 구조 및 기능이 밝혀져 왔다. 사람 피브리노겐의 아미노산 서열 완성(Henschen and Lottspeich, 1977) 및 다이설파이드 결합의 지정(Blomback et al., 1976, Douma et al., 1978)은 확장된 멀티도메인 분자의 선봉적인 관찰법을 확립시키는 데이터를 제공하였다(Hah and Slayter, 1959). 피브리노겐 유전자의 클로닝 및 cDNA 연구에 의한 사람 피브리노겐의 3사슬의 완전한 아미노산 서열은 종래의 아미노산 서열결정법에 기초하여 앞서 보고된 것들과 일치한다(Chung et al., 1983).

시판용 피브리노겐 제조에는 침전법이 널리 사용되고 있다. 현재는 대안으로서 또는 피브리노겐 농축액의 순도를 개선시키기 위하여 크로마토그래피법이 연구되고 있다.

피브리노겐은 플라스미노겐, 트롬빈, 피브로넥틴, 몇몇 포도상구균주, 및 혈소판과 같이 생리학적으로 중요한 많은 단백질과 상호작용 한다(Doolittle, 1984). 다음을 포함하는 분자의 특정한 부분에 대하여 많은 기능적 특징이 확인되었다: 트롬빈의 촉매작용에 의하여 모체 분자로부터 방출된 피브리노펩타이드 부분, 피브린 공유 안정화 도너 및 억셉터 자리, 탄수화물 클러스터, 중합 자리, 칼슘 결합 자리, 및 피브로넥틴, 플라스미노겐, 박테리아, 및 혈소판 부착 자리.

사람 피브로겐은 피브린에 대하여 강한 친화력을 가지며, 이러한 친화성을 이용하여 피브리노겐을 정제하는 방법이 개발되어 왔다. 세파로스 상에 고정된 피브린은 사람 플라스마로부터 피브리노겐을 분리하는데 사용되었다(Matthias et al., 1975). 단백질 구조의 기능적 연구에 의하여 피브리노겐에 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 피브린의 펩타이드 서열이 동정되었다. Gly-L-Pro-Arg 서열로 시작되는 짧은 펩타이드가 피브리노겐에 결합하는 것으로 밝혀졌다(Laudano and Doolittle, 1978). 이 서열은 트롬빈에 의하여 노출되는 피브린의 α-사슬의 처음 3개의 아미노산에 해당하며, 모든 종류의 척추동물의 피브리노펩타이드 A의 방출을 촉매한다. 최근에는 상기 서열에 제2 프롤린을 첨가하면 Gly-Pro-Arg-Pro 펩타이드의 피브리노겐에 대한 친화도가 거의 10배 가량 증가한다는 사실이 확인되었으며 (Laudano and Doolittle, 1980). 이러한 정보를 기초로 하여, 상기 서열에 해당하는 합성 펩타이드가 피브리노겐에 결합한다는 사실이 밝혀졌다(Gartner and Taylor, 1991).

본 발명은 피브리노겐의 제조 방법에 관한 것이며, 본 발명의 방법을 사용하면 피브로넥틴 및 인자 ⅩⅢ를 제조할 수 있다.

본 발명은 침전법을 사용하여 사람의 혈장의 기타 혈액 단백질, 동결침전물, 제1 침전물 분액, 피브리노겐을 함유하는 기타 플라스마 분액 또는 DNA를 재조합하고 헤파린 침전물을 처리하여 제조되는 피브리노겐 함유 배지로부터 피브리노겐을 대규모로 분리하는 방법에 관한 것이다. 그 밖의 침전법, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피와 같은 단계적 크로마토그래피법 또는 원심여과법을 사용하면 얻어진 피브리노겐-강화 조성물을 균질로 추가 정제할 수 있다.

본 발명자는 피브리노겐이 헤파린이 침전된 페이스트로부터 회수될 수 있으며, 인자 Ⅷ(항혈우병 인자, AHF)의 제조공정으로부터는 부산물이 회수될 수 있다는 사실을 발견하였다. 헤파린 페이스트 침전물을 NaCl과 같은 염을 함유하는 용액에 용해시키면 매우 특이적인 활성을 가지는 피브리노겐 조성물을 제조할 수 있다. 본 발명의 방법은 처리된 플라스마의 폐기 분액으로부터 균질의 피브리노겐을 비교적 높은 수득율로 회수할 수 있다는 점에서 공지된 다른 분리법보다 우수한 것으로 확인되었다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 피브리노겐-강화 조성물의 제조 방법을 포함한다:

(ⅰ) 피브리노겐-함유 용액에 유효량의 설페이트화 다당류(SPS)를 첨가하여 피브리노겐-함유 침전물을 제조하는 단계; 및

(ⅱ) 적어도 0.1 M, 바람직하게는 적어도 0.2 M의 염을 함유하는 용액을 사용하여 단계 (ⅰ)에서 제조된 피브리노겐-함유 침전물로부터 피브리노겐을 추출하여 피브리노겐-강화 조성물을 제조하는 단계.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 용액은 클로라이드, 포스페이트, 및 아세테이트 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 염, 바람직하게는 NaCl을 포함한다. NaCl은 약 0.1 내지 2.0 M, 바람직하게는 약 0.2 내지 0.8 M의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.

보다 바람직한 실시예에서, 상기 용액은 ε-아미노카프로산(ε-aminocaproic acid)을 포함한다.

다른 바람직한 실시예에서, SPS는 무코폴리사카라이드 폴리설페이트, 펜토산 폴리설페이트, 콘드로이친 설페이트, 덱스트란 설페이트, 및 헤파린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤파리노이드이며, 그중 헤파린이 바람직하다.

사용되는 SPS의 함량은 쉽게 결정될 수는 있으나, SPS를 피브리노겐-함유 용액에 첨가하여 SPS의 농도가 적어도 0.15 mg/㎖이 되도록 하는 함량이 바람직하다.

피브리노겐을 치료 목적으로 사용하는 경우에는 피브리노겐을 바이러스 불활성화 단계에 주입하게 될 것이다. 이때, 불활성화 방법은 당업자에게 공지된 것으로서, 가열 및 용매 세제의 처리과정을 포함한다.

피브리노겐-함유 용액은 플라스마(항응고 플라스마 포함), (동결 침전물 및 용해된 분액 Ⅰ과 같은)플라스마 분액, 및 DNA 재조합에 의한 피브리노겐 제조시에 만들어지는 피브리노겐-함유 세포 배지와 같이 당업자에게 공지된 용액들 중 하나일 수 있다. 그러나, 피브리노겐-함유 용액으로는 혈장 분액, 특히 이것의 동결 침전물이 바람직하다.

당업자에게 공지된 방법중 하나를 사용함으로써 피브리노겐-강화 조성물로부터 피브리노겐을 추가 정제할 수 있다. 예를 들면, 염 및/또는 아미노산이 존재하는 단백질 침전물과 함께 피브리노겐을 재침전시키거나 이온교환, 친화성, 소수성 또는 겔 투과 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피법을 사용하거나, 상기 두 방법을 함께 사용함으로써 피브리노겐-강화 조성물로부터 피브리노겐을 정제할 수 있다. 통상적으로는, 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 피브리노겐-강화 조성물로부터 SPS 및/또는 플라스미노겐을 제거한 후 사용한다. 본 발명에 참고로 인용된 하기의 참고문헌들에는 공지된 정제법의 예들이 기재되어 있다:

"Affinity purification of human fibronectin on immobilized gelatine" Regnault V, Rivat C, ＆ Stoltz; Journal of Chromatography, 432 (1988) 93-102

"Isolation of Fibronectin under Mild Conditions" Morgenthaler J, Baillod P ＆ Friedli H; Vox Sang 47(1984) 41-46

"Plasminogen: Purification from human plasma by affinity chromatography" Deutsch D ＆ Mertz E; Science 170(1970) 10951096

"A Pasteurised Concentrate of Human Plasma FactorXIH for Therapeutic Use" Winkelman L, Sims G, Haddon M, Evans D ＆ Smith J; Thrombosis and Haemostasis 55(3)(1986) 402-405

"The Preparation of Human Fibrinogen Free of Plasminogen" Mosesson M; Biochim Biophys Acta 57 (1962) 204-213 US Patent No. 3,340,156

"Severely Heated Therapeutic Factor VIII Concentrate of High Specific Activity" Winkelman L, Owen n, Evans D, Evans H, Haddon M, Smith J, Prince P ＆ Williams J; Vox Sang 5 7(1989) 97-103

"Plasma Protein Fractionation" Heide K, Haupt H ＆ Schwick H; in The Plasma Proteins, 2nd Edition Vol 3 (1977) Putnam F. (Ed)

또한, 피브리노겐-함유 용액의 특성에 따라 피브리노겐-강화 조성물은 피브로넥틴 및 인자 ⅩⅢ를 함유할 수도 있다. 예를 들면, 피브리노겐-함유 용액이 플라스마 또는 플라스마 분액인 경우에는 피브리노겐-강화 조성물에 피브로넥틴 및/또는 인자 ⅩⅢ가 함유될 것이다. 원하는 경우에는 공지된 분리법을 사용하여 피브리노겐-강화 조성물로부터 이들 단백질을 추가 정제할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 피브로넥틴 또는 인자 ⅩⅢ가 강화된 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 피브리노겐-함유 용액이 혈장 분액인 경우에 본 발명의 방법에 따라 제조되는 피브리노겐-강화 조성물로부터 피브로넥틴 또는 인자 ⅩⅢ를 추출하는 단계를 포함한다.

상기에 기재된 바와 같이, 본 발명은 혈장 농축액, 특히 동결 침전물로부터 피브리노겐을 정제하는 방법을 제공한다. 지금까지 사용되어온 상업적으로 가장 중요한 플라스마 농축액으로는 보편적인 혈장 분액의 동결 침전물 및 동결 침전물로부터 제조된 정제 농축액이 있다. 통상적으로, 동결 침전물은 저온 플라스마 분류법을 사용하여 급속 냉동된 사람의 플라스마로부터 제조되는 인자 Ⅷ 및 피브리노겐이 풍부한 침전물을 의미한다.

대표적인 고도의 냉동 플라스마는 5℃ 이하의 온도에서 연화되며, 인자 Ⅷ가 풍부한 동결 침전물은 원심분리에 의하여 수집된다.

이러한 방법으로 제조된 동결 침전물은 상업용 인자 Ⅷ의 공급원으로 사용되어 왔으며 플라스마를 유도하는 전체 혈액 내에 함유된 인자 Ⅷ의 전체 함량의 40 내지 60% 이내로 농축되어 포함된다. 동결 침전물로부터 인자 Ⅷ의 수득율을 개선시키고 이를 추가 정제하고자 하는 많은 연구가 이루지고 있다. 피브리노겐 및 피브로넥틴은 몇몇 처리 단계에서 인자 Ⅷ의 막대한 손실을 초래하기 때문에, 인자 Ⅷ 조성물 내에 피브리노겐 및 피브로넥틴이 고농도로 존재하는 것은 바람직하지 못하다. 피브리노겐은 일반적으로 피브로넥틴보다 훨씬 높은 농도로 혈장 및 동결 침전물 내에 존재하고 제거되기도 어렵기 때문에 특히 중요하다.

Winkleman(AU B55435/86)은 설페이트화 다당류를 첨가하여 인자 Ⅷ 함유 혈장 분액의 완충용액으로부터 피브리노겐 및 피브로넥틴을 침전시키는 단계를 포함하는 인자 Ⅷ 함유 조성물의 제조 방법을 제시하였으며, 그는 또한 pH가 6 내지 8로 유지된 동결 침전물의 완충용액으로부터 피브리노겐이 침전되는 곳에서 인자 Ⅷ를 정제하는 방법을 제시하였다.

헤파린 침전물은 인자 Ⅷ 함유 상청액으로부터 분리되어 폐기된다. 본 발명의 방법을 사용하면 상기 폐기물로부터 유용한 단백질을 정제할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 특징을 보다 명확하게 이해시키기 위하여, 하기 실시예를 참조하여 본 발명을 바람직한 형태로 설명한다.

재 료

완충용액

트리스 완충용액:

50 mM 트리스

5 mM EDTA

5 mM ε-아미노카프로산

0.8 M NaCl

pH 7.3

시트레이트 완충용액:

20 mM Na-시트레이트

5 mM EDTA

5 mM ε-아미노카프로산

0.8 M NaCl

pH 7.3

세척용 트리스 완충용액:

50 mM 트리스

5 mM EDTA

5 mM ε-아미노카프로산

pH 7.3

헤파린 페이스트는 AHF(고순도) 제조 공정에서 생성되는 부산물이다. 얻어진 헤파린 페이스트는 100 g씩 분취하여 -80℃에 저장한다.

방 법

완충용액 최적화 실험

37℃의 물중탕에서 헤파린 페이스트를 해동시키고 30분 동안 실온으로 평형화시켰다. 헤파린 페이스트(6 g)를 50 ㎖의 추출 완충용액에 첨가한 다음, 거품이 발생하지 않을 정도의 속도로 교반하면서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 용해된 페이스트를 4℃에서 10분 동안 4,200 rpm으로 원심분리 하였다. 펠릿 및 상청액의 질량을 측정한 뒤, 펠릿을 제거하였다. 상청액은 5 ㎖씩 분취하여 -80℃에서 동결시켰다.

트리스 완충용액(50 mM 염, 5 mM EDTA, 5 mM ε-아미노카프로산, 0.8 M NaCl, pH 7.3)을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 추출하였다(CLS work book 0525 pp 28-47). 이 과정에서, 완충용액의 성분 및 상태를 추출 과정에 가장 바람직한 조건으로 바꾸어 주었다. 트리스 완충용액의 다양화 조건은 다음과 같다.

- 트리스 완충용액의 한가지 성분을 제거하고 나머지 모든 성분은 일정하게 유지시킴

- 트리스 완충용액의 pH를 변화시킴

- 트리스 완충용액의 NaCl 농도를 변화시킴.

또한, 시트레이트 완충용액(20 mM Na-시트레이트, 5 mM EDTA, 5 mM ε-아미노카프로산, 0.8 M NaCl, pH 7.3)의 완충용액 성분 및 상태를 변화시키고 각각에 대하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 추출하는 능력을 조사하였다.

시트레이트 완충용액의 다양화 조건은 다음과 같다:

- 시트레이트 완충용액의 한가지 성분을 제거하고 나머지 모든 성분은 일정하게 유지시킴

- 시트레이트 용액의 pH를 변화시킴

- EDTA가 제외된 시트레이트 완충용액의 NaCl 농도를 변화시킴

- 시트레이트 완충용액의 Na-시트레이트 농도를 변화시킴.

또한, BP 주입용 물(WFI) 및 O.8 M NaCl을 함유하는 WFI에 대하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 추출하는 능력을 조사하였다.

상청액 내의 전체 응고성 피브리노겐, 전체 단백질, 및 인자 ⅩⅢ을 분석하여 완충용액 각각에 대하여 헤파린으로부터 피브리노겐을 추출하는 능력을 측정하였다.

헤파린 페이스트 농도 실험

일정한 부피의 트리스 완충용액에 용해될 수 있는 헤파린 페이스트의 최대 함량을 측정하였다. (상기에 기재된 방법으로 제조된)헤파린 페이스트의 중량을 측정하여(6 g, 22 g, 및 40 g) 50 ㎖의 세척용 트리스 완충용액에 첨가한 후, 거품이 발생하지 않을 정도의 속도로 교반하면서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 그런 다음, 세척용 완충용액으로부터 페이스트를 분리하여 50 ㎖의 트리스 (추출)완충용액을 함유하는 비커에 넣고, 거품이 발생하지 않을 정도의 속도로 교반하면서 실온에서 30분 동안 배양하였다. 용해된 페이스트를 4℃에서 10분 동안 4,200 rpm으로 원심분리 하였다. 펠릿 및 상청액의 질량을 측정한 뒤, 펠릿을 제거하였다. 상청액은 5 ㎖씩 분취하여 -80℃에서 동결시켰다.

상청액 내의 전체 응고성 피브리노겐, 전체 단백질, 인자 ⅩⅢ의 활성, 및 전체 플라스미노겐을 분석함으로써 상이한 함량의 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 추출하는 트리스 완충용액(일정 부피)의 능력을 측정하였다.

결 과

완충용액 최적화 실험

실험 1

실험 1에서는 트리스 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트를 용해시켜 14.1 mg/㎖의 단백질을 추출하였다. 얻어진 단백질의 75%가 응고성 피브리노겐이었다(표 1 참고).

특정 성분이 제외된 트리스 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트를 용해시켰다. 이 완충용액을 사용한 경우에는 14.2 내지 16.5 mg/㎖ 가량의 단백질이 추출되었으며, 얻어진 단백질로부터 52 내지 83%의 응고성 피브리노겐이 회수되었다(표 1 참고). EDTA가 제외된 트리스 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트를 용해시킨 경우에 최대 함량(83%)의 응고성 피브리노겐이 추출되었다. ε-아미노카프로산이 제외된 트리스 완충용액을 사용하여 헤파린을 용해시킨 경우에는 겨우 52%의 응고성 피브리노겐이 추출되었으며, 트리스가 제외된 완충용액을 사용한 경우에는 66%의 응고성 피브리노겐이 추출되었다(표 1 참고).

＜표 1＞ 특정 성분이 제외된 트리스 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐 추출.

실험 2

실험 2에서는 트리스 완충용액(pH 6.0 내지 8.0)을 사용하여 헤파린 페이스트를 용해시켜 15.0 mg/㎖(pH 7.5의 트리스 완충용액) 내지 17.3 mg/㎖(pH 7.0의 트리스 완충용액)의 단백질을 추출하였으며, 그중 응고성 피브리노겐의 비율은 48%(pH 8.0의 트리스 완충용액) 내지 60%(pH 7.3의 트리스 완충용액)이었다(표 2 참고).

＜표 2＞ 다양한 pH의 트리스 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐 추출.

실험 3

표 3은 다양한 농도의 NaCl(0.2 M 내지 2 M)을 함유하는 트리스 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 추출한 실험에서 얻어진 데이터이다. NaCl의 존재는 헤파린 페이스트의 부분적인 용해를 초래하였다(5.3 g의 헤파린 페이스트가 용해되지 않음). 그 결과, 단백질 및 피브리노겐의 회수율이 낮아졌다: 1.9 mg/㎖의 단백질이 추출되었으며, 그중 겨우 11%만이 응고성 피브리노겐이었다. 0.2 내지 2 M의 NaCl을 함유하는 트리스 완충용액을 사용한 경우에는 상당량의 단백질이 추출되었다. 0.6 M의 NaCl을 함유하는 트리스 완충용액을 사용한 경우에 최대량(8.4 mg/㎖)의 응고성 피브리노겐이 회수되었으며, 염의 농도(0.6 M 이상의 NaCl)가 높아질수록 응고성 피브리노겐의 비율이 감소하였다.

＜표 3＞ 다양한 농도의 NaCl을 함유하는 트리스 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐 추출.

실험 4:

실험 4는 헤파린 페이스트(3 배치)를 용해시키는 능력에 대한 시트레이트 완충용액의 효과를 조사한 것이다. 시트레이트 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 14.7 mg/㎖, 14.0 mg/㎖, 및 17.4 mg/㎖(각각 표 4a, 4b, 및 4c)의 단백질을 추출하였으며, 그중 91%(표 4a), 65%(표 4b), 및 95%(표 4c)가 응고성 피브리노겐이었다. 시트레이트 완충용액에 용해된 헤파린 페이스트에서는 5.2 IU/㎖, 9.5 IU/㎖, 및 8.4 IU/㎖(각각 표 4a, 4b, 및 4c)의 인자 ⅩⅢ가 검출되었다.

또한, 특정 성분이 제외된 시트레이트 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트를 용해시켰다. 시트레이트 완충용액으로부터 EDTA가 제외된 경우에도 헤파린 페이스트로부터 추출되는 단백질, 응고성 피브리노겐, 및 인자 ⅩⅢ의 함량에는 아무런 영향이 나타나지 않았다(각각 14.6 mg/㎖, 99%, 및 4.3 IU/㎖, 표 4a; 각각 13.2 mg/㎖, 113%, 및 6.3 IU/㎖, 표 4b; 각각 14.5 mg/㎖, 106%, 및 4.2 IU/㎖, 표 4c). 마찬가지로, ε-아미노카프로산이 제거된 경우에도 헤파린 페이스트로부터 추출되는 단백질, 응고성 피브리노겐, 및 인자 ⅩⅢ의 함량에는 아무런 영향이 나타나지 않았다(각각 14.6 mg/㎖, 86%, 및 3.9 IU/㎖, 표 4a; 각각 14.5 mg/㎖, 65%, 및 8.0 IU/㎖, 표 4b; 각각 14.7 mg/㎖, 72%, 및 7.8 IU/㎖, 표 4c). 그러나, NaCl이 함유되지 않은 시트레이트 완충용액에는 헤파린이 용해되지 않았으며, 상청액 내에서 단백질 및 피브리노겐을 검출할 수 없었다. Na-시트레이트를 단독으로 사용하는 경우에도 헤파린 페이스트 배치로부터 단백질, 인자 ⅩⅢ, 또는 피브리노겐을 추출할 수 없었다(표 4a, 4b, 및 4c).

＜표 4a＞ 특정 성분이 제외된 시트레이트 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐 추출.

＜표 4b＞ 특정 성분이 제외된 시트레이트 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐 추출.

＜표 4c＞ 특정 성분이 제외된 시트레이트 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐 추출.

실험 5:

시트레이트 완충용액에 가장 적합한 pH를 측정하기 위하여 5.0 내지 9.0 범위의 pH를 테스트하였다. 6.0 내지 9.0 범위의 pH에서 상당량의 단백질 및 응고성 피브리노겐이 추출되었다(13.5 내지 14.2 mg/㎖ 및 85 내지 94%). 그러나, pH 5.0에서는 단지 6.0 mg/㎖의 단백질이 추출되었으며, 그중 20%가 응고성 피브리노겐이었다(표 5 참고).

＜표 5＞ 다양한 pH의 시트레이트 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐 추출.

실험 6:

실험 6에는 EDTA가 제외되고 0 내지 1 M 농도의 NaCl을 함유하는 시트레이트 완충용액을 사용하였다. 상기의 농도 범위를 테스트하기 위하여 2가지 실험을 수행하였다. 실험을 통해, EDTA가 제외된 시트레이트 완충용액 내에서 NaCl의 농도가 증가할수록 헤파린 페이스트의 용해도가 증가한다는 사실을 확인하였다(표 6 참고). 0.05 M 이하의 NaCl을 함유하는 EDTA가 제외된 시트레이트 완충용액에는 극소량의 헤파린 페이스트가 용해되었다. 이는 0.2 내지 0.4 mg/㎖의 단백질 및 0.3 내지 0.6 mg/㎖의 응고성 피브리노겐의 추출로 확인되었다. 2가지 상이한 실험에서, 0.1 M의 NaCl이 존재하는 완충용액에서는 4.2 내지 1.0 mg/㎖ 가량의 단백질(86 내지 105% 응고성 피브리노겐)이 추출되었다. 0.2 M 이상의 NaCl이 존재하는 경우에는 단백질 추출량이 12.3 내지 14.7 mg/㎖(107 내지 119% 응고성 피브리노겐)으로 증가하였다. EDTA가 제외된 시트레이트 완충용액에 고농도의 NaCl을 첨가한 경우에도 일정 수준의 단백질 및 응고성 피브리노겐이 추출된다는 사실을 확인하였다. 이때 얻어진 수치는 0.8 M의 NaCl을 함유하는 EDTA가 제외된 시트레이트 완충용액 대조군에서 얻어지는 수치와 비슷하였다. 완충용액에 0 내지 0.1 M의 NaCl이 혼합된 경우, 인자 ⅩⅢ의 농도는 검출되지 않는 수준에서 대략 3 IU/㎖ 가량이었다. EDTA가 제외된 시트레이트 완충용액에 (0.2 내지 1 M의)NaCl이 첨가되는 경우에는 인자 ⅩⅢ의 농도가 인정한 상태를 유지하였다. EDTA가 제외된 시트레이트 완충용액에 0.4 M의 NaCl이 첨가되는 경우에 7.8 IU/㎖로 인자 ⅩⅢ의 최대값이 얻어졌다.

＜표 6＞ 다양한 농도의 NaCl을 함유하는 EDTA가 제외된 시트레이트 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐 추출.

실험 7:

표 7은 시트레이트 완충용액 내의 Na-시트레이트의 농도 변화에 따라 회수되는 단백질 및 응고성 피브리노겐의 함량을 자세히 기록한 것이다(실험 7). Na-시트레이트의 농도가 5 mM에서 80 mM로 증가되면서, 추출되는 단백질의 함량도 다소 증가되었다(최소 13.4 mg/㎖, 최대 15.1 mg/㎖)(표 7 참고). Na-시트레이트의 함량이 20 mM로 증가되면서, 응고성 피브리노겐의 함량도 79%에서 107%로 증가하였다 (표 7 참고). 완충용액에 40 mM 및 80 mM의 Na-시트레이트가 첨가된 경우, 응고성 피브리노겐의 함량이 감소한 것으로 관찰되었다(각각 85% 및 74%).

＜표 7＞ 다양한 농도의 Na-시트레이트를 함유하는 시트레이트 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐 추출.

실험 8:

pH 7.3의 WFI를 사용하여 피브리노겐을 추출하였다. 추출된 단백질의 전체 함량은 3.3 mg/㎖로 낮았지만, 모든 경우에서 응고성 피브리노겐(106%)이 검출되었다(표 8 참고). 추출 완충용액으로 0.8 M의 NaCl을 요해시킨 WFI를 사용한 경우, 상당량의 단백질(10.1 mg/㎖)이 회수되었으며, 그중 84%가 응고성 피브리노겐이었다(표 8 참고).

＜표 8＞ WFI를 사용하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐 추출.

실험 9:

헤판린 페이스트 농도 실험

일정한 부피의 pH 7.3 트리스 완충용액에 용해될 수 있는 헤파린 페이스트의 함량을 측정하였다. 50 ㎖의 트리스 완충용액을 사용하여 6 g의 헤파린 페이스트로부터 전체 14.9 내지 17.9 mg/㎖의 단백질을 추출하였으며, 그중 응고성 피브리노겐의 함량은 55% 내지 71% 이었다. 상기 함량의 헤파린 페이스트로부터 추출된 활성 인자 ⅩⅢ의 함량은 4.5 내지 6.2 IU/㎖ 이었으며, 상기 헤파린 페이스트는 14.1 내지 16.6 ㎍/㎖의 플라스미노겐을 함유하고 있었다(표 9 참고).

헤파린 페이스트의 질량을 22 g으로 증가시킨 경우에는 38.6 mg/㎖의 단백질이 추출되었으며, 그중 58%가 응고성 피브리노겐이었다. 추출된 프라스미노겐 및 인자 ⅩⅢ의 함량은 각각 18.6 ㎍/㎖ 및 26.0 IU/㎖이었다(표 9 참고).

대략 40 g의 헤파린 페이스트를 용해시킨 경우에는 48.0 내지 53.1 mg/㎖의 단백질이 추출되었으며(표 9 참고), 그중 56 내지 79%가 응고성 피브리노겐이었다. 상기 함량의 헤파린 페이스트로부터 추출된 활성 인자 ⅩⅢ의 함량은 24.5 내지 27.5 IU/㎖ 이었으며 상기 헤파린 페이스트는 21.5 내지 24.4 ㎍/㎖의 플라스미노겐을 함유하고 있었다(표 9 참고).

＜표 9＞ 일정 부피의 pH 7.3 트리스 완충용액을 사용하여 6 g, 22 g, 및 40 g의 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐 추출.

실험 10:

본 발명의 상업적 이용 가능성을 증명하기 위하여 다량의 헤파린 페이스트를 사용하여 실험을 수행하였다.

결 과

표 10은 AHF(HP) 공정으로 제조된 헤파린 페이스트로부터 추출된 피브리노겐의 특징을 기재한 것이다. 상기 공정은 0.8 mg/㎖의 헤파린을 함유하는 트리스 완충용액에 동결 침전물을 용해시켜 헤파린 페이스트를 제조하는 단계를 포함한다. 1733 내지 2618 kg 가량의 플라스마를 사용하여 제조한 6배치의 AHF(HP) 헤파린 페이스트를 400 mM의 NaCl 및 5 mM의 ε-아미노카프로산을 함유하는 20 mM의 Na-트리스 시트레이트 완충용액을 사용하여 추출하였다. 전체 14.1 내지 16.7 mg/㎖의 단백질이 추출되었으며, 그중 79% 내지 85%가 응고성 단백질이었다. 피브로넥틴 및 플라스미노겐의 함량은 각각 3.9 mg/㎖ 및 46.1 mg/㎖이었다.

표 11은 400 mM의 NaCl 및 5 mM의 ε-아미노카프로산을 함유하는 20 mM의 Na-트리스 시트레이트 완충용액을 사용하여 생물상태(biostate)의 공정으로 제조한 헤파린 페이스트로부터 추출되는 피브리노겐의 특징을 기재한 것이다. (생물상태의 공정은 헤파린을 저농도로 함유하는 물에 동결 침전물을 용해시킨 다음, 헤파린의 농도가 약 1.0 mg/㎖이 되도록 헤파린을 추가로 첨가하여 헤파린 페이스트를 제조하는 단계를 포함한다). 이와 같은 헤파린 페이스트 제조 공정에 사용되는 플라스마의 전체 질량은 1556 내지 1635 kg이었다. 전체 11.5 내지 12.8 mg/㎖의 단백질이 추출되었으며, 그중 응고성 단백질의 함량은 71% 내지 85%이었다. 피브로넥틴 및 플라스미노겐의 함량은 각각 평균 2.75 mg/㎖ 및 34.4 ㎍/㎖이었다.

표 12는 단위 kg의 플라스마로부터 얻어지는 피브리노겐의 수득율을 상세히 기재한 것이다. AHF(HP) 공정으로 제조된 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 정제하면 플라스미노겐의 단위 kg 당 평균 0.68 g(0.62 내지 0.79 g 범위)의 피브리노겐이 얻어진다. 생물상태의 공정으로 제조된 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 정제하면 플라스미노겐의 단위 kg 당 평균 0.425 g(0.4 내지 0.45 g 범위)의 피브리노겐이 얻어진다.

＜표 10＞ 트리스 완충용액을 사용하여 추출한 동결 침전물 유래의 용해된 헤파린 페이스트의 특징.

＜표 11＞ 물을 사용하여 추출한 동결 침전물 유래의 용해된 헤파린 페이스트의 특징.

＜표 12＞ 플라스마로부터 피브리노겐의 수득율.

트리스 완충용액 또는 물을 사용하여 추출한 동결 침전물로부터 유래된 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 추출하였다. 상기 과정은 대규모(1.5 내지 2.6톤의 플라스마)로 수행되었다. 침전물은 상당량의 단백질을 함유하고 있었으며, 그중 90% 가량이 응고성 단백질이었다. 또한, 상기 추출 물질은 피브로넥틴, 플라스미노겐, 및 인자 ⅩⅢ을 함유하고 있었다.

확인된 바와 같이, 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 추출하는 상기 방법은 피브리노겐, 피브로넥틴, 플라스미노겐, 및 인자 ⅩⅢ를 대규모로 제조하는데 사용될 것이다.

첫 번째 실험의 목적은 pH 7.3의 트리스 완충용액(대조 완충용액)의 어떤 성분이 헤파린 페이스트를 용해시키고 피브리노겐을 추출하는데 필요한 성분인가를 결정하는 것이었다. 완충용액으로부터 트리스, EDTA, 및 ε-아미노카프로산을 제거하여도 대조군과 비교하여 헤파린 페이스트의 용해에는 아무런 차이가 나타나지 않았다. 그러나, EDTA가 제거된 트리스 완충용액 및 ε-아미노카프로산이 제거된 트리스 완충용액에 의하여 추출된 응고성 피브리노겐의 함량에서는 차이가 발견되었다. 즉, 완충용액으로부터 EDTA가 제거된 경우에는 대조군 및 다른 트리스 완충용액에 비하여 다량의 응고성 피브리노겐이 추출되었다. EDTA-함유 완충용액에 의하여 추출되는 피브리노겐의 함량이 낮은 이유는 EDTA에 의하여 초래되는 정량 저해(assay inhibition)에서 기인된 것일 수 있다.

ε-아미노카프로산이 제거된 경우에는 응고성 피브리노겐이 23% 가량 감소하였다. 따라서, ε-아미노카프로산은 헤파린 페이스트의 트리스 추출 완충용액에 중요한 성분일 수 있다.

트리스 완충용액의 pH 변화에 의해서는 헤파린의 용해도 또는 피브리노겐의 추출량에 대하여 주목할만한 차이가 나타나지는 않았다 따라서, 트리스 완충용액의 pH는 pH 7.3으로 유지시켰다.

트리스 완충용액으로부터 NaCl과 같은 염이 제외되면 헤파린 페이스트의 부분적인 용해가 초래되었으며, 이로 인하여 응고성 피브리노겐의 회수율이 낮아졌다. 완충용액에 0.2 M의 NaCl이 첨가된 경우에는 응고성 피브리노겐의 회수율이 증가되었다. 따라서, 헤파린 페이스트를 완전히 용해시켜 응고성 피브리노겐을 추출하기 위해서는 NaCl과 같은 염이 요구된다. 0.2 내지 1.5 M의 NaCl을 함유하는 완충용액에 대해서는 일반적으로 일정한 함량의 응고성 피브리노겐 추출되었으며, 그 수치는 대조군(0.8 M의 NaCl을 함유하는 트리스 완충용액)에 필적하는 값이었다. 2 M의 NaCl을 함유하는 트리스 완충용액의 경우에는 응고성 피브리노겐의 뚜렷한 감소가 관찰되었다. 따라서, NaCl의 농도가 1.5 M 이상으로 높아지면 헤파린 페이스트로부터 추출되는 응고성 피브리노겐의 함량이 영향을 받거나 분석에 방해가 될 수 있다.

트리스 완충용액과 비교하여 용해 능력 및 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 추출하는 능력에 대하여 시트레이트 완충용액을 조사하였다. 시트레이트 완충용액 실험을 위해서는 3종류의 헤파린 페이스트 배치를 사용하였다. pH 7.3의 시트레이트 완충용액은 90% 이상의 응고성 피브리노겐을 추출시킬 수 있었으며, 이는 트리스 완충용액(75%)에 비하여 응고성 피브리노겐이 증가되었음을 의미하는 것이다. EDTA 및 ε-아미노카프로산이 제거된 시트레이트 추출 용액의 경우에도 트리스 완추용액의 성분에 대하여 유사한 결과가 나왔다. 또한, EDTA가 제거된 트리스 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트를 용해시킨 경우에도 응고성 피브리노겐이 증가된(대략 100%) 것으로 확인되었다. 이는 피브리노겐을 추출하는데 EDTA가 필요치 않으며 EDTA-함유 완충용액이 피브리노겐 분석에 방해가 될 수 있음을 의미하는 것이다.

Na-시트레이트의 단독적인 사용은 헤파린 페이스트의 용해에 영향을 주지 않으며, 단백질 및 피브리노겐이 검출되지 않았다. 시트레이트 완충용액 내의 Na-시트레이트의 농도 변화 실험을 통해서는 Na-시트레이트의 농도가 20 mM인 경우에 최대 함량의 응고성 피브리노겐이 회수된다는 사실을 확인하였다. 따라서, 시트레이트 완충용액 내의 Na-시트레이트 농도는 20 mM으로 유지시켰다.

시트레이트 완충용액의 pH 최적화 실험을 통해 pH 6.0 내지 9.0이 헤파린 페이스트로부터 추출되는 응고성 피브리노겐의 함량에 영향을 주지 않는 다는 사실을 확인하였다. pH 5.0이 사용된 경우에는 차이가 관찰되었다. 추출된 단백질의 함량은 테스트된 다른 pH에서 얻어진 함량의 절반 이하였으며, 응고성 피브리노겐 함량도 21%로 감소하였다. 이는 피브리노겐의 활성이 상기 pH에서 영향을 받았음을 보여주는 것이다. 이러한 pH 레벨에서, 시트레이트 완충용액은 대략 90%의 응고성 피브리노겐을 추출시킬 수 있었던 반면, 트리스 완충용액은 대략 60%의 피브리노겐을 추출시킬 수 있었다.

트리스 완충용액 실험에서 관찰된 바와 같이, 헤파린 페이스트를 용해시키고 응고성 피브리노겐을 추출하기 위해서는 EDTA가 제거된 시트레이트 완충용액에 NaCl과 같은 염이 요구된다. EDTA가 제거된 시트레이트 완충용액으로부터 NaCl을 완전히 제거한 경우에는 헤파린 페이스트의 용해도가 감소되었다. 이러한 용해도 감소는 단백질 및 피브리노겐의 추출을 저하시켰다. NaCl의 농도(0 내지 0.2 M) 분석을 통해 0.1 M 이하의 NaCl을 함유하는 EDTA가 제거된 시트레이트 완충용액을 사용한 경우에는 헤파린 페이스트로부터 단백질이 거의 추출되지 않았으며 추출된 단백질은 모두 응고성 피브리노겐이었다는 것을 확인하였다. 헤파린 페이스트로부터 보다 많은 단백질 및 피브리노겐을 추출하기 위해서는 pH 7.3의 EDTA가 제거된 시트레이트 완충용액 내에 적어도 0.15 M의 NaCl이 함유되어야 한다. NaCl의 농도를 0.1M에서 0.2 M로 증가시킨 경우, 단백질 및 피브리노겐의 추출량이 증가되었다. 이는 EDTA가 제거된 시트레이트 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트를 가장 효과적으로 용해시키는데는 적어도 0.2 M의 NaCl이 필요함 의미하는 것이다. EDTA가 제거된 시트레이트 완충용액 내의 NaCl의 농도를 0.15 M에서 0.6 M로 증가시킨 경우에도 헤파린 페이스트로부터 추출되는 단백질의 함량이 증가하였다. 그러나, NaCl의 농도를 0.6 M에서 1 M로 증가시킨 경우에도 추출되는 단백질의 함량은 더 이상 증가하지 않았다. 헤파린 페이스트로부터 추출되는 응고성 피브리노겐의 함량 또한 NaCl의 농도 증가(0.2 M 내지 0.8 M)와 함께 증가되었다. EDTA가 제거된 시트레이트 완충용액에 0.8 M이상의 NaCl가 첨가된 경우에는 헤파린 페이스트로부터 추출되는 응고성 피브리노겐의 함량이 감소하였다. 이는 단백질 및 응고성 피브리노겐의 추출에 요구되는 NaCl의 최적의 농도가 0.2 M 내지 0.8 M임을 의미하는 것이다. 따라서, 트리스 완충용액을 사용하여 헤파린 페이스트를 가장 효과적으로 용해시키기 위한 NaCl의 농도는 0.2 M 내지 0.8 M이다.

0.8 M의 NaCl을 함유하는 pH 7.3의 WFI 및 이를 함유하지 않은 pH 7.3의 WFI에 대하여 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 추출시키는 능력을 조사하였다. 이 실험은 헤파린 페이스트가 물에 용해되며, 용해를 위하여 완충용액을 필요로 하지 않는다는 사실을 입증해주었다. pH 7.3의 WFI는 매우 적은 양의 단백질을 추출시켰으나, 추출된 단백질의 모두가 피브리노겐인 것으로 확인되었다. 또한, 단백질 및 피브리노겐의 추출량을 증가시키기 위해서는 0.2 M 이상의 NaCl을 첨가해야 했다. 0.8 M의 NaCl을 함유하는 WFI는 pH 7.3의 트리스 완충용액에 필적하는 함량의 피브리노겐을 추출시켰으나, 시트레이트 완충용액에 비해서는 적은 양의 피브리노겐을 추출시켰다.

헤파린 페이스트의 농도 실험을 통해 50㎖의 트리스 추출 완충용액에 6 g, 22 g, 및 40 g의 헤파린 페이스트가 용해될 수 있음을 확인하였다. 6 g(902.6 mg), 22 g(2246.5 mg), 및 40 g(3948.4 mg)의 헤파린 페이스트로부터 각각 상당량의 단백질이 추출되었다. 6 g의 헤파린 페이스트로부터 902.6 mg의 단백질이 추출된다면, 22 g 및 40 g의 헤파린 페이스트로부터는 각각 3309.5 mg 및 6017.3 mg의 단백질이 추출되어야 한다. 22 g의 헤파린 페이스트를 트리스 추출 완충용액에 용해시키는 경우에는 기대치 단백질 함량의 68%만이 추출될 것이다. 마찬가지로, 40 g의 헤파린 페이스트를 용해시키는 경우에는 기대치 단백질 함량의 66%가 추출될 것이다. 6 g(563.1 mg), 22 g(1303.7 mg), 및 40 g(2786.3 mg)의 헤파린 페이스트로부터 각각 상당량의 단백질이 추출되었다. 6 g의 헤파린 페이스트로부터 563.1 mg의 피브리노겐이 추출된다면, 22 g 및 40 g의 헤파린 페이스트로부터는 각각 2064 mg 및 36754 mg의 피브리노겐이 추출되어야 한다. 22 g의 헤파린 페이스트를 트리스 추출 완충용액에 용해시키는 경우에는 기대치 단백질 함량의 63%만이 추출될 것이다. 마찬가지로, 40 g의 헤파린 페이스트를 용해시키는 경우에는 가능한 단백질 함량의 73%가 추출될 것이다. 이는 일정 부피의 트리스 완충용액을 사용하면 모든 농도의 헤파린 페이스트가 임의의 농도로 용해될 수는 있으나, 헤파린 페이스트의 함량이 증가하면 단백질 및 응고성 피브리노겐의 추출 효율이 감소한다는 것을 의미하는 것이다. 따라서, 단백질 및 응고성 피브리노겐의 효율적인 추출에 요구되는 헤파린 페이스트의 가장 바람직한 함량은 50 ㎖의 트리스 추출 완충용액에 대하여 6 g이다.

결 론

트리스 완충용액으로부터 트리스, EDTA, 및 ε-아미노카프로산이 제거된 경우에는 대조군(트리스 완충용액)에 비하여 헤파린 페이스트의 용해도 및 단백질 추출량은 별다른 차이를 나타내지 않았다. 그러나, 트리스 완충용액으로부터 EDTA가 제거된 경우에는 대조군 및 기타 다른 조성의 트리스 완충용액에 비하여 응고성 피브리노겐의 함량이 증가되었다. 시트레이트 완충용액에서도 EDTA가 제거된 경우에 응고성 피브리노겐이 증가되었다. 이는 이러한 완충용액 내의 EDTA의 존재에 의하여 초래되는 정량 저해에서 기인된 것일 수 있다. 이는 또한 EDTA가 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 추출하는데 필요하지 않은 성분임을 의미하기도 한다.

상기 두 완충용액으로부터 ε-아미노카프로산이 제거된 경우에는 응고성 피브리노겐이 감소하였으므로, ε-아미노카프로산은 헤파린 페이스트 추출 완충용액의 중요 성분일 수 있다.

NaCl과 같은 염의 존재는 상당량의 피브리노겐을 추출하는데 절대적인 조건이었으므로, NaCl과 같은 염은 추출 용액의 필수 성분이다. 최대량의 단백질 및 응고성 피브리노겐의 회수를 위해서는 적어도 0.2 M의 NaCl이 트리스 완충용액에 요구된다. 트리스 완충용액과 같이, 시트레이트 완충용액 및 WFI에서도 피브리노겐의 추출에 있어서 NaCl의 존재는 필수 요건이다. 최대량의 단백질 및 피브리노겐의 회수를 위해서는 적어도 0.2 M의 NaCl이 시트레이트 완충용액에 요구된다.

트리스 완충용액의 pH 변화 실험을 통해 테스트된 모든 pH값(6.0 내지 9.0)에서 대조군(pH 7.3)에 필적하는 수준의 피브리노겐이 추출될 수 있음을 확인하였다.

트리스 완충용액 및 시트레이트 완충용액에 의하여 추출되는 단백질의 함량은 거의 비슷하였다. 그러나, pH 7.3의 시트레이트 완충용액은 트리스 완충용액보다 많은 양의 응고성 피브리노겐을 추출시킬 수 있었다. 기타 모든 완충용액의 성분은 동일하였기 때문에, 시트레이트 완충용액 내의 Na-시트레이트(트리스 대신)의 존재는 트리스보다 더 피브리노겐을 안정화시켰다. 시트레이트 완충용액에 대한 Na-시트레이트의 가장 바람직한 농도는 20 mM이다. 상기 농도의 Na-시트레이트는 최대량의 단백질을 회수시키지는 못하지만, 최대량의 응고성 피브리노겐을 회수시킨다. 트리스 완충용액 및 시트레이트 완충용액에 대한 응고성 피브리노겐의 평균 회수율은 각각 대략 55% 및 100%이었다. 이는 헤파린 페이스트로부터 피브리노겐을 추가로 추출할 수 있다는 시트레이트 완충용액의 가능성을 역설하는 것이다.

본 명세서에 인용된 모든 문헌은 참고를 위한 것이다.

본 명세서에서, "포함"이라는 용어는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 언급된 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함한다는 의미이며, 그 외의 요소, 정수 또는 단계, 또는 언급된 요소들, 정수들 또는 단계들을 포함한다는 의미는 아니다.

당업자는 상기의 특정한 실시예와 같이 본 발명의 내용 및 범위를 벗어나지 않는 범위에서 본 발명이 다양하게 변화 및/또는 변형될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 이들 실시예로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

참고 문헌

1. Blomback and Blomback(1956). Ark Kemi. 10:415-43.

2. Takeda(1966). J. Clin. Investigation, 45:103-111.

3. Jakobsen and Kieruif(1973). Thrombosis Research, 3:145-159

4. Holm at al(1985). Thrombosis Research, 37:165-176

5. Stathakis et al(1978). Tliorombosis Research, 13:467-475

6. Kuyas, Haeberli, Walder and Straub(1990). Thrombosis ＆ Haemostasis, 64(3):439-444

7. Vuento et al(1979), Biochemistry J, 183:331-337

8. Henschen and Lottspeich(1977). Physiological Chemistry, 358:935-938

9. Blomback, Hogg, Gardlund, Hessel and Kudryk(1978). Thrombosis Research, 8(supp2):329-346

10. Bouma, Takagi and Doolittle(1978). Thrombosis Research, 13:557-562

11. Hah and Slayter(1959). J Biophys. Biochem. Cytol. 5:11-15

12. Chung, Chan and Davies(1983). Biochemistry, 22:3250-3256

13. Doolittle(1984). Ann. Rev. Biochemistry, 53:195-229

14. Matthias, Hocke and Lasch(1975). Thrombosis Research, 7:861-870

15. Laudano and Doolittle(1978). Proc. Nat. Acad. Sci. (USA)., 75:3085

16. Laudano and Doolittle(1980). Biochemistry, 19:1013-1019

17. Gartner and Taylor(1991). PSEBM, 198:649-655.

Claims (14)

1. 피브리노겐이 강화된 조성물을 제조하는 방법에 있어서,

   (ⅰ) 피브리노겐-함유 용액에 유효량의 설페이트화 다당류(SPS)를 첨가하여 피브리노겐-함유 침전물을 제조하는 단계; 및

   (ⅱ) 적어도 0.1 M, 바람직하게는 적어도 0.2 M의 염을 함유하는 용액을 사용하여 단계 (ⅰ)에서 제조된 피브리노겐-함유 침전물로부터 피브리노겐을 추출하여 피브리노겐이 강화된 조성물을 제조하는 단계

   를 포함하는 제조 방법.
2. 제1항에 있어서,

   피브리노겐-함유 용액이 혈장 분액, 바람직하게는 혈장 분액의 동결 침전물인 피브리노겐 강화 조성물의 제조 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   용액이 클로라이드, 포스페이트, 및 아세테이트 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 염을 포함하는 피브리노겐 강화 조성물의 제조 방법.
4. 제3항에 있어서,

   용액이 NaCl을 포함하는 피브리노겐 강화 조성물의 제조 방법.
5. 제4항에 있어서,

   NaCl이 약 0.1 M 내지 2.0 M, 바람직하게는 약 0.2 M 내지 0.8 M 농도로 존재하는 피브리노겐 강화 조성물의 제조 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

   용액이 ε-아미노카프로산을 포함하는 제조 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

   SPS가 무코폴리사카라이드 폴리설페이트, 펜토스 폴리설페이트, 콘드로이친 서페이트, 덱스트란 설페이트, 및 헤파린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤파리노이드인 피브리노겐 강화 조성물의 제조 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

   SPS가 헤파린인 피브리노겐 강화 조성물의 제조 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

   SPS가 적어도 0.15 mg/㎖의 농도로 피브리노겐-함유 용액에 첨가되는 제조 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 방법이 SPS 및/또는 플라스미노겐을 제거하기 위하여 피브리노겐-강화 조성물을 처리하는 단계를 추가로 포함하는 피브리노겐 강화 조성물의 제조 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 방법이 피브리노겐-강화 조성물을 바이러스 불활성화하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
12. 제11항에 있어서,

    바이러스 불활성화 단계가 가열 및/또는 용매 세제 처리 단계를 포함하는 제조 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

    이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 또는 겔 투과 크로마토그래피, 또는 이들을 조합한 크로마토그래피에 의하여 피브리노겐-강화 조성물로부터 피브리노겐이 추가로 정제되는 피브리노겐 강화 조성물의 제조 방법.
14. 피브로넥틴 또는 인자 ⅩⅢ이 강화된 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 제2항에 따라 제조되는 피브리노겐-강화 조성물로부터 피브로넥틴 또는 인자 ⅩⅢ를 추출하는 단계를 포함하는 제조 방법.