KR0159275B1 - 안넥신의 정제 방법 - Google Patents

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Description

안넥신의 정제방법

제1도는 페닐-20 세파로즈 급속 유동 크로마토그래피의 용출 프로파일 (← → = VAC-폴 (pool)) 이다.

제2도는 Q-세파로즈 급속 유동 크로마토그래피의 용출 프로파일 (← → = VAC-폴)이다.

대부분의 포유동물에 항응고성을 갖는 단백질이 있다. 이들 단백질은 이들의 상이한 활성 메카니즘을 기준으로 하여 3 가지 그룹으로 구분할 수 있다.

1. 응고인자와 함께 복합체를 형성하고 이에 의해 응고인자를 비효과적으로 해주는 단백질. 이들은 하기의 단백질을 포함한다:

a) 항트롬빈 III (Thromb. Res. 5, 439-452 (1974))

b) α-프로테아제 억제제 (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 (1983))

c) α₂-마크로글로불린 (Ann. Rev. Biochem. 52, 655-709 (1983))

d) C₁-억제제 (Biochemistry 20, 2738-2743 (1981))

e) 프로테아제 넥신 (J. Biol. Chem. 258, 10439-10444, (1983))

2. 응고인자를 단백질 가수분해로 절단하고 이로 인해 응고인자를 불활성화시키는 단백질. 기술되어 있는 이러한 종류의 유일한 단백질 C 이다[참조: J. Biol. Chem. 251, 355-363, (1976)).

3. 응고 메카니즘의 인지질-의존 반응이 억제되므로 음하전된 인지질을 차폐시키고/시키거나 가수분해하는 단백질. 다양한 타입의 뱀독으로부터 분리한 유일한 포스포리파아제는 문헌 [참조: Eur. J. Biochem. 112, 25-32, (1980)] 에 기술되어 있다.

한 단계식 진행하는 응고 시스템이 최근 몇 년간에 집중적으로 조사되어 왔다. 이것은 한 효소가 효소원 (zymogen)을 활성 형태로 전환시키는 다양한 상호연관된 단백질 가수분해 반응의 자기-강화 다단계 시스템인 것으로 이해된다 [참조: Jackson C. M., Nemerson Y., Ann. Rev. Biochem. 49, 765-811 (1980)]. 이 반응의 속도는 인지질 및 다른 보조인자(예: 인자 V_a및 인자 VIII_a)의 존재에 의해 한정적으로 증가된다. 생체내에서 전(pro)-응고 반응은 응고 캐스케이드의 약활성화 후, 폭발적으로 혈전성 외상을 방지하는 다양한 억제 메카니즘에 의해 조절된다.

항응고 메카니즘은 하기와 같이 다시 구분할 수 있다 [참조: Rosenberg, R. D., Rosenberg, J. S., J. Clin. Invest. 74, 1-6 (1984)]:

1. 세린 프로테아제 인자 X_a및 트롬빈은 항트롬빈 III 또는 항트롬빈/헤파린 복합체에 결합함으로 인해 불활성화된다. 프로트롬빈 활성화 및 또한 피브린의 형성이 모두 이러한 방법으로 억제될 수 있다. 항트롬빈 III 이외에 예를 들어 α₂-마크로글로불린 및 항트립신과 같은 다양한 다른 플라즈마-프로테아제 억제제가 있고, 이의 효과는 시간에 좌우된다.

2. 단백질 C 의 발견은 또다른 항응고 메카니즘의 발견에 기인한다. 일단 단백질 C 가 활성화되면, 프로트롬비나제 및 인자 X 와 반응하는 효소가 불활성화됨으로써 단백질 보조인자인 인자 V_a및 VIII_a'의 선택적인 단백질 가수분해에 의해 항응고제로서 작용한다.

3. 플라스민은 트롬빈이 피브리노겐에 작용하여 형성된 생성물인 단량체성 피브린 1 을 절단하고 이에 의해 불용성 피브린의 형성을 방지한다 [참조: Nossel, H. L., Nature, 291,165-167 (1981)].

상기 언급된 응고 과정에 포함된 천연 단백질 중 항트롬빈 III 만이 통상적으로 임상용이다. 그러나, 이 단백질 용도의 심각한 단점은 출혈시 증가하는 경향이다.

천연적이거나 자연적으로 합성되는, 이제까지 항응고제로서 사용하는 모든 약제는 이들이 응고인자를 약간의 방법으로 불활성화시키며, 이로 인해 응고과정에 불리한 효과를 가질 수 있는 부작용을 초래하게 된다.

놀랍게도, 이러한 단백질 이외에, 특별한 조건하에서 목적하는 항응고성을 나타내지만 출혈의 위험이 증가하지 않는 다른 천연 물질을 현재 분리하였다. 대부분의 출혈의 경우 이러한 단백질은 항응고성을 상실하고, 결과적으로 이의 이용은 이러한 경우에 생존하는데 필요한 응고 과정을 방해하지 않는다. 이들은 강한 혈과조직으로부터 처음 분리되어, 이들은 혈관 항응고 단백질인 VAC 로서 공지되어 있다.

강한 혈관 조직 (제대 혈관 및 태반) 으로 부터 분리한 단백질의 분자량은 약 70 x 10³, 약 60 x 10³, 약 34 x 10³및 약 32 x 10³이고, 이중 분자량이 34 및 32 x 10³인 물질이 폴리펩타이드 일본쇄를 구성한다. 이들 단백질의 정확한 생화학적 특성화 및 이들을 분리정제하는 방법은 EP-A-0 181 465 에 기술되어 있다.

VAC 활성을 갖는 단백질은 두가지 관점에서 혈액 응고 캐스케이드를 방해하는 천연 혈액응고 억제제이다. 첫째, 이들은 인자 IX_a및 VIII_a'에 의해 촉매되는 인자 X 의 활성화를 X_a' 중으로 억제하고, 둘째 이들은 프로트롬빈의 절단을 억제하여 트롬빈을 형성하며 이는 인자 X_a및 V_a에 의해 중재된다. 활성화 단계 모두에 공통되는 한 가지 사실은 이들이 칼슘 이온 및 인지질을 필요로 한다는 것이다. 확실히 VAC 단백질은 또한 인지질과 상호작용할 수 있고, 이러한 결합의 결과로서 응고인자의 활성화 단계를 차단한다.

한편, VAC 와 유사하게 칼슘-의존 방법으로 인지질에 결합하고 인지질 표면에 의존하는 공정을 방해하는 전체 부류의 물질이 있음을 밝혀내었다.

또한, 안넥신으로서 공지된 이 부류는 리포코리틴 I, 칼팩틴 I, 단백질 II, 리포코르틴 III, p67-칼엘렉트린 뿐만 아니라 IBC, PAP, PAP I, PP4, 엔도넥신 II 및 리포코르틴 V 을 포함한다.

안넥신의 공통적인 구조특징이 아마도 이의 유사한 Ca²⁺및 인지질 결합 특성을 기초로 하여 형성된다. 이러한 일반특성이 모든 안넥신에 일치하더라도 Ca²⁺및 다양한 유형의 인지질에 대해 명백한 독립성이 이의 무한대로 있다.

안넥신의 생리적 기능은 막-관련 공정에 관련된다. VAC 의 항응고 효과의 기본적인 메카니즘은 VAC 가 인지질의 표면에 결합하여 표면상에 응고 촉진 복합체의 형성을 억제함으로써 인지질의 촉매 능력이 억제되는 것으로 인지되어 왔다.

다른 안넥신은 또한 응고를 억제할 수 있지만 VAC 는 가장 효과적인 억제제이다.

결합 연구는 VAC 가 칼슘 의존 방법으로 전-응고 인지질과 역으로 회합하는 것으로 보여지고 있다.

다른 Cd²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, 및 Co²⁺계열 중에서 선택되는 이가 양이온은 또한 회합에 대해 포지티브 효과를 가지지만 Ca²⁺와 동일한 범위는 아니다.

이들 특성은 약리학적 관점에서 단백질을 흥미있고 매우 유용한 활성물질로 만든다. 이는 VAC 단백질을 제조할 수 있는 유전공학 방법이 EPA 293 567 에 기술되어 있고 이의 교시는 특정하게 본원에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 VAC 단백질을 분리 정제하는 EPA 293 567 에 기술되어 있는 방법을 개선하는 것이다.

EPA 293 567 로부터 공지된 방법에서 발현된 단백질을 분리정제하기 위해 냉동된 생체량을 적당한 용해 완충액에 현탁시킨다. 세포를 이어서 예를 들어 만톤-가울린(Manton-Gaulin) 압축기를 사용하여 기계적으로 파괴시킨다. 폴리에틸렌이민과 같은 비단백질 조성물에 대한 침전제를 가한 후, 고체 조성물을 예를 들어 원심분리로 제거한다. 단백질의 침전, 바람직하게는 황산 암모늄 분획화, 침전물의 용해, 침전제의 제거 및 용액의 투명화 후, 이렇게 수득된 추출물을 다양한 크로마토그래피로 정제시킨다. 단백질의 침전 대신, 조 VAC 추출물은 또한 후에 세정 사이클을 적용시킬 수 있는 한 크로마토그래피 예비-정제로 정제할 수 있다. SiO₂는 예비-정제를 위한 칼럼 물질로서 적당한 것으로 입증되었지만, 예를 들어 유사한 특성을 가진 다른 물질도 또한 적당하다. 본 발명에 따라 Messrs Grace 사 제품의 실리카 촉매 담체 등급 953W 가 사용된다.

본 발명에 따라 단백질을 정제하는 적당한 크로마토그래피 정제 사이클은 예를 들어 DEAE-급속-유동-세파로즈, 세파크릴 S-200 고성능 분리 및 Q-세파로즈-급속 유동-크로마토그래피이다. 이 방법으로 수득한 본 발명에 따른 단백질의 순도를 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, 젤 투과 HPLC, 역 HPLC 및 등전 포커싱으로 측정한다.

이러한 종전 기술 공정에 따라 수행한 용해 및 추출 단계에서 추가의 정제를 필요로 하는 물질은 약 50%의 수율로 수득된다. 이러한 본 발명에 따른 공정의 단계를 개선시킴으로써 놀랍게도 이 단계 후 수율이 80% 이상 증가될 수 있다.

한 양태에서, 본 발명은

a) 균질화된 세포물질의 pH 값을 8.0 내지 10.0 으로 조절하고;

b) Ca²⁺, Cd²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺및 Co²⁺중에서 선택된 하나 이상의 이가 양이온을 가하고;

c) 인지질을 가하고;

d) 불용성 세포 잔사를 세척하여 가용성 성분을 제거하고;

e) 킬레이트화제를 사용하여 세포잔사로 부터 안넥신을 추출하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 안넥신을 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 방법은 균질화된 물질에 함유된 안넥신, 즉 VAC 단백질이 숙주 생물, 바람직하게는 이. 콜라이 (E. Coli) 의 불용성 세포 잔사 또는 세포막상으로 흡착됨을 확신시켜 준다. 이러한 동일반응계내 흡착 단계는 놀랍게도 바람직하지 않은 용융 물질을 규질화된 물질로부터 간단히 세척하여 제거할 수 있게 해준다. 고체 담체에 결합된 안넥신, 즉 VAC 단백질의 탈착은 킬레이트화제, 바람직하게는 EDTA 를 함유한 완충액을 사용하여 수행된다.

바람직하게는 이가 양이온의 혼합물은 예를 들어 Zn²⁺와 결합된 Ca^2-를 사용할 수 있고, 여기에서 각각의 양이온의 몰비를 조절하여 VAC 와 같은 안넥신의 흡착이 불용성 세포 잔사상에서 최대가 되도록 한다.

놀랍게도, 이 콜라이에서 발현시켜 제조된 안넥신을 정제할 경우 이. 콜라이 단백질 (ECP) 의 양은 이온성 그룹, 바람직하게는 BPA (Bioprocessing Aids, Tosohaas, Stuttgart, Germany사 제품)과 같은 강한 양이온성 그룹을 갖는 수지의 첨가에 의해 상당히 감소될 수 있다. 예를 들어, BPA-1000 (강한 양이온성 그룹(4급 아민) 작용성을 갖는 가교결합된 폴리메틸아크릴산 에스테르), BPA-1050 (약한 양이온성 그룹(3급 아민) 작용성을 갖는 가교결합된 폴리메틸아크릴산 에스테르), BPA-2100 (강한 음이온성 그룹 (설폰산) 작용성을 갖는 디비닐벤졸-가교결합된 폴리스티랜), 바람직하게는 BPA-1000 을 EDTA 추출후 수득된 조 추출물에 가하고, 이어서 교반한다. 첨가량은 1 내지 20 용적%, 바람직하게는 5 내지 10, 더욱 특히 10 용적% 일수 있다. 침전물을 원심분리로 제거한다. 이를 단백질 침전 및 크로마토그래피시킨다. BPA 를 가함으로써 이 단계에서 조차 ECP 함량을 초기 농도의 2%만으로 낮출 수 있다. 다른 한편, VAC 함량이 6%까지만 감소되었다.

놀랍게도 세포의 분해 이전에 발효 혼합물의 세포를 탈활성화시킴으로써 수율이 추가 개선된다. 적당한 탈활성화제는 그 중에서도 벤젠, 톨루엔, 페닐, 크실렌 또는 크레졸과 같은 간단한 방향족 화합물이다. 특히 m-크레졸을 사용하는 것이 유리하다.

본 발명의 첫 번째 양태와 접목된 이러한 예비탈활성화 단계를 포함함으로써 추출물 수율이 98% 이상 증가할 수 있다.

흡착/탈착 단계는 EPA 293 567 로부터 공지된 정제 단계의 다음이다. 온도, 양, 각 단계의 순서, pH 값, 특별한 시약 등과 같은 필요한 매개변수는 본 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 하기 실시예는 필요한 경우 본 분야의 숙련가에게 공지된 적당한 방법으로 변형될 수 있다. 특히 이들은 정제할 단백질에 관한 어떠한 제한도 포함하지 않는다. 안넥신의 공통 구조 특징 및 일반 특징의 관점에서 본 발명에 따른 방법은 또한 다른 안넥신의 정제에 적용될 수 있고, 특히 안넥신 IBC, PAP, PAP I, PP4, 엔도넥신, 리포코르틴 V 및 VAC 를 정제하는데 적당하다. 더욱이 본 발명이 재조합 숙주로부터 VAC 를 수득하는 참조문헌에 기술되어 있더라도, 이는 예를 들어 강한 혈관조직으로부터 안넥신을 수득하는데 사용될 수 있다.

사용한 시약의 기원에 관한 정보는 오로지 실시예에 기술되어 있고 이를 제한하려는 것은 아니다.

본 발명은 도면을 참조로 하여 비제한 실시예에 의해 기술할 것이다.

[실시예 1]

1. 세포의 파괴:

Ca⁺⁺및 레시틴의 첨가, 세척 및 추출

발효 No. 524 로부터 클론 (clone) 이. 콜라이 HB101/pRH291 의 냉동시킨 비불활성화된 세포 매스 (mass) 122g 을 해동시키고, 교반하면서 용해 완충액 500㎖ 로 현탁시키며 (약 1시간, 얼음으로 냉각), 이어서 울트라-투랙스 (Ultra-Turrax) T 45/6을 사용하여 균질화시킨다(약 1분, 얼음으로 냉각).

[용해 완충액]

100 mM 트리스(TRIS) 12.14g/1000 ㎖ Merck 8382

1mM EDTA 0.37g/1000 ㎖ 티트리플렉스(Titriplex) III, Merck 8418

200 mM NaCl 11.69g/1000 ㎖ Merck 6404

pH 를 32% HCl 을 사용하여 9.0±0.1 로 조절한다.

수혈관을 얼음으로 냉각시키면서 현탁액을 만톤-가울린 압축기, 타입 15M 8TA 를 사용하여 약 6000 psi 에서 3 회 균질화시킨다. 장치를 이어서 용해 완충액 150 내지 200㎖ (추출물의 총 용적: 1000㎖)로 2회 세척한다.

2. 불용성 세포 잔사상 VAC 의 흡착을 위한 Ca⁺⁺및 레시틴의 첨가

신선하게 용해시킨 (최종농도 5mM) 염화칼슘(Merck 2083) 0.55g 및 레시틴 용액 (200 mg/㎖ 클로로포름) 6.1 ㎖을 균질화된 물질에 가한다. 최종농도 1g 의 레시틴/100g 의 생체량.

혼합물을 울트라-투랙스로 1 분간 균질화시키고 빙욕에서 60 분간 교반시킨다.

레시틴 : 대두, 프랙트,(pract), 세르바(serva) 57556 으로 부터 분리한 레시틴.

5%폴리아민 용액(50%폴리아민 P, 세프바 33141 로 부터 제조하고 5%로 희석한 후 5N HCl 을 사용하여 pH 8 로 중화) 110㎖ 를 이어서 가하고 혼합물을 추가 30 분간 교반시킨다. 최종농도 0.5%. 현탁액을 이어서 투명해질 때까지 원심분리한다 (Beckman High Speed Centrifuge J2-21, Rotor JA 10, 8000 rpm, 30 분, 설정온도 2℃).

상등액 I : 1020㎖ (4.25mg 단백질/㎖ ; 0.05mg VAC/㎖)

3. 임의의 용해성 물질을 제거하기 위한 세포잔사의 세척.

세포잔사를 울트라-투랙스를 사용하여 세척 완충액 600㎖ 로 현탁시키고 이어서 30 분간 교반한다.

세척 완충액 :

100 mM 트리스

200 mM NaCl

5 mM CaCl₂

pH 를 32% HCl 을 사용하여 9.0±0.1로 조절한다.

세포잔사를 상기한 바와 같이 원심분리하여 수득한다.

상등액 II : 580㎖ (1.35 mg 단백질/㎖ ; 0.04 mg VAC/㎖)

세척 완충액 350 ㎖ 중 현탁액을 연속 균질화시키고 교반을 1 회 이상 반복한다. 혼합물을 이어서 원심분리한다.

상등액 III : 340 ㎖ (0.93 mg 단백질/㎖ ; 0.02 mg VAC/㎖)

4. EDTA 를 함유하는 완충액을 사용한 VAC 의 추출

펠렛을 울트라-투랙스에서 추출 완충액 900㎖ 로 군질화시키고 이어서 냉장실에서 밤새 교반한단. 추출물을 상기한 바와 같이 원심분리하고 투명 용액, 즉 조 추출물을 수득한다.

조 추출물 : 915㎖ (1.98 mg 단백질/㎖; 0.65 mg VAC/㎖)

추출 완충액:

20 mM 트리스

50 mM EDTA

pH 를 5 N NaOH 를 사용하여 7.5±0.1 로 조절한다.

[실시예 2]

요약 :

1. 불활성화

2. 세포분해

3. 불용성 세포잔사상 VAC 의 흡착을 위한 Ca⁺⁺및 레시틴의 첨가

4. 용해성 성분을 제거하기 위한 세포잔사의 세척

5. EDTA 를 함유한 완충액을 사용한 VAC 의 추출

6. 35% 포화 황산암모늄의 첨가 및 침전물의 제거

7. 페닐-세파로즈 급속 유동 크로마토그래피

8. VAC-폴의 투석 및 Q-세파로즈 급속 유동 크로마토그래피

9. VAC-폴의 농축 및 세파크릴 S-200 HR 크로마토그래피

1. 불활성화

발효의 종료는 배지 중 인산염의 소모로부터 약 17 시간 후 성취된다. 이때 10 mM CaCl₂를 가하고 온도를 5 내지 8℃로 가능한한 가장 빨리 냉각시키면서 조절한다. 모든 다른 조절된 매개변수 (통기교반, pH, 압력 등과 같은) 를 동일하게 유지한다. 약 10 분후 m-크레졸 7㎖/ℓ 를 가하고, 이어서 압력, 통기 및 pH 조절의 스위치를 끄고 발효액이 크레졸과 적당히 혼합되지만 포움의 형성이 제한됨을 확인할 수준으로 교반을 감소시킨다. 이러한 조건하에서 불활성화를 적어도 3 시간 내지 15 시간 동안 수행시킨다(온도는 5 내지 8℃로 유지).

2. 세포분해

Ca⁺⁺및 레시틴의 첨가, 세척 및 추출

m-크레졸로 불활성화된 클론 HB101/pGN25 의 냉동시킨 세포 매스 286g 을 해동시키고, 교반하면서 용해 완충액 750㎖ 로 현탁시키며(약 1 시간, 얼음으로 냉각), 이어서 울트라-투랙스 T 45/6 을 사용하여 균질화시킨다(약 1 분, 얼음으로 냉각).

용해 완충액 :

100 mM 트리스

1 mM EDTA

200 mM NaCl

pH를 32% HCl 을 사용하여 9.0±0.1 로 조절한다.

현탁액을 얼음으로 냉각시킨 수혈관과 함께 만톤-가울린 압축기, 타입 15M 8TA 를 사용하여 약 6000 psi 에서 3 회 균질화시킨다. 장치를 이어서 용해 완충액 150 내지 200 ㎖ 으로 2 회 세척한다. 균질화된 물질의 용적: 1400 ㎖.

2. 불용성 세포 잔사상 VAC 의 흡착을 위한 Ca⁺⁺및 레시틴의 첨가:

0.55g 의 CaCl₂(Merck 2083)/1000 ㎖ (최종농도 5mM) 을 균질화된 물질 (H₂O 약 10㎖ 에 용해)에 가하고, 클로로포름 (약 0.2g/㎖) 에 용해시킨 1g 의 레시틴/100 g 의 생체량을 가한다.

혼합물을 울트라-투랙스를 사용하여 균질화시키고 빙욕에서 60 분간 교반시킨다.

레시틴 : 대두, 프랙트., 세르바 57556 으로 부터 분리한 레시틴.

5% 폴리아민 용액 (50% 폴리아민 P, 세르바 33141 로부터 제조하고5% 로 희석한 후 5N NCl 을 사용하여 pH 8 로 중화) 0.1 ℓ 용적을 이어서 가하고 혼합물을 추가 30 분간 교반시킨다. 최종농도 0.5%. 현탁액을 이어서 투명해질때까지 원심분리한다 (Beckman High Speed Centrifuge J2-21, Rotor JA 10, 8000 rpm, 30 분, 설정온도 2℃).

상등액 I : 1200㎖ (5.8 mg 단백질/㎖; 0.01 mg VAC/㎖).

3. 용해성 물질을 제거하기 위한 세포잔사의 세척.

세포잔사를 울트라-투랙스를 사용하여 세척 완충액 약 1000 ㎖ 로 현탁시키고 이어서 30 분간 교반한다.

세척 완충액:

100 mM 트리스

200 mM NaCl

5 mM CaCl₂

pH 를 32% HCl 을 사용하여 9.0±0.1 로 조절한다.

세포잔사를 상기한 바와 같이 원심분리하여 수득한다.

상등액 II : 1000㎖ (1.94 mg 단백질/㎖ ; 0.01 mg VAC/㎖)

세척 완충액 1000 ㎖ 중 현탁액을 균질화시킨 후 교반을 1 회 이상 반복하며 최종적으로 원심분리를 수행한다.

상등액 III : 1000 ㎖ (0.79 mg 단백질/㎖ ; 0.01 mg VAC/㎖)

4. 완충액을 함유하는 EDTA 를 사용한 VAC 의 추출

펠렛을 울트라-투랙스에서 추출 완충액 1350 ㎖ 로 균질화시키고 이어서 냉장실에서 밤새 교반한다. 추출물을 상기한 바와 같이 원심분리하고 투명 용액, 즉 조 추출물을 수득한다.

조 추출물 : 1350 ㎖(3.35 mg 단백질/㎖ ; 1.46 mg VAC/㎖)

추출 완충액 :

20 mM 트리스

50 mM EDTA

pH 를 5 N NaOH 를 사용하여 7.5±0.1 로 조절한다.

세척과정 및 추출의 요약

5-6. 35℃ 포화 황산암모늄에서 침전 및 페닐-세파로즈 급속 유동 크로마토그래피

황산암모늄을 사용한 침전

고체 황산암모늄 (Merck 1217) 290g/ℓ을 교반하면서 서서히 조 추출물에 가한다. 이를 35% 의 포화 농도로 제조한다. 1시간 이상 냉장실에서 교반한 후 용액을 투명해질 때까지 원심분리하고(상기한 바와 같은 동일한 조건하) 침전물을 버린다. 용액을 제조된 페닐 세파로즈 FF 상으로 FPLC 장치를 사용하여 8 내지 10㎖/분의 속도로 펌핑시킨다.

원신분리한 35% 포화 황산암모늄 상등액을 두 가지 대략 동일한 뱃취에서 추가로 가공하고 모든 연속 정제 단계를 연속 2회 수행한다.

칼럼의 제조 :

파마시아(Pharmacia) 칼럼, 타입 XK 26/40 (베드 용적 약 200 ㎖)을 페닐-세파로즈 급속 유동 (Pharmacia, Code No. 17-0965)으로 충전시키고 완충액 A 로 평형시킨다. 이에 대해 완충액의 2 내지 3 CV (칼럼 용적)이 필요하다. 칼럼을 FPLC 장치에 연결한다. 모든 크로마토그래피를 주위 온도에서 수행한다.

완충액 A :

50 mM 트리스

완충액을 농 HCl 를 사용하여 pH 7.2±0.1 로 조절한다.

이어서 고체 황산암모늄 (Merck 1217) 209 g/1000 ㎖ 을 가한다.

완충액 B:

완충액 A 와 유사하지만 황산암모늄을 가하지 않는다.

크로마토그래피

용출액을 O. D. 280 nm 를 측정하여 모니터한다. 제제를 칼럼에 적용하자마자, O. D. 280 nm 가 본래의 값으로 될 때까지 완충액 A 로 세척한다. 이어서, 5칼럼 용적 (1000 ㎖) 의 0 내지 100% B의 구배 완충액 A완충액 B를 사용하여 결합된 VAC를 용출시킨다. VAC 는 구배 개시후 첫 번째 우세한 피크이다(용출도식의 그림을 참조; 제1도). 유동의 분취량, VAC-풀 및 O. D. 프로파일의 임의의 다른 피크를 SDS-PAGE 로 조사한다. VAC-풀의 시험: 단백질 측정, VAC-시험, SDS-PAGE.

칼럼의 재생 :

페닐 세파로즈를 6 M 우레아의 2 배 용적으로 재생시킨다. 우레아를 세척제거(증류수 1 CV) 한 후 24% 에탄올에 저장한다.

칼럼의 상층 말단에 임의의 착색 성분을 제거 또는 피하기 위해 더욱 광범위한 세척 및 재생 공정이 사용된다:

1. 1 CV 증류수

2. 2 CV 6 M 우레아(Merck 8487)

3. 1 CV 증류수

4. 1 CV 0.1 M NaOH

5. 세척 및 24% 에탄올에 저장

6. 3 CV 완충액 A 를 사용하기 이전의 평형화

7. Q-세파로즈 급속 유동 크로마토그래피

매우 많은 완충액의 사용을 피하기 위해 VAC-풀의 투석에 Q 세파로즈의 완충액을 사용하여 풀을 AMICON-초여과(Ultrafiltration) 셀(cell) 및 YM 10-필터에서 처음에 농축시킨다: 약 150 ㎖ 미만. 이어서 완충액 A 로 투석시킨다.

완충액 A :

20 mM 비스-트리스

pH 를 5 N HCl 을 사용하여 6.3±0.1 로 조절한다.

완충액 B :

완충액 A + 0.35 M NaCl

20 mM 비스-트리스

350 mM NaCl

pH 를 5 N HCl 을 사용하여 6.3±0.1 로 조절한다.

칼럼의 제조 :

타입 HR 16/50 파마시아 칼럼(CV 100 ㎖) 을 FPLC 시스템에 연결하고 충전장치를 사용하여 Q-세파로즈 급속 유동 (파마시아) 으로 충전시킨다. 2 CV 완충액 A 로 평형시킨다. 크로마토그래피를 주위온도에서 수행한다.

크로마토그래피 :

샘플을 4 ㎖/분의 속도로 적용시킨다. 이어서 용출액의 O. D. 280 nm 가 본래의 값으로 떨어질 때까지 완충액 A 로 세척한다. 구배 프로그램은 하기와 같다:

0.5 CV 0 내지 30% B

8.0 CV 30 내지 70% B (분리는 여기에서 수행된다)

약 1.0 CV 100% B

세척 프로그램 :

UV-활성화된 물질이 100% B 에서 용출되지 않을 때 세척 프로그램을 개시한다.

2 CV 증류수

2 CV 0.5n NaOH

2 CV 증류수

저장 : 24% 에탄올

사용하기 전 완충액 A 2 내지 3 CV 로 세척한다 :

pH 를 6.3으로 조절한다.

불순물을 VAC 이전 프로그램에서 용출시킨다. 용출 프로파일을 여기에 부착시킨다 (제2도).

8. 세파크릴 S-200 HR 크로마토그래피

VAC-풀을 AMICON-울트라필터 YM 10 을 사용하여 약 10 ㎖ 로 농축시킨다. VAC 를 특정 문제없이 100 mg/㎖ (BioRad) 미만으로 농축시킬 수 있음으로 이해된다.

칼럼 제조 :

베드 용적이 약 400 ㎖ 인 파마시아사 제품 K 26/100 칼럼을 지시에 따라 세파크릴 S-200 고성능 분리(파마시아)로 충전시키고 용출 완충액(2 CV) 로 평형시킨다.

용출 완충액 :

20 mM 인산나트륨 pH = 7.2

15 mM NaCl 또는

20 mM 숙신산의 나트륨염 (pH = 7.0)

0.01 % 트윈 (Tween) 20

pH 를 1 N HCl 을 사용하여 7.0±0.1 로 조절한다.

크로마토그래피 :

크로마토그래피를 냉장실에서 수행한다. 유속은 80 ㎖/시간이다. O. D. 280 nm 에서 기록된 피크를 수집한다. 이러한 방법으로 정제한 VAC 는 99%순도 이상이다(RP-HPLC 분석).

세파크릴 칼럼의 재생 :

세척 프로그램 :

1 CV 증류수

2 CV 0.5 N NaOH (+ 며칠간 저장)

(장기간 저장시 1 M NaCl + 0.0025 % NaOH 를 사용하는 것이 바람직하다)

재생 :

1 CV 증류수

2 CV 용출 완충액

X) 바이오래드(Biorad) 단백질 검정(표준물질 : 소혈청 알부민)

XX) VAC 알파 검정 : 프로트롬빈으로부터 트롬빈 형성의 억제 [참조: Reutelingsperger, Hornstra und Hemker, Eur, J. Biochem. 151, 625-629; 1985]. 정제한 vac 알파 제제를 대조군으로서 사용한다.

XXX) 순수한 VAC 알파에 대해 측정된 인자를 사용하여 O. D. 280 nm 를 측정하여 판정된 단백질 함량:

0. D. 280 nm x 1.277 = mg/㎖ VAC-알파

[실시예 3]

BPA 를 갖는 조 EDTA 추출물의 정제

실시예 1 및 2 에 기술한 정제를 수행하고, EDTA 를 함유하는 완충액으로 추출(단계 4)한다. 출발물질은 각각 295g 및 240 g 의 생체량이다.

조 추출물을 수득한 후, 10 용적% 의 BPA 1000 을 가하고 혼합물을 10 분간 교반한다. 형성된 침전물을 원심분리(High-Speed Centrifuge J2-21, Beck-man 제품, Rotor JA 10, 8000 rpm, 2℃ 에서 30 분)로 제거한다.

추가의 정제를 하기와 같이 수행한다:

고체 황산암모늄을 35 포화% 가 될 때까지 가하고 추가로 페닐 세파로즈 급속 유동 크로마토그래피한다[참조: 상기 내용].

Claims (14)

1. a) 균질화된 세포물질의 pH 값을 8.0 내지 10.0으로 조절하고; b) Ca²⁺, Cd²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺및 Co²⁺중에서 선택된 하나 이상의 이가 양이온을 가하고; c) 인지질을 가하고; d) 불용성 세포 잔사를 세척하여 가용성 성분을 제거하고; e) 킬레이트화제를 사용하여 세포잔사로부터 안넥신을 추출하는 단계를 포함함을 특징으로 하여, 안넥신을 정제하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 이온성 그룹을 갖는 수지를 단계 (e) 이후 가하고 형성된 침전물을 분리하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 수지를 강한 양이온성 그룹으로 작용화시키는 방법.
4. 제1항 또는 2항에 있어서, 단계 (e) 에서 수득한 안넥신을 단백질 침전 및 연속 단백질 정제 단계에 의해 추가로 정제하는 방법.
5. 제1항 또는 2항에 있어서, 단계 (a)에서 pH 를 9.0으로 조절하는 방법.
6. 제1항 내지 3항중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 이가 양이온으로서 Ca²⁺을 가하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 단계 (b)에서 이가 양이온으로서 Ca²⁺및 Zn²⁺를 가하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 단계 (c)에서 인지질로서 레시틴을 가하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)를 실질적으로 동시에 수행하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 단계 (e) 에서 킬레이트화제로서 EDTA를 사용하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 균질화 및 단계 (a) 이전에 세포를 불활성화시키는 방법.
12. 제11항에 있어서, 세포를 벤젠, 톨루엔, 페놀, 크실렌 및 크레졸 중에서 선택된 시약에 의해 불활성화시키는 방법.
13. 제12항에 있어서, 불활성화제로서 m-크레졸을 사용하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 정제할 안넥신이 VAC 또는 이의 유사체인 방법.

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