NO177787B

NO177787B - Fremgangsmåte for rensing av annexiner

Info

Publication number: NO177787B
Application number: NO903149A
Authority: NO
Inventors: Christiaan Reutelingsperger; Gerhard Bodo
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 1989-07-15
Filing date: 1990-07-13
Publication date: 1995-08-14
Also published as: US5258497A; AU628604B2; DE4021979A1; ATE95189T1; IL95082A0; JPH03175992A; FI95136B; FI903508A0; IE902563A1; NO903149L; NO903149D0; IL95082A; DK0409053T3; PT94674B; NZ234492A; FI95136C; ES2045669T3; EP0409053A1; KR910002893A; DD297977A5

Description

I de fleste pattedyr forekommer proteiner som oppviser blodkoaguleringshemmende egenskaper. Disse proteiner kan inndeles i 3 grupper, hvor inndelingen beror på de ulike virkningsmekanismer. 1. Proteiner som danner et kompleks med koaguleringsfaktoren og derved gjør koaguleringsfaktoren uvirksom. Til disse hører proteinene:

a) antitrombin-III (Thromb. Res. 5, 439-452 (1974))

k) éi-protease-hemmer (Ann. Rev. Biochem., 52, 655-709

(1983))

c) 62-makroglobulin (Ann. Rev. Biochem., 52, 655-709

(1983))

d) Ci-hemmer (Biochemistry, 20, 2738-2743 (1981))

e) protease Nexin (J. Biol. Chem., 258, 10439-10444,

(1983)) .

2. Proteiner som avskjærer en koagulasjonsfaktor proteolytisk og derved deaktiverer koagulasjonsfaktoren. Som eneste beskrevne protein av denne art er protein C

(J. Biol. Chem., 251, 355-363, (1976)). 3. Proteiner som avskjermer og/eller hydrolyserer de negativt ladede fosfolipider slik at de fosfolipid-avhengige reaksjoner ved blodkoagulasjonsmekansimen hemmes. Hittil er kun fosfolipaser, isolert fra forskjellige slangegift-sorter, beskrevet (Eur. J. Biochem., 112. 25-32 (1980)).

Det trinnvis forløpende koagulasjonssystem er grundig undersøkt i de siste år. Det oppfattes som et selv-forsterkende flertrinns-system av forskjellige proteolytiske reaksjoner som er forbundet med hverandre, hvor et enzym omsetter et zymogen i den aktive form (sml. Jackson CM. , Nemerson Y. , Ann. Rev. Biochem., 49., 765-811 (1980)). Hastigheten av denne reaksjon økes på avgjørende måte ved nærvær av fosfolipider og andre kofaktorer, som faktor Va og faktor VIIIa. In vivo styres prokoagulasjonsreaksjonene gjennom forskjellige hemmings-mekanismer som forebygger et eksplosivt trombotisk traume etter en svak aktivering av koagulasjonskaskaden.

Antikoagulasjonsmekanismene kan inndeles på følgende måte (Rosenberg, R.D., Rosenberg, J.S., J. Clin. Invest., 74, 1-6

(1984)): 1. Serin-protease-faktor Xa og trombin inaktiveres som følge av deres binding til antitrombin III, resp. til antitrombin/heparin-komplekset. Så vel protrombin-aktiveringen som dannelsen av fibrin kan på denne måte hemmes. Ved siden av antitrombin III finnes forskjellige andre plasmaprotease-hemmere som eksempelvis 62-makroglobulin og antitrypsin, som er tidsavhengige i sin virkning. 2. Oppdagelsen av protein C førte til avdekking av en ytterligere antikoagulasjonsmekanisme. Er protein C engang aktivert, virker det som antikoagulant ved selektiv proteolyse av protein kofaktorene faktor Va og VIIIa, som bevirker inaktivering av protrombinasen og det enzym som omsetter faktor X. 3. Plasmin spalter monomert fibrin 1, et produkt av inn-virkningen av trombin på fibrinogen, hvorved dannelsen av et uløselig fibrin forebygges (Nossel, H.L., Nature, 291, 165-167 (1981)).

Av de ovennevnte kroppsegne proteiner som griper inn i koagulasjonsprosessen, benyttes for tiden kun antitrombin III klinisk. En vesentlig ulempe ved anvendelse av dette protein er imidlertid den forekommende økning av blødningstendensen.

Alle midler som hittil er anvendt som antikoagulanter, det være seg kroppsegne eller av syntetisk natur, gjør på en eller annen måte koagulasjonsfaktoren uvirksom og fører derved til bivirkninger som kan ha en uheldig innvirkning på

koagulasj onsprosessen.

Ved siden av disse proteiner har det nå kunnet isoleres kroppsegne stoffer som oppviser de ønskede blodkoagulasjonshemmende egenskaper under spesielle betingelser, men som herunder ikke øker blødningsfaren. Ved større blødninger taper disse proteinene deres blodkoagulasjonshemmende egenskaper og forstyrrer dermed ved bruk ikke de koagulasjonsprosesser som i slike tilfeller er nødvendige for overlevelse. Da de først ble isolert fra sterkt vaskularisert vev, ble de betegnet "vascular anticoagulating proteins", VAC.

Proteinene isolert fra sterkt vaskularisert vev, som navlestrengskar og placenta, oppviser molekylvekter på ca. 70 x 10<3>, ca. 60 x 10<3>, ca. 34 x 10<3> og ca. 32 x 10<3>, hvorav substansene med molekylvektene 34, resp. 32 x 10<3> består av en eneste polypeptidkjede. Den nøyaktige biokjemiske karakterisering av disse proteiner, samt isolering og rensing av disse er beskrevet i EP-A-0 181-465.

Proteiner med VAC-aktivitet utgjør naturlige blodkoagulasjonshemmere som griper inn i blodkoagulasjons-kaskaden på to steder.

I første omgang hemmer de ved den katalyserte aktivering av faktor X til Xa forårsaket av faktorene IXa og Villa, og i annen omgang stanser de den spaltning av protrombin til trombin som formidles gjennom faktorene Xa og Va. Begge aktiveringstrinn har det tilfelles at de trenger kalsium-ioner og fosfolipider. Åpenbart kan VAC-proteiner likeledes tre inn i en vekselvirkning med fosfolipider og gjennom denne binding blokkere koagulasjonsfaktorenes aktiveringstrinn.

Som det imidlertid har vist seg, finnes det en hel familie som binder seg, som VAC, til fosfolipider på kalsiumavhengig måte og interfererer med prosesser som er avhengig av fosfolipidoverflater.

Til denne familie som også kalles annexiner, tilhører ved siden av Lipocortin I, Calpactin I, Protein II, Lipocortin III, p67-Calelectrin også IBC, PAP, PAP I, PP4, Endonexin II og Lipocortin V.

Annexinenes felles strukturelle trekk er antagelig basis for deres lignende Ca<2+-> og fosfolipid-bindingsegenskaper. Selv om denne generelle egenskap gjelder for alle annexiner, består en klar individualitet med hensyn til deres affinitet til Ca<2+ >og til de forskjellige fosfolipidarter.

Annexinenes fysiologiske funksjon gjelder membran-assosierte prosesser. Den grunnleggende mekanisme for den koaguleringshemmende virkning av VAC er erkjent som en hemming av den katalytiske kapasitet av fosfolipidene ved binding av VAC til deres overflate, hvorved dannelsen av det koagulasjonsfremmende kompleks på dens overflate forhindres.

Også andre annexiner kan hemme blodkoagulasjonen, men VAC synes å være den mest effektivt hemmer.

Bindingsundersøkelser har vist at VAC assosieres reversibelt, kalsiumavhengig med pre-koagulatoriske fosfolipider.

Også andre bivalente kationer fra rekken Cd<2+>, Zn2+, Mn2+ og Co<2+> påvirker assosiasjonen positivt, men ikke i den utstrekning som Ca<2+>.

Deres egenskaper gjør proteinene til interessante, farmakologisk ytterst verdifulle virkestoffer. Den genteknologiske metode som muliggjorde fremstillling av VAC-proteiner, er beskrevet i EPA 293 567, som det her uttrykkelig henvises til.

Foreliggende oppfinnelse har hatt til formål å forbedre den fremgangsmåte for isolering og rensing av VAC-proteiner som er beskrevet i EPA 293 567.

Etter den fremgangsmåte som er kjent fra EPA 293 567, ble isolering og rensing av de nevnte proteiner foretatt ved at den frosne biomasse ble suspendert i en egnet lyseringsbuffer. Cellene ble deretter ødelagt mekanisk, for eksempel ved hjelp av en Manton-Gaulin-presse. Etter tilsetning av et fellingsmiddel for ikke-protein-komponenter, som polyetylenimin, ble de faste bestanddeler fjernet, for eksempel ved sentrifugering. Etter utfelling av proteinene, fortrinnsvis ved ammoniumsulfatfraksjonering, oppløsning av bunnfallet, fjerning av fellingsmidlet og klarning av oppløsningen, ble det således oppnådde ekstrakt underkastet forskjellige kromatografiske rensetrinn. I stedet for utfelling av proteinene, kan det rå VAC-ekstrakt også renses tilstrekkelig ved en kromatografisk for-rensning slik at det deretter kan underkastes en rensecyklus. Egnet kolonnemateriale for for-rensningen er for eksempel Si02/ men også andre materialer med lignende egenskaper er egnet. I henhold til foreliggende oppfinnelse ble det benyttet Silica Catalyst, Carrier, Grade 953 W fra firma Grace.

En kromatografisk rensecyklus egnet for rensning av de aktuelle proteiner besto eksempelvis i en DEAE-Fast-Flow-Sepharose-, en Sephacryl S-200 High Resolution- og en Q-Sepharose-Fast-Flow-Chromatographie. Renheten av de således oppnådde proteiner ble bestemt ved SDS-PAGE, Western Blot, gelpermeasjons HPLC, omvendt-fase HPLC og isoelektrisk fokusering.

Ved den utførte lysering og ekstraksjon etter denne fremgangsmåte, ble materialet, som trengte ytterligere opprensning, oppnådd i et utbytte på ca. 50%.

Ved forbedring av disse prosesstrinn i henhold til foreliggende oppfinnelse, har det overraskende vist seg mulig å øke utbyttet ifølge dette trinn til over 80%.

Forbedringen ble oppnådd på overraskende måte ved å innstille den homogeniserte lyse-suspensjon på en pH-verdi mellom 8,0 og 10, fortrinnsvis på en pH-verdi på 9,0. Særlig fordelaktig virker tilsetningen av bivalente kationer, spesielt av Ca<2+0> og fosfolipider som kefalin og lecitin, spesielt lecitin. Gjennom disse forholdsregler adsorberes de VAC-proteiner som finnes i homogenisatet, seg til cellemenbranen i vertsorganismen, fortrinnsvis E. coli. Dette in situ adsorpsjonstrinn gjør det på overraskende måte mulig å fjerne forstyrrende oppløselige andeler fra homogenisatet ved en enkel vasking. Desorpsjonen av VAC-proteiner bundet til den faste "bærer" skjer ved hjelp av chelaterende midler, fortrinnsvis med EDTA-holdig buffer.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for rensing av annexiner, som kjennetegnes ved a) at pH-verdien av celleoppslutnings-homogenisatet

innstilles på 8,0 til 10,0,

b) at et bivalent kation valgt blant Ca<2+>, Cd<2+>, Zn<2+>, Mn<2+> og Co<2+> tilsettes, idet konsentrasjonen av det

bivalente kation er ca. 5 mM,

c) at et fosfolipid tilsettes, idet konsentrasjonen av fosfolipidet er ca. 1 g/100 g cellemasse, d) at oppløselige komponenter fjernes ved vasking av celle-remanensen, e) at proteinene ekstraheres med EDTA eller andre chelaterende midler fra celle-remanensen, og f) at de ekstraherte proteiner renses på i og for seg kjent måte, ved protein-felling og påfølgende

protein-rensetrinn.

Tilsetning av fosfolipidet (Trinn c) kan skje samtidig eller trinnvis.

Fortrinnsvis kan det benyttes en blanding av bivalente kationer, eksempelvis Ca<2+> i forbindelse med Zn<2+>, hvorunder de molare forhold av hvert kation innstilles slik at adsorpsjonen av annexinet, f.eks. VAC, til celleoverflaten er maksimal.

Ved rensingen av annexiner som var fremstillet ved "Expression" i E. coli, lot andelen av E. coli-proteiner (ECP) seg tydelig redusere ved tilsetningen av BPA (Bioprocessing Aids, Fa. TOSOHAAS). Til dette formål ble det oppnådde råekstraktet etter EDTA-ekstraksjonen tilsatt BPA, eksempelvis BPA-1000, BPA-1050 eller BPA-2100, fortrinnsvis BPA-1000, og omrørt. Den tilsatte mengde kan utgjøre 1 til 20 volumprosent, fortrinnsvis 5 til 10 volumprosent, spesielt 10 volumprosent. Bunnfallet avsentrifugeres. Heretter følger proteinutfellings-samt kromatograferings-trinnene. Ved tilsetningen av BPA lot innholdet av ECP seg allerede på dette trinn senke til ca. 2% av utgangsverdien. Innholdet av VAC ble derimot bare forminsket med 6%.

En ytterligere overraskende utbytteforbedring kunne oppnås ved at cellene i fermentatoren ble inaktivert før celleoppslutningen. Som inaktiveringsmiddel kan det benyttes enkle aromatiske forbindelser som eksempelvis benzen, toluen, fenol, xylen eller kresol. Særlig fordelaktig er bruk av m-kresol. Ved forutgående innkobling av disse inaktiveringstrinn var det i forbindelse med de tidligere beskrevne prosesstrinn, mulig å øke utbyttet ved ekstraksjonen til over 98%!.

Etter adorpsjons-/desorpsjonstrinnet følger de rensetrinn som er kjent fra EPA 293 567. De nødvendige parametere som temperatur, mengdeforhold, rekkefølge av de enkelte trinn, pH-verdier, spesielle reagenser, etc, er velkjent for fagmannen. Om ønskes kan de nedenfor angitte eksempler endres på måter som er kjent for fagmannen. Spesielt utgjør de ingen begrensninger med hensyn til det protein som skal renses. På grunn av de felles strukturelle trekk og de generelle egenskaper ved annexinene, er fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen også anvendelig ved rensing av de øvrige annexiner. Særlig er den egnet ved rensing av annexinene IBC, PAP, PAP I, PP4, Endonexin, Lipocortin V og VAC.

Forøvrig er fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen også anvendelig ved isolering og rensing av annexiner fra sterkt vaskularisert vev.

Opplysningene om de anvendte reagenser er kun eksempler på deres opprinnelse og skal ikke oppfattes som begrensninger.

Tekst til figurene

Fig. 1: Elueringsprofil ved kromatografi på fenyl-Sepharose

Fast Flow = VAC-Pool)

Fig. 2: Elueringsprofil ved kromatografi på Q-Sepharose Fast

Flow («--» = VAC-Pool)

Eksempel 1

1. Celleoppslutning:

Tilsetning av Ca<++> og lecitin, vask og ekstraksjon

122 g dypfryst, ikke inaktivert cellemasse av klonen E. coli HB101/pRH291 fra fermentering nr. 524, ble etter

opptining suspendert i 500 ml lyseringsbuffer under omrøring (ca. 1 time, isavkjøling) og deretter homogenisert med Ultra-Turrax T 45/6 (ca. 1 min., isavkjøling).

Lyseringsbuffer:

100 mM TRIS 12,14 g/1000 ml Merck 8382

1 mM EDTA 0,37 g/1000 ml Titriplex III, Merck 8418 200 mM NaCl 11,69 g/1000 ml Merck 6404

pH-verdien ble innstillet med 32% HCl på 9,0 ± 0,1.

Suspensjonen ble homogenisert 3 ganger ved ca. 420 kg/cm<2> gjennom en Manton-Gaulin-presse type 15 M 8TA, hvorunder mottaksbeholderen ble avkjølt i is. Apparatet ble deretter vasket 2 ganger med 150-200 ml porsjoner lyseringsbuffer (totalt volum av ekstraktet: 1000 ml). 2. Tilsetning av Ca""" og lecitin for adsorpsjon av VAC til den uløselige celle-remanens.

Til homogenatet ble 'det tilsatt 0,55 g kalsiumklorid (Merck 2083) nylig oppløst, sluttkonsentrasjon 5 mmol - og 6,1 ml lecitinoppløsning (200 mg/ml kloroform). Sluttkonsentrasjon 1 g lecitin/100 g biomasse.

Blandingen ble homogenisert i 1 minutt ved hjelp av Ultra-Turrax og omrørt i 60 minutter i isbad.

LECITIN: Lecitin fra soyabønner, prakt. Serva 57556.

Deretter ble 110 ml 5% polyminoppløsning (fremstillet fra 50% polymin P, Serva 33141, fortynnet til 5% og nøytralisert til pH 8 med 5N HCl) tilsatt og omrørt i ytterligere 30 minutter. Sluttkonsentrasjon 0,5%. Tilslutt ble suspensjonen klarnet ved sentrifugering (Beckman High-Speed sentrifuge J2-21, Rotor JA 10, 8000 rpm, 30 min. innstilling 2°C) .

SUPERNATANT I: 1020 ml (4,25 mg protein/ml; 0,05 mg VAC/ml). 3. Vask av celle-remanensen for fjerning av oppløselige komponenter.

Celle-remanensen ble suspendert med 600 ml vaskebuffer ved hjelp av Ultra-Turrax og deretter omrørt i 30 min.

Vaskebuffer:

100 mM TRIS

200 mM NaCl

5 mM CaCl2

pH-verdien ble innstillet på 9,0 ± 0,1 med 32% HCl.

Celle-remanensen ble som tidligere oppnådd ved sentrifugering.

SUPERNATANT II: 580 ml (1,35 mg protein/ml; 0,04 mg VAC/ml)

Suspenderingen i 350 ml vaskebuffer, den påfølgende homogenisering og omrøring ble gjentatt nok en gang. Blandingen ble deretter sentrifugert.

SUPERNATANT III: 340 ml (0,93 mg protein/ml; 0,02 mg VAC/ml)

4. Ekstraksjon av VAC med EDTA-holdig buffer.

De oppnådde pellets ble homogenisert med 900 ml ekstraksjonsbuffer i Ultra-Turrax og deretter omrørt over natten i kjølerom. Ekstraktet ble sentrifugert som beskrevet og den klare oppløsning = råekstrakt, oppnådd.

Råekstrakt: 915 ml (1,98 mg protein/ml; 0,65 mg VAC/ml)

EKSTRÅKSJONSBUFFER:

2 0 mM TRIS

50 mM EDTA

pH-verdien ble innstillet på 7,5 ± 0,1 med 5N NaOH.

Oversikt over vaskeprosess og ekstraksjon:

Supernatant I 1020 ml 4335 mg protein 49 mg VAC Supernatant II 580 ml 783 mg protein 22 mg VAC

Supernatant III 340 ml 316 mg protein 5 mg VAC

5434 mg protein 76 mg VAC (11%)

Råekstrakt VAC 915 ml 1816 mg protein 594 mg VAC

i 122 g cellemasse VAC totalt 670 mg (89%)

Eksempel 2

Oversikt:

1. Inaktivering

2. Celleoppslutning

3. Tilsetning av Ca"<1-1>" og lecitin for adsorpsjon av VAC til den uløselige celle-remanens 4. Vask av celle-remanensen for fjerning av oppløselige komponenter

5. Ekstraksjon av VAC med EDTA-holdig buffer

6. Tilsetning av 35% mettet ammmoniumsulfat og fjerning av bunnfallet

7. Kromatografi på fenyl-Sepharose-Fast-Flow

8. Dialyse av VAC-oppsamlingene og kromatografi på Q-Sepharose Fast Flow 9. Konsentrering av VAC-oppsamlingene og kromatografi på Sephacryl S-200 HR

1. Inaktivering

Fermenteringsslutt oppnås etter ca. 17 timer fra fosfat-forbruket i mediet. Ved dette tidspunkt tilsettes 10 mmol CaCl2 og temperaturen innstilles på en raskest mulig avkjøling til 5-8°C. Alle øvrige styrte parametere (som lufting, omrøring, pH-verdi, trykk, osv.) forble de samme. Etter ca. 10 minutter ble 7 ml/liter m-kresol tilsatt, hvorpå trykk, lufting og pH-regulering ble slått av og røringen redusert til et nivå som sikret en god gjennomblandingen av fermenteringsbuljongen med kresolen, men begrenset skumdannelsen. Under disse betingelsene ble inaktiveringen foretatt minst 3, maksimalt 15 timer (temperatur fortsatt 5-8°C) .

2. Celleoppslutning

Tilsetning av Ca" 1"* oa lecitin, vask og ekstraksjon

286 g dypfryst m-kresol-inaktivert cellemasse av klon HB 101/pGN25 ble etter opptining suspendert med 750 ml lyserings-buf f er ved omrøring (ca. 1 time, isavkjøling) og deretter homogenisert med Ultra-Turrax T 45/6 (ca. 1 minutt, isavkjøling).

LYSERINGSBUFFER:

100 mM TRIS

1 mM EDTA

200 mM NaCl

pH-verdien ble innstillet med 32% HCl på 9,0 ± 0,1.

Suspensjonen ble homogenisert 3 ganger ved ca. 420 kg/cm<2 >gjennom en Manton-Gaulin-presse type 15M 8TA, hvorunder mottaksbeholderen ble avkjølt i is. Apparatet ble deretter vasket 2 x med 150-200 ml porsjoner lyseringsbuffer. Homogenatvolum: 1400 ml

2. Tilsetning av Ca<++> og lecitin for adsorpsjon av VAC til den uløselige celle-remanens: Homogenatet tilsettes 0,55 g CaCl2 (Merck 2083)/1000 ml (sluttkonsentrasjon 5 mM) (oppløst i ca. 10 ml H20) og 1 g lecitin/100 g biomasse, oppløst i kloroform (ca. 0,2 g/ml).

Blandingen ble homogenisert i 1 minutt med Ultra-Turrax og omrørt i 60 minutter i isbad.

LECITIN: Lecitin fra soyabønner, prakt. Serva 57556

Deretter tilsettes 0,11 volumer 5% polyminoppløsning (fremstillet fra 50% polymin P, Serva 33141, fortynnet til 5% og nøytralisert til pH 8 med 5N HCl) og igjen omrørt i 30 min. Sluttkonsentrasjon 0,5%. Deretter ble suspensjonen klarnet ved sentrifugering (Beckman High Speed sentrifuge J2-21, Rotor JA 10, 8000 rpm., 30 min. , innstilling 2°C) .

SUPERNATANT I: 1200 ml (5,8 mg protein/ml; 0,01 mg VAC/ml)

3. Vask av celle-remanensen for fjerning av oppløselige komponenter

Celle-remanensen ble suspendert med ca. 1000 ml vaskebuffer ved hjelp av Ultra-Turrax og deretter omrørt i 30 min.

VASKEBUFFER: 100 mM TRIS

200 mM NaCl

5 mM CaCl2

pH-verdien ble innstillet med 32% HCl på 9,0 0,1. 3. Celle-remanensen ble oppnådd som tidligere ved sentrifugering.

SUPERNATANT II: 1000 ml (1,94 mg protein/ml; 0,01 mg VAC/ml)

Suspenderingen i 1000 ml vaskebuffer med påfølgende homogenisering og omrøring, ble gjentatt og suspensjonen deretter sentrifugert.

SUPERNATANT III: 1000 ml (0,79 mg protein/ml; 0,01 mg VAC/ml)

4. Ekstraksjon av VAC med EDTA-holdig buffer

De resulterende pellets ble homogenisert med 1350 ml ekstraksjonsbuffer i Ultra-Turrax og deretter omrørt over natten i kjølerom. Ekstraktet ble sentrifugert som beskrevet og den klare oppløsning = råekstrakt, oppnådd.

Råekstrakt: 1350 ml (3,35 mg protein/ml; 1,46 mg VAC/ml)

Ekstraksi onsbuf fer: 20 mM TRIS

50 mM EDTA

pH-verdien ble innstillet med 5N NaOH på 7,5 0,1.

9690 mg protein 32 mg VAC

(2%)

Råekstrakt VAC 1350 ml 4522 mg protein 1971 mg VAC

i 286 g cellemasse VAC totalt 2003 mg (98%)

5-6. Utfelling med 35% mettet ammoniumsulfat og kromatografi på fenyl-Sepharose fast Flow

Utfelling med ammoniumsulfat:

Råekstraktet tilsettes langsomt 209 g/liter fast ammoniumsulfat (Merck 1217) under omrøring. Det fører til en metningsgrad på 35%. Etter minst 1 times omrøring i kjølerom klarnes oppløsningen ved sentrifugering (betingelser som tidligere), hvoretter bunnfallet kasseres. Oppløsningen pumpes gjennom FPLC-apparaturen med en hastighet på 8-10 ml/min. gjennom den forberedte fenyl-Sepharose FF.

Den klarsentrifugerte 35% mettede ammoniumsulfat-supernatant ble opparbeidet videre i to tilnærmet like deler, og alle etterfølgende rensetrinn foretatt 2 x etter hverandre.

Forberedelse av kolonnen:

En Pharmacia-kolonne av type XK 26/40 (skiktvolum ca. 200 ml) fylles med fenyl-Sepharose East Flow (Pharmacia, Code No. 17-0965) og stabiliseres med buffer A. Til dette trengs 2-3 CV (Column Volume) buffer. Kolonnen er tilkoblet en FPLC-apparatur. Hele kromatograferingen skjer ved romtemperatur.

BUFFER A:

50 mM TRIS

Bufferen innstilles med kons. HCl på pH 7,2 ± 0,1. Det tilsettes 209 g/1000 ml fast ammoniumsulfat (Merck 1217).

BUFFER B: Som buffer A men uten tilsetning av ammoniumsulfat.

Kromatografi:

Eluatet kontrolleres ved måling av OD 280 nm. Så snart preparatet er anbragt på kolonnen, vaskes det etter med buffer A inntil OD 22280 nm er vendt tilbake til den opprinnelige verdi. Det benyttes deretter en gradient av buffer A/buffer B på 0-100% B på 5 kolonnevolumer (1000 ml) for eluering av bundet VAC. VAC er en første fremtredende topp etter gradient-start (se elueringsdiagrammet; Fig. 1). Alikvoter av utløpet, VAC-oppsamlingene og eventuelt ytterligere topper av OD-profilen undersøkes ved SDS-PAGE. Undersøkelse av VAC-oppsamlingene: proteinbestemmelse, VAC-undersøkelse,

SDS-PAGE.

Regenerering av kolonnen:

Fenyl-Sepharosen regenereres med 2 volumer 6M urea. Etter utvasking av urea (1 CV aqua dest.) oppbevares den i 24% etanol.

For å eliminere, resp. forhindre farvede bestanddeler i den øvre enden av kolonnen, benyttes et utvidet vaske- og regenereringsprogram:

1. 1 CV aqua dest.

2. 2 CV 6M urea (Merck 8487)

3. 1 CV aqua dest.

4. 1 CV 0,IM NaOH

5. Vask og lagring 24% etanol

6. Før bruk stabilisering med 3 CV buffer A

7 Kromatografi på Q-Sepharose Fast Flow

For ikke å benytte altfor meget buffer ved dialysen av VAC-oppsamlingen mot påføringsbufferen for Q-Sepharosen, inndampes oppsamlingen først i en AMICON-Ultrafiltrasjons-celle og et YM 10-filter: til ca. 150 ml. Deretter dialyseres mot buffer A.

Buffer A: 20 mM Bis-TRIS

pH-verdien innstilles med 5N HCl på 6,3 ± 0,1.

Buffer B: Buffer A + 0,35M NaCl

20 mM Bis-TRIS

350 mM NaCl

pH-verdien innstilles med 5N HCl på 6,3 ± 0,1.

Kolonneforberedelse:

En kolonne av type HR 16/50 Pharmacia (CV 100 ml) forbindes med FPLC-systemet og fylles ved hjelp av fylleanordningen med Q-Sepharose Fast-Flow (Pharmacia). Den stabiliseres med 2 CV buffer A. Kromatograferingen skjer ved romtemperatur.

Kromatografi:

Påføring av prøven skjer med 4 ml/min. Det vaskes deretter etter med buffer A til OD 280 nm av eluatet er sunket til den opprinnelige verdi. Gradient-programmet er som følger: 0,5 CV 0 - 30% B

8,0 CV 30 - 70% B (her utføres separasjonen)

ca. 1,0 CV 100% B

Vaskeprogram:

Etter at det ved 100% B ikke elueres mer UV-aktivert materiale, begynner vaskeprogrammet:

2 CV aqua dest.

2 CV 0,5N NaOH

2 CV aqua dest.

Oppbevaring: 24% etanol

Før bruk vaskes med 2-3 CV buffer A: kontroll pH = 6,3

Forurensninger elueres etter dette program før VAC. Elueringsprofilen er vedlagt (Fig. 2).

8. Kromatografi på Sephacryl S-200 HR

VAC-oppsamlingen irindampes med et AMICON-Ultrafilter YM 10 til ca. 10 ml. Herunder viste det seg at VAC kan konsentreres til 100 mg/ml (BioRad) uten problemer.

Kolonneforberedelse:

En K 26/100 kolonne fra Pharmacia med ca. 400 ml skiktvolum, ble fylt i henhold til forskriften med Sephacryl S-200 High Resolution (Pharmacia) og stabilisert med elueringsbuffer (2 CV) .

Elueringsbuffer:

20 mM Na-fosfat pH = 7,2

150 mM NaCl eller

20 mM ravsyre Na2-salt (pH = 7,0)

0,01% TWEEN 20

pH-verdien innstilles med IN HCl på 7,0 ± 0,1.

Kromatografi:

Kromatograferingen foretas i kjølerom. Gjennomstrømnings-hastigheten utgjør 80 ml/time. Toppen opptegnet ved OD 280 nm oppsamles. Det således rensede VAC var >99% rent (RP-HPLC-analyse).

Regenerering av Sephacrvl- kolonnen:

Vaskeprogram:

1 CV aqua dest.

2 CV 0,5N NaOH (+ lagring noen dager)

(ved oppbevaring over lenger tid anbefales: IM NaCl + 0,0025% NaOH)

Regenerering:

1 CV aqua dest.

2 CV elueringsbuffer

Oversikt over den samlede opprensning

*) BioRad Protein-bestemmelse (standard: storfeserum-albumin) **) VAC-alfa-bestemmelse: hemming av dannelsen av trombin fra protrombin (Reutelingsperger, Hornstra og Hemker, Eur. J. Biochem., 151, 625-629; 1985). Som referanse tjente et renset VAC-alfa-preparat. **<*>) Proteininnholdet bestemt ved måling av OD 280 nm under bruk av den faktor som er bestemt for ren VAC-alfa: OD 280 nm x 1,277 = mg/ml VAC-alfa.

Eksempel 3

Rensing av EDTA-råekstraktet med BPA

Rensingen beskrevet i Eksempel 1 og Eksempel 2 ble gjennomført inntil ekstraksjon med EDTA-holdig buffer (Trinn

4). Utgangsmaterialet var en gang 295 g og en gang 240 g biomasse: Etter utvinning av råekstraktet ble 10 volumprosent BPA 1000 tilsatt og omrørt i 10 min. Det resulterende bunnfall ble frasentrifugert (High Speed sentrifuge J2-21 Fa. Beckman, Rotor JA 10, 8000 rpm, 30 min. ved 2°C) .

Den videre opprensning ble foretatt som beskrevet: tilsetning av fast ammoniumsulfat til 35% metning og kromatografi på fenyl-Sepharose Fast Flow (se foranstående forskrift).

Resultater for VAC- alfa

Utgangsmaterialet var 295 g biomasse (Charge B005001)

Resultater for VAC alfa

Utgangsmaterialet var 240 g biomasse (Charge B005001)

Claims

1. Fremgangsmåte for rensing av annexiner, karakterisert veda) at pH-verdien av celleoppslutnings-homogenisatet innstilles på 8,0 til 10,0, b) at et bivalent kation valgt blant Ca<2+>, Cd<2+>, Zn<2+>, Mn<2+> og Co<2+> tilsettes, idet konsentrasjonen av det bivalente kation er ca. 5 mM, c) at et fosfolipid tilsettes, idet konsentrasjonen av fosfolipidet er ca. 1 g/100 g cellemasse, d) at oppløselige komponenter fjernes ved vasking av celle-remanensen, e) at proteinene ekstraheres med EDTA eller andre chelaterende midler fra celle-remanensen, og f) at de ekstraherte proteiner renses på i og for seg kjent måte, ved protein-felling og påfølgende protein-rensetrinn.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH-verdien innstilles på 9,0.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det som bivalent kation tilsettes Ca<2+>.

4. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at det som fosfolipid tilsettes lecitin.

5. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at cellene på forhånd inaktiveres.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det som inaktiveringsmiddel benyttes enkle aromatiske forbindelser, spesielt benzen, toluen, fenol, xylen eller kresol, spesielt kresol.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det som inaktiveringsmiddel benyttes m-kresol.

8. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at det vaskulære anti-koagulerende protein som skal renses, er VAC eller analoger derav.